Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune Dott. Fortunato FerraraTutore e...
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Interattori molecolari nel controllo Interattori molecolari nel controllo delladella
tolleranza immunetolleranza immune
Dott. Fortunato Ferrara Tutore e Relatore:Dott. Alberto Tommasini
L’omeostasi del sistema immunitarioL’omeostasi del sistema immunitario
Protezione dai Protezione dai microrganismimicrorganismi
Tolleranza verso Tolleranza verso il SELFil SELF
CD4+ CD25+CD4+ CD25+
Cellule T regolatorieCellule T regolatorie
Tolleranza perifericaTolleranza periferica- Svolta principalmente dalle cellule T regolatorie.- Controllano e sopprimono la reattività contro il selfdi linfociti T “sfuggiti” alla selezione timica.
Tolleranza centrale:Tolleranza centrale:Selezione positiva- Corteccia timica. - Timociti immaturi.- Riconoscimento della molecola MHC esposta dalle cellule dell’epitelio timico.- Il non riconoscimento porta alla delezione.Selezione negativa- Zona interna (midollare) del timo.- È controllata da cellule presentanti l’antigene (APC). - Timociti con alta affinità per gli antigeni self presentati dalle APC vengono eliminati.
Ruolo delle CD4Ruolo delle CD4++ Treg nelle situazioni di “normalità” Treg nelle situazioni di “normalità”o patologicheo patologiche
CD4+CD25+
Treg
Self Foreign Patogeni Tumori
Trapianti
Protezione dallosviluppo di patologie
autoimmuni Controllo dei processi immunitari
Teff
-
Cellule Teff autoreattive “sfuggite” alla selezione timica
Cellule Teff contro i non-self
Dalla clinica alla ricerca di baseDalla clinica alla ricerca di base
Il caso di Lorenzo…
-Risposta solo parziale a nutrizione parenterale totale (non allergia!)-Nei mesi successivi si verificano diversi episodi di polmonite interstiziale, di eziologia incerta, accompagnati da peggioramenti dell'eczema e della diarrea, -Biopsia intestinale: enteropatia autoimmune. -Nel 2° anno anemia emolitica, alopecia e DMT1
Presente nei primi Presente nei primi anni di vita:anni di vita:
- IDDMIDDM- Severa enteropatiaSevera enteropatia- Disordine epidermiciDisordine epidermici- Fenomeni autoimmuniFenomeni autoimmuni varivari
Autoanticorpi contro:Autoanticorpi contro:
TiroideTiroideReneReneIsole pancreaticheIsole pancreaticheIntestino tenueIntestino tenue
Piastrine ed altroPiastrine ed altro
Disregolazione immunologicaDisregolazione immunologicaPoliendocrinopatiaPoliendocrinopatiaEnteropatiaEnteropatiaTrasmissione X-linked recessivaTrasmissione X-linked recessiva
IIPPEEXX
Mancato funzionamento cellule Treg
FoxP3 nelle cellule TregFoxP3 nelle cellule Treg• Foxp3Foxp3 è un è un fattore trascrizionalefattore trascrizionale – – FKHFKH family – specifico per le cellule T family – specifico per le cellule Tregreg
• E’ il E’ il master regulatormaster regulator per lo sviluppo e la funzione delle cellule€ Tper lo sviluppo e la funzione delle cellule€ Tregreg
• Le Le mutazionimutazioni del gene Foxp3 portano alla comparsa dell’IPEX del gene Foxp3 portano alla comparsa dell’IPEX
Come fattore trascrizionale:Come fattore trascrizionale:Regolatore/soppressore della produzione di Regolatore/soppressore della produzione di citochinecitochine
NFAT NFAT ee NF-kappaB NF-kappaB
Blocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzioneBlocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzionedi citochine ed altri fattori essenziali all’attivazionedi citochine ed altri fattori essenziali all’attivazione
Ο = missense point mutations = deletion/frameshift mutations = splicing mutations
Induzione alla trascrizione di alcuni geni
Soppressione della trascrizione di altri geni
Il ruolo “Il ruolo “a vallea valle” di FOXP3” di FOXP3
NFAT
…“…“a montea monte” ” di FOXP3di FOXP3
Foxp3
?
Identificazione delle proteine che interagiscono con FOXP3, permettendo la localizzazionee funzione
Patologie – IPEX like
Interessante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazioneInteressante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazionedi FOXP3di FOXP3
Analisi degli interattoriAnalisi degli interattori
Obbiettivi:Obbiettivi:
1- Produzione di Foxp3 come proteina ricombinante
2- Valutazione di diverse metodiche biomolecolari per isolamento di potenziali nuovi interattori
PBL cellsPBL cells
mRNAmRNAcDNAcDNA
PCR PCR amplificationamplification
N-termN-term
Zn-fingZn-fing
FKHFKH
FOXP3 + MalFOXP3 + MalCirca 90KDaCirca 90KDa
1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante
ProduzioneProduzione
RiconoscimentoRiconoscimentoproteina con proteina con Ab-specificoAb-specifico
PurificazionePurificazione
Foxp3Foxp3
2.1 - Co-precipitazione2.1 - Co-precipitazione
Foxp3MBP
AmilosioAmilosio
AmilosioAmilosio
MBP
MW
90 Kda
85 Kda
75 KDa
45 KDa
Foxp3MBP
MBP
MW
45 Kda
25 Kda
15 KDa
2.2 Immuno-precipitazione2.2 Immuno-precipitazione
Foxp3
MBP
Y
Y Y
Proteina GProteina GF
oxp3
MB
P
YY
Y
Phage display antibody librariesPhage display antibody libraries
mRNA
cDNA
PCR
assembly
PCR
Helper phageLymphocytesV
H
CH
1C
H2
CH
3
VL
CL
linker
scFv cloning
Amp
Gene IIIscFv
Phagemidvector Ori
Transformation
E. coli
gene III
scFv
VVLL
VVHH
VVLL
VVHH
VVLL
VVHH
ELISAELISA
WBWB
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
kE7 kE12 kF5 λG3 λG6Foxp3
CH3CH3
CH2CH2
SV5SV5
Minibody
ImmunoprecipitazioneImmunoprecipitazione
Foxp3
MBP
Y
Y Y
Foxp3
MBP Y
Y Y
Verifica della metodica Per interattori noti (NFAT/NfkB)
Amp
Gene IIIscFv
Vettore pPAOfagmidico Ori
cDNA frammentazioneCellule o tessuti
displaydisplay di peptidi casualidi peptidi casuali
2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg
FP3
Isolamento cloni più reattivi
sequenziamento
Analisi sequenze:- 25 cloni selezionati- 24 riconfermano uno stesso peptide- 1 peptide diverso
Zn FKHPRR FOXP3
PRRZn
FKH
Analisi dell’interazione con i domini
0
200
400
600
800
1000
1200
sequenza 1 sequenza 2
FP3 intero
N-term
Zinc
FKH
-Il clone di “tipo 1” è specifico per l’interazione con il dominio Zinc-finger-Il clone di “tipo 2” riconosce la proteina intera ma non uno dei singoli domini: eventuale effetto di mancata conformazione dei domini ricombinanti
BLAST:Sequences producing significant alignments: Score E valuesolute carrier family 25, member 23 [Homo sapiens] 176 4e-43putative calcium binding transporter [Homo sapiens] 175 7e-43
La maggioranza dei cloni (24/25) codificano per una peptide di 100a.a.
Q96NQ4_HUMAN_Q96NQ4EfhandNo descriptionEF_HAND_2EF_HAND_1
No description
CalmodulinCalcineurin
INTER PRO SCAN
signaling proteins
These proteins typically undergo a calcium - dependent conformational change which opens a target binding site.
BLAST:Sequences producing significant alignments: Score E value
matrix metalloproteinase-3 224 2e-57
INTER PRO SCAN
MATRIXINPeptidase_M10
No description
No descriptionMATRIXMETALLOPROTEINASESTROMELYSIN
Il restante clone:
They are zinc- dependent, calcium-activated proteases
interattore
FP3
YY
AP
Clone selezionato (dominio EFH) prodotto in forma ricombinante
Analisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina BAnalisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina B
a – calcineurina Ba – calcineurina Bb – NFATb – NFATc – Foxp3c – Foxp3
interattore
FP3
YY
AP
Calc B
FP3
YY
AP
EFH calcB
FP3
YY
AP
C’è la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel C’è la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel network di attivazione di FOXP3, ma solo “motivi strutturali” coinvolti.network di attivazione di FOXP3, ma solo “motivi strutturali” coinvolti.
RisultatiRisultati-Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3.efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3.
-Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di ulteriori interattori molecolari di Foxp3.ulteriori interattori molecolari di Foxp3.
-Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini proteici interagenti con Foxp3.proteici interagenti con Foxp3.
-Verificata l’interazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH).Verificata l’interazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH).
……sviluppi futuri e futuribilisviluppi futuri e futuribili
-Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina “fisiologicamente Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina “fisiologicamente significativa”.significativa”.
-Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, -Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti tumorali o sedi di infiammazioni croniche).tumorali o sedi di infiammazioni croniche).
-Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere -Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.