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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION COMPONENTES SOLUBLES DE LA RESPUESTA INMUNOLOGICA EN MEDULA OSEA Y SUERO DE PACIENTES CON HEPATITIS C CRONICA T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS P R E S E N T A : M.C. EDGAR CERVANTES TRUJANO DIRECTOR DE TESIS: DRA. MARIA EUGENIA CASTRO MUSSOT INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL México, DF 2008
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ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
COMPONENTES SOLUBLES DE LA RESPUESTA INMUNOLOGICA
EN MEDULA OSEA Y SUERO DE PACIENTES CON HEPATITIS C CRONICA
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
QUIMICOBIOLOGICAS
P R E S E N T A :
M.C. EDGAR CERVANTES TRUJANO
DIRECTOR DE TESIS:
DRA. MARIA EUGENIA CASTRO MUSSOT
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
MEXXXX México, DF 2008
A G R A D E C I M I E N T O S
En verdad que ninguna disciplina al
presente parece ser causa de gozo, sino
de tristeza; pero después da fruto
apacible de justicia a los que en ella han
sido ejercitados
A DIOS
Quien en todo momento ha sido y será mi roca fuerte.
A MI MADRE
Profesora Silvia Trujano Moncada, quien me dio la vida y me inculco hacia el
camino del estudio y superación diaria, recibe este presente como un homenaje a
tu amor y dedicación.
A MI ESPOSA
Dra. Beatriz Verónica Álvarez Arana por haber llenado de amor mi vida, por la
comprensión y todo el apoyo brindado para la realización de este documento.
A MI HIJO
Andrés Edgar Cervantes Álvarez por haberme dado el privilegio de ser padre y
por ceder el tiempo que te corresponde para poder escribir esta tesis
A MI TIA
Enfermera Herlinda Trujano Moncada por recibirme en su hogar y compartir
conmigo la sal y la mesa durante los años de estudio de maestría
A MIS HERMANAS
c M. en C. Ruth Cervantes Trujano y D. en C. Margarita Cervantes Trujano por
su amor y cariño siempre recibido.
A MI PEQUEÑA PRINCESITA
Silvia Ruth Puerto Cervantes quien ha dado un toque mágico a nuestra familia,
que el presente sea un aliciente para tus futuras metas.
A toda la familia Trujano presente, pasada y futura.
A MI DIRECTORA DE TESIS
Dra. María Eugenia Castro Mussot por haberme distinguido con su amistad así
como por su paciencia y dedicación en la dirección de esta tesis.
A MI ALMA MATER
El Departamento de Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
quien me cobijo durante el tiempo de los estudios de maestría
A TODOS MIS AMIGOS
Que han sido participes y cómplices de mi historia, siéndome imposible de
nombrar a todos ellos.
I N D I C E
Resumen ....................................................................................................................... i
Abstrac ......................................................................................................................... ii
Índice de abreviaturas.......................... ..............................................................................iii
Índice de cuadros, tablas y figuras…………………….………………………………....…v
Introducción ................................................................................................................ 1
Epidemiología .............................................................................................................. 2
Transmisión y Factores de Riesgo .............................................................................. 3
Virología ...................................................................................................................... 4
Pruebas Diagnósticas...................................................................................................6
Historia Natural de la Enfermedad ............................................................................. 6
Cuadro Clínico ............................................................................................................ 8
Tratamiento ............................................................................................................... 12
Respuesta Inmune ...................................................................................................... 15
Hipótesis de Trabajo...................................................................................................23
Objetivo General ........................................................................................................ 23
Objetivos Particulares ............................................................................................... 23
Material y Métodos ................................................................................................... 24
Resultados ................................................................................................................. 33
Discusión ................................................................................................................... 47
Conclusiones ............................................................................................................. 64
Bibliografía ............................................................................................................... 65
i
RESUMEN
El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente etiológico de la hepatitis no A no B y
aunque sus principales manifestaciones usualmente están relacionadas al hígado, las
manifestaciones extrahepáticas son relativamente frecuentes por lo que se considera una
enfermedad sistémica y debido a su elevada tasa de persistencia en el huésped
(cronicidad) es causa de una importante morbilidad. Los mecanismos responsables para
la persistencia del VHC y su patogénesis no son del todo entendidos, aunque es muy
probable que las interacciones entre el VHC y el sistema inmune del huésped tengan un
importante papel, por tal motivo en el presente trabajo estudiamos algunas de las
respuestas inmunes en pacientes con hepatopatía crónica secundaria a infección por el
VHC y lo comparamos con pacientes con hepatopatía alcohólica (HA) y con individuos
sanos. Se estudiaron 16 pacientes con hepatopatía crónica e infección por el VHC (grupo
1), 11 pacientes con hepatopatía crónica alcohólica (HA) sin infección por el VHC (grupo
2) y 5 individuos sanos (grupo 3). Los pacientes del grupo 1 y 2 fueron analizados con una
prueba de ELISA de segunda generación en búsqueda del VHC, siendo confirmada su
presencia únicamente en el grupo 1. A todos los participantes se les tomó una muestra de
sangre periférica para obtener el suero y un aspirado de médula ósea para el
sobrenadante del mismo y se determinó en ambas las concentraciones de complejos
inmunes circulantes (CIC), proteína C reactiva (PCR), componentes 3 y 4 del
complemento (C3 y C4) mediante nefelometría e interleucina 6 (IL-6) y anticuerpos
anticardiolipina (CLS) mediante ELISA. Con los resultados obtenidos establecimos la
presencia de estos componentes de la respuesta inmune en el sobrenadante de médula
ósea y mediante una regresión lineal establecimos una correlación directa entre ambos
compartimentos (suero y médula ósea) en la mayoría de las variables. Por otro lado, tanto
el grupo de VHC como el de HA demostraron un alto consumo de los componentes del
complemento, concentraciones elevadas de CIC, PCR e IL-6, así como la presencia de
anticuerpos anticardiolipinas. Nuestros resultados indican una desregulación de la
respuesta inmune secundaria a la presencia del VHC, lo cual puede contribuir a la
cronicidad del mismo, sin embargo más estudios son necesarios para lograr entender
mejor la inmunopatogénesis del VHC.
ii
ABSTRACT
El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente etiológico de la hepatitis no A no B y
aunque sus principales manifestaciones usualmente están relacionadas al hígado, las
manifestaciones extrahepáticas son relativamente frecuentes por lo que se considera una
enfermedad sistémica y debido a su elevada tasa de persistencia en el huésped
(cronicidad) es causa de una importante morbilidad. Los mecanismos responsables para
la persistencia del VHC y su patogénesis no son del todo entendidos, aunque es muy
probable que las interacciones entre el VHC y el sistema inmune del huésped tengan un
importante papel, por tal motivo en el presente trabajo estudiamos algunas de las
respuestas inmunes en pacientes con hepatopatía crónica secundaria a infección por el
VHC y lo comparamos con pacientes con hepatopatía alcohólica (HA) y con individuos
sanos. Se estudiaron 16 pacientes con hepatopatía crónica e infección por el VHC (grupo
1), 11 pacientes con hepatopatía crónica alcohólica (HA) sin infección por el VHC (grupo
2) y 5 individuos sanos (grupo 3). Los pacientes del grupo 1 y 2 fueron analizados con una
prueba de ELISA de segunda generación en búsqueda del VHC, siendo confirmada su
presencia únicamente en el grupo 1. A todos los participantes se les tomó una muestra de
sangre periférica para obtener el suero y un aspirado de médula ósea para el
sobrenadante del mismo y se determinó en ambas las concentraciones de complejos
inmunes circulantes (CIC), proteína C reactiva (PCR), componentes 3 y 4 del
complemento (C3 y C4) mediante nefelometría e interleucina 6 (IL-6) y anticuerpos
anticardiolipina (CLS) mediante ELISA. Con los resultados obtenidos establecimos la
presencia de estos componentes de la respuesta inmune en el sobrenadante de médula
ósea y mediante una regresión lineal establecimos una correlación directa entre ambos
compartimentos (suero y médula ósea) en la mayoría de las variables. Por otro lado, tanto
el grupo de VHC como el de HA demostraron un alto consumo de los componentes del
complemento, concentraciones elevadas de CIC, PCR e IL-6, así como la presencia de
anticuerpos anticardiolipinas. Nuestros resultados indican una desregulación de la
respuesta inmune secundaria a la presencia del VHC, lo cual puede contribuir a la
cronicidad del mismo, sin embargo más estudios son necesarios para lograr entender
mejor la inmunopatogénesis del VHC.
iii
INDICE DE ABREVIATURAS DNA: Acido desoxiribonucleico
RNA: Acido ribonucleico
ALT: Alanino transferasa
aCLP: Anticuerpos anticardiolipina
ANCA: Anticuerpos anticitoplasma de neutrófilo
AMA: Anticuerpos antimitocondriales
AAN: Anticuerpos antinucleares
dsDNA: Anticuerpos contra DNA de doble cadena
LKM: Anticuerpos contra microsomas hepáticos-renales
HLA: Antígeno de histocompatibilidad de leucocitos humanos
NK: Células asesinas naturales
NKT: Células T asesina natural
CIC: Complejos inmunes circulantes
C3: Componente 3 del complemento
C4: Componente 4 del complemento
CM: Crioglobulinemia mixta
ELISA: Ensayo inmunoenzimático
TNFα: Factor de necrosis tumoral alfa
NF kB: Factor nuclear kappa B
Gp130: Glicoproteína 130
HA: Hepatopatia alcohólica
RIBA: Inmunoensayo recombinante
PEG-IFNα2b: Interferon alfa 2b pegilado
INFγ: Interferon gamma
IL-1: Interleucina 1
IL-6: Interleucina 6
LTC: Linfocitos T citotóxicos
LPS: Lipopolisacarido
MO: Médula ósea
iv
OMS: Organización mundial de la salud
PAN: Poliarteritis nodosa
PCR: Proteína C reactiva
NS: Proteína no estructural
SLA: Proteína soluble hepática
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
CR1: Receptor tipo 1 del complemento
RBV: Ribavirina
VHB: Virus de la hepatitis B
VHC: Virus de la hepatitis C
VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana
v
INDICE DE CUADROS, TABLAS Y FIGURAS
Página
Cuadro 1 Infección global por VHC, VHB y VIH....…………………………. 2
Figura 1 Estructura y organización genética del genoma del VHC....… 3
Cuadro 2 Manifestaciones extrahepáticas listadas en relación al posible
mecanismo patogénico…………………………………………… 10
Cuadro 3 Terapias para el VHC en investigación………………………… 13
Tabla 1 Valores obtenidos en muestras de pacientes con hepatitis C
crónica…………………………………………………………….. 33
Tabla 2 Valores obtenidos en muestras de pacientes con hepatopatía
alcohólica……………………………………………………………. 34
Tabla 3 Valores obtenidos en muestras de individuos sanos…………… 34
Figura 2 Gráfica de la media grupal de complejos inmunes circulantes 35
Figura 3 Correlación lineal de los complejos inmunes circulantes.……… 36
Figura 4 Gráfica de la media grupal de la interleucina 6………………… 37
Figura 5 Correlación lineal de la interleucina 6…………………………… 38
Figura 6 Gráfica de la media grupal de anticuerpos contra cardiolipinas 39
Figura 7 Correlación lineal de los anticuerpos contra cardiolipinas…… 40
Figura 8 Gráfica de la media grupal de la proteína C reactiva…………... 41
Figura 9 Correlación lineal de la proteína C reactiva……………………. 42
Figura 10 Gráfica de la media grupal del componente 3 del complemento 43
Figura 11 Correlación lineal del componente 3 del complemento………… 44
Figura 12 Gráfica de la media grupal del componente 4 del complemento 45
Figura 13 Correlación lineal del componente 4 del complemento………… 46
1
INTRODUCCIÓN
La identificación de la hepatitis no A, no B, que representaba el 60% a 90% de las
hepatitis postransfusionales a principios de la década de los 70´s, dio muchos de
los antecedentes para la mayoría de la información conocida el día de hoy acerca
de la historia natural de la hepatitis C [Weiner et al, 1990; Kenny-Walsh, 2001]
El virus de la hepatitis C (VHC) fue identificado por Michael Houghton y
colaboradores de la corporación Chiron y el CDC de Atlanta en 1989 [Choo et al, 1989],
éste fue un hecho sin precedentes, debido a que nunca había sido visualizado,
crecido en medios de cultivo celular o detectado serológicamente; a partir de
entonces y hasta el momento actual el conocimiento de este virus se ha expandido
exponencialmente, dominando la práctica y la literatura de las enfermedades
hepáticas y virológicas como se ha evidenciado en los más de 1700 artículos
publicados tan sólo en el año 2002. Esto se debe a 2 principales circunstancias: la
primera es el desarrollo de pruebas de anticuerpos que identifican la infección por
VHC, y la segunda al desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
lo cual ha permitido la secuenciación viral y genotipificación del virus. El VHC es
uno de los 6 virus (A, B, C, D, E y G) que condicionan la mayoría de los casos de
hepatitis viral en el mundo [Kenny-Walsh, 2001; Rosen y Pawlotsky, 2003]
La infección por VHC frecuentemente resulta en cronicidad y puede progresar a
cirrosis y carcinoma hepatocelular después de muchos años de infección, por lo
que el conocimiento de la inmunopatogénesis de la infección del VHC permitirá
conocer el porqué de la persistencia del VHC así como de la lesión celular del
hígado.
Los datos existentes sugieren que las interacciones del huésped-virus durante la
fase temprana de la infección por VHC son críticos en el subsecuente curso clínico
y que las respuestas de células T específicas del virus juegan un papel clave en
este proceso [Chang, 2003]. El virus de la hepatitis C infecta linfocitos de sangre
periférica además de los hepatocitos, por lo tanto la infección con VHC es mucho
más que una enfermedad hepática [Oliveri et al, 2003]
2
Epidemiología
La infección por el VHC está distribuida en todo el mundo, y es causa del 12% de
las hepatitis virales [Inchauspé y Feinstone, 2003] agudas y crónicas, afecta el 3% de la
población mundial [Chang, 2003; Oliveri et al, 2003], es decir aproximadamente a 170
millones de personas [Chevaliez y Pawlotsky, 2007], lo que representa cerca de la mitad de
los infectados por el virus de la hepatitis B (VHB), pero aproximadamente 7 veces
más que el número de portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
(cuadro 1) [Inchauspé y Feinstone, 2003], por lo que ha sido identificado por la Organización
Mundial del la Salud (OMS) como el principal problema de salud pública tanto para
el presente como para un futuro real previsible [Kenny-Walsh, 2001].
Cuadro 1.- Infección global por VHC, VHB y VIH.
(Estimaciones de la OMS, París. Septiembre 2001)
VHC VHB VIH
Prevalencia Global 170,000,000 1,200,000,000 36,100,000
Infección Crónica 129,000,000 350,000,000 36,100,000
Muertes por año 476,000 1,200,000 2,800,000
Tasa de mortalidad anual
0.4% 0.49% 7.8%
Letalidad 7 – 10 % - - - - - - (100%)
La infección aguda del VHC usualmente pasa inadvertida, debido a que del 70% al
80% de los pacientes son anictéricos y asintomáticos [Oliveri et al, 2003], y tienden a
tener cronicidad de la enfermedad en un 70 a 85% de los casos, de estos
pacientes el 20% evolucionará a cirrosis [Kenny-Walsh, 2001] en un periodo de 20 a 40
años [Oliveri et al, 2003] y el carcinoma hepatocelular se presentará en el 4% de los
pacientes cirróticos [Kenny-Walsh, 2001], sin embargo el carcinoma hepatocelular
también puede presentarse en ausencia de lesiones cirróticas, lo que sugiere un
posible factor oncogénico del VHC [De Mitri et al, 1995. Actualmente la infección por
VHC es la principal causa de transplante hepático en los EU y Europa oriental
[Kenny-Walsh, 2001]
En relación a la prevalencia del VHC se ha estimado que era de 150,000 nuevos
casos por año en los Estados Unidos, antes de la implementación de las pruebas
3
de tamizaje para los donadores de sangre, cifra que se ha modificado a 33,000 por
año posterior a la implementación de dichas pruebas [Inchauspé y Feinstone, 2003]
Transmisión y Factores de Riesgo
El VHC es transmitido principalmente por vía parenteral, a través de la sangre
contaminada, productos sanguíneos y menos efectivamente por secreciones
corporales como la orina, saliva, semen y ascitis. Los factores de riesgo para la
infección por VHC incluyen transfusión de sangre y sus derivados, uso de drogas
intravenosas, conductas sexuales de alto riesgo, hemodiálisis, personal médico,
transplante de órganos, utilización de equipos médicos mal esterilizados,
transmisión vertical y transmisión en casa [Shapiro, 1994; Kenny-Walsh, 2001; Oliveri et al, 2003]
El riesgo de transmisión por sangre y sus derivados ha disminuido
considerablemente (de 0.19% en 1980 a 0.03% por unidad transfundida) desde
que la prueba de anticuerpos fue introducida para los donadores de sangre. El
riesgo de infección por VHC en personal médico después de la picadura
accidental con una aguja oscila de 3 a 10% [Shapiro, 1994; Kenny-Walsh, 2001]
La transmisión vertical aunque es rara, va del 0% al 13% [Shapiro, 1994] y está
directamente relacionada con la carga viral en el suero de la madre al nacimiento,
con la forma de nacimiento (cesárea o eutocia) [Kenny-Walsh, 2001] y con la presencia
de enfermedades concomitantes (VIH), una tercera parte de los recién nacidos
adquieren la infección in utero y la transmisión posparto no puede ser excluida [Mork
et al, 2005]
La transmisión sexual es controversial, ocurre muy raramente pero al parecer es
más eficiente de hombres con VHC positivo a mujeres [Kenny-Walsh, 2001; Inchauspé y
Feinstone, 2003]
La transmisión intrafamiliar y en el hogar ha sido reportada en contactos de
pacientes con hepatitis crónica, en donde la saliva puede ser una fuente de
contagio, esta posibilidad tiene su fundamento en el hecho de haberse detectado
el RNA del VHC en la saliva de los pacientes con hepatitis C crónica mediante
técnicas de reacción en cadena de la polimerasa, sin embargo se requiere más
información a este respecto [Takamatsu et al, 1991]
4
Aunque los factores de riesgo puedan ser identificados en un 70% a 80% en los
pacientes con VHC, permanece un 20% a 30% al que no se le ha identificado un
factor de riesgo, por lo que el modo de transmisión de los casos adquiridos en la
comunidad o esporádicos permanece desconocido. La posibilidad de transmisión
mediante artrópodos ha sido considerada, debido a que la estructura del VHC
guarda homología con los flavivirus (dengue, fiebre amarilla), pero este modo de
transmisión es poco probable y permanece sin aprobarse [Kenny-Walsh, 2001]
Virología
El virus de la hepatitis C es un virus RNA de cadena sencilla positiva, contenido
dentro de una capside icosahedral, envuelto por una bicapa lipidica dentro de la
cual dos diferentes glicoproteínas están ancladas [Chevaliez S y Pawlotsky JM, 2007] es
hepatotrófico, altamente mutable [Kenny-Walsh, 2001; Chang, 2003], lineal [Oliveri et al, 2003] de 9
kb de longitud, perteneciente a la familia de los flaviviridae, género hepacivirus
[Sansonno y Dammacco, 2005]. El genoma contiene 3 diferentes regiones:
1) Una región 5´corta no codificante que contiene 2 dominios, una estructura
tipo asa que está involucrada en el iniciador de la cadena positiva durante
la replicación del HCV y los sitios de entrada a los ribosomas internos
(IRES), estructuras del RNA responsables para la unión a los ribosomas y
la traslación de las poliproteinas [Chevaliez S y Pawlotsky JM, 2007].
2) Un sólo fragmento grande, de lectura abierta (ORF) de 9,600 nucleótidos
[Sansonno y Dammacco, 2005], los cuales codifican a un gran precursor poliprotéico
de 3,000 aminoácidos aproximadamente [Kenny-Walsh 2001, Sansonno y Dammacco, 2005]
que son procesados postransduccionalmente por las proteasas virales y del
huésped en 10 proteínas, de las cuales 4 son estructurales (core, E1, E2,
p7), localizadas en el tercer N-terminal de la proteína [Sansonno y Dammacco, 2005]
y 6 no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B), cuales se
localizan de la región codificante estructural hacia abajo. Las funciones de
prácticamente todas estas proteínas no estructirales han sido bien
definidas, participando en la codificación de proteínas con funciones
enzimáticas requeridas para el procesamiento de proteínas y la replicación
5
(proteasas, helicasas, polimerasas) del VHC [Mc Hutchinson et al, 2004, Sansonno y
Dammacco, 2005] Sin embargo las funciones de NS4B y NS5A no han sido bien
definidas [Chevaliez y Pawlotsky, 2007]
3) Una región 3´ corta (con un final de 15 nucleótidos de huella de
polipramida) no transducidas, las cuales son requeridas para la
transducción y replicación del RNA viral y una secuencia terminal
conservada de aproximadamente 100 nucleótidos Kenny-Walsh, 2001; Mc Hutchinson,
2004].
Figura 1. Estructura y organización genética del genoma del Virus de la
Hepatitis C. [Sansonno y Dammacco, 2005]
La estructura genómica del VHC es altamente heterogénea, existen 6 tipos
principales y más de 100 subtipos diferentes [Oliveri et al, 2003], y se han identificado
numerosas cuasiespecies. Los genotipos más comunes en EU y oeste de Europa
son el 1a, 1b, 2a, 2b y 3, los genotipos 1a y 3 son comunes en el noreste y sureste
de Europa y Australia, el genotipo 4 en el medio oriente, el genotipo 5 en Sudáfrica
y el genotipo 6 en Hong Kong [Kenny-Walsh, 2001]
Las mutaciones son resultados de un típico error de la RNA polimerasa
dependiente de RNA, la falta de actividad corregida común a los virus RNA y a la
presión del sistema inmune, la suma de estos factores es responsable de que
circulen VHC en el huésped como una población viral compleja conocida como
cuasiespecies, los cuales pueden ser uno de los mecanismos usados por el VHC
6
para evadir la vigilancia inmune del huésped. La naturaleza y complejidad de las
cuasiespecies puede influir en la respuesta inmune [Inchauspé y Feinstone, 2003]
El VHC tiene un gran trofismo celular, por lo que el RNA del VHC se puede
encontrar en plasma, hígado, células mononucleares de sangre periférica y de
médula ósea y su replicación se ha demostrado en hepatocitos, células de médula
ósea y en células mononucleares de sangre periférica [Manzini et al, 1994, Pioltelli et al, 1996]
Pruebas Diagnósticas
Las pruebas diagnósticas de primera generación se introdujeron a principios de los
90´s, carecían de sensibilidad para el diagnóstico temprano de la infección y
daban muchos falsos positivos en pacientes con enfermedades coexistentes
(enfermedad hepática alcohólica y autoinmunes). Las pruebas de segunda y
tercera generación detectan anticuerpos circulantes con especificidad a varios
epitopes, con lo que mejoran la sensibilidad y la especificidad aproximadamente a
un 95%, estas pruebas se realizan mediante ELISA o RIA que detectan varios
recombinantes antigénicos derivados del VHC (core, NS3, NS4 y NS5), una
prueba positiva puede confirmarse con una prueba suplementaria más específica
conocida como inmunoensayo recombinante (RIBA).
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa es una
tecnología altamente sensible para la identificación viral y ha sido estandarizada
en una gran cantidad de laboratorios en todo el mundo [Kenny-Walsh, 2001; Chang, 2003]
Historia Natural de la Enfermedad
Las características más importantes de la infección por el VHC son su alta tasa de
cronicidad, su baja tasa de eliminación y su naturaleza asintomática e insidiosa. La
mayoría de los casos son asintomáticos durante la primera y segunda década de
la enfermedad. Los síntomas se desarrollan conforme la enfermedad progresa a
cirrosis y aparecen las complicaciones de la misma (ascitis y várices esofágicas).
Los principales síntomas asociados con la progresión de la enfermedad son fatiga
y artralgias.
7
El efecto del VHC sobre la bioquímica hepática (niveles de aminotransferasa) es
extremadamente variable, pero se han identificado 3 patrones característicos:
a) Niveles de aminotransferasa persistentemente normales
b) Niveles de aminotransferasa persistentemente anormales
c) Niveles de aminotransferasa fluctuantes entre normales y anormales
Ninguno de los tres patrones ha demostrado tener un efecto predictivo sobre la
progresión de la enfermedad.
Entre el 70% al 85% de las personas infectadas con virus de la hepatitis C
desarrollan infección crónica, cuya progresión a cirrosis ocurre aproximadamente
en el 20% de los casos con un posible desarrollo de cirrosis descompensada y
carcinoma hepatocelular. El rango de progresión es variable y puede ser lineal o
no lineal y está influenciado por la presencia o ausencia de cofactores. El cofactor
puede estar relacionado con la genética del huésped, la naturaleza intrínseca del
virus o los factores ambientales que pueden afectar tanto al huésped como al
virus. Estos cofactores dirigen la progresión de la enfermedad y son considerados
predictores positivo o negativo de la progresión y de las complicaciones de la
infección por el VHC.
Cofactores
Factores del Huésped
La genética del huésped es muy importante en la eliminación del virus o en la
persistencia del mismo, se han investigado alelos del complejo principal de
histocompatibilidad clase II. La importancia de la edad al momento de la infección
también se ha determinado, una menor edad al momento de la infección es un
factor predictor positivo para una tasa lenta de progresión de la enfermedad.
Factores Virales
La importancia de la diversidad viral (diferentes tipos y subtipos virales) como
factor independiente de la progresión viral se encuentra en debate, la mayoría de
los estudios se ha enfocado en los genotipos 1a, 1b y 2. La cantidad de inóculo al
momento de la infección va a determinar los subsecuentes niveles de RNA-VHC
8
en el suero del huésped, lo cual puede ser el factor primario en determinar la tasa
de progresión de la enfermedad.
Coinfecciones Virales
La presencia de coinfecciones es también importante en la tasa de progresión de
la enfermedad y el curso clínico. La presencia de hepatitis B, virus de la
inmunodeficiencia humana y esquistosomiasis son factores que incrementan la
progresión de la enfermedad.
Factores Ambientales
Los factores ambientales tales como el consumo de alcohol y de tabaco influyen
tanto en los factores virales como del huésped, se ha demostrado en numerosos
estudios que el alcohol tiene un efecto deletéreo en las tasas de progresión de la
enfermedad, sin embargo esto no se ha podido comprobar con el uso de tabaco
[Kenny-Walsh, 2001]
Cuadro Clínico
La infección por el virus de la hepatitis C es una de las enfermedades más
mimetizantes. Puede inducir una gran cantidad de signos y síntomas que
involucren prácticamente cualquier órgano del cuerpo [Oliveri et al, 2003]
Manifestaciones extrahepáticas
Es bien sabido que el VHC puede replicarse fuera del hígado, particularmente en
las células mononucleares de sangre periférica, este hecho puede facilitar el
involucro sistémico de enfermedad, principalmente debido a mecanismos
mediados por el sistema inmune [Marson, 1995]. Se han reportado numerosas
manifestaciones extrahepáticas (Cuadro 2). Este virus puede infectar a los
linfocitos, lo que dispara la proliferación crónica de las células B. La alteración del
sistema inmune puede promover varios desórdenes incluyendo crioglobulinemia
mixta, vasculitis, porfiria cutánea tardía, liquen plano, glomerulonefritis
membranoproliferativa, tiroiditis autoinmune, fibrosis pulmonar, hepatitis
9
autoinmune, síndrome sicca y diferentes formas de artritis [Michel et al, 1992; Peters et al,
1995; Ferri et al, 1996; Hanley et al; 1996; Oliveri et al, 2003]. Existen una gran cantidad de datos
acerca del papel del VHC en la inducción de anormalidades autoinmunes
serológicas. Los factores genéticos pueden influir en el inicio de las enfermedades
autoinmunes en los pacientes con hepatitis C crónica. Se ha reportado que el HLA
A1-B8-DR3 está asociado con la seropositividad para anticuerpos antinucleares,
mientras que la presencia de entidades inmunológicas está más asociada con el
HLA-DR4 [Oliveri et al, 2003]
Artritis relacionada al VHC
La artritis es una de las diversas enfermedades autoinmunes inducidas por la
infección por VHC en más de la tercera parte de los pacientes, quienes sufren de
artralgias-artritis. No hay un patrón clínico característico, sin embargo se han
descrito 2 subgrupos no erosivos y no deformantes:
1. Mono-oligoartritis que involucra medianas y grandes articulaciones, es
menos común y generalmente presenta un curso intermitente, además de
estar asociada a la presencia de crioglobulinas.
2. Poliartritis parecida a la artritis reumatoide que afecta pequeñas
articulaciones, en donde el factor reumatoide generalmente está presente,
pero la elevación de la velocidad de sedimentación globular es menos
frecuente que en la artritis reumatoide. Nunca se han reportado nódulos
reumatoideos.
La artritis relacionada al VHC debe ser considerada como un diagnóstico
diferencial en muchos pacientes que tienen inflamación articular. Los
excepcionales casos erosivos descritos pueden representar una artritis reumatoide
coexistente con la infección por VHC.
La asociación entre artritis psoriática e infección por VHC ha sido ampliamente
descrita en la literatura, sin embargo los autores no han sido capaces de confirmar
estos datos.
10
Cuadro 2.- MANIFESTACIONES EXTRAHEPÁTICAS LISTADAS EN RELACIÓN AL POSIBLE MECANISMO PATOGÉNICO [Mehta et al, 2001]
Producción o depósito anormal de inmunoglobulinas-células B Síndrome antifosfolípido Autoanticuerpos Linfoma de células B Crioglobulinemia Vasculitis leucocitoclástica Tumores linfoides asociados a mucosas (síndromes MALT) Plasmocitoma
Autoinmunes Enfermedad de Behcet´s Liquen plano Úlcera corneal de Mooren´s Sialoadenitis (Sjogren-like) Tiroiditis Trombocitopenia Vitiligo Mecanismos Desconocidos Porfiria cutánea tarda
La patogénesis de la artritis relacionada al VHC no ha sido aclarada, pero se
postulan 3 posibles mecanismos:
1. Daño del tejido sinovial por invasión viral directa
2. Respuesta autoinmune sinovial inducida por el virus
3. Depósito de complejos inmunes – crioglobulinas
El tratamiento de la artritis relacionada a VHC debe incluir anti-inflamatorios no
esteroideos, hidroxicloroquina y dosis bajas de corticoesteroides, el empleo de
Interferón alfa 2b pegilado (PEG-IFN 2b) y ribavirina debe de estar limitado a los
pacientes con afección hepática o sistémica del virus [Oliveri et al, 2003]
11
Crioglobulinemia
La crioglobulinemia mixta es una vasculitis sistémica caracterizada por púrpura
palpable, artralgias y fiebre, su patogénesis está caracterizada por
inmunoglobulinas séricas que precipitan reversiblemente en frío [Oliveri et al, 2003].
Esta vasculitis sistémica es secundaria a una expansión benigna de linfocitos B
[Ferri et al, 1995]. Se divide en 3 grupos, la tipo I está asociada a inmunoglobulinas de
una sola clase y por lo tanto no está clasificada dentro de las crioglobulinemia
mixtas; en la tipo II los precipitados tienen factor reumatoide monoclonal y en la
tipo III los precipitados tienen factor reumatoide policlonal [Agnello 1997]. La
prevalencia de anticuerpos contra el VHC en pacientes con crioglobulinemia mixta
varía del 70% al 100% y grandes cantidades de RNA del VHC están concentradas
en los crioprecipitados. La crioglobulinemia tipo II está fuertemente asociada con
la infección concomitante por el VHC y las crioglobulinas presentan complejos
inmunes de anticuerpos-antígeno del VHC, así como viriones del mismo, lo que
sugiere un papel patogénico del VHC en la crioglobulinemia mixta [Agnello et al, 1992;
Sansonno et al, 1996]. El papel principal del VHC en la patogénesis de la crioglubulinemia
está demostrado por la presencia de proteínas relacionadas al VHC en los vasos
sanguíneos de la piel de pacientes con crioglobulinemia [Sansonno y Dammacco, 2005]
Linfoma no Hodgkin de células B
Los linfomas no Hodgkin comprenden un grupo heterogéneo de diferentes
enfermedades se han asociado con la infección por VHC en varias cohortes de
pacientes, así mismo se ha demostrado el RNA del VHC en médula ósea, ganglios
linfáticos, en suero y en linfocitos de estos pacientes [Ferri et al, 1995; Pioltelli et al, 1996],
específicamente dentro del sub-grupo de inmunocitomas [Silvestri et al, 1996] y en los
linfomas de bajo grado [Ferri et al, 1995; Hanley et al, 1996; Mazzaro et al, 1996]
Poliarteritis
La poliarteritis nodosa (PAN) es una arteritis necrotizante sistémica de pequeños y
medianos vasos que involucra varios órganos, puede ser inducida por una gran
12
variedad de agentes y mecanismos. El mecanismo de la inflamación vascular más
comúnmente involucrado es la presencia de complejos inmunes. El VHC ha sido
relacionado hasta en un 20% de los pacientes con PAN y esta seropositividad
correlaciona con historia de afección hepática y niveles elevados de aspartato
aminotransferasa [Carson et al, 1993]
Anemia Aplásica
Es definida como una falla de la médula ósea y pancitopenia periférica, que puede
ser condicionada por múltiples entidades, siendo la infección por VHC la más
importante para el desarrollo de la enfermedad causada por hepatitis viral [Peters et al,
1995].
Enfermedades Hepáticas Autoinmunes
Los anticuerpos anti VHC han sido encontrados en diferentes enfermedades
hepáticas autoinmunes, por ejemplo en hepatitis autoinmune tipo 1 (caracterizada
por la presencia de anticuerpos contra antígenos extraídos del núcleo [ANA]), en
hepatitis autoinmune tipo 2 (caracterizada por la presencia de anticuerpos contra
microsomas hepáticos-renales [LKM]), en hepatitis autoinmune tipo 3
(caracterizada por la presencia de anticuerpos contra la proteína soluble hepática
[SLA]) y en cirrosis biliar primaria (caracterizada por la presencia de anticuerpos
antimitocondriales [AMA]) entre otras enfermedades con prevalencia variable,
dependiendo de la serie estudiada [Michel et al, 1992]
Tratamiento
El tratamiento estándar actual es a base de interferón alfa 2b pegilado (PEG-
IFN 2b) más ribavirina (RBV), lo cual produce una respuesta virológica sustancial
que es definida como la ausencia en la detección del RNA del VHC.
Observándose esta respuesta en promedio en el 50% de los pacientes que tienen
hepatitis C crónica [Mc Hutchinson, 2004], sin embargo esta terapia es dependiente del
genotipo infectante, ya que las tasas de respuesta favorable a largo plazo pueden
ser entre el 70% al 80% para los genotipos 2 y 3 pero tan bajas como del 40% al
13
50% para los genotipos 1 [Inchauespé y Feinstone, 2003] y desconocidos para los genotipos
4,5 y 6 en virtud de la falta de ensayos clínicos suficientes [Chevaliez y Pawlotsky, 2007]
Este tratamiento está asociado con ciertas limitaciones que incluyen el alto costo,
efectos adversos indeseables, tiempo prolongado de tratamiento (6 a 12 meses) y
falta de apego al mismo. Además una importante proporción de pacientes no logra
una adecuada respuesta y puede requerir otras terapias, y pacientes con
enfermedad avanzada de hígado o contraindicaciones para la terapia actual tienen
opciones de tratamiento limitado, por tal motivo se están investigando nuevas
terapias con el desarrollo de agentes que tienden a mejorar la eficacia o la
tolerabilidad (Cuadro 3).
Cuadro 3.- TERAPIAS PARA EL VHC EN INVESTIGACIÓN
Interferones modificados / nuevos métodos de administración
Bombas de infusión
Inyecciones de liberación controlada
Sistemas de administración oral
Sistemas basados en liposomas
Análogos de la Ribavirina
Levovirina
Viramadine
Otros agentes inmunomoduladores
Inhibidores de la Inosine 5´-monofosfato deshidrogenasa (IMPDH)
Dihidroclorido histamina
Timosina 1
Amantadina
Terapias moleculares
Inhibidores de enzimas del VHC
Oligonucleotidos antisentido
Ribosomas
RNA de interferencia corta
Agentes antifibróticos
Interferon
Vacunas
El tratamiento actual estandarizado es con PEG-IFN 2a a dosis 180 g por
semana (independientemente del peso corporal) o con PEG-IFN 2b a dosis de 1.5
14
g/kg por semana más RBV a dosis de 1000 a 1200 mg/día para el genotipo 1 y a
dosis de 800 mg/día para los genotipos 2 y 3 por 48 y 24 semanas
respectivamente. Los pacientes con genotipo 1 que reciben estas dosis deben
tener una disminución igual o mayor a 2-log10 de las copias del RNA del VHC
después de 12 semanas de tratamiento, ya que se ha observado que los
pacientes que no logran esta disminución en este tiempo, no van a lograr
respuestas virológicas substanciales subsecuentemente. A las 24 semanas se
debe de realizar nueva determinación del RNA del VHC si este se encuentra
ausente se continua tratamiento y se repite el RNA del VHC al final del tratamiento
(48 semanas) y si el RNA del VHC permanece indetectable a las 24 semanas
después de haber concluido el tratamiento se considera una respuesta virológica
sustancial de contrario será una falla terapéutica. Los pacientes con genotipo 2 o 3
deberá determinarse el RNA del VHC al final del tratamiento (24 semanas) y si el
RNA del VHC permanece indetectable a las 24 semanas de haber finalizado el
tratamiento se considera una respuesta virológica sustancial de contrario será una
falla terapéutica. En virtud de la falta de ensayos clínicos en pacientes con
genotipos 4,5 ó 6 se sugiere que la dosis del tratamiento sea igual que para el
genotipo 1 con una duración de 48 semanas, se deberá de investigar el RNA del
VHC al final del tratamiento y a las 24 semanas después del mismo, si se
encuentra ausente la detección del RNA del VHC se considera una respuesta
virológica sustancial de contrario será una falla terapéutica [Chevaliez y Pawlotsky, 2007].
La pegilación del interferón no es otra cosa mas que el unir una molécula de glicol
polietileno al interferón [Oliveri et al, 2003]. La introducción del PEG-IFN permitió la
disminución en el número de inyecciones comparado con el IFN estándar
(semanalmente vs 3 veces por semana), lo cual permitió una mayor adherencia al
tratamiento [Mc Hutchinson, 2004].
El uso de IFN está acompañado de un aumento sustancial de las respuestas
proliferativas de células T CD4 específicas del VHC, y cambios en la producción
de citocinas pro-inflamatorias (IL-1 , IL-1 , IL-6 y TNF ) lo que lleva a una
eliminación exitosa del virus. Se ha demostrado que los pacientes que responden
15
adecuadamente (es decir con eliminación del virus) a la terapia con IFN presentan
mayor disminución en la producción de las citocinas pro-inflamatorias [Itoh et al, 1995]
Vacunas
El desarrollo de una vacuna contra el VHC ha sido lento debido a las
complicaciones inherentes para su estudio como lo es la falta de modelos
animales pequeños (diferentes a los chimpancés), el alto grado de variabilidad
genómica del VHC y las dificultades técnicas para la producción de grandes
cantidades del VHC en los medios de cultivo. El blanco para las vacunas DNA-
VHC incluye las glicoproteínas E1 o E2, el core antigénico y proteínas no
estructurales (NS3, NS2, NS5) [Mc Hutchinson, 2004]
Las vacunas que se encuentran en fases de investigación preclínica incluyen
aquellas basadas en epitopos originales y modificados, en proteínas virales, en
DNA, vacunas de vectores vivos y vacunas de regímenes combinados. El
desarrollo de la vacuna contra el VHC a pesar de progresos subtanciales,
permanece en etapas iniciales, por lo que el reto para el desarrollo de la misma es
muy grande [Inchauspé y Feinstone, 2003]
Respuesta Inmune al VHC
Después de la infección por el VHC una minoría de pacientes desarrolla síntomas
durante la fase aguda y se montan las respuestas necesarias para la eliminación
del virus. [Inchauspé y Feinstone, 2003]. La eliminación del virus corre a cuenta de la
respuesta inmune, la cual en general se divide en innata y adaptativa, cada una de
estas respuestas depende de diferentes estirpes celulares y de la secreción de
productos de las mismas llamados citocinas. [Chang, 2003]. El control de la infección
por el VHC es primariamente dependiente de células T, en donde la resistencia
exitosa al VHC requiere de una vigorosa respuesta de células T citotóxicas
específicas al virus [Sansonno y Dammacco, 2005]. En los párrafos siguientes se describen
con detalle los acontecimientos necesarios para esta respuesta.
Hay tres principales características inmunológicas asociadas con este enigmático
virus, la primera y más importante es que en todas las circunstancias engaña al
16
sistema inmune dando como resultado la infección crónica, la segunda es la
aparición de un factor reumatoide monoclonal restrictivo y la tercera es la
producción de diferentes auto-anticuerpos diferentes al factor reumatoide [Agnello,
1997]
Respuesta Inmune Innata
Es la primera línea de defensa contra las infecciones e involucra la participación
de barreras epiteliales y mucosas, del complemento y de una amplía gama de
estirpes celulares y mediadores inflamatorios humorales que incluyen a
neutrófilos, macrófagos, células NK, células NKT, células dendríticas, citocinas,
quimiocinas e interferón. Estas respuestas ocurren inmediatamente para controlar
la infección inicial pero no proveen inmunidad específica. En la infección por VHC
hay poca información de esta fase de la respuesta inmune en virtud de que es
difícil identificar a los pacientes inmediatamente después de la inoculación y no
hay adecuados modelos animales. Sin embargo hay evidencia de que la
interacción entre el VHC y el sistema inmune innato juega un papel crítico en el
futuro curso clínico de la infección, ya que algunas regiones de su genoma pueden
reprimir a las proteín kinasas pkr, las cuales median los efectos antivirales del
interferón. Recientes estudios demuestran que la glicoproteína E2 puede inhibir la
función de las células NK (proliferación, producción de citocinas y liberación de
gránulos citotóxicos) [Chang, 2003].
Respuesta Inmune Adaptativa
Esta se divide en respuesta inmune humoral y celular.
Respuesta Humoral
La presencia de anticuerpos puede ser identificada 7-8 semanas después de la
inoculación, sin embargo a diferencia de otro tipo de infecciones virales (hepatitis
A ó B), su presencia indica el inicio de la infección más que inmunidad protectora.
Hay evidencia de que la función neutralizante ocurre en la infección por VHC pero
17
ésta es superada [Chang, 2003] e incluso se ha documentado la producción de
anticuerpos no neutralizantes, lo cual explica tanto la falta de control de la
diseminación viral como la formación de complejos inmunes [Sansonno y Dammacco, 2005]
Las células B intrahepáticas tienen una masiva expansión clonal, siendo los
factores del microambiente los responsables de su activación y persistencia. El
repertorio de las células B es muy limitado y los receptores IgM con actividad de
factor reumatoide son probablemente codificados por unos pocos genes de línea
germinal, probablemente en respuesta a un estímulo antigénico muy similar. El
papel normal de estos receptores incluye la captura, procesamiento y presentación
del antígeno atrapado en los complejos inmunes a las células T Sansonno y Dammacco,
2005. Se ha detectado un gran número de autoanticuerpos en el suero de
pacientes infectados con VHC, entre los que se encuentran los anticuerpos
antinucleares (AAN), autoanticuerpos SSA/Ro y SSB/La, autoanticuerpos contra
DNA de doble cadena (dsDNA), autoanticuerpos anticardiolipina (aCLP), y
anticuerpos anti citoplasma de neutrófilo (ANCA). La prevalencia de estos
autoanticuerpos varia ampliamente dependiendo de la zona geográfica y su
posible papel en el desarrollo de desórdenes inmunológicos no está claro [Olivieri et al,
2003]
Respuesta celular de linfocitos CD4
Hepatitis Aguda
Las células T CD4 específicas al VHC son detectadas tanto en hígado como en
sangre periférica en pacientes infectados. Se ha demostrado que una respuesta
vigorosa, activa y multiespecífica de las células T CD4 específicas del VHC lleva a
la eliminación del virus, en contraste una respuesta débil, tardía y transitoria lleva
a la infección crónica. Muy poco se conoce acerca de las respuestas
intrahepáticas de células T CD4 específicas al VHC en la infección aguda.
18
Hepatitis Crónica
Células T CD4
Se han detectado células T CD4 específicas al VHC en sangre periférica en al
menos un tercio de los pacientes con infección crónica, estas respuestas están
dirigidas contra antígenos del core, a diferencia de los sujetos recuperados de la
infección en donde las respuestas son más vigorosamente contra proteínas no
estructurales (NS3, NS4, NS5). El papel de las células T CD4 específicas durante
la hepatitis C crónica no ha sido completamente definido, no hay una aparente
relación entre las respuestas de las células T CD4 intrahepáticas y los parámetros
clínicos, sin embargo la intensidad de las respuestas proliferativas de las células T
CD4 específicas al VHC correlaciona con un curso clínico más benigno (niveles
más bajos de aminotransferasas y menos fibrosis), mientras que una incapacidad
generalizada de las células T está asociada con una progresión acelerada de la
enfermedad hepática [Chang, 2003].
Respuesta de células T CD8
Hepatitis Aguda
Las respuestas de las células T CD8 al VHC son detectables tanto en el hígado
como en sangre periférica durante la infección aguda y esto correlaciona con el
curso clínico de la enfermedad, se ha demostrado en modelos animales que las
respuestas tempranas y multiespecíficas de células T intrahepáticas están
asociadas con la eliminación del virus en los estudios longitudinales. De manera
interesante las respuestas de fase hiperaguda difieren cuantitativamente de las de
la fase subaguda en donde las segundas son altamente activas (CD38+ y CD69+)
pero incapaces de elaborar IFN por lo que se ha llamado fenotipo aturdido. La
emergencia de estas células T coincide con el inicio de la inflamación hepática, lo
que sugiere un papel patogénico para las células T CD8 específicas al VHC que
son altamente activas pero sin poder producir IFN [Chang, 2003].
19
Hepatitis C Crónica
Después de la fase aguda, las respuestas de las células T CD8 específicas al
VHC disminuyen considerablemente, por lo que la frecuencia de precursores
circulantes de células T CD8 específicas al VHC es extremadamente baja después
de la infección aguda, encontrándose en un rango de 1 a 100 por millón de
linfocitos en sangre periférica. La pobre respuesta de las células T CD8 durante la
infección crónica con VHC es específica para el virus, debido a que los mismos
pacientes responden muy bien a otros virus (influenza, HIV, VEB). Se ha
demostrado una respuesta mayor del perfil de citocinas tipo 1 en los pacientes que
se recuperaron que en los pacientes con infección crónica.. En el hígado las
células T CD8 específicas al VHC estuvieron entre 1 y 2 logaritmos más
abundantes y desplegaron más actividad fenotípica que las de sangre periférica.
De manera similar a las células T CD4, las células T CD8 específicas al VHC
fueron principalmente del fenotipo 1 en ambos compartimientos. El papel de las
células T CD8 en el curso clínico de la hepatitis C crónica es controversial [Chang,
2003].
Relación de las células T CD4 y CD8 específicas al virus
Como es sabido las células T CD4 juegan un importante papel en la activación de
las respuestas de las células T CD8, por lo que la ausencia de células T CD4
efectivas es probable que comprometa las respuestas de las células T CD8, en un
estudio con pacientes con hepatitis C crónica se observó una relación positiva
entre las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (LTC) de memoria y la
respuesta proliferativa de las células T CD4. Por lo tanto la respuesta débil de las
células T CD8 durante la infección crónica del VHC puede ser una consecuencia
de la inefectividad de las respuestas de las células T CD4. Otra posible teoría es
que las células T CD4 ejercen una influencia negativa, esto basado en los reportes
de que las células T reguladoras CD4+ CD25+ bloquean la función de las célula T
[Chang, 2003].
20
Influencia de la variación viral en las respuestas de las células T en el curso clínico
La variable asociación entre las respuestas de las células T y el curso clínico
durante la infección crónica con el VHC puede en parte ser debido a la presencia
de variantes virales que escapan a las células T, en un análisis de 13 pacientes
con infección crónica por VHC se encontró una fuerte asociación entre las
respuestas de células T y los variantes de los epitopes virales, lo que sugiere que
esta variación se realiza en la fase temprana de la infección y que durante la fase
crónica las mutaciones de los epitopes son raras probablemente debido a las
respuestas débiles de las respuestas de las células T a la infección. El escape a
los LTC en esas variantes fue medido por la falta de unión al HLA así como por el
antagonismo activo a las LTC. Por lo tanto parece ser que el escape a los LTC
ocurre en la infección aguda por VHC cuando las respuestas de células T son más
vigorosas y quizá esto contribuya a la persistencia del VHC. Estas mutaciones son
relativamente fijas y no se realizan durante la infección crónica debido a que las
respuestas LTC son cuantitativamente débiles. Por lo tanto, la eliminación exitosa
de VHC es probable que requiera de un amplio espectro de células T que
contengan múltiples regiones conservadas del virus, además de la estimulación
tanto de las respuestas de células T CD4 y CD8 [Chang, 2003].
Es importante hacer notar que las asociaciones entre inmunidad celular y el curso
clínico en los pacientes no constituye una relación causal, por ejemplo, la baja
frecuencia de células T CD8 específicas al VHC en los pacientes infectados
crónicamente puede ser una consecuencia (eliminación selectiva de los LTC
específicos del VHC por una estimulación antigénica continúa o fatiga
inmunológica) más que la causa de la persistencia del VHC. Alternativamente los
LTC específicos al VHC pueden tener “homing” al hígado más que permanecer en
circulación, por lo tanto, son pobremente detectadas en sangre periférica. Estos
LTC específicos al VHC activados pueden ser eliminados en el hígado ya que es
un órgano que puede facilitar la muerte apoptótica de las células T activadas [Chang,
2003]
La citocinas tienen un papel crucial en la regulación de las respuestas inmunes y
en el caso de la infección por el VHC la producción anormal de los niveles de
21
citocinas parece contribuir a la progresión de la enfermedad, la persistencia viral y
la respuesta a la terapia [Pereira et al, 2008]. La IL-6 es una citocina inflamatoria
perteneciente a la familia de citocinas de 4 hélices [Scheller y Rose-John, 2006]. tiene un
peso molecular de 22 a 29 Kd y ejerce sus acciones a muy bajas concentraciones
séricas, habitualmente del orden de unos pocos picogramos por mililitro y se ha
reportado su presencia en el suero de cordón umbilical humano en una
concentración muy variable que oscila el promedio entre 8 y 13 pg/mL [Biesecker y
Emerson, 1993]. Su actividad biológica depende de la unión a su receptor y a 2
proteínas gp130 de forma simultánea, lo cual va a permitir el inicio clásico de
señales de transducción. La proteína gp130 se expresa en prácticamente todas
las células, mientras que el receptor de IL-6 está limitado a los hepatocitos y a
algunos leucocitos, por lo que sólo las células que contengan al receptor y a la
gp130 podrán responder al estímulo de la IL-6. Sin embargo se ha demostrado la
presencia del receptor de IL-6 en forma soluble, el cual capta a la IL-6 y este
complejo se puede unir a la gp130 de la superficie celular e iniciar las señales de
transducción, a este último proceso se le conoce como trans-señalización [Scheller y
Rose-John, 2006].
La IL-6 es una citocina pleiotrópica con muy variadas funciones, es producida por
muchos tipos de células, entre las que se encuentran las células T, los
granulocitos, los monocitos, las células B, los fibroblastos y las células
endoteliales, células del músculo liso, fibroblastos del tejido conectivo,
osteoblastos, queratinocitos, células estrelladas, células de la microglia y células
del lóbulo anterior de la glándula pituitaria [Pachówka et al, 2008]. A nivel hepático es
sintetizada por los macrófagos tisulares en respuesta a varios estímulos (TNF ,
C3a, C5a, LPS, etc). Ejerce acciones sobre la mayoría de las células, pero sus
funciones más importantes son:
a) Induce diferenciación de células B, para dar lugar a células productoras de
anticuerpo.
b) Tiene un papel crucial en los procesos de regeneración hepática mediante
la activación de señales de transducción activadoras de trascripción 3
(STAT 3) y del Factor Nuclear kappa B (NF kB) lo que regula los procesos
22
celulares involucrados en la fase aguda de la regeneración hepática,
además de participar en la inhibición de la apoptosis de los hepatocitos a
través de la activación de varios genes (FLIP, Bcl-2, Bcl-xl) que codifican
para proteínas que bloquean las caspasas, por otro lado la IL-6 ejerce un
potente efecto mitogénico en los hepatocitos, mediante la activación de las
MPA cinasas que permiten la finalización de la fase G0 y el inicio de la fase
G1 del ciclo celular [Pachówka et al, 2008, Clavien PA, 1997], en conjunto con TNF e IL-
1 estimula la síntesis de proteínas de fase aguda [Pachówka et al, 2008, Poli and
Cortese, 1998]
c) En la médula ósea en acción sinérgica con la IL-3 activa a la célula madre
CD34+ (totipotencial) para que inicie su ciclo celular y de esta manera
contribuir a la hematopoyesis [Biesecker and Emerson, 1993]
Por todo lo anterior el estudio de una citocina con funciones duales en la
patogénesis de la infección crónica por virus de hepatitis C es sumamente
interesante, ya que por un lado favorece la regeneración hepática y por el otro
facilita los procesos inflamatorios del hígado, además de su probable participación
en algunas de las manifestaciones extrahepáticas como es la trombocitopenia,
hacen de la IL-6 una citocina excitante para su estudio y aunado a esto la falta de
estudios de la misma hacen que su investigación sea necesaria.
23
HIPÓTESIS DE TRABAJO
La infección crónica por el virus de hepatitis C conlleva a una desregulación de la
respuesta inmune lo cual va a condicionar las manifestaciones extrahepáticas
comúnmente observadas en estos pacientes
OBJETIVO GENERAL
Evaluar inmunológicamente en suero y médula ósea a los pacientes con hepatitis
C crónica y tratar de correlacionarlo con las manifestaciones extrahepáticas.
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar la presencia de complejos inmunes en suero y médula ósea.
Determinar las concentraciones de IL-6 en suero y médula ósea
Determinar la concentración de anticuerpos anticardiolipina en suero y médula
ósea
Determinar la concentración de proteína C reactiva en suero y médula ósea
Determinar concentración de los componentes 3 y 4 (C3 y C4) del
complemento en suero y médula ósea
24
MATERIAL Y MÉTODOS
POBLACIONES DE ESTUDIO
A todos los sujetos de estudio se les tomó una muestra de 5 mL de sangre total y
una muestra de 2 mL de médula ósea.
Grupo1
16 pacientes con hepatopatía crónica y serología positiva para VHC del Hospital
Central Militar que cumplieron con los siguientes criterios de inclusión:
* Edades de 25 años en adelante.
* Presencia de alteraciones hematológicas.
* Que no estén recibiendo tratamiento alguno.
Grupo 2
TESTIGOS POSITIVOS.- 11 individuos que presentaban hepatopatía crónica sin
evidencia de serología positiva para el VHC.
Grupo 3
TESTIGOS NEGATIVOS.- 5 individuos sanos.
M É T O D O S
Obtención del suero:
1. Localizar una vena periférica adecuada para la venopunción.
2. Realizar la asepsia de la región con una solución adecuada (alcohol de
96º).
3. Aplicar un torniquete aproximadamente 5 a 10 centímetros hacia la región
proximal del sitio de la punción.
4. Con una aguja calibre 22 realizar la punción de la vena y obtener sangre
total.
5. Transferir la sangre total a un tubo estéril sin anticoagulante.
25
6. Una vez coagulada la sangre proceder a centrifugarla a 1500 rpm durante 5
minutos.
7. Extraer el suero de la muestra, dividirla en 3 alícuotas y congelarla a menos
20ºC hasta la fecha de realización de los estudios.
Obtención de médula ósea:
1. Localizar la espina iliaca posterosuperior
2. Colocarse gorro, cubrebocas, bata y guantes estériles
3. Realizar la asepsia de la región con isodine espuma y posteriormente con
solución de isodine
4. Colocar campo estéril que cubra la región a trabajar
5. Infiltrar de 1mL a 2mL de xilocaina simple al 2%, en la región de la espina
iliaca posterosuperior
6. Introducir a través del hueso iliaco una aguja calibre 16-18 hasta llegar a la
médula ósea
7. Aspirar con una jeringa estéril, 0.5 mL de médula ósea para realizar un
extendido en 4 portaobjetos
8. Aspirar con otra jeringa estéril 1.5 mL de médula ósea y transferir a un tubo
estéril sin anticoagulante
9. Una vez coagulada la muestra centrifugarla a 1500 rpm durante 5 minutos
10. Extraer el suero de la muestra, dividirlo en 3 alícuotas y almacenarlas a -20°
C hasta su uso
Determinación de Complejos Inmunes Circulantes.-
La aglutinación de partículas de poliestireno cubiertas con C1q humano cuando se
mezclan con muestras de suero que contienen complejos inmunes circulantes,
dispersa un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada en el
nefelómetro es directamente proporcional a la concentración de los complejos
inmunes circulantes de la muestra analizada.
26
Reactivos del sistema de Nefelometría Behring 100 (Dade Behring Marburg
GMBH, Germany)
1. N Reactivo de Complejos Inmunes Circulantes Látex consiste en un
liofilizado de partículas de polistireno recubiertas con el Factor C1q del
complemento. Una vez reconstituido el reactivo la concentración de las
partículas suspendidas es óptima para la cuantificación de la aglutinación
con el nefelómetro.
2. N estándar de complejos inmunes circulantes y N control de complejos
inmunes circulantes consiste de una mezcla de plasma humano liofilizado
suplementado con un agregado de IgG caliente después de remover los
constituyentes lábiles del plasma
3. El N Acelerador de complejos inmunes circulantes consiste en una solución
de cloruro de sodio con un detergente
4. N buffer concentrado
Procedimiento
1. Los reactivos y las muestras tienen que estar a temperatura ambiente
(entre 15 a 25° C) antes de ser utilizados
2. Reconstituir el N reactivo CIC látex con 3 mL de solución salina isotónica, el
reactivo está listo para usarse 15 minutos después de su reconstitución
3. Reconstituir el N estándar CIC con 1 mL de agua destilada, el reactivo está
listo para usarse 30 minutos después de su reconstitución
4. Reconstituir el N control CIC en 0.5 mL de agua destilada, el reactivo está
listo para usarse 30 minutos después de la reconstitución
5. El N acelerador CIC está listo para utilizarse
6. Diluir 100 mL del N buffer concentrado con 900 mL de agua destilada, el
cual puede ser usado dentro de los primeros cuatro meses de su
preparación
7. Todos los reactivos reconstituidos deben usarse el mismo día de la
reconstitución, no deben de congelarse ya que esto puede dar como
resultado una pérdida de su función
27
8. Elaborar la curva de referencia sobre una calibración de varios puntos, para
lo cual se preparan automáticamente una serie de diluciones (1:25, 1:5,
1:10, 1:20, 1:40) del N estándar CIC con el N diluyente. Las diluciones del
estándar deben de ser usadas el mismo día de la dilución
9. Las muestras de los pacientes se analizan sin diluir
10. Los resultados son calculados automáticamente en una concentración de
mg/mL
Determinación de la Interleucina 6 .-
Esta determinación está basada en el principio del ensayo inmunoenzimático de
un sandwich cuantitativo, usando dos anticuerpos monoclonales de ratón, dirigidos
contra dos diferentes epitopes de la IL-6. Ambos anticuerpos reconocen epitopes
que son esenciales para unirse al receptor, esto permite la identificación de la IL-6
biológicamente activa.
Durante el primer tiempo de incubación, la IL-6 humana en muestras o estándares
es simultáneamente cubierta por el inmunorreactivo, que son anticuerpos anti IL-6
marcados con biotina y anticuerpos anti IL-6 conjugados con peroxidasa. Esto
forma un complejo que se une vía anticuerpo marcado con biotina a la superficie
de la microplaca que está cubierta con estreptavidina (primer paso del sistema).
Posteriormente se realiza el paso de lavado (de acuerdo a las instrucciones del
proveedor). La peroxidasa que está cubriendo al complejo se revela por el reactivo
tetrametilbencidina (TMB) que produce color y así puede determinarse
fotométricamente. El desarrollo del color es proporcional a la concentración de IL-
6. En cada ensayo se realiza una curva de calibración gracias a las muestras de
concentración conocida de IL-6, lo que permite calcular la concentración de IL-6
de las muestras desconocidas.
Procedimiento:
1. Todos los reactivos a utilizar deben de estar a temperatura ambiente es
decir entre 18 y 25oC. (Boehringer Mannheim, Germany)
28
2. Tomar 20 L de los sueros de estudio o de sobrenadante de médula ósea y
colocarlos por duplicado en los pozos de la placa de ELISA.
3. Agregar 200 L del inmunoreactivo (anti-IL-6-POD+anti-IL-6-biotin+buffer) a
los pozos que contienen las muestras de estudio.
4. Cubrir la placa e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en un
agitador a 250 rpm.
5. Eliminar la solución incubada por decantamiento o succión.
6. Lavar los pozos 3 veces con la solución de lavado.
7. Agregar 200 L de la solución de sustrato (TMB) a cada pozo
8. Cubrir la placa de ELISA.
9. Incubar durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad o
en un agitador a 250 rpm.
10. Parar la reacción agregando 50 L de ácido sulfúrico (H2SO4) 1M.
11. Incubar durante aproximadamente 1 minuto en el agitador a 250 rpm
12. Medir en un lector de ELISA a 450 nm dentro de los siguientes 5 minutos
después de haber aplicado la solución de parado.
13. Obtener el promedio de los valores de absorbancia de los duplicados de las
muestras estándar para construir la curva de calibración, graficando en el eje
de las abscisas (y) el promedio de los valores de absorbancia de los
estándares y el eje de las ordenadas (x) el valor de la concentración
estándar.
Determinación de Anticuerpos Anticardiolipinas (CLP).-
Cuando una muestra diluida de suero se añade a un pozo de la microplaca, los
anticuerpos presentes en la muestra se unen al antígeno de cardiolipina
(difosfatidil glicerol de corazón de bovino) (Sigma) que recubre las paredes del
pozo de la placa de microtitulación. La muestra se decanta y la placa se lava. Se
añade a los pozos anticuerpo antiinmunoglobulina humana (IgG, IgA, IgM)
marcado con peroxidasa. El anticuerpo conjugado no unido se descarta mediante
lavados. Cuando se añade el sustrato a los pozos, se produce color cuando hay
29
anticuerpos a cardiolipina en la muestra, debido a la reacción con el anticuerpo
conjugado
Preparación de reactivos
1. Regulador de fosfatos (PBS) pH 7.4 0.5 M (concentrado)
Na2HPO4 . . . . . . . . . 57.5 g
NaH2PO4 . . . . . . . . . 13.1 g
H2O destilada . . . . . 950 mL Ajustar a pH 7.4 con NaOH, aforar a 1 litro y guardar en fracciones de 50 mL en congelador.
Solución de trabajo
NaCl . . . . . . . . . . . . . . 8.2 g
Timerosal . . . . . . . . . 0.1 g
PBS . . . . . . . . . . . . . . 20 mL
H2O destilada . . . . . 980 mL
2. Diluir 10 mg de ortofenilendiamina (OPD) en 100 mL de agua desionizada.
Guardar en la oscuridad y perfectamente bien cerrada.
3. Regulador de fosfato-citrato 0.05 M con perborato de sodio al 0.03%.
4. Conjugado de anticuerpos anti-humanos polivalentes (G,M,A) marcados
con peroxidasa.
Sensibilización de la placa de ELISA
1. Preparar una solución de cardiolipina (Sigma Chem, USA) de 45 g/mL
(diluir con etanol)
2. Poner 30 L de la solución anterior en cada pozo de la placa
3. Secar en cámara de nitrógeno (gas) durante 30 a 45 minutos
4. Bloquear cada pozo con 110 L de suero fetal de ternera al 10% en PBS
5. Tapar la placa y colocarla en un agitador de placas a temperatura ambiente
por dos horas
6. Decantar el suero fetal de ternera
7. Tapar y dejar en refrigeración por 24 hrs.
8. Lavar 4 veces con PBS
9. Secar sacudiendo la placa sobre papel
30
10. Guardar la placas en una bolsa de plástico a 4° C (estables cuando menos
un mes.
Procedimiento
1. Diluir 1:100 los sueros y sobrenadantes de MO, 1:50 el control positivo y
1:50 el control negativo en PBS con suero fetal de ternera al 10%
2. Colocar 100 l en cada pozo por duplicado
3. Incubar una hora a temperatura ambiente
4. Decantar y lavar 4 veces con PBS
5. Invertir la placa sacudiendo sobre papel filtro para eliminar el líquido
residual
6. Colocar en cada pozo 100 l de conjugado polivalente anti IgG, IgM e IgA
diluido 1:1000 en PBS con suero fetal de ternera al 10%
7. Incubar durante una hora, decantar y lavar 4 veces
8. Colocar 100 l de solución OPD con 10 mg en 10 ml de regulador fosfato
citrato con perborato de sodio con H2O2 al 30% (sustrato)
9. Incubar durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente
10. Detener la reacción agregando 50 l de ácido sulfúrico 2N.
11. Leer a 492 nm en lector de ELISA. Cuando la absorbancia es menor de 0.5
el resultado es negativo. Cuando la absorbancia se encuentra entre 0.5 y
1.0 el resultado es probablemente positivo. Si la lectura de absorbancia es
mayor de 1 el resultado es positivo
Determinación de la Proteína C Reactiva (PCR).-
Las partículas de poliestireno recubiertas con un anticuerpo monoclonal (ratón)
específico contra la proteína C reactiva humana, al mezclarse con las muestras
que contienen proteína C reactiva forman agregados, los cuales dispersan el rayo
de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada depende de la concentración
de la proteína correspondiente en la muestra.
31
Reactivos (Dade Behring Marburg GMBH, Germany)
1. Reactivo CardioPhase hsPCR, el cual está compuesto por una suspensión
de partículas de poliestireno recubiertas con un anticuerpo monoclonal
(ratón) contra la PCR humana
2. N Reuma Estándar SL
3. N/T Reuma Controles SL 1 y SL 2
4. Suero control de apolipoproteínas CHD
5. N Diluyente
6. Regulador protector de evaporación BN II
Equipo
1. Sistema de nefelometría Behring 100
Procedimiento
1. Los reactivos y las muestras tienen que estar a temperatura ambiente
(entre 15 a 25° C) antes de ser utilizados
2. Elaborar la curva de referencia sobre una calibración de varios puntos, para
lo cual se preparan automáticamente una serie de diluciones del N Reuma
estándar SL con el N diluyente. Las diluciones del estándar deben de ser
usadas en las siguientes 4 horas
3. Las muestras de suero se diluyen 1:20 automáticamente y deberán
analizarse dentro de las siguientes 4 horas
4. La valoración se efectúa automáticamente en mg/L
Determinación de los componentes 3 y 4 (C3 y C4) del complemento.-
Las proteínas contenidas en los líquidos corpóreos humanos forman
inmunocomplejos, en una reacción inmunoquímica con anticuerpos específicos,
los cuales pueden dispersar un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz
dispersada es proporcional a la concentración del correspondiente factor del
32
complemento en la muestra. La valoración se efectúa por comparación con un
estándar de concentración conocida.
Reactivos (Dade Behring Marburg GMBH, Germany)
1. Sistema de nefelometría Behring 100
2. N proteína-estándar SL (humana)
3. N/T Proteína-controles SL, L/M/H (humano)
4. N regulador para reacción
5. N Diluyente
6. Regulador protector de evaporación BN II
7. N Antisuero contra C3c humano
8. N antisuero contra C4 humano
Los N antisueros son sueros líquidos de origen animal, elaborados mediante la
inmunización de conejos con factores del complemento (C3c o C4) de alta pureza.
Los títulos de los anticuerpos (T) se obtienen por inmunodifusión radial y vienen
señalados en la etiquetas.
Procedimiento
1. Los reactivos y las muestras tienen que estar a temperatura ambiente
(entre 15 a 25° C) antes de ser utilizados
2. Elaborar la curva de referencia sobre una calibración de varios puntos, para
lo cual se preparan automáticamente una serie de diluciones del N
proteína-estándar SL con el N diluyente. Las diluciones del estándar deben
de ser usadas en un periodo de 4 horas
3. Las muestras de los pacientes se diluyen automáticamente 1:20 con N
Diluyente. Las muestras diluidas deben ser determinadas en un plazo de 4
horas.
33
RESULTADOS
En las siguientes tablas se detallan el total de variables obtenidas en los grupos de
estudio así como los resultados individuales de cada una de ellas.
TABLA 1
CICS = Complejos Inmunes Circulantes en Suero (mg/dL) CICMO = Complejos Inmunes Circulantes en Médula Ósea (mg/dL) C3S = Componente 3 del complemento en suero (mg/dL) C3MO = Componente 3 del Complemento en Médula Ósea (mg/dL) C4S = Componente 4 del complemento en suero (mg/dL) C4MO = Componente 4 del complemento en Médula Ósea (mg/dL) PCRS = Proteína C Reactiva en suero (mg/dL) PCRMO = Proteína C Reactiva en Médula Ósea (mg/dL) CLS = Anticuerpos vs cardiolipinas en suero (Densidades ópticas) CLMO = Anticuerpos vs cardiolipinas en Médula Ósea (Densidades ópticas) IL6S = Interleucina 6 en suero (mg/mL) IL6MO = Interleucina 6 en Médula Ósea (mg/mL)
VALORES OBTENIDOS EN MUESTRAS DE PACIENTES CON HEPATITIS C CRÓNICA
CICS CICMO C3S C3MO C4S C4MO PCRS PCRMO CLS CLMO IL-6S IL-6MO
8.2 8.4 15.5 15.3 8.6 7.5 0.31 0.31 1.327 0.7365 8.51 5.27
2.4 2.4 138.3 133.8 29.3 29.2 1.64 1.69 0.5445 0.5015 4.19 4.19
1.5 0.7 75.7 71.4 25.1 25.7 0.31 0.31 0.7945 0.88 10.4 6.19
3.5 2.8 38.8 39.4 10.9 9.9 0.53 0.55 1.409 1.4115 5.3 3.82
40 55.8 71.4 61.4 19.5 18.1 0.31 0.31 0.5505 0.3935 4.51 4.4
2.2 1.6 89.7 90.3 36.3 29.8 0.31 0.31 0.2815 0.202 3.35 3.25
1.6 1.4 74.1 56.8 18.7 17.2 0.31 0.31 0.651 0.5055 9.14 4.82
5.9 6.4 16.5 48.5 8.9 9.3 0.31 0.31 0.3015 0.418 6.4 4.46
2.9 3.4 54 51.3 7.4 7.4 0.66 0.59 0.7165 0.7825 6.03 4.93
3.7 4.7 77.5 63.4 20.3 16 0.31 0.45 0.399 0.6575 9.19 17.4
2.9 2.9 65.5 69.3 16.3 14.8 2.39 1.57 0.4495 0.3955 57.25 54.93
5.8 4.8 53.4 45.6 7.6 7.9 0.31 0.31 0.673 0.649 6.93 6.77
2.4 2.5 126.8 125.2 13.2 12.2 0.66 0.63 0.1465 0.1165 16.09 14.36
6.6 6.3 75.2 58.3 11.8 10.7 0.76 0.57 0.5925 0.6355 23.93 18.93
8.2 8.2 119.5 110.5 21.5 14.5 3.11 2.77 0.524 0.577 15.72 20.4
6.2 8 146.1 143.2 19.3 27.3 2.73 15.77 0.211 0.265 17.51 41.19
34
TABLA 2
VALORES OBTENIDOS EN MUESTRAS DE PACIENTES CON HEPATOPATÍA ALCOHÓLICA
CICS CICMO C3S C3MO C4S C4MO PCRS PCRMO CLS CLMO IL-6S IL-6MO
0.6 0.8 238.8 240.9 46.3 47 9.27 14.38 0.1625 0.1545 26.72 22.35
7.5 7.6 146.7 131.4 21.6 21.8 0.31 0.31 0.4725 0.59 7.77 5.67
0.9 1 160.3 144.5 29 28 0.9 0.84 0.214 0.306 3.98 3.49
3.4 3.3 51.3 51.6 6.2 6.8 0.31 0.31 0.537 0.671 7.72 5.03
15.6 8.6 72.4 63.9 10.7 10.6 0.31 0.31 0.488 0.606 11.4 6.19
1.8 1.9 31.6 29.1 11.7 12.1 0.57 0.42 0.4005 0.434 13.56 9.56
3.2 3.3 129.8 112.9 13.3 14.7 0.31 0.31 0.3649 0.348 6.14 5.14
5.5 5.3 101.1 101.1 7.7 8 0.88 0.89 0.6025 0.595 4.19 2.57
1.3 2.1 207 164.3 30.6 27 0.73 0.69 0.4865 0.4865 8.93 35.93
2.7 2.7 56.2 53.7 12 11.6 0.61 0.55 0.602 0.517 16.72 7.93
3.5 3.8 41.1 45.4 15 16 0.31 1.95 0.2425 0.269 18.51 13.98
TABLA 3
VALORES OBTENIDOS EN MUESTRAS DE INDIVIDUOS SANOS
CICS CICMO C3S C3MO C4S C4MO PCRS PCRMO CLS CLMO IL-6S IL-6MO
1.8 2.2 276.4 214.4 31.4 26.1 0.31 0.31 0.151 0.1485 3.3 3.35
1.5 1.4 128.9 135.9 15.4 25.7 0.31 0.31 0.1855 0.169 2.3 2.88
1.1 1.1 152.5 173.7 26 29.1 0.31 0.31 0.133 0.079 1.77 2.09
0.8 0.9 141 137.2 28 29 0.31 0.31 0.1585 0.196 3.66 3.35
0.8 0.8 280.4 287.7 25 27 0.31 0.31 0.0645 0.159 2.61 2.82
CICS = Complejos Inmunes Circulantes en Suero (mg/dL) CICMO = Complejos Inmunes Circulantes en Médula Ósea (mg/dL) C3S = Componente 3 del complemento en suero (mg/dL) C3MO = Componente 3 del Complemento en Médula Ósea (mg/dL) C4S = Componente 4 del complemento en suero (mg/dL) C4MO = Componente 4 del complemento en Médula Ósea (mg/dL) PCRS = Proteína C Reactiva en suero (mg/dL) PCRMO = Proteína C Reactiva en Médula Ósea (mg/dL) CLS = Anticuerpos vs cardiolipinas en suero (Densidades ópticas) CLMO = Anticuerpos vs cardiolipinas en Médula Ósea (Densidades ópticas) IL6S = Interleucina 6 en suero (mg/mL) IL6MO = Interleucina 6 en Médula Ósea (mg/mL)
35
La media de los complejos inmunes circulantes en suero (CICS) de los pacientes
con Hepatitis C crónica fue de 4.2657 con una desviación estándar de 2.3268 (IC
0.2948 a 8.8262). La media de los complejos inmunes circulantes en Médula Ósea
(CICMO) fue de 4.3 con una desviación estándar de 2.6058 (IC 0.8073 a 9.4073)
(Figura 2), la regresión lineal entre estas dos variables tiene una p<0.001 y una r
= 0.963 (Figura 3 A). Los valores individuales de los CICS y CICMO se encuentran
en la Tabla 1. La media de los CICS de los pacientes con Hepatopatía Alcohólica
fue de 3.04 con una desviación estándar de 2.148 (IC 1.17 a 7.25). La media de
los CICMO fue de 3.6727 con una desviación estándar de 2.5417 (IC 1.309 a
8.6544) (Figura 2), la regresión lineal entre estas dos variables tiene una p = 0.269
y una r = 0.387 (Figura 3 B). Los valores individuales de los CICS y CICMO se
encuentran en la Tabla 2. La media de los CICS de los individuos sanos fue de 1.2
con una desviación estándar de 0.4416 (IC 0 a 2.0655). La media de los CICMO
fue de 1.28 con una desviación estándar de 0.563 (IC 0 a 2.3834) (Figura 2). La
regresión lineal entre estas dos variables tiene una p = 0.011 y una r = 0.995
(Figura 3 C). Los valores individuales de los CICS Y CICMO se encuentran en la
Tabla 3.
VHC HA SANOS
Co
mp
lejo
s In
mu
ne
s C
ircu
lan
tes
(mg
/dL
)
0
1
2
3
4
5
6
CIC S
CIC MO
Figura 2. Gráfica de la media grupal de complejos inmunes circulantes en el grupo de Hepatitis C Crónica (VHC), de Hepatopatía alcohólica (HA) y en individuos sanos (sanos). El * indica p < 0.05 entre el grupo de VHC y sanos.
*
36
1 2 3 4 5 6 7 8 9
CIC
en
Mé
du
la Ó
se
a (
mg
/dL
)
0
2
4
6
8
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CIC
en
Mé
du
la Ó
se
a (
mg
/dL
)
0
2
4
6
8
10
CIC en Suero (mg/dL)
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
CIC
en
Mé
du
la Ó
se
a (
mg
/dL
)
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
P < 0.001r = 0.963
P = 0.269r = 0.387
P = 0.011r = 0.955
Figura 3. Regresión lineal de los niveles de complejos inmunes circulantes en suero con los de complejos inmunes circulantes en médula ósea. A: grupo de Hepatitis C, B: grupo de Hepatopatía Alcohólica y C: grupo de individuos sanos. La significancia estadística (P) y la correlación (r) se indican en cada gráfica.
A
B
C
37
La media de los valores de la Interleucina 6 en suero (IL-6S) de los pacientes con
hepatitis C Crónica fue de 9.8133 con una desviación estándar de 5.9273 (IC
1.8042 a 21.4308). La media de la Interleucina 6 en Médula Ósea (IL-6MO) fue de
10.692 con una desviación estándar de 10.3742 (IC 9.6414 a 31.0254) (Fig. 4). La
regresión lineal entre estas dos variables tiene una p = 0.002 y una r = 0.742 (Fig.
5A). Los valores individuales de IL-6S y IL-6MO se encuentran en la Tabla 1.
La media de la IL-6S de los pacientes con hepatopatia alcohólica fue de 9.892 con
una desviación estándar de 5.0366 (IC 0 a 19.7637). La media de la IL-6MO fue
de 8.191 con una desviación estándar de 5.9562 (IC 3.4831 a 19.8651) (Fig.4). La
regresión lineal entre estas dos variables tiene una p = 618 y una r = 181 (Fig. 5B).
Los valores individuales de IL-6S e IL-6MO se encuentran en la Tabla 2.
La media de la IL-6S de los individuos sanos fue de 2.728 con una desviación
estándar de 0.76 (IC 0 a 4.2176). La media de la IL-6MO fue de 2.898 con una
desviación estándar de 0.5167 (IC 0 a 3.9107) (Fig. 4). La regresión lineal entre
estas dos variables tiene una p = 0.019 y una r = 0.936 (Fig. 5C). Los valores
individuales de IL-6S e IL-6MO se encuentran en la Tabla 3.
VHC HA SANOS
Inte
rleuci
na 6
(g/m
L)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
IL-6 S
IL-6 MO
Figura 4. Gráfica de la media grupal de Interleucina 6 en el grupo de Hepatitis C Crónica (VHC), Hepatopatía Alcohólica (HA) y en individuos sanos (sanos). El * indica p < 0.05 entre el grupo de VHC y sanos y del grupo de HA y sanos.
* *
38
0 5 10 15 20 25
Inte
rle
ucin
a 6
en
Mé
du
la Ó
se
a (
pg
/dL
)
0
10
20
30
40
50
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Inte
rle
ucin
a 6
en
Mé
du
la Ó
se
a (
pg
/dL
)
0
5
10
15
20
25
Interleucina 6 en Suero ( g/dL)
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Inte
rle
ucin
a 6
en
Mé
du
la Ó
se
a (
pg
/dL
)
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
P = 0.002r = 0.742
P = 0.618r = 0.181
P = 0.019r = 0.936
Figura 5. Regresión lineal de la Interleucina 6 en suero con la Interleucina 6 en médula ósea, A: grupo de Hepatitis C, B: grupo de Hepatopatía alcohólica, C: grupo de individuos sanos. La significancia estadística (P) y la correlación (r) se indican en cada gráfica.
A
B
C
39
La media de los valores de anticuerpos contra cardiolipinas en suero (CLS) de los
pacientes con hepatitis C crónica fue de 0.4882 con una desviación estándar de
0.1974 (IC 0 a 0.8751). La media de los anticuerpos contra cardiolipinas en
médula ósea (CLMO) fue de 0.5144 con una desviación estándar de 0.285 (IC
0.0442 a 1.073) (Fig. 6). La regresión lineal entre estas dos variables tiene una p =
0.294 y una r = 302 (Fig. 7A). Los valores individuales de CLS y CLMO se
encuentran en la Tabla 1. La media de los CLS de los pacientes con hepatopatia
alcohólica fue de 0.4157 con una desviación estándar de 0.1534 (IC 0 a 0.7163).
La media de los CLMO fue de 0.4525 con una desviación estándar de 0.1646 (IC 0
a 0.7751) (Fig. 6). La regresión lineal entre estas dos variables tiene una p < 0.001
y una r = 0.906 (Fig. 7B). Los valores individuales de CLS y CLMO se encuentran
en la Tabla 2. La media de los CLS de los individuos sanos fue de 0.1385 con una
desviación estándar de 0.0455 (IC 0 a 0.2276). La media de los CLMO fue de
0.1503 con una desviación estándar de 0.0463 (IC 0 a 0.241) (Fig. 6). La regresión
lineal entre estas dos variables tiene una p = 0.758 y r = 0.192 (Fig. 7C). Los
valores individuales de los CLS y CLMO se encuentran en la Tabla 3.
VHC HA SANOS
Anticuerp
os c
ontr
a c
ard
iolip
inas (
DO
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
CL S
CL MO
Figura 6. Gráfica de la media grupal de anticuerpos contra cardiolipinas en el grupo de Hepatitis C Crónica (VHC), Hepatopatía Alcohólica (HA) y en individuos sanos (sanos). El * indica p < 0.05 entre el grupo de VHC y sanos y del grupo de HA y sanos.
*
*
40
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
An
ticu
erp
os a
ntica
rdio
lip
ina
en
MO
(D
O)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
An
ticu
erp
os a
nti c
ard
iolip
ina
en
MO
(D
O)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Anticuerpos anticardiolipina en suero (DO)
0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20
An
ticu
erp
os a
ntica
rdio
lip
ina
en
MO
(D
O)
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
P = 0.294r = 0.302
P < 0.001r = 0.906
P = 0.758r = 0.192
Figura 7. Regresión lineal de los anticuerpos anticardiolipinas en suero con los anticuerpos anticardiolipinas en médula ósea. A: grupo de Hepatitis C, B: grupo de Hepatopatía Alcohólica, C: grupo de individuos sanos. La significancia estadística (P) y la correlación (r) se indican en cada gráfica.
A
B
C
41
La media de los valores de la proteína C reactiva en suero (PCRS) de los
pacientes con hepatitis C crónica fue de 0.79 mg/dL con una desviación estándar
de 0.8014 mg/dL (IC 0.7807 a 2.3607). La media de la proteína C reactiva en
médula ósea (PCRMO) fue de 0.7327 mg/dL con una desviación estándar de
0.7166 mg/dL (IC 0.6718 a 2.1372) (Fig. 8). La regresión lineal entre estas dos
variables tiene una p < 0.001 y una r = 0.963 (Fig. 9A). Los valores individuales de
la PCRS y PCRMO se encuentran en la Tabla 1.La media de la PCRS de los
pacientes con HA fue de 0.524 mg/dL con una desviación estándar de 0.247
mg/dL (IC 0 a 1.0081). La media de la PCRMO fue de 0.658 mg/dL con una
desviación estándar de 0.5066 mg/dL (IC 0.3349 a 1.6509) (Fig. 8). La regresión
lineal entre estas dos variables tiene una p = 0.648 y una r = 0.191 (Fig. 9B). Los
valores individuales de la PCRS y PCRMO se encuentran en la Tabla 2. La media
de la PCRS de los individuos sanos fue de 0.31 mg/dL con una desviación
estándar de 0 mg/dL (IC no es factible por falta de variación). La media de la
PCRMO fue de 0.31 mg/dL y una desviación estándar de 0 mg/dL (IC o es factible
por falta de variación) (Fig. 8). La regresión lineal entre estas dos variables no es
factible por falta de variación (Fig. 9C). Los valores individuales de la PCRS y
PCRMO se encuentran en la Tabla 3.
VHC HA SANOS
Pro
teín
a C
Re
activa
(m
g/d
L)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
PCR S
PCR MO
Figura 8. Gráfica de la media grupal de la Proteína C Reactiva en el grupo de Hepatitis C Crónica (VHC), Hepatopatía Alcohólica (HA) y en individuos sanos (sanos). No hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.
42
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
PC
R e
n M
éd
ula
Óse
a (
mg
/dL
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
PC
R e
n M
éd
ula
Óse
a (
mg
/dL
)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
PCR en Suero (mg/dL)
0.0 0.5 1.0 1.5
PC
R e
n M
éd
ula
Óse
a (
mg
/dL
)
0.0
0.5
1.0
1.5
P < 0.001r = 0.963
P = 0.698r = 0.141
No factible
Figura 9. Regresión lineal de la Proteína C Reactiva en suero con la proteína C Reactiva en médula ósea. A: grupo de Hepatitis C, B: grupo de Hepatopatía alcohólica y C: individuos sanos. La significancia estadística (P) y la correlación (r) se indican en cada gráfica, en el caso del grupo de individuos sanos no es factible realizar una regresión lineal por falta de variabilidad
A
B
C
43
La media de los niveles de componente 3 del complemento en suero (C3S) de los
pacientes con hepatitis C crónica fue de 77.375 mg/dL con una desviación
estándar de 39.2791 mg/dL (IC 0 a 154.362). La media del componente 3 del
complemento en médula ósea (C3MO) fue de 73.9813 mg/dL con una desviación
estándar de 36.5525 mg/dL (IC 0 a 145.6242) (Fig.10). La regresión lineal entre
estas dos variables tiene una p < 0.001 y una r = 0.958 (Fig. 11A). Los valores
individuales del C3S y C3MO se encuentran en la Tabla 1. La media del C3S de
los pacientes con hepatopatía alcohólica fue de 112.3909 mg/dL con una
desviación estándar de 69.951 mg/dL (IC 24.7130 a 249.4948). La media del
C3MO fue de 103.5273 mg/dL con una desviación estándar de 63.8606 mg/dL (IC
21.6394 a 228.6940) (Fig. 10). La regresión lineal entre estas dos variables tiene
una p < 0.001 y una r = 0.984 (Fig. 111B). Los valores individuales del C3S y
C3MO se encuentran en la Tabla 2. La media del C3S de los individuos sanos fue
de 195.84 mg/dL con una desviación estándar de 75.8404 mg/dL (IC 0 a
344.4871). La media del C3MO fue de 189.78 mg/dL con una desviación estándar
de 63.4838 mg/dL (IC 0 a 314.2082) (Fig. 10). La regresión lineal entre estas dos
variables tiene una p = 0.034 y una r = 0.906 (Fig. 11C). Los valores individuales
del C3S y C3MO se encuentran en la Tabla 3.
VHC HA SANOS
Com
ponente
3 d
el com
ple
mento
(m
g/d
L)
0
50
100
150
200
250
C3 S
C3 MO
Figura 10. Gráfica de la media grupal del componente 3 del complemento en el grupo de Hepatitis C Crónica (VHC), Hepatopatía Alcohólica (HA) y en individuos sanos (sanos). El * indica p < 0.05 entre el grupo de VHC y sanos y del grupo de HA y sanos.
*
* *
*
44
0 20 40 60 80 100 120 140 160
C3
en
Méd
ula
Óse
a m
g/d
L)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 50 100 150 200 250
C3
en
Méd
ula
Óse
a (
mg/d
L)
0
50
100
150
200
250
300
C3 en Suero (mg/dL)
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
C3
en
Méd
ula
Óse
a (
mg/d
L)
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
P < 0.001r = 0.958
P < 0.001r = 0.984
P = 0.034r = 0.906
Figura 11. Regresión lineal del componente 3 del Complemento en suero con el C3 en médula ósea. A: Hepatitis C, B: Hepatopatía alcohólica y C: grupo de individuos sanos. La significancia estadística (P) y la correlación (r) se indican en cada gráfica.
A
B
C
45
La media de los niveles de componente 4 del complemento en suero (C4S) de los
pacientes con hepatitis C crónica fue de 15.8933 mg/dL con una desviación
estándar de 6.7611 mg/dL (IC 0 a 29.145). La media del componente 4 en médula
ósea (C4MO) fue de 16.0938 mg/dL con una desviación estándar de 7.8838 mg/dL
(IC 0 a 31.546) (Fig. 12). La regresión lineal entre estas dos variables tiene una p
= 0. 018 y una r = 0.594 (Fig. 13A). Los valores individuales del C4S y C4MO se
encuentran en la Tabla 1. La media del C4S en pacientes con hepatopatía
alcohólica fue de 15.78 mg/dL con una desviación estándar de 8.4908 mg/dL (IC
0.8619 a 32.4219). La media del C4MO fue de 15.66 mg/dL con una desviación
estándar de 7.5391 mg/dL (IC 0 a 30.4366) (Fig. 12). La regresión lineal entre
estas dos variables tiene una p < 0.001 y una r = 0.992 (Fig. 13B). Los valores
individuales del C4S y C4MO se encuentran en la Tabla 2. La media del C4S de
los individuos sanos fue de 25.16 mg/dL con una desviación estándar de 5.979
mg/dL (IC 0 a 36.8788). La media del C4MO fue de 27.38 mg/dL con una
desviación estándar de 1.5959 mg/dL (IC 0 a 30.5079) (Fig. 12). La regresión
lineal entre estas dos variables tiene una p = 0.528 y una r = 0.38 (Fig. 13C). Los
valores individuales del C4S y C4MO se encuentran en la Tabla 3.
VHC HA SANOS
Com
ponente
4 d
el C
om
ple
mento
(m
g/d
L)
0
5
10
15
20
25
30
C4 S
C4 MO
Figura 12. Gráfica de la media grupal del componente 4 del complemento en el grupo de Hepatitis C Crónica (VHC), Hepatopatía Alcohólica (HA) y en individuos sanos (sanos). El * indica p < 0.05 entre el grupo de VHC y sanos y del grupo de HA y sanos.
* *
* *
46
5 10 15 20 25 30 35
C4
en
Mé
du
la Ó
se
a (
mg
/dL
)
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35
C4
en
Mé
du
la Ó
se
a (
mg
/d)
5
10
15
20
25
30
C4 en Suero (mg/dL)
14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
C4
en
Mé
du
la Ó
se
a (
mg
/dL
)
25.5
26.0
26.5
27.0
27.5
28.0
28.5
29.0
29.5
P = 0.018r = 0.599
P < 0.001r = 0.992
P = 0.528r = 0.380
Figura 13. Regresión lineal del C4 del Complemento en suero con el C4 en médula ósea. A: grupo de Hepatitis C, B: grupo de Hepatopatía alcohólica y C: grupo de individuos sanos. La significancia estadística (P) y la correlación (r) se indican en cada gráfica.
A
B
C
47
DISCUSIÓN
Los complejos inmunes circulantes (CIC) son producidos por una respuesta de
anticuerpos a antígenos solubles, estos complejos van a ser eficientemente
eliminados de la circulación gracias al sistema fagocítico mononuclear Janeway et al,
2005. Este fenómeno se encuentra presente aún en situaciones de normalidad
(individuos sanos) sin que por ello se considere patológico, en algunas
condiciones especiales el cuerpo no es hábil para eliminar estos complejos
inmunes de la circulación y entonces se vuelven patológicos. Existen 3
mecanismos de falla en este sistema, uno de los cuales es por la presencia de una
infección crónica Janeway et al, 2005 como en el caso de la infección por virus de VHC.
En nuestro estudio establecimos la presencia de los complejos inmunes en
individuos sanos, con una media en suero (S) de 1.2 mg/dL (IC 0–2.0655), así
como en el sobrenadante de médula ósea (MO) con una media de 1.28 mg/dL (IC
0–2.3834) (Fig. 2), esto último no reportado en la literatura y por lo tanto fue
necesario realizar un modelo de correlación para determinar la intensidad de la
relación lineal entre las dos variables y de esta manera poder establecer si
estábamos ante una distribución normal bivariada. La ecuación de la regresión
lineal fue: CICMO = -0.182 + (1.218*CICS), con un coeficiente de correlación (r) de
0.955 validado mediante un análisis de varianza con una p = 0.011 (ver figura 5C),
con lo anterior establecimos una correlación lineal directa al 95% entre las dos
variables y por lo tanto se trata de una distribución normal bivariada, es decir
estamos ante dos poblaciones (CICS y CICMO) diferentes pero intensamente
(95%) relacionadas.
En el grupo de estudio (individuos infectados con VHC encontramos niveles
incrementados de los complejos inmunes circulantes en suero, con una media
4.2667 mg/dL (IC 0.2948–8.8262) (Fig. 2). Al realizar un análisis de varianza
encontramos una diferencia estadísticamente significativa con una p = 0.026 y
mediante el método de comparación de medias de Duncan encontramos una p <
0.05 en relación a los individuos sanos (Fig. 2) tal como ha sido demostrado por
48
otros autores [Fujita et al, 2006, Marino et al, 2005, Peng et al, 2002, Wang et al, 2003]. Mientras que
entre el grupo de estudio y el control (hepatopatia alcohólica [HA]) no se
encontraron diferencias significativas, pero se puede observar que la tendencia de
los complejos inmunes circulantes en suero es mayor (Fig. 2), este resultado es
concordante con lo previamente reportado por Miyaike en donde demuestra que
los niveles de CIC son más elevados significativamente en los individuos
infectados por VHC [Miyaike et al, 2002]. Por otro lado pudimos establecer la presencia
de estos complejos inmunes en el sobrenadante de médula ósea, con una media
de 4.3 mg/dL (IC 0.8073–9.4073) (Fig. 2) lo cual no ha sido reportado en la
literatura. La ecuación de la regresión lineal fue: CICMO = -0.301 + (1.078*CICS),
con un coeficiente de correlación (r) de 0.963 validado mediante un análisis de
varianza con una p < 0.001 (Fig. 5A). Para esta población el análisis de varianza
no demostró diferencias significativas entre los tres grupos.
En los pacientes con crioglubulinemia mixta (CM) e infección por VHC se ha
demostrado que los complejos inmunes crioprecitables contienen proteínas del
core del VHC no encapsulado [Sansonno et al, 2003] y CIC con viriones libres en
pacientes infectados con VHC sin crioglubulinemia [Fujita et al, 2003], por lo que
consideramos que en nuestros pacientes, los niveles incrementados de CIC tienen
el mismo mecanismo el cual está exacerbado por la falta de depuración de los CIC
en el sistema reticuloendotelial del hígado lesionado de los pacientes. Por otro
lado se ha postulado que los CIC están asociados a varias de las manifestaciones
extra hepáticas [Miyaike et al, 2002] de la infección crónica por VHC ya que los CIC van
a ser transportados entre otros por células que tengan el receptor RII Fc gamma y
mediante esta unión se va a favorecer el ingreso del VHC a dichas células [Marino et
al, 2005]
En el grupo control (pacientes con hepatopatia alcohólica [HA]) la media de los
complejos inmunes circulantes en suero fue de 3.04 mg/dL (IC 1.17-7.25) y
mediante el análisis de varianza no encontramos diferencia significativa con los
otros dos grupos (Sanos y VHC) (Fig. 2). Se ha encontrado en otros estudios la
presencia de complejos inmunes en pacientes con hepatopatia alcohólica, tanto en
suero como en tejidos de los pacientes [Leevy y Elbeshbeshy, 2005] pero sin que se hayan
49
reportado los valores de los CIC. Por otro lado pudimos establecer la presencia de
estos complejos inmunes en el sobrenadante de médula ósea, con una media de
3.6727 mg/dL (IC 1.309–8.6544) (Fig. 2) lo cual no ha sido reportado en la
literatura. La ecuación de la regresión lineal fue: CICMO = 2.192 + (0.483*CICS),
con un coeficiente de correlación (r) de 0.387 validado mediante un análisis de
varianza con una p = 0.269 (Fig. 5B), por lo que no podemos establecer una
correlación entre las 2 variables. Para esta población el análisis de varianza no
demostró diferencias significativas entre los tres grupos (Fig. 2). En este grupo de
estudio, a diferencia de los infectados con VHC, no hay un antígeno específico
que esté condicionando los CIC, si no que éstos son el resultado de la
permeabilidad aumentada del intestino, secundaria a la ingesta crónica de alcohol,
lo que permite el ingreso masivo de antígenos al sistema porta, dando como
resultado el incremento en el número de CIC y además por la falla hepática hay
una marcada disminución en la depuración de los mismos.
La IL-6 es una citocina pro-inflamatoria la cual tiene un importante papel en los
mecanismos de defensa del huésped. Sus niveles séricos son muy bajos en
condiciones fisiológicas pero se incrementan considerablemente en diversas
patologías tales como trauma, inflamación y neoplasias [Soresi et al, 2006, Scheller et al, 2006]
En nuestro estudio la media de IL-6 en el grupo de individuos sanos en suero fue
de 2.728 pg/mL (IC 0–4.2176) (Fig. 4), lo cual coincide con lo reportado por el
grupo de Soresi en donde la media es de 3.6 con un rango de 3-17 [Soresi et al, 2006] ,
pero difiere con las concentraciones encontradas por Fukuma et al quienes tienen
una media de 16 +/- 7.1 pg/mL [Fukuma et al, 1996] Esto probablemente es debido a los
reactivos del ELISA empleado en nuestro estudio (doble sándwich cuantitativo).
En el sobrenandante de médula ósea encontramos una media de 2.898 pg/mL (IC
0-3.9107) (Fig. 4), que no ha sido reportado en la literatura. La ecuación de la
regresión lineal fue: IL-6MO = 1.162 + (0.637 * IL-6S), con un coeficiente de
correlación (r) de 0.936 validado mediante un análisis de varianza con una p =
0.019 (ver figura 5C), con lo anterior establecimos una correlación lineal directa al
95% entre las dos variables
50
En el grupo de estudio (VHC) encontramos niveles incrementados de IL-6 en
suero, con una media de 9.8133 pg/mL (IC 1.8042–21.4308). Al realizar un
análisis de varianza encontramos una diferencia estadísticamente significativa con
una p = 0.031 entre los grupos y mediante en método de comparación de medias
de Duncan tenemos una p < 0.05 en relación a los individuos sanos (Fig. 4) tal
como ha sido demostrado ampliamente por otros autores y nuevamente
observamos que nuestros resultados son muy parecidos a los de Soresi et al que
tiene una media de 6.4 con un rango de 3 a 155 [Soresi et al, 2006] a diferencia de las
encontradas por Fukuma et al y de Lecube y Hernández, ya que mientras Fukuma
tiene concentraciones mucho más elevadas con una media de 35.4 +/- 25.4 [Fukuma
et al, 1996] Lecube y Hernández tienen concentraciones mucho menores con una
media de 3.78 +/- 3.06 [Lecube and Hernández, 2006] estas últimas comparadas con Soresi
y nosotros estarían en el rango de los individuos sanos y esto seguramente es
debido tanto al tipo de reactivo empleado en cada estudio como a la variabilidad
genética de los individuos participantes, así como a la severidad y tiempo de
evolución de la enfermedad. Entre este grupo y el control (HA) no se encontraron
diferencias significativas y la concentración en suero tiende a ser muy similar
(Figura 4). La media de la IL-6 en el sobrenadante de médula ósea fue de 10.692
pg/mL (IC 9.6414–31.0254) (Fig. 4) lo cual no ha sido reportado en la literatura. La
ecuación de la regresión lineal fue: IL-6MO=-2.057 + (1.299 * IL-6S) con un
coeficiente de correlación (r) de 0.742 validado mediante un análisis de varianza
con una p = 0.002 (Figura 5A) con lo anterior establecimos una correlación lineal
directa al 95% entre estas dos variables. Para esta población el análisis de
varianza no demostró diferencias significativas entre los tres grupos (Fig. 4). La IL-
6 es una citocina clave en la regeneración hepática, ya que es un potente
mitógeno de hepatocitos, participa en los procesos de regeneración hepática e
inhibe la apoptosis de los hepatocitos [Pachówka et al, 2008, Clavien PA, 1997]. Sin embargo la
persistente concentración elevada de la IL-6 puede condicionar el agotamiento sus
funciones regenerativas además de sobreestimular a los reactantes de fase aguda
que condicionaran un estado inflamatorio persistente que permitirá la progresión a
51
la cirrosis hepática y en algunas condiciones especiales el desarrollo de
hepatocarcinoma.
En el grupo control (HA) la media de IL-6 en suero fue de 9.892 pg/mL (IC 0–
19.7637) y mediante el análisis de varianza pudimos establecer una diferencia
estadísticamente significativa con una p = 0.031 y mediante el método de
comparación de medias de Duncan encontramos una p<0.05 con el grupo de
sujetos sanos (Fig. 4) tal como ha sido demostrado por el grupo de Latvala y
colaboradores [Latvala et al, 2005] sin embargo este grupo no indica las medias ni las
desviaciones encontradas en su estudio. Por otra parte no se demostraron
diferencias estadísticamente significativas con el grupo control (VHC). En el
sobrenadante de médula ósea tuvimos una media de la IL-6 de 8.191 pg/mL (IC
3.4831–19.8651), lo cual no ha sido reportado en la literatura (Fig. 4). La ecuación
de la regresión lineal fue: IL-6MO = 6.079 + (0.213 * IL-6S) con un coeficiente de
correlación (r) de 181 validado mediante un análisis de varianza con una p=0.618
(Figura 5B) por lo que no podemos establecer una correlación entre estas dos
variables. Para esta población el análisis de varianza no demostró diferencias
significativas entre los tres grupos (Fig. 4). El daño hepático en la hepatitis
alcohólica está mediado por disturbios del sistema inmune, que inducen una
miriada de manifestaciones inmunológicas, las cuales incluyen entre otras
liberación de citocinas proinflamatorias como la IL-6 que estimula la síntesis de
proteínas de fase aguda por parte del hepatocito [Leevy y Elbeshbeshy 2005] que junto con
los otros reactantes de fase aguda (PCR) y citocinas pro-inflamatorias pueden
condicionar el daño hepático que conllevará a la fibrosis.
Los anticuerpos anticardiolipina (CL) son un grupo heterogéneo de anticuerpos
con aparente afinidad a los fosfolípidos aniónicos y su presencia se asocia a
enfermedades autoinmunes, infecciosas y otras condiciones. En pacientes con
enfermedades autoinmunes estos anticuerpos se asocian con trombosis,
trombocitopenia, pérdidas fetales y una amplia variedad de manifestaciones
clínicas (livedo reticularis, enfermedad valvular cardiaca, etc). Estas asociaciones
52
clínicas han sido definidas como síndrome antifosfolípido. En este síndrome los
anticuerpos anticardiolipina requieren que la beta 2 glicoproteína uno (B2GPI) se
una a la cardiolipina, pero los anticuerpos anticardiolipina inducidos por
infecciones usualmente no requieren de este cofactor para unirse a los fosfolipidos
aniónicos por lo que son considerados no patogénicos [Ordis-Ros et al, 2000] En nuestro
estudio elaboramos un ELISA para detectar los anticuerpos polivalentes (IgG e
IgM) contra la cardiolipina, de acuerdo a nuestros parámetros las densidades
ópticas por debajo de 0.5 se consideran negativas, las de la zona gris requieren
confirmación con clases (IgG o IgM) cuando las densidades ópticas se encuentran
entre 0.500 y 1.0 y son positivos cuando los valores son mayores a 1.0. El grupo
de individuos sanos no presentó anticuerpos contra cardiolipinas, con una media
de densidades ópticas de 0.1385 (IC 0-0.2276) lo cual es consistente con la
literatura [Harada et al, 2000; Ordis-Ros et al, 2000; Sthoeger et al, 2000; Zachou et al, 2003] y en el
sobrenadante de médula ósea la media fue de 0.1503 (IC 0-0.241), lo cual no ha
sido reportado en la literatura. La ecuación de la regresión lineal fue: CLMO =
1.125 + (0.184 * CLS), con un coeficiente de correlación (r) de 0.192 validado
mediante un análisis de varianza con una p=0.758 (Figura 7C), con lo anterior no
podemos establecer una correlación entre estas dos variables
El grupo de estudio (VHC) presenta anticuerpos anticardiolipina en suero con una
media de densidades ópticas de 0.4882 (IC 0-0.8751) y mediante el análisis de
varianza pudimos establecer una diferencia estadísticamente significativa con una
p = 0.002 y mediante el método de comparación de medias de Duncan
encontramos una p<0.05 con el grupo de sujetos sanos (Fig. 6) tal como ha sido
demostrado por otros grupos [Harada et al, 2000; Ordis-Ros et al, 2000; Sthoeger et al, 2000; Zachou et al,
2003]. Por otra parte no se demostraron diferencias estadísticamente significativas
con el grupo control (HA). Los resultados grupales de esta variable como grupo lo
hace negativo, sin embargo si los analizamos individualmente podemos notar que
2/15 tienen anticuerpos anticardiolipína positivos lo que corresponde al 13.3% del
grupo, lo cual se encuentra dentro de los rangos reportados en los diferentes
estudios, que oscilan del 3 al 40% [Harada et al, 2000; Ordis-Ros et al, 2000; Sthoeger et al, 2000;
53
Zachou et al, 2003] La tan elevada variación de la prevalencia de los anticuerpos
anticardiolipina puede ser atribuida a los métodos de laboratorio empleados. Por
otro lado 7/15 de las muestras de pacientes (46.6%) se encuentran en zona gris y
por lo tanto requerirían confirmación para la positividad de anticuerpos
anticardiolipina, sin embargo esto no fue posible realizar. En el sobrenadante de
médula ósea la media de densidades ópticas fue de 0.5144 (0.0442-1.073), esto
último no ha sido reportado en la literatura. Como grupo esta variable se encuentra
en zona gris pero analizado individualmente encontramos 1/15 positivo lo que
corresponde al 6.67 % y 8/15 muestras de pacientes en zona gris que
corresponden al 53.3%; ambos resultados muy parecidos a lo encontrado en
suero La ecuación de regresión lineal fue: CLMO = 0.693 – (0.329 * CLS) con un
coeficiente de correlación (r) de 0.302, validado mediante un análisis de varianza
con una p = 0.294 (Figura 7A) con lo anterior no podemos establecer una
correlación entre estas dos variables. La posible causa de la producción de estos
autoanticuerpos es que las células infectadas por virus liberan productos pro-
coagulantes provenientes de fragmentos de la membrana y macromoléculas
cargadas negativamente y que puedan unirse a la 2-glicoproteína-I pudiendo
estimular la síntesis de anticuerpos anticardiolipinas [Yuste and Prieto, 2003] Otra posible
causa es que los productos génicos del VHC (proteína del core, proteína 3 y 5 no
estructural) pueden influir en las señales de transducción en las células infectadas,
estos eventos pueden inducir alteraciones inmunológicas y disparar las
manifestaciones extrahepáticas, incluyendo la producción de estos
autoanticuerpos [Harada et al, 2000]
El grupo control (HA) presenta anticuerpos anticardiolipinas en suero con una
media de densidades ópticas de 0.4157 (IC 0-0.7163) y mediante el análisis de
varianza se estableció una diferencia estadísticamente significativa con una p =
0.002 y mediante el método de comparación de medias de Duncan encontramos
una p<0.05 con el grupo de sujetos sanos (Fig. 6) tal como ha sido demostrado
por otros grupos [Gerz, 2003, Rolla et al, 2001] . Por otra parte no se demostraron
diferencias estadísticamente significativas con el grupo de estudio (VHC). Los
54
resultados grupales de esta variable como grupo lo hacen negativo, sin embargo si
los analizamos individualmente podemos notar que 3/11 se encuentran en zona
gris y por lo tanto requerirían confirmación para la positividad de anticuerpos
anticardiolipina, nuestros resultados difieren con los reportes de los últimos años,
en donde han encontrado una importante asociación entre la intoxicación
alcohólica y la presencia de anticuerpos antifosfolipidos circulantes, cuyos rangos
de positividad oscilan entre el 48% al 81% [Gerz, 2003, Rolla et al, 2001] recientemente el
grupo de Rolla y colaboradores encontró una prevalencia del 55% en los pacientes
con cirrosis alcohólica, del 31% en los pacientes alcohólicos sin cirrosis pero con
pruebas de función hepática alteradas (similares a nuestro grupo) y del 15% al
17% en los alcohólicos con pruebas de función hepática normales [Rolla et al, 2001];
una posible explicación para esta discrepancia en nuestros resultados es la falta
de confirmación en los pacientes en zona gris ya que en el caso hipotético de que
uno de estos pacientes hubiera sido positivo tendríamos entonces un 9%, con dos
pacientes tendríamos un 18% y con tres pacientes el 27% de positividad para
estos autoanticuerpos y por lo tanto estaríamos en los rangos descritos por Rolla.
En el sobrenadante de médula ósea se obtuvo una media de 0.4525 (IC 0-0.7751),
no reportada en la literatura. Como grupo esta variable es negativa pero analizada
individualmente encontramos 5/11 (45%) en zona gris. La ecuación de regresión
lineal fue : CLMO = 0.0483 + (0.972 * CLS) con un coeficiente de correlación (r) de
0.906 validado mediante un análisis de varianza con una p<0.001. Con lo anterior
establecimos una correlación lineal directa al 95% entre estas dos variables
La proteína C reactiva (PCR) es un reactante de fase aguda que en condiciones
fisiológicas se encuentra presente pero en concentraciones escasas, dependiendo
del método empleado serán los valores de normalidad, en nuestro caso se
considero como normales o negativos los valores <0.5 mg/dL. En el caso de los
individuos sanos encontramos una media de PCR en suero de 0.31 mg/dL lo cual
está dentro de los rangos esperados y en el sobrenadante de médula ósea una
media de 0.31mg/dL esto último no reportado en la literatura. En el caso de estas
dos variables no es factible la realización de la regresión lineal ya que como todos
55
los valores de los individuos sanos en suero y médula ósea son los mismos
(0.31mg/dL) no hay variación para poder realizar este análisis estadístico.
En el grupo de estudio (VHC) la media en suero de la PCR fue de 0.79 (IC 0.7807-
2.3607) y mediante el análisis de varianza tenemos una p = 0.258 por lo que no
encontramos diferencias significativas con los otros dos grupos (sanos y HA) (Fig.
8) y en el sobrenadante de médula ósea fue de 0.7327 (IC 0.6718-2.1372) esto
último no reportado en la literatura. El análisis de varianza tiene una p = 0.395 por
lo que no podemos establecer diferencias significativas con los otros dos grupos
(sanos y HA) (Fig. 8). La ecuación de regresión lineal fue: PCRMO = 0.0521 +
(0.861 * PCRS) con un coeficiente de correlación (r) de 0.963 validado mediante
un análisis de varianza con una p<0.001, con lo anterior podemos establecer una
correlación lineal directa al 95% entre ambas variables
En el grupo control (HA) la media en suero de la PCR fue de 0.524 (IC 0-1.0081) y
mediante el análisis de varianza tenemos una p = 0.258 con lo cual no podemos
establecer diferencias estadísticamente significativas con los otros 2 grupos
(sanos y VHC). Con estos resultados podemos establecer un proceso inflamatorio
crónico sistémico en estos pacientes, lo cual es similar con lo reportado por el
grupo de Pemberton y cols. en donde estudiaron a 24 pacientes con cirrosis
alcoholica y los valores de la PCR fueron significativamente más elevados que en
los controles sanos (p<0.001) [Pemberton et al, 2005] y aunque en nuestros pacientes
evidenciamos un proceso inflamatorio sistémico, no pudimos establecer
diferencias estadísticamente significativas con el grupo sano. Mientras que en el
sobrenadante de médula ósea la media de la PCR fue de 0.658 (IC 0.3349-
1.6509) esto último no reportado en la literatura. El análisis de varianza tiene una p
= 0.395 por lo que no podemos establecer diferencias estadísticamente
significativas con los otros dos grupos (sanos y VHC), La ecuación de la regresión
lineal fue PCRMO = 0.506 + (0.289 * PCRS) con una correlación (r) de 0.141,
validado con una análisis de varianza con una p=0.698 con lo anterior no podemos
establecer una correlación entre ambas variables. Es bien conocido que en las
56
enfermedades hepáticas alcohólicas la progresión de la esteatosis inicial continua
hacia la hepatitis y finalmente la cirrosis, sin embargo los mecanismo patogénicos
son pobremente entendidos. La ingesta de alcohol puede ser asociada a la
inflamación hepática como lo demuestran los niveles incrementados de PCR en
nuestros pacientes, lo cual aunado a otros marcadores de inflamación (IL-6 entre
otros) podrían proveer el camino necesario para la progresión a la fibrosis
hepática.
El complemento es parte del sistema de defensa y tiene actividades duales entre
la inmunidad innata y la adquirida en ocasiones perfectamente bien delimitadas y
en otras interrelacionadas entre sí. Existen 3 formas de activación del
complemento por medio de la reacción antígeno-anticuerpo (vía clásica), de
manera espontánea (vía alterna) y mediante la manosa que une lectina (vía de las
lectinas). En caso del componente 3 del complemento (C3) se sabe que éste se
activa de manera espontánea al estar en contacto con ciertos componentes de
microorganismos y que su función se encuentra ligada a la inmunidad innata, sin
embargo también puede activarse al estar en contacto con el resto de la cascada
del complemento activado por la vía clásica a través de la convertasa de C3
(C2aC4b). Sabemos que existen concentraciones fisiológicas que nos permiten el
adecuado funcionamiento y que cuando éstas aumentan o disminuyen de los
parámetros normales entonces condicionan eventos patológicos. En el caso del
grupo de individuos sanos la media del C3 en suero fue de 195.84 mg/dL (IC 0-
344.4871) y en el sobrenadante de médula ósea fue de 189.78 mg/dL (IC 0-
314.2082) esto último no reportado en la literatura. La ecuación de regresión lineal
fue de C3MO = 1.237 + (0.758 * C3S) con un coeficiente de correlación (r) de
0.906 validado con una análisis de varianza con una p = 0.034, con lo anterior
podemos establecer una correlación lineal directa al 95% entre ambas variables.
En el grupo de estudio (VHC) la media del C3 en suero fue de 77.375 mg/dL (IC 0-
154.362) y mediante el análisis de varianza tenemos una p = 0.002 y mediante el
análisis de medias de Duncan una p < 0.05 en relación con el grupo de individuos
57
sanos (Fig. 10) tal como ha sido demostrado por otros autores [Dumestred-Perard et al,
2002, Ishii et al, 2001]. No se demostraron diferencias estadísticamente significativas con
el grupo control (HA). Estos resultados se encuentran dentro de los valores
normales (75-153 mg/dL) pero en los límites inferiores, lo cual concuerda con lo
reportado por el grupo de Dumestre-Perard quienes tienen valores de 107.8 mg/dL
[Dumestred-Perard et al, 2002] y diferimos con lo publicado por el grupo de Ishii quienes
tienen una media de C3 de 68.1 [Ishii et al, 2001] (hipocomplementemia) aunque
nuestros resultados se asemejan más a los de Ishii (tendencia a la
hipocomplemenemia). Es importante hacer notar que las discrepancias
encontradas por los otros grupos son debidas a las características de los
pacientes estudiados, ya que los del grupo de Dumestre-Perard tienen valores de
alanino transferasa (ALT) normales, a diferencia de nuestro grupo en donde las
ALT se encuentran por arriba de lo normal, por lo tanto nuestros pacientes tienen
una enfermedad hepática más avanzada y ésta puede ser la razón por la que
encontremos alto consumo del componente 3 del complemento, mientras que los
del grupo de Ishii tienen ALT normales pero son de raza asiática a diferencia de
los nuestros (mestizos).y por lo tanto las características genéticas y ambientales
son completamente diferentes. En el sobrenadante de médula ósea la media del
C3 fue de 73.9813 mg/dL (IC 0-145.6242) y mediante el análisis de varianza
tenemos una p = 0.001 y mediante el método de comparación de medias de
Duncan tenemos una p < 0.05 en comparación con el grupo sano (Fig. 10) y no
encontramos diferencias con el grupo control (HA). Esto no ha sido reportado en la
literatura. La ecuación de regresión lineal fue de: C3MO = 5.030 + (0.891 * C3S)
con un coeficiente de correlación (r) de 0.958 validado con un análisis de varianza
con una p<0.001, con lo anterior establecimos una correlación lineal directa al
95% entre ambas variables. En esta variable no documentamos una
hipocomplementemia sérica del C3 como grupo, ya que los valores están dentro
de los rangos normales pero en limites inferiores (muy cercano a la
hipocomplementemia), sin embargo si analizamos a esta variable en forma
individual (no grupal) observamos que 9/11 pacientes (81%) tienen
hipocomplementemia (media de 43.24). lo cual es similar (30 mg/dL) a un caso
58
reporte de un paciente con VHC y glomerulonefritis y vasculitis leucocitoclastica
[Nakajima et al, 2003] Nuestro 81% de hipocomplementemia es muy superior a lo
reportado por el grupo de estudio HISPAMEC en donde la hipocomplementemia
de C3 y C4 fue del 56% en 87/154 pacientes con hepatitis C con la coexistencia
de enfermedades autoinmunes [Ramos-Casals et al, 2005] y por el grupo de Ramos-Casals
y colaboradores quienes recientemente lo refieren en 24% en 35/143 pacientes
con VHC y crioglobulinemia [Ramos-Casals et al, 2007] Es importante hacer notar que las
diferencias encontradas con los otros grupos obedecen a que las dos poblaciones
de estos estudios difieren importantemente (enfermedad autoinmune y
crioglobulinas asociadas) con nuestros pacientes. Esta hipocomplementemia
puede ser debida a varios factores, por ejemplo:
a) el hígado es el sitio principal de síntesis de los componentes séricos
del complemento y como en nuestros pacientes está evidenciado un
daño hepático, esto puede contribuir a la hipocomplementemia
b) Los complejos inmunes circulantes consumirían C3b, el cual se fija al
receptor tipo 1 del complemento (CR1) de los eritrocitos para ser
transportados al hígado y depurados, sin embargo por el daño
hepático y la infección crónica por el VHC nuestros pacientes tienen
concentraciones elevadas de complejos inmunes circulantes y esto
puede llevar al consumo del complemento [Rich et al, 2001]
c) La infección crónica por el VHC per se, así como las células
infectadas por el mismo que expresan determinantes antigénicos
virales, pueden condicionar la activación del complemento
d) A pesar de lo previamente comentado, los mecanismos exactos del
consumo del complemento requieren más estudios.
En el grupo control (HA) la media del C3 en suero fue de 112.3909 (IC 24.7130-
249.4948) y mediante el análisis de varianza obtenemos una p = 0.002 y mediante
el método de comparación de Duncan tenemos una p < 0.05 en comparación con
el grupo de individuos sanos (Fig. 10) y no encontramos diferencias significativas
con el grupo de estudio (VHC). Estos resultados se encuentran dentro de los
59
parámetros normales, pero difieren con algunos reportes en los que se comenta
que este tipo de pacientes cursan con hipocomplementemia [Leevy and Elbeshbeshy, 2005]
sin embargo si analizamos esta variable en forma individual podemos notar que
5/11 (45%) de nuestros pacientes cursan con hipocomplementemia (media de
50.52) lo cual es más parecido a lo reportado en la literatura con la excepción de
que estos reportes no especifican las concentraciones encontradas. En el
sobrenadante de médula ósea la media fue de 103.5273 (IC 21.6394-228.6940) y
mediante el análisis de varianza encontramos una p < 0.001 y mediante el análisis
de comparación de medias de Duncan tenemos una p < 0.05 en relación con el
grupo de individuos sanos (Fig. 10) y no encontramos diferencias con el grupo de
estudio (VHC), estos resultados no ha sido reportado en la literatura. Al analizar
esta variable en forma individual observamos que 5/11 (45%) de nuestros
pacientes cursan con hipocomplementemia (media de 48.74). La ecuación de
regresión lineal fue de: C3MO = 2.604 + (0.898 * C3S) con un coeficiente de
correlación (r) de 0.984 validado mediante análisis de varianza con una p<0.001
con lo cual podemos establecer una correlación lineal directa al 95% entre ambas
variables.
El componente 4 del complemento (C4) se activa por medio de la vía clásica de
este sistema, la cual en general requiere de la participación de anticuerpos
fijadores de complemento. Al igual que el resto de los componentes del
complemento existen concentraciones fisiológicas y cualquier alteración en las
mismas condiciona eventos patológicos. En el caso del grupo de individuos sanos
la media del C4 en suero fue de 25.16 (IC 0-36.8788) y en el sobrenadante de
médula ósea fue de 27.38 (IC 0-36.8788) esto último no reportado en la literatura.
La ecuación de regresión lineal fue de: C4MO = 24.826 + (0.102 * C4S) con un
coeficiente de correlación (r) de 0.380 validado mediante un análisis de varianza
con una p=0.528 con lo cual no podemos establecer una correlación lineal directa
entre ambas variables.
60
En el grupo de estudio (VHC) la media del C4 en suero fue de 15.8933 (IC 0-
29.145) lo cual se encuentra dentro de los parámetros normales (12-24 mg/dL),
esto concuerda con lo reportado por el grupo de Ishii quienes tienen una media de
C4 de 22.53 Ishii et al, 2001, sin embargo diferimos con lo reportado por el grupo de
Dumestre-Perard, ya que estos miden la actividad específica del C4 (diferencia
entre C4 hemolítico / componente C4) encontrando un consumo de la actividad
específica del C4, pero no detallan las concentraciones encontradas del
componente C4 Dumestre-Perard et al, 2002, en el apartado del C3 en pacientes con VHC
ya se comentaron las diferencias entre los pacientes estudiados por cada grupo.
Mediante el análisis de varianza encontramos una p=0.048 y mediante el método
de comparación de medias de Duncan tenemos una p<0.05 en relación con el
grupo de individuos sanos (Fig. 12), tal como ha sido descrito por otros autores
Dumestre-Perard et al, 2002, Ishii et al, 2001, en la comparación con el grupo control (HA) no
encontramos diferencias estadísticamente significativas. En el sobrenadante de
médula ósea la media del C4 fue de 16.0938 mg/dL (IC 0-31.536) y por el análisis
de varianza una p = 0.011 y mediante el método de comparación de medias de
Duncan la p < 0.05 al compararlos con el grupo de individuos sanos (Fig. 12) y no
encontramos diferencias significativas con el grupo control (HA). Esto resultados
no han sido reportados en la literatura. La ecuación de regresión lineal fue de:
C4MO = 4.714 + (0.669 * C4S) con un coeficiente de correlación (r) de 0.599
validado con análisis de varianza con una p = 0.018 con lo cual se establece una
moderada correlación lineal directa entre ambas variables. Aunque nuestros
resultados como grupo no demuestran hipocomplementemia, si los analizamos
individualmente podemos observar que 5/11 pacientes (45%) tienen
hipocomplementemia con una media de 8.68mg/dL, lo cual es similar a un caso
reporte de un paciente con VHC y glomerulonefritis y vasculitis leucocitoclástica
Nakajima et al, 2003 quienes reportan hipocomplementemia de C4 en 1 mg/dL, así como
a lo reportado por el grupo de estudio HISPAMEC en donde la
hipocomplementemia de C3 y C4 fue del 56% en 87/154 pacientes con hepatitis C
con la coexistencia de enfermedades autoinmunes Ramos-Casals et al, 2005 y finalmente
con el grupo de Ramos-Casals y colaboradores en donde la hipocomplementemia
61
es del 41% en 59/143 pacientes con VHC y crioglobulinemia Ramos-Casals et al, 2007 Las
posibles causas de esta hipocomplementemia han sido discutidas en el apartado
de C3 con VHC.
En el grupo control (HA) la media del C4 en suero fue de 15.78 (IC 0.8619-
32.4219) por lo que se encuentra dentro de parámetros normales (12-24mg/dL) lo
cual difiere con algunos reportes en los que se comenta que este tipo de pacientes
cursan con hipocomplementemia [Leevy and Elbeshbeshy, 2005] sin embargo si analizamos
esta variable en forma individual podemos notar que 4/11 (36.36%) de nuestros
pacientes cursan con hipocomplementemia (media de 9.07 mg/dL) lo cual es más
parecido a lo reportado en la literatura con la excepción de que estos reportes no
especifican las concentraciones encontradas, y con el análisis de varianza una p =
0.048 y mediante el método de comparación de medias de Duncan la p < 0.05 al
compararlos con el grupo de individuos sanos, mientras que no encontramos
diferencias estadísticamente significativas con el grupo de estudio (VHC). En el
sobrenadante de médula ósea la media del C4 fue de 15.66 (IC 0-30.4366) esto
último no reportado en la literatura, lo cual como grupo lo sitúa dentro de
parámetros normales. Mediante el análisis de varianza se obtuvo una p = 0.011 y
con el método de comparación de medias de Duncan encontramos una p < 0.05 al
compararlo con el grupo de individuos sanos (Fig. 12) y no encontramos
diferencias estadísticamente significativas con el grupo de estudio (VHC) (Fig. 14).
Si analizamos en forma individual estos resultados, podemos notar que 3/11
(27.27%) cursan con hiporcomplementemia (media de 8.47 mg/dL) La ecuación de
regresión lineal fue de: C4MO = 1.762 + (0.881 * C4S) con un coeficiente de
correlación (r) de 0.992, validado con un análisis de varianza con una p<0.001 con
lo cual podemos establecer una correlación lineal directa al 95% entre ambas
variables.
62
La infección con VHC es una enfermedad sistémica y aunque sus principales
manifestaciones usualmente están relacionadas al hígado, las manifestaciones
extrahepáticas son más frecuentes que para las infecciones con virus A o B de la
hepatitis y es probablemente un factor disparador de múltiples procesos
patológicos. Muchos progresos se han realizado en el campo de la
inmunopatogénesis del VHC aunque son necesarios más trabajos para definir los
mecanismos de persistencia del VHC y la lesión celular hepática, un mejor
entendimiento de los factores del huésped y del virus para el curso clínico y
virológico y los mecanismos de los efectos inmune selectivos contra el VHC serán
invaluables en nuestra habilidad para tratar a los pacientes infectados con VHC.
En las enfermedades hepática alcohólicas la progresión de la esteatosis inicial,
pasando por la hepatitis y finalmente la cirrosis es bien descrita, sin embargo los
mecanismo patogénicos son pobremente entendidos. La ingesta del alcohol puede
asociarse a la inflamación hepática como lo demuestran los niveles incrementados
de IL-6 y PCR en nuestro grupo de estudio y esto conllevar a la fibrosis hepática.
Tradicionalmente las variables investigadas en este trabajo (CIC, IL-6, PCR,
antcuerpos anticardiolipina, C3, C4) han sido extensamente estudiadas en suero y
sus concentraciones normales están perfectamente delineadas, en nuestros
resultados encontramos la presencia de estas variables en un compartimiento
nunca antes estudiado, que es el sobrenadante de médula ósea y mediante el
análisis estadístico se determinó una intensa correlación con el suero por lo cual
consideramos que estos componentes de la respuesta inmune (y seguramente
otros no estudiados) tienen la capacidad de migrar a los diferentes
compartimentos del cuerpo humano tanto en homeostasis como en condiciones de
enfermedad. Por lo tanto la desregulación inmune puede jugar un papel en la
patogénesis de las enfermedades hepáticas en los pacientes alcohólicos
63
Las relevancias clínicas de nuestros hallazgos estarán en función de las
condiciones particulares de cada paciente, sin embargo en forma global podemos
comentar lo siguiente:
1. Varias manifestaciones extrahepáticas clínicas y biológicas han sido
reportadas en el 38% a 74% de los pacientes con infección por el VHC, las
cuales se asocian a la presencia de complejos inmunes circulantes y
crioglobulinas, lo cual ha sido corroborado por nuestros resultados en
donde encontramos concentraciones incrementadas de CIC en pacientes
con VHC
2. Los anticuerpos anticardiolipina son unos de los mas comunes
autoanticuerpos encontrados en pacientes con infección crónica por el virus
de la hepatitis C tal como hemos demostrado en nuestros resultados y el
consenso actual es que en la mayoría de los casos no son patogénicos sin
embargo en pacientes particulares con reactividad inmune especial o
alteraciones hemostáticas, estos anticuerpos pueden ejercer un efecto pro-
coagulante por lo que la pregunta de cuales anticuerpos son puramente un
epifenómeno neutral y cuáles vana a tener un papel en la progresión o en la
patogénesis de las manifestaciones extrahepáticas queda sin resolver y no
hay que olvidar que la infección con VHC tiene una inusual propensión para
disparar enfermedades autoinmunes.
3. En pacientes con enfermedades hepáticas crónicas y cirrosis se han
encontrado concentraciones persistentemente elevadas de citocinas de
fase aguda como por ejemplo la IL-6, la cual se encuentra en
concentraciones elevadas en nuestros resultados. Esta citosina tiene un
papel dual en el hígado ya que por un lado puede promover la proliferación
hepática por lo que es clave en la regeneración hepática, al iniciar los
procesos de reparación mediante la proliferación de los hepatocitos a través
de la activación del factor nuclear kappa beta (NF-kB) y por otro lado puede
convertir a las células hepáticas a células productoras de colágena, lo cual
es un importante mecanismo potencial en la patogénesis de la cirrosis.
64
CONCLUSIONES
1. Los pacientes con VHC presentan una mayor propensión a la formación de
CIC, a tener una concentración más elevada de IL-6 y PCR, a la formación
de anticuerpos contra cardiolipinas y a un consumo de los componentes 3 y
4 del complemento.
2. Los pacientes con hepatopatía alcohólica presentan formación de
complejos inmunes circulantes, IL-6 y PCR fuera de rangos normales pero
en menor proporción que los pacientes con VHC, hay formación de
anticuerpos contra las cardiolipinas en la misma proporción que los
pacientes con VHC y un mayor consumo del componente 3 y la misma
proporción de consumo del componente 4 del complemento en relación a
los pacientes con VHC
3. Los CIC, la IL-6, la PCR, los anticuerpos contra las cardiolipinas, los
componentes C3 y C4 del complemento se encuentran presentes en el
sobrenadante de médula ósea en una proporción equivalente al suero.
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