Intro Duca o

Introduo

Chagas, KN. Avaliao do Gene Estrutural da MBL e a sua Relao com a TransmissoMaterno-fetal do HIV.

1

1 - Introduo:

A lectina ligadora de manose (MBL) uma protena plasmtica, com

papel importante no sistema de defesa inato (Thiel et al, 1995), que

constitui o primeiro componente de ativao da via das lectinas do sistema

complemento e atua na neutralizao de microorganismos patognicos por

um mecanismo independente de anticorpo (Turner, 1996; Wallis et al, 2000;

Guardia et al, 2003). A MBL encontrada no soro de mamferos e

considerada uma protena de fase aguda (Ezekowitz et al, 1988; Thiel et al,

1992).

O padro de reconhecimento da MBL definido atravs da

conformao espacial e do sentido de orientao de seu domnio de

reconheciemento de carboidrato (CRD), determinando o tipo de ligante da

proteina, que so microorganismos com grande quantidade de manose (ou

N-acetil-D-glucosamina ou similar) e glicanos em sua superfcie (Jack et al,

2003).

Quando ocorre a ligao ao microorganismo, a MBL pode

desencadear vrias atividades anti-microbianas. A protena interage com,

pelo menos, quatro protenas relacionadas ao Sistema serino protease

associado (MASP): MASPs 1, 2, 3 e uma forma truncada de MASP 2, a

Map 19. Essa interao, por sua vez, ativa a cascata do complemento com a

lise dos microorganismos diretamente ou com o aumento da fagocitose

(Turner, 1996; Wallis et al, 2000; Jack et al, 2003).

O gene mbl2, localizado no brao q11.2-q21 do cromosomo 10,

formado por quatro exons. Trs pontos de mutao foram encontrados na

Introduo


2

regio estrutural da molcula (cdons 52, 54 e 57) resultando em trs

variantes allicas chamadas de alelos D, B e C, respectivamente. A forma

selvagem denominada A. Essas mutaes ocorrem nos nucleotdeos 223

(C para T), 230 (G para A) e 239 (G para A) do exon 1 para D, B e C,

respectivamente (Steffensen et al, 2000). A regio promotora apresenta

stios de ligao para transcrio de fatores envolvidos na regulao da

resposta de fase aguda (Guardia et al, 2003). Polimorfismos adicionais

foram descritos na regio promotora do gene. Duas variaes H e L, na

posio 550, esto em desequilbrio de ligao com X e Y, variantes da

posio 221, e so encontrados em trs hapltipos: HY, LY e LX (Madsen

et al, 1995; Steffensen et al, 2000; Guardia et al, 2003). O hapltipo HY

associado a altos nveis sricos de MBL; LY com nveis intermedirios e LX

aos nveis sricos mais baixos (Madsen et al, 1995; Steffensen et al, 2000).

As mutaes na regio codificadora do gene afetam o nvel srico da

protena e baixas concentraes de MBL tm sido associadas a defeitos de

opsonizao e fagocitose, resultando em infeces de repetio em recm-

nascidos e crianas (Steffensen et al, 2000; Guardia et al, 2003). Acredita-se

que este defeito seja freqente na populao geral (5 a 7%) sugerindo tratar-

se da imunodeficincia primria mais comum (Super et al, 1989; Jack et al,

2001).

Vrios estudos associam os nveis de MBL suscetibilidade a

agentes infecciosos. A deficincia de MBL tem sido associada infeco

pelo HIV (Vrus da imunodeficincia humana) e a outros patgenos como

bactrias, fungos, parasitas e outros vrus, tanto em crianas quanto em

adultos (Kilpatrick et al, 1996-97). O HIV-1 um vrus com envelope, que

Introduo


3

expressa a gp120/gp41, um receptor de fuso protica na superfcie viral. A

gp120 extensivamente glicosilada, com carboidratos em mais da metade

de sua massa molecular constituindo um excelente alvo para interao com

a MBL (Saifudin et al, 2000).

Os primeiros estudos mostraram que a MBL inibe, in vitro, a infeco

de linfcitos T CD4+ pelo HIV e liga-se, seletivamente, s clulas infectadas

pelo vrus (Ezekowitz et al, 1989). O papel da MBL na infeco pelo HIV

ainda considerado bipolar, isto , a MBL ligada ao vrus pode resultar em

sua neutralizao com a ativao do complemento, mas por outro lado, o

vrus pode utilizar a MBL para ligar-se ao receptor do complemento e utiliz-

lo comco porta de entrada nas clulas. (Thielens et al, 2002).

Embora diversos estudos avaliem uma possvel associao entre a

infeco pelo HIV e os gentipos de MBL, correlacionando-os ao

desenvolvimento e progresso para a AIDS (sndrome da imunodeficincia

adquirida), (Nielsen et al, 1995; Senaldi et al, 1995; Garred et al, 1997;

Thielens et al, 2002; Lian et al, 2004), o papel desta protena na transmisso

materno-fetal do vrus ainda no est esclarecido.

Introduo


4

2 - Reviso da Literatura:

2.a Sistema Complemento:

Em 1888, Nuttal descobriu que hemcias de carneiro possuam

atividade bactericida para Bacillus anthracis, que era perdida com o

aquecimento do soro a 55C. Logo aps, Bordet (1894) observou que a

atividade imune do soro inativado pelo calor poderia ser restaurada com

pequenas quantidades de soro fresco no imune, que por si s no

apresentava atividade bactericida. Aps quase meio sculo, o sistema

complemento foi definido como uma srie de protenas sricas, ativadas

sequencialmente, cuja atividade resulta em hemlise (Figueroa et al, 1991;

Frank, 1998).

As protenas do sistema complemento possuem atividade proteoltica,

porm so encontradas na forma de pr-enzimas (zimognio), que so

ativadas apenas sob condies particulares. Nos stios de inflamao, estas

enzimas ativadas geram vrias funes efetoras, que resultam em potentes

eventos inflamatrios (Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005).

Por volta dos anos 80, investigadores mostraram que o sistema

complemento constitudo no apenas de componentes solveis que se

depositam na superfcie de microorganismos, mas tambm por protenas de

membrana nas clulas do hospedeiro, que interagem com aquelas (Figueroa

et al, 1991). Cerca de 35 protenas participam do sistema complemento

realizando funes de: protenas efetoras, de receptores de superfcie

celular e com atividade reguladora (Frank, 1998) (Tabelas 1 e 2)

Introduo


5

Tabela 1 - Componentes das vias clssica, alternativa, das lectinas e da

cascata final do sistema complemento.

Protenas da via clssica

Protena Concentrao sricamg/mL

Funo

C1 (C1qr2s2) Inicia a via clssica.

C1q 75-150 Liga-se a poro Fc de anticorpos.

C1r 50 Cliva C1s.

C1s 50 Cliva C4 e C2.

C4 300-600 C4b liga-se a superfcie ativadora e a C4a estimula a inflamao.

C2 20 C2a a enzima ativa das C3 e C5 convertases.

Protenas da via alternativa


Funo

C3 1000-1200 C3b liga-se a superfcie ativadora, componente de C3 e C5convertase; C3a estimula a inflamao.

Fator B 200 Bb a enzima ativa de C3 e C5 convertase.

Fator D 1-2 Cliva o fator B quando ligado a C3b.

Properdina 25 Estabiliza a C3 convertase (C3bBb) na superfcie ativadora.

Via das lectinas


Funo

MBL 1-2 Ligao a resduos de acares na superfcie de microorganismos.

MASP-1 6 Serinoprotease, cliva C2, ativa C3.

MASP-2 0.5 Serinoprotease, cliva C4.

MASP-3 ? No conhecida.

MAp-19 ? No conhecida.

L-ficolina 13.7 Associa-se as MASPs e Map19 e pode ativar a via das lectinas.

H-ficolina 15 Associa-se as MASPs e Map19 e pode ativar a via das lectinas.

Cascata final do complemento


Funo

C5 80 C5b inicia o MAC; C5a estimula a inflamao.

C6 45 Liga-se a C5 e recebe C7.

C7 90 Liga-se a C5b6 e insere o complexo na membrana.

C8 60 Liga-se a C5b-7 e inicia a ligao e polimerizao de C9.

C9 60 Liga-se a C5b-8 e forma poros na membrana.

Modificado de Abbas et al, 2000; Winkelstein J et al, 2003; Prodinger et al, 2003.

Introduo


6

Tabela 2 - Protenas reguladoras e receptores de superfcie dos produtos do

complemento.

Protenas reguladoras da ativao do sistema complemento

Protena Distribuio econcentrao srica

(mg/mL)

Interao Funo

Inibidor de C1esterase (C1-INH)

Protena plasmtica

200

C1r, C1s Inibidor de serinoprotease,controla as vias clssica e daslectinas.

Fator I Protena plasmtica

35

C4b, C3b Serinoprotease, cliva C3b e C4bcom auxlio de cofatores.

Fator H Protena plasmtica

480

C3b Liga-se a C3b e dissocia-o deBb; cofator para fator I.

Protena ligadora deC4 (C4bp)

Protena plasmtica

300

C4b Liga-se a C4b e dissocia-o deC2a; cofator para fator I.

Properdina Protena plasmtica

340

C3bBb Retarda a dissocoaoespontnea da enzima.

Protena S Protena plasmtica

340

C5b-9 Liga-se a C5b-9 na fase fluida,inibe a formao do MAC.

Receptores de superfcie

Protena cofator demembrana (MCP)

Leuccitos, clulasepiteliais e endoteliais.

C3b, C4b cofator para fator I.

fator acelerador dedecaimento (DAF)

Clulas sanguneas,epiteliais e endoteliais.

C4b2a, C3bBb Dissociao da C3 convertase.

CD59 Clulas sanguneas,epiteliais e endoteliais.

C7, C8 Bloqueia a ligao de C9 eimpede a formao do MAC.

Modificado de Abbas et al, 2000, Winkelstein et al, 2003; Prodinger et al, 2003.

CR1 - receptor 1 do complemento.

Os hepatcitos sintetizam cerca de 90% dos componentes do sistema

complemento. Apenas alguns deles tm sua origem predominantemente fora

do fgado, como o C1 no epitlio intestinal e em moncitos/macrfagos; o

Fator D no tecido adiposo; as clulas da medula ssea, particularmente os

granulcitos, parecem representar a maior fonte de C7 plasmtico. Alguns

estudos demonstram outras fontes no usuais das protenas do

Introduo


7

complemento, tais como astrcitos, clulas endoteliais, linfcitos, epitlio

renal, rgos reprodutores, entre outras (Volanakis, 1998; Prodinger et al,

2003).

Trs vias de ativao do sistema complemento tm sido descritas: 1)

a via clssica, desencadeada por ligao antgeno-anticorpo; 2) a via das

lectinas, ativada atravs da ligao da MBL a estruturas polissacardicas na

superfcie de microorganismos e 3) a via alternativa, que pode ser iniciada

pela ligao de C3, ativado espontaneamente no plasma, superfcie de

microorganismos. Depois de ativadas, as trs vias formam a enzima C3

convertase, que posteriormente resulta na formao da C5 convertase e

evoluem para a via terminal comum (C5b-9). Nesta via, os componentes so

ativados de maneira no-proteoltica e formam o complexo de ataque a

membrana (MAC). Na fase fluida, as protenas esto inativadas, ou apenas

transitoriamente ativadas, e tornam-se estveis aps a sua ligao com

microorganismos ou com anticorpos (Volanakis, 1998; Abbas et al, 2000;

Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005).

As protenas que formam a cascata de ativao da via clssica

compreendem C1, C2, C4 e C3, nesta ordem, e a regulao exercida por

protenas como o inibidor de C1 esterase (C1-INH), o DAF, a protena de

ligao C4 (C4bp), CR1, o fator I e a protena cofator de membrana (MCP)

(Prodinger et al, 2003). A ligao de C1q superfcie de patgenos ou a

imunoglobulinas, desencadeia uma alterao conformacional no complexo

C1r:C1s, resultando na ativao de C1r que, posteriormente, ativa o C1s

associado, para gerar uma serinoprotease ativa. C1s atua nos prximos dois

componentes da via clssica C4 e C2, clivando-os em dois fragmentos: C4a,

Introduo


8

fragmento pequeno, com baixa atividade quimiottica, e C4b, maior, que

sofre uma alterao conformacional. Apenas cerca de 5% do C4b torna-se

aderido de forma covalente s partculas de superfcie, ao redor do stio de

ativao. Aps esta adeso, C2 forma um complexo com C4b, e clivado

por C1s, formando dois fragmentos: o menor, C2b, liberado na fase fluida

e o maior, C2a, mantm-se ligado a C4b, para formar o complexo C4b2a,

enzimaticamente ativo, que a C3 convertase da via clssica (Rother et al,

1985; Figueroa et al, 1991; Winkelstein et al, 2003; Prodinger et al, 2003;

Janeway et al, 2005) (Figura 1).

Introduo


9

Figura 1 - Representao esquemtica da via clssica de ativao do

complemento.

C1s

Carboidrato

C2

C2b

C4

C2a C4b2a

C4a

C3C3a

C4b2a3b

Via Clssica

C1r

C1q

Modificado de Walport, 2001.

O C1-INH liga-se enzima ativa C1r:C1s e causa sua dissociao de

C1q, limitando o tempo de durao no qual C1s ativo capaz de clivar C4 e

C2. O complexo C4b2a tem meia-vida curta, aps a qual h dissociao de

C2a em uma forma inativa. A protena srica C4bp liga-se ao C4b,

acelerando a sua dissociao do complexo e impedindo a formao de uma

nova convertase. E tambm, atua como cofator para o fator I, que quebra

C4b em fragmentos menores, inativos. O DAF associado membrana

acelera a dissociao da C3 convertase aderida superfcie de clulas do

hospedeiro (Abbas et al, 2000; Winkelstein et al, 2003; Prodinger et al, 2003;

Janeway et al, 2005).

Introduo


10

A funo mais importante da C3 convertase clivar um nmero

suficiente de molculas C3 para produzir C3b, que se adere superfcie do

patgeno. Ao mesmo tempo, C3a, o fragmento menor, inicia resposta

inflamatria local. A ativao de C3 resulta tambm na formao da C5

convertase, com a ativao de C5 e incio da via terminal (Janeway et al,

2005).

A ativao da via alternativa do complemento pode ocorrer em vrias

superfcies de microorganismos, na ausncia de anticorpo especfico

(Janeway et al, 2005). A ativao de C3, pela clivagem em C3b, a reao

central da cascata. (Prodinger et al, 2003).

Ao contrrio das outras vias, a via alternativa no depende de uma

superfcie ativadora para a sua iniciao, podendo ocorrer hidrlise

espontnea de C3. Normalmente, o C3 plasmtico continuamente clivado

em baixas doses para gerar C3b. Formando C3a e C3b. C3a, o fragmento

menor, uma potente anafilatoxina e exerce seus efeitos em locais distantes

do stio de ativao. O fragmento maior, C3b, altera sua conformao e liga-

se a nuclefilos prprios e a grupos amida ou hidroxila de qualquer molcula

ao redor (molcula aceptora), incluindo molculas de gua (Frank, 2000;

Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005). Se e ligao no ocorrer, o C3b

permanece na fase fluida e rapidamente hidrolisado, tornando-se inativo e

encerrando a ativao da cascata. Caso o C3b se ligue a uma protena

plasmtica, o fator B, sofre uma mudana conformacional e ativa o fator D.

Este segundo fator determina a quebra do fator B em dois fragmentos Ba,

que fica na fase fluida e Bb, que se mantm aderido a C3b, formando o

complexo C3bBb a C3 convertase da via alternativa. Essa convertase atua

Introduo


11

clivando mais molculas de C3, induzindo a amplificao da ativao da

cascata. O complexo C3bBb regulado positivamente pela ao da

properdina (fator P) que se liga superfcie ativadora e estabiliza a

convertase (Abbas et al, 2000; Frank, 2000; Winkelstein et al, 2003;

Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005) (Figura 2).

Figura 2 - Representao esquemtica da via alternativa de ativao do

complemento.

C3

C3

H O2

C3(HO)2B

D

C3(HO) Bb2

C3(HO) B2

Ba

C3a

C3bBb

C3a

C3bBb3b

Via alternativa


Em superfcies no ativadoras do complemento, como por exemplo,

as clulas humanas, os resduos de cido silico na poro de carboidratos

das glicoprotenas permitem que o C3b aderido membrana seja

rapidamente ligado ao fator H e, subsequentemente, quebrado pelo fator I. O

fator H tambm pode dissociar o complexo C3bBb formado na membrana

Introduo


12

celular ou na fase fluida (Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005). O CR1

e DAF competem com o fator B pelo stio de ligao de C3b e podem

dissoci-lo do complexo C3bBb. O fator I, junto com CR1 e MCP, cliva C3b

em iC3b (forma inativa) impedindo a formao de nova convertase

(Winkelstein et al, 2003; Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005).

A via citoltica ou cascata terminal comum do sistema complemento

inicia-se com a ligao do C3b a C3 convertase, formando um complexo

trimolecular C4b2aC3b ou C3bBbC3b, que atua como C5 convertase, com

seu stio ltico nas molculas de C2a e Bb, respectivamente. A convertase

quebra C5 em dois fragmentos: C5a, que atua em receptores especficos e

promove resposta inflamatria local e C5b, que inicia a formao do

complexo C5b-9 terminal (MAC). C5b sofre alterao conformacional e liga-

se a C6, formando um complexo que se liga a C7. H exposio de stios de

ligao na membrana e a incorporao do complexo C5b67. Posteriormente,

ocorre a ligao de C8, formando um complexo que j possui atividade ltica.

O complexo C5b-8 atua como polimerizador de C9, que por sua vez, comea

a aderir-se ao complexo e a formar poros na membrana, resultando em lise

celular (Winkelstein et al, 2003; Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005)

(Figura 3).

Introduo


13

Figura 3 - Representao esquemtica da cascata terminal do sistema

complemento.

C4b2a3bC3bBb3b

C5b

C5aC5

C5bC6

C7

C5bC6

C7C8

Complexo de ataque membrana

C5b

C5b

C6

C7


Caso o complexo C5b-9 permanea na fase fluida, a protena S liga-

se a ele, impedindo sua insero na membrana e inibindo a formao do

MAC. A protena de membrana CD59 liga-se ao complexo C5b-8 e inibe a

polimerizao de C9 (Prodinger et al, 2003).

O sistema complemento possui funes importantes na imunidade

inata contra agentes infecciosos e na resposta inflamatria, incluindo:

atividade quimiottica, clareamento de imunocomplexos, ativao da

resposta imune humoral, opsonizao, fagocitose e atividade citotxica e

ltica (Figueroa et al, 1991; Frank, 2000; Prodinger et al, 2003; Janeway et al,

2005) (Tabela 3).

Introduo


14

Tabela 3 - Principais funes biolgicas do sistema complemento.

Funo Protenas responsveis

Proteo contra infeco

Opsonizao C3 e C4.

Quimiotaxia e ativao de leuccitos Anafilatoxinas (C5a, C3a e C4a); receptoresde anafilatoxinas em leuccitos.

Lise de bactrias e clulas MAC

Interface entre imunidade inata e adaptativa

Aumento da resposta humoral C3b e C4b; receptores de C3 nas clulas B enas APC.

Intensificao da memria imunolgica C3b e C4b; receptores de C3 nas CFD.

Depurao

Depurao de imunecomplexos dos tecidos C1q

Depurao de clulas apoptticas C1q

APC clulas apresentadores de antgenos.

CFD clulas foliculares dendrticas.


2b. Lectina Ligadora de Manose MBL:

A lectina de ligao manose, anteriormente conhecida como

protena de ligao manose (MBP), pertence a uma famlia de protenas

chamadas de colectinas. Esta protena caracterizada pela presena de trs

subunidades de cadeias polipeptdicas, de 32 kD, covalentemente ligadas

por pontes de dissulfeto (domnio NH2 terminal, rico em cistena), uma

seqncia de segmento semelhante ao colgeno e um domnio carbxi-

terminal (CRD, ligante de clcio - domnio lectina) em cada subunidade. Esta

ltima poro confere molcula a capacidade de reconhece resduos de

carboidratos com especificidade primria para manose, fucose ou N-

acetilglucosamina (Holmskov et al, 1994; Summerfield et al, 1995; Prodinger

Introduo


15

et al, 1998; Ghiran et al, 2000; Kilpatrick, 2003; Jack et al, 2003), no se

ligando significativamente a D-galactose (Jack et al, 2001).

No homem, so reconhecidas trs protenas da famlia das colectinas:

a MBL, que se apresenta sob as formas srica e heptica, produtos do

mesmo gene, e as protenas surfactantes pulmonares A e D. Todas so

protenas solveis (Jack et al, 2001; Kilpatrick, 2002). Descreve-se,

atualmente, que as ficolinas (H e L), protenas com domnio de

reconhecimento semelhante ao fibrinognio, tambm se associam as

MASPs e a Map19 e podem ativar a via das lectinas pelo reconhecimento de

estruturas de carboidratos especficos. Esta observao indica que a MBL

no o nico componente da famlia das lectinas que ativa o sistema

complemento (Schwaeble et al, 2002). Recentemente, foram descritas mais

duas formas de colectinas humanas: 1) a colectina heptica-1 (CL-L1) e 2) a

colectina placentria-1 (CL-P1) (Ohtani et al, 1999; Ohtani et al, 2001).

O conceito de via das lectinas na ativao do sistema complemento

relativamente recente e decorrente da observao de que resduos de

carboidratos em microorganismos invasores podiam ativar complemento na

ausncia de anticorpo e por um mecanismo independente da via alternativa.

A via das lectinas composta pela MBL e pelas MASP-1, -2, -3 e a Map-19,

porm, apenas MASP-1 e -2 apresentam funes definidas. A MBL circula

no sangue em um complexo na forma zimognio da serinoprotease MASP

apresentando a mesma estrutura modular de C1r:C1s (Petersen et al,

2001a; Schwable et al, 2002; Prodinger et al, 2003; Janeway et al, 2005).

Os resduos de ligao para a MBL na superfcie do microorganismo

esto arranjados em padres, com ordem repetitiva. Acredita-se que seja

Introduo


16

esta conformao que resulte em alvo apropriado para a ligao da protena.

Os padres, dos trs stios de ligao ao acar de cada subunidade

oferecem uma plataforma lisa, com distncias constantes entre os stios

(45) (Jack et al, 2001). Esses stios constantes e simultneos so

essenciais devido constante de dissociao (kD) de cada interao

separada MBL-acar ser relativamente baixa (10-3M). Todos estes padres

facilitam a interao da MBL com a superfcie de microorganismos e

minimiza as chances de ligao com as clulas do hospedeiro, onde so

limitados nas glicoprotenas e no esto arranjados de forma repetitiva, com

distncia de 20-30 entre si. Alm disso, a maioria das estruturas de

carboidratos nas clulas animais termina com galactose ou cido silico, no

reconhecidos pelas colectinas (Jack et al, 2001; Gadjeva et al, 2001; Botos

et al, 2005).

Aps a ligao aos resduos de acares, o complexo MBL-MASP

sofre alterao conformacional e h uma auto-ativao de uma nica cadeia

do zimognio MASP para uma serinoprotease ativa de cadeia dupla. O stio

enzimaticamente ativo na cadeia B da serinoprotease classicamente

descrito como componente cataltico triplo. Composto por serina, histidina e

resduo de cido asprtico, que esto separados na estrutura primria, mas

aproximam-se na estrutura quaternria. Seqencialmente, h clivagem de

C4 e, posteriormente, de C2, formando-se a C3 convertase (C4b2a) tal como

na via clssica (Prodinger et al, 2003).

O complexo MBL-MASP-2 suficiente para ativar o complemento,

sem necessidade de outra serino protease, demonstrando assim, que a

MASP-2 o componente efetor da via das lectinas. O complexo MBL-MASP-

Introduo


17

1 responsvel pela ativao direta de C3, funcionando como C3

convertase e determinando uma via alternativa via das lectinas, embora

alguns autores considerem este assunto controverso (Hajela et al, 2002;

Schwaeble et al, 2002). MASP-1 cliva C2 e parece ser capaz de clivar C3

diretamente, enquanto que MASP-2 cliva C4 e C2. As atividades

proteolticas de MASP-1 e MASP-2 so inibidas pelo C1-INH, ambas

podendo ligar-se de maneira covalente ao complexo MBL/MASP-2 ativado

(Thiel et al, 1992; Reid, 1998; Wallis et al, 2002; Guardia et al, 2003;

Prodinger, et al, 2003; Janeway et al, 2005) (Figura 4).

Introduo


18

Figura 4 - Representao esquemtica da via das lectinas de ativao do

complemento.

MBL

MASP-2MASP-1

Carboidrato

C2

C2b

C4

C2a C4b2a

C4a

C3C3a

C4b2a3b

Via das lectinas


Por microscopia eletrnica, a MBL apresenta uma aparncia de

buqu de tulipas, semelhante a C1q. A regio de colgeno dos trs

polipeptdeos forma uma tripla-hlice, formando uma subunidade trimrica

de cerca de 90 kD. No soro, um complexo de massa molecular grande

(cerca de 200-700 kD) de MBL circulante evidenciado e, provavlemente,

estabilizado atravs das regies NH2 terminal, ricas em cistena, das

subunidades trimricas adjacentes. Este complexo forma unidades de

Introduo


19

dmeros a hexmeros, mas a sua atividade funcional completa requer a

presena das estruturas maiores (Turner, 1996; Saiffudin et al, 2000; Ghiran

et al, 2000; Jack et al, 2001) (Figura 5).

Figura 5 - Representao da estrutura polipepitdica da cadeia de MBL.

Modificado de Petersen et al, 2001a.

A MBL secretada pelo fgado, mas moncitos/macrfagos, assim

como outros leuccitos, tambm parecem sintetizar a protena (Ogden et al,

2001; Kilpatrick, 2003). Seu nvel srico geneticamente determinado,

variando de 1 a 2 mg/mL e apresenta elevao de at trs vezes na fase

aguda do processo inflamatrio (Ezekowitz, et al, 1988; Prodinger, et al,

1998; Saiffudin, et al, 2000). Um estudo com anlises sucessivas de

amostras sangneas de crianas, no dia do nascimento, com 1 e 5 meses e

com 1 e 2 anos de idade, demonstrou que a concentrao srica de MBL

aumenta aps o nascimento, tornando-se mxima aps 1 ms de vida

(Aittoniemi, et al, 1996). Os autores sugerem que a rpida elevao dos

nveis sricos de MBL seja devido ao estresse do nascimento e adaptao

Introduo


20

no perodo neonatal. A concentrao de MBL no sangue de cordo umbilical

muito semelhante encontrada no adulto e no h aumento (ou se h,

este muito pequeno) dos nveis de MBL durante o primeiro trimestre

(perodo mais crtico) de gestao (Kilpatrick et al 1997; Kilpatrick, 2000).

A principal funo biolgica da MBL a opsonizao, pois suas

estruturas de colgeno so ligantes para receptores de colectinas presentes

nos fagcitos, ou seja, atua diretamente como opsonina (Holmskov, et al,

1994; Summerfield, et al., 1995; Turner, 1996). Sua regio N-terminal

interage com receptores partilhados com C1q na superfcie de fagcitos:

cC1qR/calreticulina, uma protena multifuncional localizada no retculo

endoplasmtico e na superfcie de vrias clulas; gC1qR, uma protena

mitocondrial e C1qRp, expresso na superfcie das clulas mielides

(macrfagos, moncitos e neutrfilos), clulas endoteliais, plaquetas e

clulas pluripotentes que repopulam a medula ssea (Gadjeva et al, 2001;

Holmskov et al, 2003). CR1/CD35 tambm foi descrito como receptor para

todas as opsoninas primrias do complemento: MBL, C1q solvel, C4b e

C3b (Ghiran et al, 2000; Holmskov et al, 2003; Guardia et al, 2003). O CD91

est associado com a captao de clulas apoptticas pelos macrfagos,

mediada pela MBL (Ogden et al, 2001; Guardia et al, 2003).

A MBL parece ser um dos componentes mais versteis do sistema

imune inato, sendo funcionalmente anloga IgM pois liga-se a vrios

substratos atravs de mltiplos CRD. Esta ligao fraca, entretanto a

interao de vrios CRD resulta em maior avidez. Tambm pode ser

comparada IgG e IGA, por atuar diretamente como opsonina, interagindo

com um ou mais receptores de colectina. E tambm, assemelha-se C1q,

Introduo


21

interagindo com outras serinoproteases (MASP) para a ativao do sistema

complemento (Turner, 1996).

So descritos dois genes correlacionados MBL, o mbl-1, um pseudo

gene e o mbl-2, localizado no brao q11.2-q21 do cromossomo 10, que

codifica a protena. O gene composto por quatro exons: a) o exon 1

codifica a regio 5 no-transcrita, um peptdio sinal, um seguimento N-

terminal rico em cistena e a primeira poro da regio semelhante ao

colgeno rica em glicina; b) o exon 2 codifica o restante da regio

semelhante ao colgeno; c) o exon 3 codifica uma estrutura em espiral a

helicoidal, que conhecida como a regio de pescoo e d) o exon 4

codifica o domnio de reconhecimento de carboidrato, que adota uma

configurao globular, e a regio 3 no-transcrita (Guardia et al, 2003)

(Figura 6).

Introduo


22

Figura 6 - Representao do gene mbl-2 e das mutaes do exon 1.

Modificado de Guardia et al, 2003 e Petersen et al, 2001a.

5`UT L N-Term 1C 2 C

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4DNA 5` 256bp

GINGFPGKDGRDGTKGEKGEPGQGLR

Variante C

Variante B

Variante D

Gly 34 Asp

Arg 32 Cys

Gly 37 Glu

Variante A: tipo selvagem

Introduo


23

As mutaes gnicas evidenciadas so resultantes de trs

substituies nucleotdicas, independentes, no exon 1: no cdon 54,

decorrente da troca da glicina pelo cido asprtico (alelo B); no cdon 57,

decorrente da troca da glicina pelo cido glutmico (alelo C) e no cdon 52,

decorrente da troca da arginina pela cistena (alelo D). O alelo normal para a

MBL o A e a designao usual para os alelos variantes O (Turner, 1996;

Garred, et al, 1997; Saiffudin, et al, 2000; Petersen, et al, 2001a). Estudos

sugerem que todas as trs variantes impedem a habilidade da MBL em

formar cadeias polipeptdicas com estrutura de tripla-hlice semelhante ao

colgeno nas formas homo ou heterozigotas, ou ainda, tornam as

subunidades mais vulnerveis degradao (Butter at al, 2002; Petersen, et

al, 2001a; Reid, 1998; Garred, et al, 1997) Consequentemente, os alelos B,

C e D resultam em deficincia completa ou em nveis sricos baixos da

protena.

A expresso gncia da MBL diferente nas diversas populaes

mundialmente estudadas. A variante B mais freqente entre caucasianos

europeus (29%) e em populaes japonesas (37%); a variante C

caracterstica das populaes africanas do sub-Sahara, com freqncia de

50 a 60% e a mutao D alcana freqncias baixas em todas as

populaes (Sumiya et al, 1991; Lipscombe et al, 1992; Sasaki et al, 2000)

(Tabela 4).

Tabela 4 - Freqncias allicas do gene mbl2 em diferentes populaes.

Populao N HYPA LYQA LYPA LXPA HYPD LYPB LYPD LYQC

Dinamarca a 250 0.31 0.19 0.04 0.26 0.06 0.11 - 0.03

Introduo


24

Dinamarca b 100 0.285 0.235 0.045 0.195 0.085 0.135 - 0.002

Inglaterra c 54 0.245 ? ? 0.31 0.07 0.085 - 0.01

Inglaterra d 258 0.33 ? ? 0.23 ? ? - ?

Euro-BR f 202 0.34 0.18 0.08 0.22 0.06 0.11 0.0025 0.0025

Kenia e 61 0.08 0.25 0.13 0.24 0.04 0.02 - 0.24

Moambique a 154 0.06 0.27 0.3 0.13 0 0 - 0.24

Afro-BR 32 0.13 0.25 0.27 0.11 0.02 0.03 0 0.2

Fonte: a) Madsen et al, 1998; b) Steffensen et al, 2000; c) Crosdale et al, 2000; d)

Mullighan et al, 2000; e) Madsen et al, 1995; f) Boldt et al, 2002.

A concentrao srica da proteina tambm varia devido a

polimorfismos encontrados na regio promotora do gene, responsveis pela

variabilidade dos nveis sricos de MBL na populao geral, mesmo em

indivduos sadios (Garred, et al, 1997). Duas variaes H e L, na posio

550, esto em desequilbrio de ligao com X e Y, variantes da posio

221, e so encontrados em trs hapltipos: HY, LY e LX. O hapltipo HY

associado com altos nveis sricos de MBL; LY com nveis intermedirios e

LX com os nveis sricos mais baixos. Hapltipos de indivduos contendo a

variante X resultam em nveis de MBL similares s variantes B, C e D

(Madsen et al, 1995; Steffensen et al, 2000; Guardia et al, 2003). Os

hapltipos descritos so HYPA, LYPA, LYQA, LXPA, LYPB, LYQC e HYPD.

Foram relatados, ainda, outros dois hapltipos: HXPA, encontrado em trs

pacientes americanos, negros, com diagnstico de Lupus Eritematoso

Sistmico e LYPD, recentemente encontrado em um indivduo brasileiro

(Sullivan et al, 1996; Boldt et al, 2002; Steffensen et al, 2003).

As formas allicas distintas so efetivamente diferentes na ativao

do sistema complemento. Acredita-se que essas diferenas, qualitativas e

quantitativas, influenciem na predisposio infeco (Prodinger, et al,

Introduo


25

1998) e impeam a protena de ativar o sistema complemento (Summerfield,

et al, 1995).

At o presente momento no h consenso clnico do ponto de corte

para o valor de referncia da protena. Como guia usa-se: nvel srico alto,

acima de 1000 ng/mL; mdio, entre 500 e 1000 ng/mL; baixo, porm

suficiente, entre 200 e 500 ng/mL e nvel srico muito baixo e provavelmente

insuficiente, abaixo de 200 ng/mL (Guardia et al, 2003).

Introduo


26

2c. Deficincia de MBL e suas Repercusses Clnicas:

A deficincia de MBL foi reconhecida, inicialmente, em 1968, por

Miller e col., que descreveram uma criana de 3 meses de idade, do sexo

feminino, com quadro de eczema refratrio, falncia de crescimento e

episdios intermitentes de diarria. A criana apresentava histria familiar de

eczema atpico grave, em parentes paternos e um primo materno com

quadro de dermatite similar ao seu. Aps avaliao laboratorial, demonstrou-

se deficincia na capacidade fagoctica, sem alterao nos demais exames

imunolgicos avaliados (CH50). Este caso clnico representou,

provavelmente, o primeiro relato de deficincia de MBL.

Em 1976, Soothill e col. avaliaram 11 crianas e seus famliares, com

quadro de infeces de repetio e detectaram um defeito semelhante na

opsonizao de partculas fngicas, porm, com manifestaes clnicas

diferentes. Em 1989, Super e col. identificaram, pela primeira vez, a

deficincia srica de MBL, usualmente relatada em crianas e tambm

observada em indivduos adultos. A otite mdia, a diarria crnica e a

meningite foram descritas como as infeces mais comuns nesta deficincia,

isolando-se nos pacientes patgenos como S. aureus, N. meningitidis,

Klebisiella, Proteus, Pseudomonas e Candida (Summerfield, et al., 1995;

Aittoniemi, et al., 1997). Estima-se que cerca de 5 a 7% dos indivduos da

populao geral sejam acometidos por deficincia de MBL, o que resultaria

na imunodeficincia primria mais comum (Super, et al, 1989; Jack, et al,

2001).

Introduo


27

Alguns trabalhos evidenciam a inter-relao entre MBL e infeces de

repetio e sugerem que a protena desempenhe uma importante proteo

adicional contra infeco (efeito ante-anticorpo) em crianas durante o

perodo de imaturidade do sistema imune e de suscetibilidade infeco

(Sastry, et al, 1993). Esta observao pode ser confirmada pela

demonstrao de nvel srico de MBL maior na populao peditrica que

nos indivduos adultos (Tabela 5).

Tabela 5 - Associao entre protena ligadora de manose e infeces.

Autores Quadro Clnico Resultados

Miller et al, 1968 eczema, diarria, dermatite grave Fagocitose ausente.

Soothill et al,

1976

infeco freqente sem explicao Fagocitose diminuda em 10crianas.

Summerfield et al,

1995

infeces no usuais e graves Mutao no gene da MBL; nvelsrico baixo.

Ten et al, 1999 pansinusite, infeces recorrentes MBL- diminudo; CH50- normal;Imunoglobulinas - normal

Koch et al, 2001 Infeco aguda de vias areas(IVAS)

maior risco de IVAS nos pacienteshomo e heterozigotos paramutaes no gene.

Cedzynski et al,

2004

Infeces do aparelho respiratriopelo VSR

Maior risco de infeco nospacientes com defeito de respostahumoral e deficincia de MBL.

VRS vrus sinsicial respiratrio.

Vrios estudos demonstram que a lectina apresenta afinidade por

carboidratos presentes em bactrias (Salmonella, E. coli, Staphylococcus,

Streptococcus, micobactrias, etc.), vrus (Influenza A, HIV, etc.), fungos

(Candida) e parasitas (Leishmania major e L. mexicana) (Holmskov, et al,

1994; Polotsky, et al, 1997; Guardia et al, 2003) (Tabela 6).

Introduo


28

Tabela 6 - Caractersticas de ligao da MBL com os micoorganismos.

Ligao eficiente Padro heterogneo deligao

Ligao baixa ou nenhumaligao

Candida albicans,Saccharomyces cerevisiae,

Aspergillus fumigatus,Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes,Salmonella typhimurium,

Salmonella montevideo, N.gonorrhoeae, Bifidobacteriumbifidum, Veillonella dispar e

formas no encapsuladas deListeria monocytogenes,Haemophilus influenzae,

Neisseria cinera e N. subflavi.

E. coli, Klebisiela, H.influenzae tipo b, N.

meningitidis sorogrupo A,Propionibacterium acnes,

Actinomyces israelli,Fusobacteria e Leptotrichia

buccalis.

Streptococcus agalactiae,Streptococcus pneumoniae,Staphylococcus epidermidis,Clostridium sp, Bacterides

sp, Fusobacteria mortiferum,Eubactria, Neisseriae

mucosa, N. meningitidissorogrupo B e Cryptococcus

neoforman.

Modificado de Guardia et al, 2003.

H tambm alguns autores que relatam um papel protetor dos nveis

sricos diminudos de MBL e a infeco por microorganismos intracelulares,

o que poderia ser explicado pela diminuio da ativao do sistema

complemento com consequente diminuio do processo inflamatrio (Sobrog

et al, 2003; El Sahly et al, 2004). Mais recentemente, Dahl e col. (2004)

publicaram um estudo no qual 9245 pacientes foram avaliados quanto ao

nvel srico e a genotipagem de MBL, na tentativa de correlacionar a

deficincia da protena com risco de infeces ou morbidade aumentada por

outras doenas, ou comportamentos sociais associados, e no encontraram

significncia estatstica na correlao entre os indivduos com deficincia de

MBL comparados ao grupo controle.

2d. Interao MBL e o Vrus da Imunodeficincia Humana tipo 1 (HIV-1):

Introduo


29

O HIV-1, agente etiolgico da AIDS, foi inicialmente identificado no

tecido linfide de um paciente masculino, homossexual, de 33 anos de

idade, em 1983 (Barre-Sinoussi et al, 1983). O HIV um RNA vrus,

pertence famlia dos retrovrus e subfamlia dos lentivrus, caracterizado

pela complexidade de seus genomas, pois contm alm de genes comuns

de retrovrus (gag, pol e env), outros seis genes reguladores: vif, vpu, vpr,

tat, rev e nef. O envoltrio externo do vrus composto por duas

glicoprotenas, que se originam de uma protena precursora, a gp160: as

glicoprotenas transmembrana gp41 e de superfcie gp120, responsveis

pela interao com os ligantes (Greene, 1991).

A produo dos componentes do HIV est sob comando dos genes

virais. O gene env responsvel pela codificao das protenas do

envelope, por sua vez as enzimas integrase, protease, transcriptase reversa

e ribonuclease so codificadas pelo gene pol e o gene gag responsvel

pela formao dos componentes do core (Greene, 1993).

A estrutura da gp120 importante para a interao vrus-receptor e

conseqente entrada do vrus na clula. Vrias pontes de dissulfeto

contribuem para a dobradura do envelope. A gp120 uma protena muito

glicosilada. Os n-glicanos nelas interligados so necessrios para a criao,

mas no para a manuteno da conformao bioativa. As alteraes

induzidas por drogas no padro de glicosilao da gp120 podem impedir a

fertilidade do vrus (Greene, 1991; Pavlakis, 1997). O core contm quatro

protenas nucleocapsdeos: p-24, p-17, p-9 e p-7. Em seu interior,

Introduo


30

encontram-se as duas fitas de RNA e enzimas virais importantes para a sua

replicao: transcriptase reversa, integrase e protease (Greene, 1991).

O papel do sistema complemento na infeco pelo HIV tem sido

intensamente avaliado. Em 1987, Perricone e col. verificaram, pela primeira

vez, a ativao reduzida das vias clssica e alternativa em pacientes HIV

soropositivos. Slder e col. (1989) observaram que esta ativao poderia

ocorrer sem a participao do anticorpo. Foi estabelecido que as protenas

do complemento e os anticorpos competem pelo mesmo stio de ligao na

gp120 (Prohszka et al, 1997a). E tambm, observou-se que as protenas

DAF e fator H relacionvam-se com a resistncia do HIV lise mediada pelo

complemento (Stoiber et al, 1996). Posteriormente, foi evidenciado que a

ligao de C1q poro globular do seu receptor bloqueia a interao entre

CD4 e gp120 (Szab et al, 2001).

As possveis conseqncias da ativao do complemento pelo HIV

poderiam evoluir para dois sentidos distintos: 1) aumento da infeco devido

maior ligao de vrions s clulas alvo, atravs de receptores do

complemento ou 2) eliminao do vrus devido sua lise ou lise das

clulas infectadas, ou ainda, neutralizao do vrus por clulas fagocitrias

(Haurum et al, 1993; Speth et al, 1997; Stoiber et al, 2003).

Com relao via das lectinas, em 1989, Ezekowitz e col.

demonstraram a inibio in vitro de clulas T CD4+ pelo vrus. Pouco tempo

depois, foi relatado que a ativao do sistema complemento ocorreria aps a

ligao da MBL gp120 (Haurum et al, 1993).

Introduo


31

Figura 7- Representao do HIV, e as glicoprotenas de superfcie, e sua

interao com a MBL.

HIV

10 nm

CRD

MBL (tetrmero)

Regio de pescoo

Domnio semelhante ao colgeno

gp120

Domnio rico em cistena

Glicanos ricos em manose

Modificado de Ji X et al, 2005.

Em 1995, um estudo clnico com 80 pacientes HIV-soropositivos

evidenciou que a distribuio do nvel srico de MBL nestes indivduos era

semelhante de pessoas saudveis, sem influencia no risco de infeco

pelo HIV. Porm, o maior nmero de pacientes com nvel srico indetectvel

estava presente entre os indivduos infectados. No se comprovou a

associao entre o nvel de MBL e o declnio de clulas T CD4+; o tempo de

demora da soro-converso ou com a durao da doena at a morte

(Nielsen et al, 1995). Senaldi e col. (1995), descreveram que os nveis

sricos de MBL esto elevados em todos os estgios da infeco pelo HIV e

so estatisticamente semelhantes aos da populao normal, corroborando

Introduo


32

os dados de Nielsen. Estes autores tambm no associaram a deficincia de

MBL ao desenvolvimento ou progresso da infeco pelo HIV (Nielsen et

al, 1995; Senaldi et al, 1995).

Em 1997, Garred e col. descreveram pacientes, HIV-soropositivos,

nos quais a presena das mutaes do exon 1 do gene mbl2 (homo e

heterozigose) estavam associadas a maior morbi-mortalidade dos pacientes,

devido a suscetibilidade aumentada de infeces durante o curso da doena.

Por outro lado, as concentraes sricas aumentadas de MBL poderiam ser

decorrentes do grande nmero de infeces oportunistas.

Prohszka e col. (1997a) encontraram nveis sricos de MBL

significativamente mais baixos nos indivduos HIV-soropositivos que no

grupo controle HIV-soronegativos e concluem que a MBL pode afetar a

progresso da AIDS de duas formas: 1) a MBL pode se ligar a gp120 no

envelope dos vrions, resultando em ativao da via das lectinas, e os

fragmentos das protenas ativadas do complemento poderiam se ligar aos

vrions e aumentar a sua infectividade e 2) a ativao das vias das lectinas

poderia ocorrer atravs da gp120 livre, adsorvida clula T CD4+, o que

poderia facilitar a destruio destas clulas e, conseqentemente, a

progresso da AIDS (Prohszka et al, 1997b).

Ao contrrio destes relatos, Maas e col. (1998) evidenciaram um

efeito protetor, embora fraco, da variante do exon 1 nos pacientes HIV-

soropositivos sem doena. Malik e col. (2003) avaliaram pacientes HIV

positivos (n=138) e HIV negativos (n=40) e no observaram diferena

estatstica na freqncia de alelos homo ou heterozigotos da MBL entre os

dois grupos. Em um estudo previamente realizado em nosso laboratrio,

Introduo


33

foram avaliados 107 pacientes HIV positivos, evidenciando-se que 20,6%

apresentavam dosagem de MBL acima do limite superior (> 7,5 mg/mLl) e

elevao dos nveis sricos de MBL nos estgios mais avanados da

doena, porm sem significado estatstico (Lian et al, 2004). Alves e col.

(2004) relataram maiores valores de carga viral nos pacientes soropositivos

que apresentavam a variante allica B, sugerindo que os baixos nveis

sricos de MBL nestes pacientes poderiam levar a uma eliminao ineficaz

do vrus na circulao e, conseqentemente, ao aumento da carga viral

plasmtica. Todos estes relatos demonstram o quo controverso este

assunto tem se mostrado.

2e. MBL e a Transmisso Materno-Fetal do HIV:

Considerando-se a importncia da MBL na resposta imune inata, sua

capacidade de ligao com a gp120 e a dificuldade no estabelecimento dos

diversos fatores relacionados com a transmisso materno-fetal do HIV,

suspeitou-se da influncia desta protena nesta situao.

H poucos estudos desenvolvidos, tentando correlacionar o gene da

MBL e o risco de transmisso materno-fetal do HIV e, ainda, a evoluo para

AIDS. Em 1999, Amoroso e col. avaliaram a presena do alelo B em

crianas HIV-soropositivas infectadas por transmisso materno-fetal e em

crianas expostas ao risco, porm no infectadas. No houve diferena

significativa na freqncia de distribuio deste entre os grupos porm, nas

crianas infectadas notou-se um risco maior (3.68) para progresso rpida

da doena quando a mutao estava presente.

Introduo


34

Boniotto e col. (2000) avaliaram a presena de mutaes ou

polimorfismos da protena em trs grupos de pacientes infectados pelo HIV:

1) filhos de mes HIV positivas infectados pelo vrus, 2) filhos de mes HIV

positivas sem infeco viral e 3) pacientes saudveis, sugerindo que a

influncia da MBL na transmisso materno-fetal do vrus e a progresso para

AIDS poderiam ser decorrentes de mutaes da regio codificadora do gene

mbl2, que alterariam a estrutura da protena, ou a regio promotora, por

regular a concentrao srica da MBL.

Posteriormente, em 2003, Boniotto e col. ainda avaliaram filhos de

mes HIV-soropositivas, com e sem infeco, evidenciando maior freqncia

do alelo O nas crianas infectadas e que a sua presena determinava um

risco de 1.37 para a infeco pelo HIV.

Apenas no trabalho mais recente (Arraes et al, 2004) foi feita uma

correlao entre os dados maternos e do lactente ao gentipo da MBL, onde

se encontrou uma freqncia maior de alelos O nas mes transmissoras.

Porm, as mes acompanhadas neste estudo no receberam tratamento

durante a gestao e os seus filhos tambm no receberam AZT ao

nascimento e durante as seis primeiras semanas de vida. Os autores

sugerem que a transmisso materno-fetal do vrus depende somente do

gentipo de mlb2 da me e da criana.

Intro Duca o

Documents

Transcript of Intro Duca o