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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
“DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS
INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL
MEZCAL TAMAULIPECO”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
PRESENTA:
Biól. JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Diciembre del 2009, Reynosa (Tam.), México
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de
Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología
Genómica del Instituto Politécnico Nacional, bajo la
dirección de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA I JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ÍNDICE
ABREVIATURAS _________________________________________________________ VI
DEDICATORIA _________________________________________________________ VII
AGRADECIMIENTOS ____________________________________________________ VIII
RESUMEN _______________________________________________________________ IX
ABSTRACT _______________________________________________________________ X
1. INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1
2. ANTECEDENTES ________________________________________________________ 2
2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino ____________________ 2
2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio _________________ 5
2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados ________________________________ 7
2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) ___________________________ 8
2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP) __ 8
2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) __________ 8
2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH) _________________________________ 9
2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila ______________________________ 11
2.3.1. El jimado ________________________________________________________ 11
2.3.2. Cocción _________________________________________________________ 11
2.3.3. Molienda: obtención del mosto _______________________________________ 12
2.3.4. Fermentación _____________________________________________________ 13
2.3.5. Destilación _______________________________________________________ 13
3. JUSTIFICACIÓN ________________________________________________________ 15
4. HIPÓTESIS ____________________________________________________________ 16
5. OBJETIVO GENERAL ___________________________________________________ 16
6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS _______________________________________________ 16
7. MATERIALES Y MÉTODOS ______________________________________________ 17
7.1. Levaduras ___________________________________________________________ 17
7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol ______________________________ 17
7.2. Extracción de ADN de las levaduras ______________________________________ 18
7.2.1. Identificación molecular de las levaduras _______________________________ 18
7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg _______________ 20
7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal ______________ 21
7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto ________________________________ 22
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA II JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
7.4.1. Medios de cultivo _________________________________________________ 22
7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave ______________________________ 22
7.4.3. Cuantificación de azucares reductores por DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) ___ 23
7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco _____________________________ 24
7.5. Análisis estadístico ___________________________________________________ 25
7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC ___________ 25
7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR ___________ 26
8. RESULTADOS _________________________________________________________ 28
8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos ____________________________ 28
8.2. Identificación molecular de las levaduras __________________________________ 29
8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal _________________ 34
8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave _______________________________ 35
8.3.1. Consumo de azúcares reductores _____________________________________ 35
8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave ________________________ 36
8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores ___________________ 36
8.4. Capacidad fermentativa de los aislamientos ________________________________ 39
8.5. Diversidad genética de levaduras por rep-PCR ______________________________ 42
8.5.1. Diversidad genética y productividad de etanol ___________________________ 46
9. DISCUSIÓN ____________________________________________________________ 48
9.1. Caracterización morfológica y molecular __________________________________ 48
9.2. Diversidad fenotípica __________________________________________________ 51
9.3. Diversidad genética y productividad ______________________________________ 51
10. CONCLUSIONES ______________________________________________________ 54
11. RECOMENDACIONES _________________________________________________ 55
12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________ 56
13. APÉNDICE ___________________________________________________________ 60
14. GLOSARIO __________________________________________________________ 101
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA III JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Lista de figuras
Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como etanol,
glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae. __________________________________________ 3
Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le dan
un sabor desagradable al mezcal. _____________________________________________________ 11
Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave _______________________________________ 12
Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave __________________________________ 13
Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas __________________________________________ 13
Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado. ______________________________ 14
Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se llevo a
cabo este trabajo. _________________________________________________________________ 17
Figura 8. Esquema de la región ribosomal que involucra los genes 18S, 5.8S y 26S, además de las regiones no
codificantes ITS1 e ITS2 y la localización de los oligonucleotidos utilizados en este trabajo. ______ 19
Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras
con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___________ 20
Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13
levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___ 20
Figura 11. Curva de calibración para fructosa ___________________________________________________ 24
Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC ____________________________________________________ 26
Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para
clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri
(ovalada). Objetivo 100X. __________________________________________________________ 29
Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4 utilizando
el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum
Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del
GenBank fue utilizada como grupo de salida. ___________________________________________ 32
Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor Joining.
La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un re-
muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como
grupo de salida. ___________________________________________________________________ 33
Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae
(S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery
(P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.). ___ 35
Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.); B)
Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E)
Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.). __________ 37
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA IV JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces
cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia
kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.,
P.g.). ___________________________________________________________________________ 38
Figura 19. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo S. cerevisiae _________ 42
Figura 20. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras
Saccharomyces cerevisiae utilizando el programa Statistica y el método de distancias euclidianas. __ 43
Figura 21. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo K. marxianus y T.
delbrueckii. ______________________________________________________________________ 44
Figura 22. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras
Kluyveromyces marxianus y Torulaspora delbrueckii utilizando el programa Statistica y el método de
distancias euclidianas. _____________________________________________________________ 45
Figura 23. Comparación de la diversidad genética y la producción específica de etanol de las levaduras probadas
en este trabajo. S.c. (Saccharomyces cerevisiae). _________________________________________ 46
Figura 24. Comparación de la diversidad genética y la producción de etanol de las levaduras Kluyveromyces
marxianus (K.m.) y Torulaspora delbrueckii (T.d.). ______________________________________ 47
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA V JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Lista de cuadros
Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp. _____ 10
Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS _____________ 23
Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las levaduras
aisladas en diferentes etapas del proceso. _______________________________________________ 28
Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos de
mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI. _____________________________ 30
Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San Carlos
(Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la
diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson. __________________________________________ 34
Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar ____________________________________________ 39
Cuadro 7. Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos obtenidos por HPLC. 40
Lista del apéndice
APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el que se
encuentra en el gel de agarosa de la PCR. ______________________________________________ 61
APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. _____________________________ 62
APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que tienen
células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X _________________________________ 63
APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para la elaboración
de los árboles de distancias génicas de las dos diferentes regiones. ___________________________ 72
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA VI JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ABREVIATURAS
g Microgramos
L Microlitro
M Micromolar
A260 Absorbancia a 260 nm
A280 Absorbancia a 280 nm
ADNg Ácido desoxiribonucléico genómico
AFLPs Polimorfismos de la Longitud de los Fragmentos Amplificados.
dNTP Deoxinucleótidotrifosfato
DO Densidad óptica (nm)
EDTA Ácido etilendiaminotetracético
mg Miligramos
mL Mililitro
mM Milimolar
NH4OAc Acetato de amonio
nm Nanómetros
ºC Grados centígrados
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PDA Agar papa dextrosa
rpm Revoluciones por minuto
Taq ADN polimerasa de Thermus aquaticus.
TGY Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA VII JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
DEDICATORIA
A mis padres María Guadalupe Mireles Berlanga y Pedro Arratia Arratia que siempre han
estado conmigo en las buenas y en las malas por darme la vida, su amor y sobre todo su apoyo
incondicional ya que la mejor forma de agradecerles todo lo que me han dado es con mis
logros profesionales.
Y especialmente para la Dra. Paty quien creyó en mí y por estar siempre ayudándome en cada
etapa de mi tesis por su apoyo y por no permitirme desistir en los momentos más difíciles
Gracias.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA VIII JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona por su asesoría para llevar a cabo este proyecto y
por creer en mí.
A mi comité revisor de tesis la M.C. María Antonia Cruz Hernández, el Dr. José Alberto
Narváez Zapata, Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez y el M.C. Víctor Moreno por sus críticas
constructivas que hicieron en cada presentación de avances.
A la M.C. Amanda Alejandra Oliva Hernández por su ayuda durante el desarrollo del trabajo
de laboratorio.
A todos mis compañeros de laboratorio Isabel, Erika, Paco, Salvador, Eliseo, Samantha,
Amanda, Elizabeth y Leandro por su amistad y compañía que siempre tuve durante mi
estancia en el laboratorio.
A la generación 2007-2009 por su amistad y apoyo durante estos dos años y por compartir su
compañerismo y amistad siempre.
Al maestro Víctor e Israel del área de servicios por su apoyo en el uso del HPLC y por su
ayuda durante la secuenciación de las muestras.
Y a todas las personas que de alguna manera directa o indirectamente contribuyeron al
desarrollo de este trabajo.
Finalmente, se agradece el apoyo económico del CONACyT, por la Beca de Estudios
otorgada, así como al Instituto Politécnico Nacional por la Beca Tesis otorgada, para la
terminación del presente trabajo. Los insumos y la movilidad fueron apoyados por los
proyectos CONACyT Básica2006-57576, y los proyectos SIP2008-0597 y SIP2009-0613,
junto con el complemento de beca (PIFI) asociada a estos proyectos del Instituto Politécnico
Nacional.
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA IX JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
RESUMEN
El mezcal es una bebida artesanal de México con denominación de origen. A pesar de que esta
bebida tiene una importancia económica para los estados donde se elabora, hace falta realizar
más investigaciones acerca de la micoflora involucrada en la fermentación. Las levaduras son
las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir gracias a ellas la
fructosa, obtenida de la hidrólisis de la inulina al cocerse la piña de esta planta, es
transformada en etanol y otros compuestos que le dan sabor, y si bien existen varios trabajos
en la literatura que analizan la fermentación del mosto de Agave tequilana Weber var azul
(para producir tequila), son muy pocos los resultados reportados para otras especies de Agave.
En este trabajo se estudió la micoflora presente durante la fermentación de una mezcalera
tamaulipeca, y se obtuvieron 51 aislamientos, pertenecientes a 9 especies diferentes de
levaduras colectadas en diversas etapas de la fermentación, y se caracterizaron por su
capacidad de consumo de azúcares y producción de etanol a 15 aislamientos de
Saccharomyces cerevisiae, 12 de Kluyveromyces marxianus, 5 de Torulaspora delbrueckii, 6
de Pichia kluyveri, 4 de P. guillermondii, 2 de P. mexicana, 5 de Clavispora lusitaniae, 1 de
Candida parasilopsis y 1 de Zygosaccharomyces bailii. De manera relevante, todos los
aislamientos fueron capaces de producir etanol en concentraciones variables, no solamente S.
cerevisiae, lo cual indica que todas contribuyen a la fermentación alcohólica. El análisis
global genómico mediante la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales de
bandeo inter e intra especies, y si bien no fue posible determinar a priori las características
productivas de un aislamiento basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí pueden ser
utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los aislamientos,
que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la fermentación, para verificar
que la población deseada se encuentra presente en el proceso. Este trabajo constituye el primer
reporte de caracterización global molecular y productiva de las levaduras involucradas en la
producción del mezcal tamaulipeco.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA X JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ABSTRACT
Mezcal is a mexican artisan liquor with denomination of origin and very unique organoleptic
characteristics. Despite the economic importance of this industry, there is a lack of of
information concerning the micoflora involved in mezcal fermentation. The yeast are
responsible for the fermentation of Agave must, converting the sugars obtained from the
thermal hydrolysis of inulin present in the “piña” (Agave stalk) to ethanol and other
compounds that confer the mezcal its unique flavor. There are several reports concerning the
characterization of must of Agave tequilana Weber var Azul (to obtain tequila), but very few
with other Agave species. In this work the fermentation of a tamaulipeca mezcalera was
sampled, and 51 isolates were obtained, belonging to 9 different species from all stages of the
fermentation, and they were molecularly identified and characterized in terms of consumption
of sugars and ethanol production. Fifteen isolates were identified as Saccharomyces
cerevisiae, 12 of Kluyveromyces marxianus, 5 of Torulaspora delbrueckii, 6 of Pichia
kluyveri, 4 of P. guillermondii, 2 of P. mexicana, 5 of Clavispora lusitaniae, one of Candida
parasilopsis and one of Zygosaccharomyces bailii. All isolates were able to produce ethanol
in variable concentration, not only S. cerevisiae, which meant that all were contributing to the
alcoholic fermentation. The global genomic analysis performed by rep-PCR allowed us to
obtain differential patterns that were inter and intraspecific, although it was not possible to
predict the productive behavior of the isolates by this analysis, nonetheless this technique can
be used for fingerprinting of the isolates and to track their presence during the fermentation.
This work is to our knowledge the first report of global molecular and productive
characterization of all the yeast involved in the production of Tamaulipas´ mezcal.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 1 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
1. INTRODUCCIÓN
Las bebidas elaboradas mediante la fermentación alcohólica han sido producidas por el
hombre desde hace miles del años, acompañando el proceso de construcción de las
civilizaciones. En la actualidad su consumo genera una importante fuente de divisas para
los países que las producen. Entre las bebidas alcohólicas más importantes se tiene a la
cerveza, el vino y las bebidas destiladas como el whisky, el ron y el tequila. La cerveza es
elaborada a partir de la fermentación de cereales malteados, mientras que el vino, mezcal y
tequila son producidos por la fermentación del jugo de frutas y agave, respectivamente. La
destilación de bebidas malteadas producen el whiskey, el vino destilado produce el brandy,
la destilación de melazas de caña de azúcar fermentadas producen el ron y la destilación del
fermentado de cereales y bayas de enebro producen la ginebra. En cualquiera de los casos,
la etapa más importante en la producción de estas bebidas es la fermentación, proceso en el
cual los azucares son transformados en etanol por levaduras principalmente de la especie
Saccharomyces cerevisiae. Esta se encuentra involucrada en todas las etapas de
fermentación desde el inicio de esta hasta su terminación, siendo la más tolerante a altas
concentraciones de etanol. El tequila y el mezcal se elaboran por fermentación alcohólica
utilizando levaduras capaces de realizar la biotransformación de la glucosa a etanol y
bióxido de carbono. En México existen diferentes especies de Agave con los cuales se
elaboran bebidas alcohólicas , tales como el Agave tequilana con el cual se elabora el
tequila, Agave salmiana y Agave angustifolia con los que se elabora el mezcal, el Agave
maximiliana con el que se elabora el sotol, además de que existen otras especies como el
Dacilirium con el cual se elabora la raicilla. El proceso de elaboración del mezcal es
rudimentario y generalmente se realiza en cinco etapas: jimado, cocción, molienda,
fermentación y destilación. A pesar de que México por denominación de origen es el único
productor de mezcal y tequila, la mayoría de las investigaciones a cerca de las levaduras
involucradas en la fermentación de estas bebidas son en el tequila aunque los dos son
elaborados bajo los mismos principios, por lo que existe una escasa información de las
levaduras que participan en la fermentación del mezcal de Tamaulipas, en especial de
aquellas que le dan sus características organolépticas distintivas.
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 2 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
2. ANTECEDENTES
Dada la importancia que las bebidas fermentadas presentan tanto desde el punto de vista
científico como económico, y debido al papel fundamental que juegan las levaduras y
bacterias en éste proceso, a continuación se presentan los aspectos biológicos más
importantes relacionados con la bebida alcohólica más estudiada: el vino, y la información
existente del producto más emblemático de nuestro país: el tequila. Para ello en la presente
revisión se analizan los siguientes aspectos: la bioquímica y la biología de la fermentación
alcohólica del vino; las sucesiones microbianas durante la fermentación alcohólica y su
metodología de estudio, y el proceso de elaboración del tequila y del mezcal.
2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino
La fermentación alcohólica por definición es el proceso bioquímico de extracción de
energía en el cual compuestos orgánicos sirven tanto de donador (piruvato) como aceptor
(NAD+) de electrones, teniendo como productos el etanol y bióxido de carbono.
C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + ∆
El alcohol etílico (etanol, C2H5OH) es producido por microorganismos (levaduras y
bacterias) durante un proceso que no requiere la participación del oxígeno (anaerobio). Este
etanol es la base de la producción de bebidas alcohólicas complejas, sin embargo, también
tiene usos como solvente industrial y como aditivo para la gasolina, entre otros. Dicha
fermentación comienza con el transporte de azúcares a través de la membrana y su
metabolización por la vía glucolítica (Embden-Meyerhof-Parnas principalmente). Las
levaduras son principalmente los microorganismos involucrados en la producción de etanol,
estos son anaerobios facultativos, lo que significa que pueden vivir sin oxigeno; cuando hay
oxigeno lo utilizan para oxidar la glucosa completamente y de esa manera obtener ATP
(respiración). En condiciones anaerobias ellas pueden transforman la glucosa en acido
pirúvico siguiendo la secuencia de reacciones que conlleva la glucólisis, como se muestra
en la figura 1.
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 3 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como
etanol, glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae.
El segundo mayor producto derivado de la fermentación alcohólica producido por S.
cerevisiae es el glicerol. Esta molécula es sintetizada a partir de la dihidroxiacetona fosfato,
un intermediario de la glucólisis. Este compuesto es reducido por la enzima Gdp
GLUCOSA
GLUCOSA 6-P
FRUCTOSA 6-P
GLICERALDEHIDO 3-PDIHIDROXIACETONA-PGLICEROL
3-P GLICERATO
FOSFOENOLPIRUVATO
PIRUVATO
OXALACETATO
ACETALDEHIDO
ETANOL
PIRUVATO
ACETATO
SERINAGLICINA
TREONINA
ACETATO
ACETIL-CoA
ALANINA
BIOMASA
BIOMASA
BIOMASA
ALANINA
BIOMASA
BIOMASA
BIOMASA
PENTOSA 5-P
BIOMASA
MEDIO
CITOSOL
α-KETOGLUTARATOSUCCINATO
OXALACETATO MALATO
MITOCONDRIA
ACETIL-CoA
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 4 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
(dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato deshidrogenasa) a glicerol 3-fosfato el cual es
desfosforilado por la enzima Gpp (dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato fosfatasa) a
glicerol el cual puede ser usado por la levadura como fuente de carbono y energía, así como
para proteger a la célula contra altas temperaturas, estrés oxidativo y estrés hiperosmotico
acumulándose intracelularmente en células que son expuestas a decreciente actividad de
agua extracelular. (Folch-Mallol et al., 2004).
Las bebidas alcohólicas son elaboradas por bioconversión o biotransformación de la
glucosa en etanol (fermentación), proceso que es llevado a cabo mediante una serie de
reacciones químicas realizadas por levaduras y bacterias específicas como parte de su
metabolismo de producción de energía, cuyo rendimiento varía según el microorganismo
involucrado y sus capacidades metabólicas específicas, como por ejemplo el trabajo
realizado por Sánchez et al., (2005) quienes compararon la secuencia glucolítica de
Debaryomyces hansenii y S. cerevisiae, observando que S. cerevisiae produjo
aproximadamente cuatro veces mas etanol que D. hansenii. La relación entre el consumo de
glucosa y la producción de etanol fue casi 3 veces más alta que en D. hansenii.
La fermentación del jugo de uva (mejor conocido como mosto) es realizada por una serie
de interacciones entre microorganismos en los cuales están involucradas bacterias,
levaduras, hongos e incluso virus, y éstas determinan el perfil ecológico de la producción y
tiene influencias positivas o negativas en el sabor del vino. La producción de etanol durante
la fermentación es principalmente llevada a cabo por la levadura Saccharomyces cerevisiae,
la cual se encuentra de manera natural en los mostos de uva (Fleet et al., 1984), y juega un
papel central debido a sus capacidades metabólicas en el proceso de fermentación de
mostos (Zagorc et al., 2001).
Las levaduras generalmente se originan de la micoflora epifítica natural de las uvas, de la
flora asociada con la superficie de los equipos de vinería y los cultivos iniciadores que son
añadidos. Los hongos filamentosos se encuentran en la producción del vino en varias etapas
durante la serie de operaciones, y su principal impacto más importante tiene lugar durante
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 5 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
el cultivo, ya que pueden causar la pudrición de la cosecha, especialmente la provocada por
Botrytis cinerea (Fleet, 2003).
Un importante fenómeno ocurre con algunas cepas de levaduras, las cuales secretan
proteínas o glicoproteínas tóxicas que son letales para cepas sensibles de diferentes
especies, por lo que se han denominado levaduras killer ó zimocidas (Zagorc et al., 2001).
La actividad killer ha sido encontrada en los géneros Saccharomyces, Candida,
Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Willopsis y
Zygosaccharomyces y han sido aisladas de muchos nichos ambientales como lagos, ríos,
frutas y vegetales así como de la fermentación de varios alimentos y bebidas. El interés
ecológico en este tipo de levaduras deriva debido a que cuando están presentes pueden
dominar el proceso de fermentación, cuando poseen características enológicas positivas
pueden ser usadas como inoculo inicial y producir una bebida de excelente calidad.
En un estudio del vino realizado por Versavaud et al. (1995) en cuanto a la diversidad
genética de S. cerevisiae, los autores concluyen que la fermentación espontánea es iniciada
por algunas especies tales como: Kloeckera apiculata, Candida famata, Rhodotorula sp.,
Metschnikowia pulcherrima y Saccharomyces cerevisise y que esta última se encuentra
presente en todas las etapas de fermentación desde el inicio hasta el final de esta. Los
autores detectaron 14 cepas killer de las cuales solamente 4 cepas fueron resistentes a la
toxina K2, y 10 fueron sensibles, mientras que las cepas asociadas fueron neutrales. La
cepa predominante fue S. cerevisiae y era del tipo killer 2 con la asociación de cepas que
generalmente eran neutrales y algunas sensibles.
2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio
La calidad final del vino es determinada por toda esta gama de microorganismos los cuales
están presentes en diferentes cantidades en los mostos y que se desarrollan durante la
fermentación, determinando en gran medida la cantidad y tipos de las muchas substancias
que contribuyen en el olor, color y sabor característico de esta bebida (Fleet et al., 1984).
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Tradicionalmente la elaboración del vino es realizada de forma espontánea por las
levaduras presentes en las uvas y en los tanques o quipo de vinería. Por lo general las
especies de Hanseniaspora (y su anamorfo Kloeckera), Metschnikowia, Pichia y Candida
crecen durante las etapas tempranas de fermentación, pero comienzan a perecer conforme
progresa la fermentación y comienza a aparece en mayor proporción la especie S.
cerevisiae. Esta levadura no es predominante en la micoflora epifitica de la uva, ya que
generalmente se encuentra en concentraciones de 10 a 100 CFU/gr. Sin embargo, conforme
la fermentación avanza, aparece en mayor proporción y se incrementa hasta llegar al final
del proceso como prácticamente la única levadura presente en forma activa (Fleet, 2003).
Generalmente las cepas de Hanseniaspora (Kloeckera), Candida y Metschnikowia inician
la fermentación y éstas se originan de las uvas. Algunas veces las especies Pichia,
Issatchenkia y Kluyveromyces pueden tener crecimiento en estas etapas y llegan a alcanzar
hasta 106 o 10
7 CFU/ml a la mitad de la fermentación, pero empiezan a declinar hasta
morir, durante este tiempo S. cerevisiae se vuelve predominante (107-10
8 CFU/ml) y
continua la fermentación hasta que esta termina (Fleet, 2003).
La producción de etanol por S. cerevisiae es considerado el factor que gobierna el
crecimiento microbiano e influencia a las especies no-Saccharomycetaceas durante la
fermentación. Por lo general las especies Hanseniaspora (Kloeckera), Candida,
Metschnikowia, Pichia, Issatchenkia y Kluyveromyces se encuentran en el jugo y no son
tolerantes al etanol cuando este supera 5 a 7 % , lo cual explica que declinen y mueran
conforme avanza la fermentación, poco después de iniciada la etapa exponencial del
proceso (Fleet, 2003).
Las levaduras nativas son requeridas para la producción del vino en específicos ambientes
característicos de cada región (Araujo et al., 1998). Los autores concluyen que las especies
de S. cerevisiae y S. rouxii son las especies que prevalecen durante la fermentación del vino
en el estado de Zulia (Venezuela).
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Las presencia de bacterias también tienen influencias positivas (y negativas, dependiendo
de las especies presentes) en la producción de bebidas alcohólicas. Estas contribuciones
pueden ser moderadas por interacciones con levaduras. Los dos grupos principales de
bacterias que son importantes en la microbiología del vino son las bacterias acidolácticas y
las bacterias acidoacéticas (Fleet, 2003). Dentro de las bacterias acidolácticas los géneros
Lactobacillus y Pediococcus son las más relevantes y junto con Oenococcus oeni conducen
la fermentación maloláctica. Mientras que entre las bacterias acidoacéticas se encuentran
Acetobacter aceti, Pasteurianus y Gluconobacter oxidans. Esta fermentación es siempre
negativa dentro del proceso de producción de vino.
La fermentación maloláctica es la segunda fermentación más importante que ocurre en
muchos vinos generalmente de 2 a 3 semanas después de la terminación de la fermentación
alcohólica. La principal bacteria responsable de esta fermentación es O. oeni, durante esta
fermentación funciona para incrementar la acidez del vino por transformación del acido
málico en acido láctico aumentando el sabor y complejidad del vino (Fleet, 2003).
La mayoría de los estudios para identificar las especies de levaduras que aparecen en el
proceso de fermentación generalmente están basados en la morfología comparativa,
cultivos e identificación utilizando algunos criterios bioquímicos, la fisiología y la genética
convencional de estas especies pero estas técnicas son tardadas y generalmente solo se
puede identificar hasta el nivel de género. Es por eso que en algunos estudios se han
utilizado técnicas basadas en el ADN.
Las principales técnicas empleadas para identificar levaduras de la fermentación se
describen a continuación, haciendo énfasis en su utilización en vino y tequila.
2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados
La metodología de campos pulsados permite analizar el ADN genómico de levaduras para
diferenciar en una misma especie, si los microorganismos analizados son iguales (clones) o
no (policlonales). La técnica consiste en una variación de la electroforesis hecha en un gel
de agarosa, en donde la orientación del campo eléctrico a través del gel se cambia
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periódicamente, en vez de mantenerse constante. Esto permite que fragmentos grandes de
ADN se separen por tamaño, en forma efectiva. Esta técnica fue usada por Versavaud et al.
(1995) para identificar la diversidad genética de cepas nativas de S. cerevisiae.
2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt)
Esta técnica está basada en el contenido de G+C existente en el ADN nuclear (ADNn) en
comparación con el del ADN mitocondrial, el ADNn tiene aproximadamente un 40% de
contenido de G+C mientras que el ADNmt tiene solamente el 20 % por lo tanto, si se
utilizan enzimas de corte específico para regiones ricas en G+C puede separarse debido a
que el ADNn sería cortado en pequeños fragmentos no detectables en el gel de agarosa
mientras que el ADNmt produciría fragmentos de mayor tamaño detectables en el gel de
agarosa. En un estudio realizado por Sabate et al. (1998) se analizó la diversidad de cepas
de S. cerevisiae en la fermentación de vino usando esta técnica, y encontraron una gran
diversidad de cepas nativas de S. cerevisiae. Concluyen que S. cerevisiae es la
predominante durante la fermentación sin embargo en algunos otros estudios tienden a
confundirla y clasificarla incorrectamente como S. bayanus.
2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN
(RFLP)
La técnica de RFLP se basa en el polimorfismo del ADN cuando es digerido con enzimas
de restricción, lo cual visualizado en un gel de electroforesis, produce un patrón de bandas
polimórficas de diferentes tamaños. Debido a que los cortes generados con estas enzimas
difieren entre un organismo y otro por la distancia entre el sitio de corte, Zagorc et al.
(2001), usaron esta técnica para identificar levaduras zimocidas (killer) de aislamientos de
levaduras de vino.
2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP)
Esta técnica combina el uso de la PCR y los RFLP, y consiste en cortar el ADN con dos
enzimas de restricción, una de corte frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los
fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas,
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se amplifica por PCR probando diferentes combinaciones de complementariedad del
oligonucleótido con el sitio de restricción, con lo cual se puede disminuir o aumentar el
número de bandas amplificadas y comparar su polimorfismo generado. Una ventaja
especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una
sola reacción, por lo que deben visualizarse en un gel de poliacrilamida de alta resolución.
Esta técnica fue usada para comparar las levaduras del genero Saccharomyces de mostos de
agave (Flores-Berrios et al., 2005). Los autores encontraron cuatro diferentes especies de
este género (S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, y S. paradoxus) y el agrupamiento de
los aislamientos de acuerdo al proceso de donde fueron aisladas.
2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH)
Con esta técnica se pueden analizar células o tejidos completos, para la cual son
primeramente fijados e hibridados con sondas específicas para los genes 18S o 28S del
ADNr marcadas con algún fluorocromo. Posteriormente las células marcadas pueden verse
a un microscopio óptico de fluorescencia. Con este método y gracias a que las células
completas se hibridan se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN,
amplificación por PCR y clonación. Xufre et al. (2006) utilizaron esta técnica para analizar
poblaciones dinámicas de levaduras en mostos de uva a nivel laboratorio. En su estudio
muestran la identificación exacta mediante esta técnica de las especies presentes en la
fermentación y concluyen que las especies Candida stellata, Torulaspora delbrueckii y
Kluyveromyces spp. Deben también ser tomadas en cuentas como inóculos iniciales ya que
tienen influencias positivas en el sabor del vino.
En el cuadro 1 se muestran a las principales levaduras y bacterias que han sido identificadas
en los mostos de uva y de agave con las diferentes técnicas moleculares descritas
anteriormente. En el se presentan las diferentes etapas de fermentación en el cual aparecen
estas especies y como al transcurrir el tiempo y pasar las diferentes fases de fermentación la
mayoría de las especies que se encuentran en los mostos desaparecen permaneciendo
solamente las mas aptas a altas concentraciones de etanol.
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Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp.
Microorganismo
Tipo de mosto Etapa de fermentación Fermentación
maloláctica Autor
Uva Agave Exponencial
temprana
Exponencial
tardía Estacionaria
Kloeckera XXX XXX XX X Ø Ø 1,3,7,11,13
Torulopsis stellata XXX XX X Ø Ø 1
Saccharomyces
cerevisiae
X X XX XXX XXX Ø 1,2,3,4,5,6,
7,8,9,10,11
,12,13
S. bayanus Ø X X XX XX Ø 8,9
S. pastorianus Ø X X XX XX Ø 9
S. paradoxus Ø X X XX XX Ø 9
S. rouxii X Ø X XX XX Ø 4
Hanseniaspora XXX Ø X Ø Ø Ø 3,6,10
Metschnikowia XXX Ø X Ø Ø Ø 3,7
Torulaspora XX X Ø Ø Ø Ø 10,12
Candida sp XXX X X Ø Ø Ø 3,6,7,10,11
,13,12
Rhodotorula XX X X Ø Ø Ø 7,12
Cryptococcus XX Ø X Ø Ø Ø 6
Pichia XXX X X Ø Ø Ø 3,6,10
Willopsis XX Ø X Ø Ø Ø 6
Kluyveromyces XXX X X Ø Ø Ø 3,6,10,12
Debaryomyces XXX X X Ø Ø Ø 6,12
Zygosaccharomyces XX Ø X Ø Ø Ø 6
Issatchenkia XX X X Ø Ø Ø 3,12
Lactobacillus X Ø X X XX XXX 3
Pediococcus X Ø X X XX XXX 3
Oenococcus X Ø X X XX XXX 3
Acetobacter X Ø X X XX XXX 3
Gluconobacter X Ø X X XX XXX 3
Ø. Ausente, X. Escaso, XX. Moderado, XXX. Abundante.
Tomado de: 1Fleet et al., (1984),
2Zagorc et al,. (2001),
3Fleet (2003),
4Araujo et al., (1998),
5Sánchez et al.,
(2005), 6Versavaud et al., (1995),
7Cronwright et al., (2002),
8Sabate et al., (1998),
9Flores-Berrios et al.,
(2005), 10
Xufre et al., (2006), 11
Arrizon et al., (2006), 12
Jacques et al., (2006), 13
Fiore et al., (2005).
Otra técnica rápida que ha sido usada recientemente es el polimorfismo en la conformación
de cadena sencilla (SSCP) la cual ha mostrado ser una técnica muy poderosa logrando
encontrar diferencias en especies las cuales tiene un cambio en un solo nucleótido. Esta
técnica puede ser usada con fragmentos relativamente cortos de aproximadamente 200 pb
(Qui-Ming et al., 2008), y permite encontrar diferencias en algunas especies de
Saccharomyces y Candida debido a la migración de fragmentos amplificados de la región
ITS1 e ITS2 en un gel de acrilamida.
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2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila
El mezcal y el tequila son bebidas alcohólicas elaboradas en México por fermentación y
destilación del jugo de algunas plantas de Agave tales como A. salmiana, A. angustifolia, A.
tequilana y A. potatorum (Flores et al., 2005). El mezcal es una bebida alcohólica regional
obtenida por destilación y fermentación de mostos preparados directa y originalmente con
los azucares extraídos de las piñas maduras del Agave, las cuales son previamente cocidas
para hidrolizar los azúcares, y son sometidas a fermentación alcohólica, con inóculos
espontáneos o comerciales de levaduras. Generalmente el proceso es dividido en cinco
diferentes fases: el jimado, el cocimiento de la piña, la extracción del mosto, la
fermentación y la destilación.
2.3.1. El jimado
En esta etapa es en la cual se cortan las pencas (Fig. 2) para dejar solo la piña, la cual
después es rasurada para eliminar la raíz y todo lo que le pueda dar sabor desagradable al
mezcal. Una vez obtenida la piña se lleva al horno de cocción.
Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le
dan un sabor desagradable al mezcal.
2.3.2. Cocción
La cocción se lleva a cabo para hidrolizar o transformar la inulina, el principal polisacárido
presente en la piña de las plantas de agave. La inulina es convertida en azúcares libres,
principalmente fructosa, para su posterior fermentación (Mancilla y Margalli 2002). A la
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reacción que ocurre durante el calentamiento de las piñas de agave se le denomina reacción
de Maillard, y es un conjunto de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y
azúcares reductores cuando este se calienta aunque no sea a altas temperaturas. Los
productos mayoritarios de estas reacciones son moléculas cíclicas y poli cíclicas, que
aportan sabor y aroma al mezcal y tequila. La cocción se realiza en un horno construido a
partir de un agujero cavado en la tierra (Fig. 3) y recubierto con piedras al rojo vivo
después de haber colocado en su fondo las piñas, ó en autoclaves industriales.
Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave
2.3.3. Molienda: obtención del mosto
La molienda tiene como finalidad hacer que los monosacáridos obtenidos en la cocción
estén más disponibles a la acción microbiana, así como a la captación de microorganismos
del medio para favorecer la fermentación. La molienda se lleva a cabo generalmente
utilizando un “trapiche” (Fig. 4). Este esta hecho de madera con 2 troncos unidos
simulando los engranes, y dos troncos largos amarrados que son jalados por dos caballos.
En versiones industrializadas, molinos de martillo o de tornillo sinfín realizan la extracción
del mosto.
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Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave
2.3.4. Fermentación
Es el proceso en el que las levaduras transforman los monosacáridos del Agave en etanol
por medio de la fermentación alcohólica. Esta operación se lleva a cabo en tinas abiertas, de
madera (Fig. 5) durante un tiempo aproximado de ocho a diez días, tomando en
consideración la temperatura ambiente. Puede usarse como inóculo el remanente de la
fermentación anterior que se deja en el fondo, o inocular con cepas de levaduras
comerciales.
Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas
2.3.5. Destilación
En esta operación se efectúa la separación del alcohol del resto del mosto fermentado
aprovechando para ello sus diferentes puntos de ebullición. El etanol, debido a su estructura
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molecular, tiene un punto de ebullición más bajo que el agua (78.5 o
C a nivel del mar), por
lo tanto, se separa de ésta al alcanzar esta temperatura. El dispositivo utilizado para la
destilación tradicional es el alambique (Fig. 6) Este equipo está conformado por cuatro
elementos fabricados en cobre debido a su alta conductividad térmica, de tal forma que
facilita la transferencia de calor calentándose y enfriándose fácilmente alcanzando así la
temperatura apropiada de separación. En versiones industriales, se puede utilizar una torre
de platos. Durante la destilación también se separan otros compuestos volátiles tales como
el acetaldehído, etil acetato, metanol, n-propanol, isobutanol, alcohol amílico y alcoholes
superiores (Arrizon et al., 2006).
Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado.
Todas estas etapas determinarán la calidad final del producto a obtener, sin embargo, se
sabe que las más importantes son la fermentación y la destilación.
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3. JUSTIFICACIÓN
Las levaduras son las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir
gracias a ellas la fructosa que se encuentra en la piña de esta planta es transformada en
etanol y otros compuestos que le dan sabor al mezcal y al tequila, sin embargo las mayoría
de las investigaciones que se han realizado acerca de las bebidas alcohólicas que se
elaboran en México son sobre el tequila y esta información no puede ser extrapolada al
mezcal ya que no utilizan las mismas plantas de Agave.
México por denominación de origen es el único productor de mezcal el cual tiene una
importancia económica para los estados donde se elabora, además de ser una bebida típica
artesanal del país por lo que hace falta realizar más investigaciones acerca de las levaduras
que se encuentran involucradas en la fermentación del mezcal.
En Tamaulipas el mezcal se elabora en los municipios de San Carlos, Jiménez, Bustamante,
Palmillas, Miquihuana, Méndez, San Nicolás, Jaumave y Cruillas este deja importantes
ganancias económicas para los productores. Como en todos los productos de producción
bebidas alcohólicas, la levadura S. cerevisiae es la mas importante durante el proceso de
fermentación, de ahí la importancia de aislar levaduras con una alta productividad de
etanol que podrían ser utilizadas como inoculo inicial para producir un mezcal con
excelente calidad ayudando a los productores a competir mejor en el mercado. En este
trabajo se propone realizar una caracterización genética de levaduras aisladas durante la
fase exponencial de producción de mezcal, y determinar si existe una relación entre los
niveles de productividad de etanol y el perfil genético determinado a nivel genómico.
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4. HIPÓTESIS
La productividad de etanol de una población de levaduras está relacionada con su
diversidad genética.
5. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar genética y productivamente a las levaduras involucradas en la fermentación
del mezcal.
6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar genéticamente y caracterizar morfológicamente a las levaduras presentes
en los mostos de mezcal tamaulipeco.
Caracterizar la productividad alcohólica de las levaduras.
Caracterizar la diversidad genética de las levaduras mediante una técnica de análisis
global de su ADN.
Correlacionar la diversidad genética de las levaduras con su productividad.
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1. Levaduras
Las levaduras utilizadas en este trabajo pertenecen a la colección del Laboratorio de
Biotecnología Industrial y fueron aisladas de fermentaciones de la vinata en el ejido “El
Palmar” en el municipio de San Nicolás Tamaulipas donde se produce el mezcal. La
imagen de satélite (Fig. 7) muestra la localización de dicha vinata.
Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se
llevo a cabo este trabajo.
Un total de 51 aislamientos fueron obtenidos los cuales fueron primeramente caracterizados
de acuerdo a la forma de la célula separándolas de esta manera en dos grupos: morfología
redonda u ovalada (Cuadro 2) y las cuales fueron aisladas de diferentes etapas de la
fermentación, la cual fue caracterizada por la concentración de azúcares presentes en el
momento del muestreo, con lo cual les fue asignada una clave.
7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol
Todas los aislamientos fueron crecidos hasta la mitad de la fase exponencial en caldo YPF,
y se diluyó con glicerol estéril hasta una concentración final de glicerol del 86%, y
almacenadas a -70 °C.
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 18 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
7.2. Extracción de ADN de las levaduras
Las cepas se cultivaron en medio YPDA (Extracto de levadura 5 g L-1
; peptona 3 g L-1
;
glucosa 20 g L-1
; agar 20 g L-1) y se colocaron en el agitador orbital durante 18 horas a 30
°C y 250 rpm. Se utilizó el protocolo de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda
(1985) con las siguientes modificaciones: Se colocaron de 40 a 50 mg de la muestra de
levaduras en tubos eppendorf estériles y se sumergieron en nitrógeno líquido por 20
minutos, posteriormente se maceraron con un pistilo estéril. Se agregó 500 µl de solución
amortiguadora de extracción (200 mM de Tris HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM de
EDTA y 0.5% de SDS) y se incubó por 10 minutos, posteriormente se añadieron 500 µl de
fenol-cloroformo mezclando en vortex por 5 minutos y se centrifugó a 13,000 rpm durante
30 minutos. La fase acuosa fue transferida a otro tubo adicionando 400 µl de cloroformo
frío mezclando durante un minuto seguido de centrifugación a 13,000 rpm por 5 minutos y
transfiriendo a un nuevo tubo, adicionando 8 µl de RNAsa e incubando a 37 °C,
posteriormente se adicionan 500 µl de isopropanol frío mezclando por inversión ligera e
incubando a -20 °C por 15 minutos y centrifugando por 5 minutos a 13,000 rpm, el
sobrenadante fue desechado y se agregaron 500 µl de etanol al 70% mezclando por
inversión y centrifugando, de igual manera el sobrenadante fue desechado y el tubo fue
colocado boca abajo en papel secante para que se evaporara el etanol durante
aproximadamente 30 minutos. La pastilla fue re suspendida en 50 µl de agua estéril. El
ADN obtenido fue visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™ 10X.
7.2.1. Identificación molecular de las levaduras
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue utilizada para
amplificar regiones utilizadas para identificar a nivel de especie a las levaduras utilizadas
en este trabajo. En Saccharomyces cerevisiae como en todos los hongos existen cuatro
regiones de ADNr (5S, 5.8S, 18S y 26S) y están agrupados en arreglos de cabeza a cola
formando un grupo sencillo que se ubica en el cromosoma 12. Los genes 18S y 26S se
encuentran separados por los espaciadores internos (ITS) (Fig. 8) los cuales no son
secuencias codificantes excepto por los genes pequeños 5S y 5.8S (Montrocher et al. 1998).
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Figura 8. Esquema de la región ribosomal elaborado con la secuencia Saccharomyces cerevisiae
(EU649672) que involucra las regiones 18S (SSrDNA), 5.8S y 26S (LSrDNA), además de las regiones no
codificantes ITS1 e ITS2, la localización de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo y el tamaño de los
fragmentos esperados.
La amplificación por PCR de estas regiones mostró una similaridad en el tamaño de las
bandas que para la región 26S las cuales fueron de aproximadamente 800 pb mientras que
en el caso de la región ITS mostró más diferencias encontrando bandas que iban desde 500
hasta 800 pb (Fig. 9 y 10).
Se amplificó la región 26S y la ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg utilizando los oligonucleótidos
reportados por White et al., (1990): NL1 (5’ GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’) y
NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’) para la región 26S y los oligonucleótidos ITS1
(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) para
la región ITS1-5.8S-ITS2. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Perkin Elmer
GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron en un
volumen final de 25 μl, utilizando 1 μl del ADN, 2.5 μl de Buffer 10X, 0.75 μl de cloruro
de magnesio de 25 mM, 0.2 μl de dNTPs 10 mM, 1 μl de cada uno de iniciadores 5 μM y
0.2 μl de la enzima Taq DNA polimerasa 5 U/5μl y completando el volumen a 25 μl con
agua milliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de desnaturalización por
5 min a 94ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94ºC, 30 seg a 59 ºC para ITS o 63 ºC para 26S y 1
min a 72ºC. Finalmente se dio un paso de extensión final a 10 min a 72ºC. Posteriormente
los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% mezclando 5 μl del
producto de PCR con 3 μl de SyberGold™ y depositándolos en el gel el cual se corrió en
una cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad a 100V por 30 min. De igual manera los
productos de PCR fueron visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™
10X, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM 1D (Figs. 8 y 9).
Los productos de PCR fueron purificados con el Kit comercial Wizard SV and PCR clean
up System de Promega para su posterior secuenciación. La imagen obtenida de cada una de
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las regiones amplificadas se muestra a continuación donde además se puede observar el
tamaño del fragmento obtenido el cual para la región 26S fue de aproximadamente 800 pb,
mientras que para la región ITS1-5.8S-ITS2 fue de entre 300 y 700 pb.
Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras
con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.
Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13
levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.
7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg
Los fragmentos amplificados por PCR una vez que ya habían sido purificados se procedió a
su secuenciación utilizando el secuenciador automático de capilar ABI Prism (Applied
800pb
800pb
800pb
700pb
300pb
700pb
700pb 300pb
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Biosystem Modelo 3130) con los siguientes oligonucleótidos: NL1
(5’GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG3’) forward para la región 26S, y el ITS1
(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) forward para la región ITS. Las reacciones de
secuenciación se realizaron como sigue. Los productos de PCR purificados fueron
nuevamente amplificados utilizando la siguiente reacción: 4 μl de Buffer big dye v 3.1 5X,
1 μl de iniciador, 4 μl de Big dye v 3.1 ready mix, 2 μl del producto de PCR, 9 μl de agua
esteril milliq para un volumen final de 20 μl. Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo de 96
°C por 1 minuto, seguido de 25 ciclos a 96 °C 10 segundos, 59 °C para los ITS o 63 °C
para los 26S y 60 °C durante 4 min. Posteriormente la reacción de secuenciación fue
purificada adicionando 2 μl de EDTA 125mM, 2 μl de NaOAC 3M pH 5.2 y 50 μl de
etanol absoluto Merck mezclando suavemente e incubando a -20 °C durante 20 minutos y
centrifugando a 14000 rpm por 15 minutos a 4 °C, se hizo un segundo lavado con 70 μl de
etanol al 70% mezclando, incubando y centrifugando como en el paso anterior, secando la
pastilla utilizando un termo-mixer (Eppendorf) durante aproximadamente 30 minutos,
posteriormente fueron secuenciadas en el Área de Biotecnología del CBG.
Una vez obtenidas las secuencias, estas se alinearon en la base de datos BLAST del NCBI
para su comparación e identificación, se seleccionaron las secuencias de referencia con las
cuales tenían similitud, posteriormente se elaboraron los árboles de distancias génicas con
las dos regiones usando el método Neighbor-Joining Saitou et al (1987) con un bootstrap
de 1000 replicas, la distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum
Composite Likelihood, también se estimo la divergencia evolutiva entre secuencias usando
el método Maximum Composite Likelihood dato no mostrado, todo este análisis
filogenético fue elaborado en el programa MEGA4 (Tamura et al., 2007).
7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal
Para conocer la diversidad de las especies y poblaciones involucradas en la fermentación
del mezcal, se calcularon los índices de diversidad y dominancia de Simpson, así como el
índice de Shannon, de acuerdo a las siguientes fórmulas:
Índice de dominancia de Simpson
D´= (n/N)2
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Índice de diversidad de Simpson
D= 1/(n/N)2
Donde N= Número total de variedades presentes de todas las especies
n = Número de variedades por especie
Índice de diversidad de Shannon
H = - (pi) * ln (pi)
Donde pi = Proporción de variedades de la especie i respecto al total de variedades
presentes de todas las especies, es decir, la abundancia relativa de variedad ni/N, donde:
ni = Número de variedades de la especie i
N = Numero de todas las variedades de todas las especies
7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto
7.4.1. Medios de cultivo
Los aislamientos se activaron en el medio de cultivo rico YPFA (extracto de levadura 5 g,
peptona 3 g, fructosa 20 g y agar 20 g) aforando hasta un litro con agua destilada y se
calento por aproximadamente 15 min. o hasta que se tornara translúcido, se esterilizó por
15 min a 121 oC, y se vació en cajas petri de 9 cm de diámetro. Cada aislamiento fue
sembrado por duplicado en cajas petri.
Para preparar el inóculo de los experimentos, se tomó una asada del aislamiento reactivado
en YPFA, y se inoculó en 30 mL del medio YPF (sin agar) colocado en un matraz de 200
mL.
7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave
Con el fin de estudiar el sistema de fermentación del mezcal bajo condiciones de vinata, se
preparó un medio de cultivo basado en mosto fresco de agave, el cual fue filtrado y
centrifugado a 7000 pm por 15 minutos, y debido a que su concentración inicial de azúcares
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reductores fue de 170 g L-1
, fue diluido con agua estéril hasta alcanzar una concentración de
100 g L-1
de azúcar, se le agregó 1 g L-1
de sulfato de amonio (NH4)2 SO4 y se esterilizó
para matar a los microorganismos presentes. Los experimentos se llevaron a cabo en tubos
falcon de 50 ml y por duplicado añadiendo la cepa la cual fue crecida en el medio líquido
midiendo la concentración con el uso de un espectrofotómetro a una D.O. de 0.05 y
aforando hasta 30ml con mosto el cual contenía 1 g L-1
de (NH4)2SO4 como fuente de
nitrógeno y colocándolas en una estufa a 30 °C durante 60 horas (tiempo de cosecha).Se
cuantificó la concentración de azúcar residual en cada experimento utilizando el método del
DNS, y la biomasa por peso seco. Se utilizo la prueba de ANOVA para escoger levaduras
que representaran a cada uno de los grupos formados por la comparación de medias en el
programa SAS.
7.4.3. Cuantificación de azucares reductores por DNS (ácido 3,5-
dinitrosalicílico)
El método DNS se basa en la reducción del acido 3,5-dinitrosalisilico (el cual se encuentra
de color amarillo naranja) por la glucosa y/o fructosa al acido 3-amino-5-nitrosalisilico (de
color rojo obscuro) (Miller, 1959), cuya presencia puede detectarse por la lectura de la
absorbancia. La solución DNS esta compuesta por 5 g de hidróxido sodio; 5 g de ácido 3,5-
dinitrosalicílico; 2.5 g de bisulfito de sodio y 1 g de fenol en cristales completando a 500
mL de agua y evitando su exposición a la luz; el reactivo puede ser utilizado después de 15
horas de su preparación. Posteriormente se realizó una curva patrón (Fig. 11) con diferentes
concentraciones de fructosa que va desde 0 a 1.2 g L-1
como se muestra en el cuadro 2 a
continuación:
Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS
No. De dilución Concentración
de fructosa
Agua
(ml)
Fructosa
(mL)
0 0 0.500 0
1 0.2 0.475 0.025
2 0.4 0.450 0.050
3 0.6 0.425 0.075
4 0.8 0.400 0.100
5 1 0.375 0.125
6 1.2 0.350 0.150
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 24 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
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Figura 11. Curva de calibración para fructosa
El análisis se efectúo en un tubo de ensayo conteniendo 0.5 ml de reactivo DNS y 0.5 ml de
la muestra a analizar, previamente diluida a la concentración de la curva patrón,
incubándose a 100 °C durante 10 minutos; enfriando por 10 minutos en hielo, agregando 5
ml de agua estéril y determinando la absorbancia a 570 nm (Miller, 1959).
7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco
La concentración celular se determinó por el método de peso seco, esta técnica permite la
estimación de la biomasa total de cada levadura. Para ello se pesaron tubos Falcon de 50
mL limpios y secos, y se les agregó 30 mL del medio YPF e inoculó con la levadura a
probar, y se corrió la fermentación durante 60 h, después de lo cual se centrifugó a 2500
rpm por 15 min y se colectó el sobrenadante, y el tubo con la pastilla celular se secó a a 50
°C por 24 h, se colocó en un desecador por 12 h más, y se pesó el tubo con la muestra seca,
restándole el peso del tubo limpio como se observa en la fórmula. Este método puede
llevarse en paralelo con el de espectrometría, con el fin de obtener la correlación entre D.O.
y concentración en biomasa por peso seco (Alfermann et al., 1997). La fórmula utilizada se
muestra a continuación:
Donde:
y = 0.1545xR² = 0.9954
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.00 0.50 1.00 1.50
Ab
sorb
anci
a 5
70
nm
Concentración de fructosa (g L-1)
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Pf = peso final de la muestra en el tubo
P0 = peso del tubo
V = Volumen de la muestra
PS = peso seco del mosto
7.5. Análisis estadístico
Se analizaron los resultados de biomasa y consumo de azúcares reductores utilizando una
prueba ANOVA con un diseño experimental completamente al azar, y comparando las
medias obtenidas por la prueba de la Diferencia Mínima Significativa (LSM por sus siglas
en inglés) en el programa SAS y el programa Excel. De los resultados obtenidos por la
prueba de LSM se escogieron las medias que fueran significativamente diferentes para
analizar su productividad de manera fina por cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC por sus siglas en inglés), y estos datos se utilizaron para realizar el cálculo de los
parámetros de productividad y rendimiento de cada una de las levaduras analizadas en este
estudio.
7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC
Para la cuantificación tanto del consumo de azúcares del mosto (glucosa y fructosa) como
para la del etanol producido, las muestras a las 60 h que fueron centrifugadas para remover
cualquier resto celular o fibra del medio de mosto, se filtraron 3 mL utilizando una
membrana de 0.20 μm, y se inyectaron 20 l de la muestra en un equipo de HPLC (Agilent
1100 seriesTM
) equipado con una columna BioRadTM
Aminex HPX (300 X 7.8 ml). La fase
móvil se preparó con agua milliQ y ácido sulfúrico al 0.005 M con un flujo de 0.5 mL min-1
con un tiempo de analisis de 30 min, a una temperatura de 35ºC y se midió la absorbancia a
190 nm. Las curvas de calibración se prepararon con concentraciones de 1 a 15 g L-1
,
haciéndose la regresión lineal para la cual el cuadrado de coeficiente de correlación de
Person (R2) no debió ser menor a 0.95 (Fig.12). A continuación se muestran las curvas de
concentración del compuesto vs el área bajo la curva del cromatograma correspondiente:
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Glucosa Fructosa
Etanol
Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC
7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR
Una de las técnicas reportadas para la caracterización de la diversidad genética de una
población con varias especies es la rep-PCR, que se basa en la utilización de
oligonucleótidos degenerados universales, los cuales amplifican regiones repetidas del
genoma, y que visualizadas en un gel de agarosa produce un patrón de bandas característico
de especie analizada. Para esto a partir del resultado de los árboles de distancias generados
con el programa MEGA4 y el resultado obtenido del HPLC se escogieron los aislamientos
que presentaron mayor producción de etanol, separándolos en 3 grupos por especie: el de
las Saccharomyces cerevisise, el grupo de las Kluyveromyces marxianus y el grupo de las
Torulaspora delbreckii, realizando esta técnica con cada grupo como se muestra a
continuación. El ADNg de las levaduras fue sometido a esta técnica usando los
oligonucleótidos REPIR-1 (5’IIIICGICGICATCIGGC3’) y REP2-I
(5’ICGICTTATCIGGCCTAC3’) de acuerdo a Hierro et al., 2004. Las condiciones de
y = 307.67xR² = 0.9976
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 10 20
Are
a
Concentración de glucosa (g L-1)
y = 1058.8xR² = 0.9949
0
5000
10000
15000
20000
0 10 20
Are
a
Concentración de fructosa (g L-1)
y = 35.501xR² = 0.9966
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20
Are
a
Concentración de etanol (g L-1)
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amplificación fueron 2.5 μl de buffer 10X, 1.5 μl de MgCl 25mM, 0.5 μl de dNTPs 10mM,
2.5 μl de cada oligonucleótido 5 μM, 0.5 μl de la enzima Taq polimerasa 5u/5 μl y 1 μl de
ADN para un volumen final de 25 μl, las condiciones de amplificación fueron 1 ciclo de 94
°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 47 °C por 1 min, 65 °C
por 4 min, además de una extensión final a 72 °C por 7 minutos. Los productos de PCR
fueron mezclados con SyberGold™10X y corridos en un gel de agarosa al 2% en una
cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad durante 4 horas a 90V y visualizados en un
transiluminador, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM
1D y
posteriormente vinculándolas con los árboles de distancias generados anteriormente.
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 28 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
8. RESULTADOS
8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos
Los 51 aislamientos de levadura obtenidos fueron clasificados de acuerdo a su origen y
etapa de fermentación (Cuadro 3). La caracterización preliminar de los mostos se realizó
midiendo los grados Brix, y esto nos permitió caracterizar la etapa de fermentación en la
que se encontraba el mosto, y por lo tanto de acumulación potencial de alcohol.
Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las
levaduras aisladas en diferentes etapas del proceso.
Aislamiento Etapa de
fermentación
Azúcar o Brix
Morfología
microscópica
C.l.4AN1, P.g.4AN2, C.l.4AN3, P.k.4AN5,
C.l.4AN6, P.g.4AN7, K.m.4D2, K.m.4D3,
K.m.4D4, K.m.4D5, P.k.4D6, P.k.4D7,
K.m.4Y2, S.c.4Y3, C.l.4Y4, P.k.4Y6
Trapiche 20.8° Ovaladas
T.d.1AN2, T.d.1AN1, P.m.1AN3, C.l.1AN4,
T.d.1AN5, K.m.1AN6, T.d.1AN9, S.c.1D1,
K.m.1D5, C.p.1Y7, P.k.1Y10, K.m.1Y11,
P.g.1Y12, P.g.1Y15, P.k.1Y16, K.m.1Y1,
K.m.1Y9, P.m.1Y14, T.d.1D2
Inicial 13.2° Redonda
S.c.D2, S.c.D3, S.c.D4, S.c.D5, S.c.D6,
Z.b.3Y1, S.c.3Y2, S.c.3Y3, S.c.3Y4, S.c.3Y5,
S.c.3Y8
Final 10° Redonda
S.c.mosca3, S.c.mosca1, S.c.mosca6,
K.m.mosca7, K.m.mosca5
Drosophila
melanogaster
(moscas)
ND Ovaladas
Nota: las claves finales de los aislamientos fueron asignadas una vez conocida su identidad molecular, y se
utilizan desde este cuadro para facilitar el análisis de resultados.
Los aislamientos que se encontraban en la etapa de trapiche tuvieron en general una
morfologia ovalada, ademas de que en esta etapa y en la inicial fue donde se observó la
mayor diversidad siendo K. marxianus la que aparece en mayor número de aislamientos,
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 29 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
mientras que S. cerevisiae se encuentra en baja frecuencia, ya que esta levadura
generalmente se encuentra en los tanque de fermentacion o en las cubetas donde es
colectado el mosto recien molido; sin embargo, ya que esta levadura es tolerante a altas
concentraciones de etanol, aumenta su frecuencia, desplazando a las demas especies de
levaduras al final del proceso, por lo que la diversidad disminuye conforme transcurre la
fermentación.
En cuanto a la caracterización microscópica, se observaron dos morfologías (redonda y
ovalada) principales, y las cuales sirvieron para realizar una clasificación preliminar de los
aislamientos (fig. 13).
Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para
clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri (ovalada).
Objetivo 100X.
Dada la baja resolución de esta determinación cualitativa, se procedió a realizar la
identificación molecular de los aislamientos, utilizando para ello la secuencia de
fragmentos ribosomales, que es una técnica ampliamente utilizada y reportada.
8.2. Identificación molecular de las levaduras
Los 51 aislamientos fueron identificados por la secuencia de dos diferentes regiones
ribosomales encontrando de esta manera nueve especies diferentes de levaduras y
asignándoles entonces claves colocando las iniciales y el punto de aislamiento de cada
levadura ya identificada (Cuadro 4), quedando de la siguiente manera: 15 Saccharomyces
cerevisiae (S.c.), 12 Kluyveromyces marxianus (K.m.), 5 Torulaspora delbrueckii (T.d.), 6
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 30 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Pichia kluyveri (P.k.), 4 P. guillermondii (P.g.), 2 P. mexicana (P.m.), 5 Clavispora
lusitaniae (C.l.), 1 Candida parapsilosis (C.p.) y 1 Zygosaccharomyces bailii (Z.b.)
Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos
de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI.
Clave Identificación con ITS Valor E Identidad
% Identificación con 26S Valor E
Identidad
% Identificación
S.c.D2 S. cerevisiae ( EU145764) 0 98 S. cerevisiae ( EF192587) 0 99 S. cerevisiae
S.c.D3 S. cerevisiae ( EU145764) 0 88 S. cerevisiae ( EU884435) 0 100 S. cerevisiae
S.c.D4 S. cerevisiae ( EU649673) 0 96 S. cerevisiae ( EU884435) 0 100 S. cerevisiae
S.c.D5 S. cerevisiae ( EU145764) 0 87 S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.D6 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.3Y3 S. cerevisiae ( EF457565) 0 98 S. cerevisiae ( EU556320) 0 99 S. cerevisiae
S.c.3Y5 S. cerevisiae ( EU145764) 0 97 S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.3Y4 S. cerevisiae ( EU145764) 0 98 S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.3Y8 S. cerevisiae ( EU145764) 0 98 S. cerevisiae ( EU884435) 0 100 S. cerevisiae
S.c.3Y2 S. cerevisiae ( EU151450) 0 98 S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.1D1 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.4Y3 S. cerevisiae ( EU145764) 0 91 S. cerevisiae ( EU386759) 0 99 S. cerevisiae
S.c.mosca3 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.mosca1 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
S.c.mosca6 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae
K.m.1Y1 K.marxianus (AY939806) 0 97 K.marxianus ( EU019219) 0 98 K.marxianus
K.m.1Y9 -- -- -- K.marxianus ( GQ121696) 0 97 K.marxianus
K.m.1AN6 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU439449) 0 99 K.marxianus
K.m.1D5 K.marxianus ( AF543841) 0 99 K.marxianus ( EU439450) 0 99 K.marxianus
K.m.1Y11 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU439450) 0 98 K.marxianus
K.m.4D2 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU019219) 0 98 K.marxianus
K.m.4D3 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU439449) 0 99 K.marxianus
K.m.4D4 K.marxianus ( AF543841) 0 97 K.marxianus ( EU019219) 0 98 K.marxianus
K.m.4D5 K.marxianus ( AF543841) 0 97 K.marxianus ( EU439450) 0 98 K.marxianus
K.m.4Y2 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU019219) 0 98 K.marxianus
K.m.mosca7 K.marxianus ( AF543841) 0 97 K.marxianus ( EU019219) 0 99 K.marxianus
K.m.mosca5 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU019219) 0 97 K.marxianus
T.d.1AN2 T. delbrueckii ( D89589) 0 98 T. delbrueckii ( EU879962) 0 96 T. delbrueckii
T.d.1D2 T. delbrueckii (EF568083) 0 98 T. delbrueckii ( EU879961) 0 98 T. delbrueckii
T.d.1AN1 -- -- -- T. delbrueckii ( EU879961) 0 97 T. delbrueckii
T.d.1AN5 T. delbrueckii ( X80275) 0 100 T. delbrueckii ( EU879961) 0 99 T. delbrueckii
T.d.1AN9 T. delbrueckii ( X80675) 0 100 T. delbrueckii ( EU879961) 0 99 T. delbrueckii
Z.b.3Y1 Z. bailii (X84640) 1E-106 93 Z. bailii ( AJ966343) 0 99 Z. bailii
C.p.1Y7 C. parapsilopsis (EU564205) 0 99 C. parapsilopsis (EU605804) 0 99 C. parapsilopsis
P.m.1AN3 -- -- -- P. mexicana (AM397863) 0 99 P. mexicana
P.m.1Y14 P. mexicana (AB365477) 0 98 P .mexicana (EU809452) 0 98 P.mexicana
P.g.1Y12 P.guillermondii (EF15140) 0 98 P.guillermondii EU177574) 0 98 P.guillermondii
P.g.1Y15 P.guillermondii (AM160625) 0 98 P.guillermondii (EU177574) 0 98 P.guillermondii
P.g.4AN2 P.guillermondii (EF151440) 0 94 P.guillermondii (EU177574) 0 98 P.guillermondii
P.g.4AN7 P.guillermondii (EU568993) 0 98 P.guillermondii (EU177574) 0 99 P.guillermondii
C.l.1AN4 C. lusitaniae (AY321469) 0 96 -- -- -- C. lusitaniae
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Cuadro 4. Continuación… Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S
de los mostos de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI.
Clave Identificación con ITS Valor E Identidad
% Identificación con 26S Valor E
Identidad
% Identificación
C.l.4AN1 -- -- -- C .lusitaniae (AY894825) 0 96 C .lusitaniae
C.l.4AN3 C. lusitaniae ( AY321469) 1E-165 98 C. lusitaniae (AY894824) 0 98 C. lusitaniae
C.l.4Y4 C.lusitaniae ( AY149777) 4E-170 99 C.lusitaniae (EU669469) 0 98 C.lusitaniae
C.l.4AN6 C. lusitaniae ( EF136370) 2E-149 94 -- -- -- C.lusitaniae
P.k.1Y10 P. kluyveri (DQ104732) 0 97 P. kluyveri (EU268643) 0 99 P. kluyveri
P.k.1Y16 P. kluyveri ( DQ104732) 3E-140 90 P. kluyveri (EU373464) 0 93 P. kluyveri
P.k.4AN5 P.kluyveri ( DQ104732) 0 97 P.kluyveri ( EU268643) 0 98 P.kluyveri
P.k.4D6 P. kluyveri ( DQ104732) 0 97 P. kluyveri ( EF116919) 0 99 P. kluyveri
P.k.4D7 P. kluyveri ( DQ104732) 0 98 P. kluyveri ( EU373464) 0 99 P. kluyveri
P.k.4Y6 P. kluyveri ( DQ104732) 0 97 P. kluyveri ( EU268643) 0 98 P. kluyveri
Una vez obtenida la identidad de cada una de la levadura y con secuencias de referencia de
la página del NCBI (GenBank) mediante el algoritmo blast, se elaboraron árboles de
distancias génicas para cada una de las regiones secuenciadas, encontrando que, para la
región 26S, todas las levaduras se agrupaban por especie, obteniéndose los nueve grupos
(en números romanos) a los que pertenecía cada levadura (Fig. 14). El grupo I pertenece a
la especie S. cerevisiae, el II son las pertenecientes a T. delbrueckii, el grupo III a Z. bailii,
en el grupo IV se encuentra K. marxianus, en el V se encuentra C.parasilopsis, en el VI se
agrupan las P. mexicana, en el grupo VII se encuentra P. guilliermondii, el grupo VIII
muestra a C. luitaniae mientras que en el grupo IX se encuentran las levaduras P.kluyveri y
se presentan de esta manera en los dos árboles de distancias mostrados a continuación.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4
utilizando el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum
Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del
GenBank fue utilizada como grupo de salida.
S.c.mosca3
S.c.3Y2
S.c.mosca6
S.c.D3
S.c.D4
S.c.D5
S.c. D6
EU556339 Saccharomyces cerevisiae
S.c.3Y5
S.c.D2
S.c.3Y3
S.c.3Y4
S.c.3Y8
S.c.1D1
S.c.4Y3
S.c.mosca1
T.d.1AN1
T.d.1AN2
T.d.1AN5
EU879961 Torulaspora delbrueckii
T.d.1AN9
T.d.1D2
Z.b.3Y1
AJ966343 Zygosaccharomyces bailii
EU439450 Kluyveromyces marxianus
K.m.1AN6
K.m.mosca7
K.m.1Y1
K.m.4D2
K.m.4D5
K.m.4D3
K.m.4D4
K.m.4Y2
K.m.1D5
K.m.1Y11
K.m.mosca5
K.m.1Y9
C.p.1Y7
EU605804 Candida parapsilosis
P.m.1AN3
EU809452 Pichia mexicana
P.m.1Y14
EU177574 Pichia guilliermondii
P.g.1Y15
P.g.4AN7
P.g.1Y12
P.g.4AN2
C.l.4AN1
AY894825 Clavispora lusitaniae
C.l.4AN3
C.l.4Y4
AY305665 Pichia kluyveri
P.k.1Y10
P.k.1Y16
P.k.4AN5
P.k.4D6
P.k.4D7
P.k.4Y6
FJ360521 Neurospora crassa
100
79
100
100
41
100
100
100
65
65
100
36
98
100
65
65
100
52
99
97
65
88
100
0.000.020.040.060.080.100.120.14
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 33 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor
Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un re-
muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como grupo de
salida.
EU145764 Saccharomyces cerevisiae
S.c.D3
S.c.4Y3
S.c.D5
S.c.3Y8
S.c.3Y2
S.c3Y3
S.c.3Y4
S.c.3Y5
S.c.D2
S.c.D4
T.d.1AN2
AB469378 Torulaspora delbrueckii
T.d.1D2
K.m.1Y1
K.m.4D2
EF568057 Kluyveromyces marxianus
K.m.4D3
T.d.1AN5
K.m.mosca5
K.m.1AN6
K.m.1D5
K.m.1Y11
K.m.4D5
K.m.4Y2
T.d.1AN9
K.m.mosca7
K.m.4D4
Z.b.3Y1
X84732 Zygosaccharomyces bailii
K.m.1Y9
P.k.4AN5
P.k.4D6
P.k.4D7
DQ104732 Pichia kluyveri
P.k.1Y10
P.k.4Y6
P.k.1Y16
P.m.1Y14
EF568069 Pichia mexicana
P.g.4AN2
EF151440 Pichia guilliermondii
P.g.4AN7
P.g.1Y12
P.g.1Y15
C.l.4Y4
AY321469 Clavispora lusitaniae
C.l.4AN3
C.l.1AN4
C.l.4AN6
C.p.1Y7
FM172980 Candida parapsilosis
FJ360521 Neurospora crassa
99
99
99
95
88
61
98
74
63
33
29
97
67
65
74
43
89
49
49
18
18
0.000.050.100.150.200.25
I
II
III
IV
V
VI
IX
VII
VIII
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 34 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Para la región ITS1-5.8S-ITS2 (Fig. 15), aunque también se formaron los nueve grupos,
algunas de las levaduras de los géneros Kluyveromyces y Torulaspora no se agruparon
correctamente con su secuencia de referencia, como es el caso de los aislamientos
T.d.1AN9 y T.d.1AN5 (Fig. 15) las cuales pertenecen al género Torulaspora y se agrupan
con el género Kluyveromyces, además estas dos levaduras obtuvieron un 99% de identidad
con su secuencia de referencia en el algoritmo blast. La levadura K.m.1Y9 también se salió
del grupo de Kluyveromyces colocándose con Zygosaccharomyces en un grupo diferente,
fuera de los 9 previamente identificados.
8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal
Para la caracterización de la diversidad ecológica del proceso de producción del mezcal, se
consideraron todas las etapas de la fermentación, comenzando por el trapiche donde se
aislaron 5 especies (16 variedades), en la etapa inicial 8 especies (24 variedades) y en la
final 2 especies (5 variedades) (Cuadro 5). El índice de diversidad también indica que esta
fue mayor en la etapa inicial. El hecho de que la mayor diversidad se encuentre en las
primeras etapas de fermentación es debido probablemente a la alta concentración de
azúcares y poco etanol en el mosto durante esas etapas (Cuadro 5).
Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San
Carlos (Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la
diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson.
Variables Etapas de la fermentación
Trapiche Inicial Final
S 5 8 2
H 1.49 1.87 0.30
D 5.22 6.9 1.5
D’ 0.19 0.15 0.67
Es claro por el índice de dominancia que, al final de la fermentación, un solo tipo de
población (S. cerevisiae) predomina en esta etapa.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 35 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave
8.3.1. Consumo de azúcares reductores
La cuantificación de los azúcares reductores en los mostos durante las fermentaciones
demostró que, a las 60 horas, que fue el punto final muestreado para todos los aislamientos
ya solo se encontraran pequeñas concentraciones de de azúcar en algunos casos.
Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae
(S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery (P.k.),
(E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.).
0
20
40
60
80
100
120
g L
-1
A
0
20
40
60
80
100
120
g L
-1
B
0
20
40
60
80
100
120
g L
-1
C
020406080
100120
g L-1
D
0
20
40
60
80
100
120
g L-1
E
0
20
40
60
80
100
120
g L-1
F
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 36 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
El consumo fue diferencial para cada aislamiento, y se puede destacar a la levadura S.c.D5,
la cual utilizó el 88 % de los azucares, además de presentar un rápido crecimiento durante
las primeras horas de inoculación (Fig. 16). En general, la mayoría de las S. cerevisiae
tuvieron un buen consumo y crecimiento en el medio de mosto de Agave (Cuadro 6).
8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave
Los aislamientos que consumieron la mayor cantidad de azúcar demostraron ser también
los que obtuvieron mayor peso seco por consiguiente fueron los que tuvieron el mayor
crecimiento, siendo los aislamientos de S. cerevisiae los que alcanzaron hasta un peso seco
de 4.8 g L-1
, mientras que los aislamientos de Pichia spp no alcanzaron el 1 g L-1
. Esto
demuestra la gran variabilidad en su capacidad de consumir los azucares presentes en el
mosto (Fig. 17).
8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores
Se realizó el cálculo del consumo de azúcares reductores por unidad de biomasa, como un
parámetro que indicara la capacidad específica de utilización de la fuente de carbono de
cada uno de los aislamientos en el medio de mosto de agave, y como se puede apreciar en
la Figura 18, al utilizar este parámetro, es posible observar diferencias en las capacidades
de consumo de cada uno de los aislamientos en todas las especies aisladas, lo cual indica
que existen diferencias metabólicas en cada población, que pudieran ser aprovechadas en el
mejoramiento de la fermentación.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.);
B) Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E)
Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.).
0
1
2
3
4
5
g L-1
A
0
1
2
3
4
5
g L-1
B
0
1
2
3
4
5
g L-1
C
0
1
2
3
4
5
g L-1
D
0
1
2
3
4
5
g L-1
E
0
1
2
3
4
5
g L-1
F
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 38 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces
cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia
kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.).
01020304050607080
g- AZ/
g- X
A
01020304050607080
g- AZ/
g X
B
01020304050607080
g- AZ/
g- X
C
01020304050607080
g- AZ/
g- X
D
01020304050607080
g- AZ/
g- X
E
01020304050607080
g- AZ/
g- X
F
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 39 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Los datos de consumo específico de azúcares reductores fueron utilizados para realizar un
análisis de varianza, el cual arrojó los siguientes resultados:
Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar
Fuente GL Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio F-Valor Pr > F
Modelo 53 44549.06627 840.54842 20.94 <.0001
Error 150 6020.04706 40.13365
Total correcto 203 50569.11333
Alfa 0.05
Error de grados de libertad 150
Error de cuadrado medio 40.13365
Valor crítico de t 1.97591
Diferencia menos significativa 8.8513
A partir de los resultados obtenidos con el ANOVA y el agrupamiento con la prueba de
Diferencias Menos Significativas (LSM) dado a que se observaron diferencias, se decidió
pasar todas las muestras por HPLC para de esta manera encontrar sus diferencias a nivel de
producción de etanol de cada uno de los aislamientos.
8.4. Capacidad fermentativa de los aislamientos
Las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae resultaron ser, como era esperado,
las que producen la mayor cantidad de etanol, sin embargo todas las especies de levaduras
probadas también lo produjeron, siendo los aislamientos de los géneros Kluyveromyces y
Torulaspora los que presentaron un buen nivel (cuadro 6), por lo tanto estos tres géneros
fueron seleccionados para ser analizadas por rep-PCR. La levadura S.c.mosca3 fue la que
presento el mayor consumo de azúcar y fue por lo tanto la de mayor producción de etanol
alcanzando hasta 90 g L-1
a diferencia de Pichia mexicana P.m1Y14 la cual solamente
produjo 2.8 g L-1
de etanol.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 40 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Cuadro 7. Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos obtenidos por
HPLC.
Aislamiento
Consumo de azúcar y producción
de etanol
g L-1
Biomasa
g L-1
Consumo ó producción
específica
g g-1
YEtOH/Azuc
Glucosa Fructosa Etanol Glucosa Fructos
a Etanol
S.c.D5 7.11 25.28 72.73 4.32 1.65 5.85 16.83 2.25
S.c.1D1 6.08 11.98 31.50 1.33 4.57 9.01 23.69 1.74
S.C.3Y5 8.28 27.25 58.81 3.15 2.63 8.65 18.67 1.65
S.c. 4Y3 8.99 36.83 43.05 3.68 2.44 10.01 11.70 0.94
S.c. 3Y8 8.82 37.16 26.78 2.93 3.01 12.68 9.14 0.58
S.c.3Y4 9.19 37.10 57.13 3.98 2.31 9.32 14.35 1.23
S.c. D4 9.34 33.80 46.80 3.82 2.45 8.85 12.25 1.08
S.c. 3Y3 9.36 38.91 49.10 3.65 2.56 10.66 13.45 1.02
S.c. mosca1 9.97 40.01 38.74 4.8 2.08 8.33 8.07 0.78
S.c.3Y2 9.72 28.83 70.28 3.15 3.09 9.15 22.31 1.82
S.c. mosca6 9.91 31.92 51.30 3.25 3.05 9.82 15.78 1.23
S.c. mosca3 10.13 58.91 90.03 3.3 3.07 17.85 27.28 1.30
S.c.D2 9.72 16.46 58.14 3.65 2.66 4.51 15.93 2.22
S.c. D6 9.90 33.25 64.41 4.42 2.24 7.52 14.57 1.49
S.c. D3 10.13 44.35 64.05 3.3 3.07 13.44 19.41 1.18
K.m.4D2 5.88 15.05 48.55 1.4 4.20 10.75 34.68 2.32
K.m.4D5 7.54 26.61 32.42 1.27 5.94 20.95 25.52 0.95
K.m.1Y11 6.94 22.99 28.33 1.53 4.53 15.03 18.52 0.95
K.m.4D4 6.97 23.67 28.75 1.38 5.05 17.15 20.83 0.94
K.m.1AN6 7.62 26.19 32.30 1.93 3.95 13.57 16.74 0.96
K.m. mosca7 8.10 32.25 28.12 1.87 4.33 17.25 15.04 0.70
K.m. 4D3 6.61 13.26 3.89 1.45 4.56 9.14 2.68 0.20
K.m. 1D5 8.33 28.65 37.31 1.93 4.32 14.84 19.33 1.01
K.m. 1Y9 8.02 19.94 50.05 1.73 4.64 11.53 28.93 1.79
K.m. mosca5 5.44 20.89 4.90 1.62 3.36 12.90 3.03 0.19
K.m. 4Y2 7.88 26.81 6.14 1.78 4.42 15.06 3.45 0.18
K.m. 1Y1 7.95 23.42 7.32 1.85 4.30 12.66 3.96 0.23
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 41 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Cuadro 7. Continuación….Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos
obtenidos por HPLC
Aislamiento
Consumo de azúcar y producción
de etanol
g L-1
Biomasa
g L-1
Consumó producción
específica
g g-1
YEtOH/Azuc
Glucosa Fructosa Etanol Glucosa Fructosa Etanol
T.d.1AN1 6.00 19.28 29.86 1.68 3.57 11.48 17.77 1.18
T.d.1D2 9.43 46.23 60.25 3.22 2.93 14.36 18.71 1.08
T.d.1AN2 8.41 40.54 54.86 3.02 2.78 13.42 18.17 1.12
T.d. 1AN9 6.49 21.05 32.94 1.45 4.47 14.52 22.72 1.20
T.d. 1AN5 8.84 34.46 4.58 1.68 5.26 20.51 2.73 0.11
P.k.1Y10 7.16 21.54 34.30 2.03 3.53 10.61 16.90 1.20
P.k. 1Y16 4.06 12.26 3.12 1.17 3.47 10.48 2.66 0.19
P.k. 4AN5 8.59 23.14 33.66 1.87 4.59 12.37 18.00 1.06
P.k. 4Y6 7.21 9.59 8.36 1.63 4.42 5.89 5.13 0.50
P.k. 4D6 10.47 0.00 3.89 1.98 5.29 0.00 1.96 0.37
P.k. 4D7 7.60 25.09 31.37 2.28 3.33 11.00 13.76 0.96
C.l.1AN4 4.13 18.05 20.79 1.12 3.69 16.12 18.56 0.94
C.l.4AN3 6.14 21.85 24.17 1.45 4.24 15.07 16.67 0.86
C.l.4AN1 4.68 21.43 19.40 1.47 3.19 14.58 13.20 0.74
C.l.4AN6 4.21 14.43 6.75 0.95 4.44 15.19 7.10 0.36
C.l. 4Y4 4.00 15.46 25.71 1.7 2.35 9.10 15.13 1.32
P.g.4AN2 5.51 17.56 28.12 1.23 4.48 14.28 22.86 1.22
P.g. 4AN7 2.37 7.48 5.19 1.72 1.38 4.35 3.02 0.53
P.g.1Y15 3.33 18.53 4.55 1.3 2.57 14.25 3.50 0.21
P.g.1Y12 7.77 0.00 32.00 1.35 5.75 0.00 23.71 4.12
P.m.1AN3 1.38 1.66 26.39 0.97 1.43 1.71 27.20 8.67
P.m.1Y14 1.00 0.14 2.49 1.25 0.80 0.11 1.99 2.18
Z.b. 3Y1 2.44 34.19 56.73 2.5 0.98 13.67 22.69 1.55
C.p. 1Y7 8.88 5.61 4.97 1.52 5.84 3.69 3.27 0.34
Como puede observarse en el cuadro 6, en relación a la producción específica de etanol en
S. cerevisiae, los aislamientos varían entre valores de 8 hasta 27 g g-1
en éste parámetro, lo
cual desde el punto de vista de la fermentación es relevante, especialmente a la hora de
seleccionar un inóculo para el proceso de producción del mezcal. En este aspecto, el
aislamiento S.c.mosca3 es el más promisorio.
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8.5. Diversidad genética de levaduras por rep-PCR
Las levaduras se clasificaron de acuerdo al patrón de bandas obtenido con la técnica de
análisis global de ADN utilizado (rep-PCR), la cual fue rápida y reproducible, a excepción
de las levaduras S.c.D3 y S.c.D5 de las cuales no fue posible lograr amplificación.
Figura 19. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo S. cerevisiae
Además, de los resultados obtenidos del rep-PCR se elaboró una matriz binaria de ausencia
presencia tomando la presencia de una banda como 1 y la ausencia como 0, posteriormente
de los resultados obtenidos se elaboro un árbol de distancias utilizando el programa
Statistica (fig. 19). Para el género Saccharomyces se obtuvieron 5 patrones rep-PCR, lo
cual fue un indicador de la diversidad genética dentro de esta especie como se puede
apreciar gráficamente en la fig. 19, en los que el análisis matemático es capaz de separarlos
en 10 distintos grupos, y la levadura S.c.mosca3 fue única en su patrón separándose en una
sola rama. En los resultados de las fermentaciones resultó ser la mejor en términos de
producción de etanol y consumo de azucares reductores.
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Distancia de ligamiento
Figura 20. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las
levaduras Saccharomyces cerevisiae utilizando el programa Statistica y el método de distancias
euclidianas.
En base a estos resultados, la técnica rep-PCR fue capaz de separar a las levaduras de
diferentes especies y posiblemente también entre cepas, ya que el patrón de rep-PCR
concuerda con los arboles de distancias genéticas (Figs. 14 y 15).
Para las levaduras del grupo K.marxianus y T.delbrueckii (Fig. 21) se observaron 6
patrones de rep-PCR, y donde la mayoria de las K.marxianus tienen el mismo patrón, sin
embargo, la levadura K.m. 1Y9 es ligeramente diferente a las demas esta diferencia es
posiblemente la que provoca que en el árbol de distancias esta levadura se salga de su
grupo. Adicionalmente la levadura K.m.1Y11 no presentó amplificación por lo tanto no
presenta las secuencias de union a estos oligonucleotidos, las levaduras K.m.1Y1, K.m.1D5
y K.m.4D4 presentaron bandas semejante entre ellas.
Para el caso de T.delbrueckii la mayoría presenta diferencias aunque con pocas bandas ya
que T.d.1AN2 y T.d.1D2 presentan dos bandas del mismo tamaño pero T.d.1D2 presenta
ademas otras dos bandas mas pequeñas. En las levaduras T.d.1AN5 y T.d.1AN9 se
observan dos bandas igual que en el caso de las Kluyveromyces y a la misma altura, esto
UPGMA
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Distancia de ligamiento
S.c.3Y8
S.c.3Y4
S.c.mos3
S.c.3Y5
S.c.1D1
S.c.D5
S.c.D3
S.c.3Y2
S.c.3Y3
S.c.mos1
S.c.D6
S.c.D4
S.c.mos6
S.c.4Y3
S.c.D2
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explica el por qué de que estas levaduras se agrupen en el la rama de las Kluyveromyces ya
que su patron rep-PCR es muy parecido, pudiendo llegar a pensar que se trata de la misma
especie sin embargo como ya se menciono anteriormente estas levaduras presentan un 99%
de identidad con su cepa de referencia (Cuadro 4). La levadura T.d.1AN1 no pudo ser
amplificada.
Figura 21. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo K. marxianus y T.
delbrueckii.
De igual manera que con S. cerevisiae, de los resultados obtenidos del rep-PCR de K.
marxianus y T. delbrueckii se elaboro una matriz de ausencia presencia seguido de el árbol
de distancias utilizando el programa Statistica con el método de Distancias Euclidianas
(Fig. 22) encontrándose 7 diferentes ramas que marcan las diferencias que existen entre las
cepas de Kluyveromyces marxianus y de Torulaspora delbrueckii.
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Distancia de ligamiento
Figura 22. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras
Kluyveromyces marxianus y Torulaspora delbrueckii utilizando el programa Statistica y el método de
distancias euclidianas.
Finalmente se compararon los arboles obtenidos de la matriz binaria, el patrón de bandas
obtenido por rep-PCR y la producción de etanol de cada una de las levaduras.
Las levaduras que en el arbol de distancias génicas de la region ITS1-5.8S-ITS2 no fueron
agrupadas correctamente mostraron claramente diferencias en el patron del rep-PCR, donde
se pudo observar que las levadura K.m.1Y9 la cual se salio del grupo de las Kluyveromyces
presenta un patrón diferente al resto de su grupo, ademas las levaduras T.d.1AN5 y
T.d.1AN9 las cuales pertenecen al grupo de las Torulaspora y que en el árbol elaborado
con las secuencias de los ITS se agruparon con Kluyveromyces tienen el mismo patrón que
algunas de las levaduras que se encuentran en el grupo de Kluyveromyces. Esto indica que
un solo nivel de caracterización molecular no es suficiente para su identificación ó
clasificación, por lo que el conjuntar estos datos con el fenotipo productivo sirvió para
elegir a los aislamientos con mejores propiedades fermentativas.
UPGMA
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Distancia de ligamiento
K.m.1Y9
T.d.1D2
T.d.1AN2
T.d.1AN9
T.d.1AN5
K.m.mos5
K.m.mos7
K.m.4Y2
K.m.4D5
K.m.4D3
T.d.1AN1
K.m.1Y11
K.m.4D2
K.m.1AN6
K.m.4D4
K.m.1D5
K.m.1Y1
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8.5.1. Diversidad genética y productividad de etanol
Con el fin de verificar si el agrupamiento de diversidad genética guardaba correlación con
la capacidad productiva de los aislamientos, se compararon los niveles de producción de
etanol de las S. cerevisiae (Fig. 23), y de K. marxianus y T. delbrueckii (Fig. 24) con su
diversidad genética arrojada por el dendrograma construido a partir del rep-PCR. Como
puede observarse en el caso de S. cerevisiae, si bien no existe una tendencia entre ambos
parámetros, el aislamiento S.c.mosca 3 presentó máxima producción de etanol, y también
tiene un patrón único que se separa en una rama individual.
Figura 23. Comparación de la diversidad genética y la producción específica de etanol de las levaduras
probadas en este trabajo. S.c. (Saccharomyces cerevisiae).
En el caso de K. marxianus y T. delbrueckii (Fig. 24) tampoco pudo observarse una
tendencia clara en cuanto a la comparación de la diversidad genética de los aislamientos
obtenida con la técnica de rep-PCR y su productividad.
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Figura 24. Comparación de la diversidad genética y la producción de etanol de las levaduras Kluyveromyces
marxianus (K.m.) y Torulaspora delbrueckii (T.d.).
Sin embargo se puede destacar a la levadura K.m.1Y9, la cual presenta un patrón rep-PCR
muy diferente a las levaduras de su grupo y fue la mas productiva de todas las
Kluyveromyces, mientras que del grupo de las Torulaspora la levadura T.d.1D2 tiene un
patron rep-PCR singular, muy similar a las del grupo Kluyveromyces, y fue la más
productiva.
Estos resultados indican que, si bien no es posible determinar a priori las características
productivas de un aislamiento simplemente basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí
pueden ser utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los
aislamientos, que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la
fermentación, para verificar que la población deseada se encuentra presente en el proceso.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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9. DISCUSIÓN
El mezcal es una bebida artesanal mexicana que tiene denominación de origen en varios
estados, incluyendo a Tamaulipas, y sin embargo existen muy pocos estudios acerca de la
microbiología del mismo. Se necesitan más estudios acerca del proceso de elaboración del
mezcal y no solamente durante la fermentación sino también de las otras etapas de
elaboración como son la molienda, el cocido de las piñas y la destilación; sin embargo, es
durante la fermentación que ocurren los procesos biológicos que determinan en gran
medida la calidad final del producto. En este trabajo, se obtuvieron importantes avances en
el conocimiento microbiológico del mezcal de Tamaulipas, caracterizándose la micoflora
presente durante las etapas de fermentación tanto a nivel fenotípico (productivo) como
molecular mediante una técnica de análisis genómico global.
9.1. Caracterización morfológica y molecular
En el mezcal analizado se observó que las levaduras que predominaron en la etapa inicial
de fermentación pertenecen en su mayoría a la especie Kluyveromyces marxianus, la cual
ya no se encuentra en la etapa final, que es cuando se encuentra la mayor concentración de
etanol. De acuerdo a esto, y apoyado por los valores de los índices de diversidad de
Shannon y Simpson, la mayor diversidad se encuentra en la etapa inicial, con ocho especies
diferentes, lo cual indica que, además de las levaduras que se incorporaron al mosto en el
trapiche, en las cubas de fermentación se encuentran presentes una gran variedad de
poblaciones. Esto se debe a la baja concentracion de etanol que se encuentra en esta etapa
sin embargo conforme transcurre la fermentacion estas desaparecen quedando solamente
dos especies como se muestra en los indices de diversidad al final solo se aisló a S.
cerevisiae, la cual tolera altas concentraciones de etanol, y la cual gobernó la etapa final, y
generalmente perece cuando se alcanza una concentración mayor al 12-15% (Fleet, 2003).
Un aislamiento de Z. bailii fue obtenido en la etapa final de la fermentación, y es el primer
reporte de la presencia de esta levadura en mostos de agave. Se sabe que, al igual que las
especies Schizosaccharomyces pombe y Zygosaccharomyces fermentans, puede tolerar
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altas concentraciones de etanol (>10%) y que suelen encontrarse en ambientes vinícolas
(Fleet, 2003). Con respecto al índice de dominancia de Simpson, se corroboró la
observación de que es en la etapa final, de alta concentración etanólica, en donde se
aislaron diez S. cerevisiae y una Z. bailii como se menciono anteriormente.
Haciendo una analogía con el sistema de fermentación vinícola, se ha observado que la
concentración inicial de células usualmente es de 104-10
5 cfu mL
-1 para las especies no-
Saccharomyces y de 102-10
3 cfu mL
-1 para las Saccharomyces, sin embargo conforme
transcurre la fermentación, las no-Saccharomyces desaparecen y las especies de
Saccharomyces aumentan alcanzando alrededor de 107-10
8 cfu mL
-1 al llegar a la etapa
final del proceso (Xufre et al., 2006). Es razonable suponer que en el sistema de mosto de
Agave spp deben presentarse cambios similares de poblaciones. Si bien en este trabajo la
concentración celular no fue medida en los diferentes puntos de muestreo de la
fermentación del mezcal tamaulipeco, sería importante, desde el punto de vista de proceso,
hacer ésta cuantificación, y verificar si la concentración celular de una especie en particular
tienen impacto en las características organolépticas del producto final.
En la fermentación espontánea de bebidas destiladas de Agave spp en general es en las
primeras etapas donde se encuentra la mayor diversidad de especies de levaduras y es
también donde se producen los primeros aromas de esta bebida lo cual es realizado por
levaduras no-Saccharomyces, las cuales pueden producir altas concentraciones de algunos
compuestos que determinan la calidad sensorial de las bebidas alcohólicas. Las especies de
levaduras involucradas en la fermentación de mostos de agave son variables, y no hay dos
tipos de mezcal que tengan el mismo perfil de poblaciones, Por ejemplo, en el caso de
mostos de Agave salmiana (mezcal potosino), se identificaron 4 especies de levaduras
involucradas en el proceso: C. lusitaniae, K. marxianus, P. fermentans y S. cerevisiae (De
León Rodríguez et al., 2006).
En contraste, las poblaciones de levaduras que se encuentran presentes durante cada una de
las etapas de fermentación en el caso del mezcal de Michoacán, se aislaron a Candida
magnoliae, Hanseniospora vineae, H. uvarum, Issatchenkia occidentalis, Kluyveromyces
lactis, y Saccharomyces cerevisiae en 13 diferentes destilerías (Gschaedler Mathis et al.,
2004). En el caso del mezcal de Oaxaca, encontraron a Candida spp., Hanseniaspora spp. y
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S. cerevisiae (Andrade Meneses y Ruiz Teran (2004), citado en Lappe-Oliveras et al.,
2008); en tanto que del mosto de A. fourcroydes de mezcal de Yucatán, se aislaron especies
de Candida spp, C. parasilopsis, C. lusitaniae, Debaryomyces hansenii, Kluyvernomyces
marxianus, Pichia caribbica, P. guilliermondii, Rhodotorula spp., T. delbrueckii y S.
cerevisiae en una fermentación natural (Lappe-Oliveras et al., 2008). Es claro que existe
una gran diversidad ecológica de levaduras que se encuentran presentes en la fermentación
del mezcal de las diferentes regiones de México, y las cuales pueden influenciar la calidad
de esta bebida artesanal, existen especies de levaduras comunes para todas las
fermentaciones de mostos de Agave, es claro que la presencia de levaduras (y Agave spp)
específicos para cada uno de los productos regionales, pueden conferirles propiedades
organolépticas únicas.
La identificacion molecular la cual fue realizada por secuenciacion de las región ITS1-
5.8S-ITS2 mostró consistencia, como era esperado, con la identificación arrojada con la
región 26S ,y solo en pocos aislamientos el producto de PCR de esta región no pudo ser
secuenciada (ver cuadro 4). También se observó que el porcentaje de identidad en general
era más bajo al utilizar la secuencia de la región ITS1-5.8S-ITS2. Se ha reportado evidencia
de que la región ITS1-5.8S-ITS2 contiene variaciones considerables en su secuencia; por
ejemplo, Sujaya et al. (2004) en su trabajo realizado en el vino de arroz, identificaron 51
levaduras, sin embargo tuvieron el mismo problema al intentar secuenciar de forma directa
las regiones ITS esto podría ser debido a la presencia de una heterocopia la cual se piensa
pude ser por que algunas cepas son heterotálicas y contienen dos alelos en un mismo locus.
Esto es una desventaja al utilizar la región ITS1-5.8S-ITS2 para clasificar levaduras. Es por
ello que para los resultados que aquí se reportan, fue muy importante también secuenciar la
región 26S, corroborando de esta manera nuestros resultados y logrando identificar
molecularmente a los 51 aislamientos (cuadro 4).
El análisis filogenético con las dos diferentes regiones ribosomales analizadas en este
trabajo reveló que dos de los aislamientos que fueron clasificados como Torulaspora
delbrueckii con la región 26S, poseen una alta similitud con Kluyveromyces marxianus al
ser identificados con la región ITS1-5.8S-ITS2, lo cual puede sugerir algunos errores en
los reportes en la literatura de estas especies cuando solamente se utiliza esta región para su
clasificación. Estos resultados indican que, en el caso de las levaduras, debieran
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secuenciarse al menos dos regiones, ribosomales o de algún gen constitutivo, para poder
tener certeza de la identidad molecular de los aislamientos.
9.2. Diversidad fenotípica
En la caracterización productiva de las levaduras a las 60 h de cultivo, se pudieron observar
diferencias fenotípicas en el consumo de azúcares, principalmente entre los aislamientos de
las especies de S. cerevisiae, K. marxianus y T. delbrueckii, y todas las levaduras fueron
capaces de producir etanol, no únicamente las pertenecientes a S. cerevisiae. En un estudio
en vino realizado por Clemente- Jimenez et al. (2004), utilizando seis diferentes variedades
de uva, midieron la cantidad de azucar residual en el mosto encontrando que las especies S.
cerevisiae y Candida stellata fueron las que consumieron la mayor cantidad de azúcar, sin
embargo al igual que en nuestro trabajo, todas las levaduras probadas produjeron etanol
pero en cantidades variables. En nuestro caso no se encontró a C. stellata en los mostos de
Agave spp utilizados en la elaboración del mezcal tamaulipeco.
Es conocido que las levaduras de la especie S. cerevisiae tienen actividad killer, es decir
que producen compuestos toxicos para otras levaduras lo cual podria ser una explicación de
que las demas levaduras presentes en las primeras etapas de fermentacion desaparecieran
conforme transcurre este proceso, adicional al conocido efecto del etanol, en el cual la
mayoría de especies, excepto las resistentes, son inhibidas cuando alcanza una
concentración del 5 al 7% en el mosto (Fleet, 2003), y que en mostos de Agave spp puede
llegar a alcanzar concentraciones del doble de ese valor (Díaz-Montaño et al., 2008). En
nuestro caso los aislamientos de S. cerevisiae fueron los que presentan una variabilidad
relativa de hasta un 70% en cuanto a su producción de biomasa, así como en su velocidad
de consumo de azúcares y de producción de etanol, lo cual indica una alta especialización
fenotípica a diferentes condiciones del mosto.
9.3. Diversidad genética y productividad
El uso de la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales para cada una de las
levaduras analizadas, sin embargo, en algunos casos, no fue posible obtener la
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amplificación, lo cual indica que probablemente estos aislamientos no tienen los sitios de
hibridación para los oligonucleótidos utilizados. Las levaduras del grupo Saccharomyces
presentan algunas diferencias en su patrón rep-PCR el cual se pudo observar principalmente
en las levaduras S.c.mosca3, S.c.1D1, S.c.3Y4 y S.c. 3Y8, las cuales presentaron un patrón
muy diferente entre sí y con las demas levaduras. Se observó variación en la identidad
genética de los aislamientos incluidos en la mayoria de las especies involucradas en la
fermentacion del mezcal tamaulipeco, pero especialmente en las especies S. cerevisiae, K.
marxianus y T. delbrueckii. De manera relevante, todas las levaduras aisladas de los mostos
de mezcal tamaulipeco producen etanol, aunque en concentraciones muy variables.
Estos resultados indican que esta técnica rep-PCR es capaz de diferenciar a las levaduras
que se encuentran en los mostos de mezcal, separando a los aislamientos que incluso
pertenecen a la misma especie. Por ejemplo, el aislamiento S.c.mosca3, que presentó la
mayor producciónn de etanol, tuvo un patrón rep-PCR diferente a las demás S. cerevisiae.
Los aislamientos Td1AN5 y Td1AN9, identificadas molecularmente como pertenecientes a
la especie Torulaspora , fueron clasificadas como Kluyveromyces tanto en el arbol de
distancias elaborado con las secuencias de la region ITS1-5.8S-ITS2, como en el árbol
elaborado con el patrón de bandas del rep-PCR, lo cual puede indicar que estos dos
aislamientos no pertenece a Torulaspora como lo indica el arbol de distancias de la region
26S. La levadura K.m.1Y9 la cual se salió del grupo de las Kluyveromyces presenta un
patrón rep-PCR diferente al resto de su grupo. Esto indica que un solo nivel de
caracterización molecular no es suficiente para su identificación ó clasificación, por lo que
el conjuntar estos datos con el fenotipo productivo sirvió para elegir a los aislamientos con
mejores propiedades fermentativas.
Estos resultados indican que, si bien no es posible determinar a priori las características
productivas de un aislamiento simplemente basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí
pueden ser utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los
aislamientos, que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la
fermentación, para verificar que la población deseada se encuentra presente en el proceso.
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Durante los últimos años han aparecido técnicas novedosas para el estudio de los
microorganismos utilizados en la industria de las fermentaciones, que han permitido
identificar una gran diversidad de especies de interés económico e industrial. La técnica
rep-PCR mostró un gran poder de resolución para los aislamientos probados en este estudio
por lo que es recomendable utilizarla como una caracterización preliminar en las levaduras
(y bacterias) presentes en los mostos para hacer una separación rápida de las diferentes
especies que puedan estar presentes en los mostos de mezcal.
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10. CONCLUSIONES
En este estudio se obtuvieron aislamientos pertenecientes a 9 especies diferentes de
levaduras colectadas en la etapa inicial y final de la fermentación, y se caracterizaron
molecular y fenotípicamente 15 aislamientos de S. cerevisiae, 12 de K. marxianus, 5 de T.
delbrueckii, 6 de P. kluyveri, 5 de C. lusitaniae, 4 de P. guillerrmondii, 2 de P. mexicana, 1
de C. parapsilopsis y un aislamiento que fue tolerante a altas concentraciones de etanol, ya
que fue colectada de la etapa final de fermentación, perteneciente a la especie Z. bailii.
Mediante el uso de la técnica rep-PCR se pudo analizar el genoma de las levaduras más
productivas, encontrando una gran diversidad genética existente entre aislamientos de la
misma especie, como fue en el caso de S. cerevisiae, mientras que en K. marxixnus y
T.delbrueckii existen pocas diferencias aparentes para comparar con esta técnica los
genoma de dichas especies. Sin embargo, el rep-PCR podría ser de gran ayuda para hacer
una comparacion rápida de las levaduras que se encuentran en cada etapa de la
fermentación.
Todas las levaduras produjeron etanol aunque en diferentes concentraciones, que variaron
hasta en dos ordenes de magnitud, pero no hay que descartar la producción de otros
metabolitos influyen considerablemente en el sabor del producto final. El aislamiento
S.c.mosca3 fue el que tuvo la tasa de consumo de azúcares mas alta, y fue por consiguiente
el que presentó la mayor producción de etanol, además de que esta levadura presentó un
patrón en huella genética de rep-PCR diferente a las demás.
Los resultados presentados en este trabajo indican que existe una gran diversidad ecológica
y genética de levaduras que se encuentran presente en las diferentes etapas de la
fermentacion del mezcal que se produce en Tamaulipas, las cuales en su conjunto
determinan las características organolépticas del producto final, y que aunque S. cerevisiae
produce la mayor cantidad de etanol, es indudable que toda una gama de microorganismos
están involucrados en menor o mayor grado en el sabor y olor del producto tamaulipeco.
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11. RECOMENDACIONES
El mezcal, al ser una bebida artesanal, requiere más estudio acerca de las levaduras y otros
microorganismos que se encuentran presentes durante cada una de las etapas de
fermentación, ya que, si bien ya han sido identificadas y analizadas en cuanto a su
productividad en este estudio, requiere corroborarse su implicación productiva en
condiciones reales directamente en la mezcalera.
También se recomienda estudiar por HPLC y por CG otros metabolitos que se sabe están
presentes en los mostos de mezcal, como ésteres y ácidos orgánicos, que son producidos
por levaduras (y bacterias) tales como los ácidos acético, láctico, succínico, málico y
cítrico; así como también es necesario estudiar los alcoholes superiores que podrían estar
presentes en las diferentes etapas de fermentación, y que se sabe tienen un fuerte impacto
en las características organolépticas del producto final.
Existen otras técnicas moleculares con las cuales se puede monitorear a las levaduras del
mezcal tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH) y de caracterización molecular
global mediante el análisis de regiones ribosomales (ARISA), con las cuales se podría hacer
el seguimiento de las especies y de la dinámica poblacional, así como implementar técnicas
más rápidas de caracterización microbiológica de los mostos.
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12. BIBLIOGRAFÍA
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13. APÉNDICE
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APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el
que se encuentra en el gel de agarosa de la PCR.
Clave Número de carril
26S
Número de carril
ITS1-5.8-ITS2
S.c.D2 1 1
S.c.D3 2 2
S.c.D4 3 3
S.c.D5 4 4
S.c.D6 5 5
Z.b.3Y1 6 6
S.c.3Y2 7
S.c.3Y3 8 7
S.c.3Y4 9
S.c.3Y5 10 8
S.c.3Y8 11
T.d.1AN2 12 9
K.m.1Y1 13 10
K.m.1Y9 14 11
P.m.1Y14 15 12
T.d.1D2 16 13
C.l.1AN4 1 1
T.d.1AN1 2 2
P.m.1AN3 3 3
T.d.1AN5 4 4
K.m.1AN6 5 5
T.d.1AN9 6 6
S.c.1D1 7 7
K.m.1D5 8 8
C.p.1Y7 9 9
P.k.1Y10 10 10
K.m.1Y11 11 11
P.g.1Y12 12 12
P.g.1Y15 13 13
P.k..1Y16 14 14
C.l.4AN1 15 15
C.l.4AN6 16 16
P.g.4AN2 17 17
C.l.4AN3 18 18
P.k.4AN5 19 19
P.g.4AN7 20 20
K.m.4D2 21 21
K.m.4D3 22 22
K.m.4D4 23 23
K.m.4D5 24 24
P.k.4D6 25 25
P.k.4D7 26 26
K.m.4Y2 27 27
S.c.4Y3 28 28
C.l.4Y4 29 29
P.k.4Y6 30 30
S.c.mosca3 31 31
S.c.mosca1 32 32
S.c.mosca6 33 33
K.m.mosca7 34 34
K.m.mosca5 35 35
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APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. Agrupamiento "T" Media N Levadura
A 77.55 4 P.m.1AN3
B 60.5 4 P.g.4AN2
B 59.6 4 K.m.4D2
C B 56.575 4 C.l.1AN4
C B D 53.05 4 K.m.4D5
C E D 48.625 4 K.m.1Y11
C E D 48.475 4 K.m.4D3
E D 46.5 4 T.d.1AN5
E D 46.3 4 S.c.D5
E D 46.25 4 T.d.1AN1
F E D 45.3 4 K.m.1D5
F E D 44.45 4 K.m.4D4
F E G 43.525 4 T.d.1D1
F H E G 43.025 4 C.l.4AN3
F H E G 43 4 K.m.1Y9
I F H E G 41.025 4 K.m.mosca5
I F H G J 39.825 4 K.m.4Y2
I F H K G J 37 4 P.k.1Y10
I F H K G J 36.675 4 K.m.1Y1
I L H K G J 34.95 4 K.m.1AN6
I L H K J 34.325 4 T.d.1D2
I L K M J 32.375 4 P.k.1Y16
I L K M J 32.225 4 C.p.1Y7
L K M J 32 4 S.c.3Y2
L N K M J 31.7 4 S.c.3Y5
L N K M 30.375 4 C.l.4AN1
L N K M 30.075 4 S.c.mosca6
L N K M 30.05 4 T.d.1AN2
L N K M 29.725 4 S.c.mosca3
L N K M 28.7 4 S.c.3Y8
L N K M 28.575 4 K.m.mosca7
L N M 27.8 4 S.c.4Y3
L N M 27.5 4 C.l.4AN6
L N O M 27.05 4 Z.b.3Y1
P N O M 25.325 4 T.d.1AN9
Q P N O M 24.6 4 S.c.3Y4
Q P N O 23.125 4 S.c.D2
Q P O R 18.45 4 P.g.1Y12
Q P R 17.725 4 S.c.mosca1
Q P R 17.375 4 P.k.4AN5
Q S R 15.8 4 P.k.4Y6
S R 14 4 P.m.1Y14
S R 13.925 4 S.c.D4
T S R 12.8 4 P.g.1Y15
T U S R 11.75 4 S.c.3Y3
T U S R 10.225 4 P.k.4D6
T U S 8.275 4 S.c.D6
T U S 8.2 4 P.k.4D7
T U S 8.1 4 S.c.D3
T U 4.95 4 C.l.4Y4
U 3.575 4 P.g.4AN7
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APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que
tienen células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X
Células Redondas
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Células Ovaladas
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APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para
la elaboración de los árboles de distancias génicas de las dos diferentes regiones.
Región 26S de ADN ribosomal.
>FJ360521_Neurospora_crassa
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATTTTTCTTACTTTCCTTCTACCTTTTTACTTTTGTAATGTCTT
GCCCCCTTAGTAAGCTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTATTCTTCTTTTCGTCCTCTTGTTCTACCTCCAAATCTTTATTAGGTA
AGGGCGTTTATAAAGTAAATAAACACTTTTAGAGTAGTAGGAGCCGGATTATAACAAGGGTAGAGGTTTTTTTTATAAAT
ATAGGAAGAAGAAGGTATTCGGAGGCGACTAAGTCGATCAACTAGAACCTATACGGTCTTGAATGAATTGTTAGGGAAGG
GCAGGTAAATAATTGATAGTAGGAAAGAAGAAAAAGAAGAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAATTTTGAAAGTAGTAG
AAGAAGAAGGGTAGTAGAATTTAGGGGGTATAAATAGTTAGTAGAGTAGGTAGGGTGTTAGGTGGCTTTGGTTGTATGGG
TAGGGAGGATATGTTGAGGTTAGTATATTAATAAAGAAGGTTGAATTGGTAAATGTAAAAAGAAAAAGATAAGAGTAAT
ATGAATACTTTTGGTATAGTTATAAGATGTTGTAAATTATATTAGGGAAGATAAAAAGTAGTTAGCTTTTTACTTAGTGGA
AACGTAGTTTGAGTGGACGCTGTAGGGTAGGCACGTCTGCTTTATATAAGAAAGGCGCGGCCGAGGTTGAAAAGGTGGAA
GAGGGAAAGGCAGTGAAGGGTGGTACTTACCGAGTGCAGGGTAGGCAAGAACGACCGGGTAGGTAAGGAAGGCGCAAT
CGACCTTTGGAAGCCGAAGTTTTGAAAAGGAAAATTGCGAGTAGGTAGCGCTTATTAAGTGTAGGGTAGGTAAGAACTAC
AGGGTAGGTACGACGGGCCTGTATGAGAAAGGTAAGATCAAAGTTGAAAAGAAAAAAGTAGTAGGCGGGTAGTACCTAC
CGAGTGCAGGGTAGGCAGGAATGACCGGGTAGGCAAGGAAGGCGCAACCAACTTGACGAGGAAGGCGTGGTCTTTGTGA
ACTTGGAGCGAGATTCCTGAGAAGGTGCGACCCAGTTGGGTGGCTGGGTGGCCGTGAGTCGATTTTTAAAATTTCCCATAC
TGGGGAATTTCGCGGGAGTTGAAAAGTCGCGGCTCAGACCGTCGGGCCGCACCGTCCCCAGACTCGAGGTCGAAGGGAAT
ACAAGAAGGAGCGGCGGAGAGCAATGGGAAAGAGCGAGCGGTAAGACTGCTCGGTCGTCCCTGCCTCCGGCTCCCTCTTA
CAGGTGTGGGCAAGGACGTACAGGGCCTGCTCCACCTGGAAGCCTTCTGCGGGAGGGCTGCTCTGGCCTGTGGCCTAGGC
ACCTTCCCGCGGTAACCTGCAAAGGAAACCAAGTTCCAGTTCATGGAGCGTTGTTATCGCGTGGCTCCCTACGGTCTGCCG
GGGAGTCAACGTTAACAGCGCGAGCCACCTCAGCACCGTTCCAGCAAGGGCTCTGCCTCTGCCGGGCGGCATCTGAGAAG
ATCCTGCAGGCGCTAGGGAGTACCCCATAAGCGCCGAGGGGTGGGCTCTGTGGATGACTGGCCGCTGGCCAAACTTATCT
ACAAGCCGCCGGGGGGTACCGGCCAGCTGGGGAAGCCTTCGGGCAGAACCTTCTGTGCTGGGCCTCCTCTTGGGGCGCAT
AGGCGGTGTGCGAGAGGCGCTCTGCGCTCTCCCGTCCTCCTGCCGACCGCGCTCTGGGGAATTCAGGAGGGGAAAGCAGA
TGCGTGTCTCGAGGCAAGTTCGGCCCTGCCGTACGAGCTTCGGACCGCCTACCTTCGTAACTTTGTGAACTCTTCCGCTCGC
TTGCGAGCGGTTGGCCTTTCCAGGCGCACGATAGTTACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA
AGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATTAAACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATAGT
ACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTA
GATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTAACTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCTGGCGATGGT
TCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGCTGGGTCTTGGCCAGCCATGGTGACAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG
CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA
CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT
AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTG
AGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCTCGGCCCGTCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGACTGGGTCGGGCCTTTT
TTCCTGGAGAACCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCGTGAACAAATCAGATCGCTCAAAG
AAGGCCTATGCTCGAATGTACTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGT
AATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACT
GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT
CTTAACCATAAACTATGCCGATTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGATAAATCAAAATGT
TTGGGCTCCTGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTG
CGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGA
TTTCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAA
CCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGG
CAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACACAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGC
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 73 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
CGGAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTGTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCC
TAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG
GCTCAGTGAGGCTTCCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCCAGGGCCGGAAAGCTATCCAAACTCGGTCATT
TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAA
ACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTC
TCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAAT
AAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT
GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCA
TTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA
CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC
GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAA
CGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAAGCTTTTGGTGA
GGCACCTTCTGAGTCCCCTGGAACGGGGCGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTATAGTCGGATGCCGATCCAATGTAAAGC
TCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAG
ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGA
AAGGGAAGCGTTTGTGACCAGACTTGCGCCGTTCCGATCATCCGGTGTTCTCACCGGTGCACTCGGGACGGCTCAGGCCA
GCATCGGTTTTGGCGGGGGGATAAAGGTCCGGGGAACGTAGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCCGGGCGTAATGCCCTC
GCCGGGACCGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA
GTCAAGGTTTTGCGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGCACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATC
ATCGACCGATCCTGATGTATTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTTAAGCCTTGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTG
GATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGAGCATG
GGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTACCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGTTCTTCAGTTT
TATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTTTTTAGCCTTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGC
CCTTGTTACTTAATTGAACGTGGGCATTCGAATGTACCAACACTAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGG
GATGAACCGAACGCGGGGTTAAGGTGCCGGAGTGGACGCTCATCAGACACCACAAAAGGCGTTAGTACATCTTGACAGC
AGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATGTACTAGCCCTGAAAATGG
ATGGCGCTCAAGCGTCCCACCCATACCCCGCCCTCAGGGTAGAAACGATGCCCTGAGGAGTAGGCGGCCGTGGAGGTCAG
TGACGAAGCCTAGGGCGTGAGCCCGGGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATACTTCAATGAGA
ACTTGAAGGACCGAAGTGGGGAAAGGTTCCATGTGAACAGCGGTTGGACATGGGTTAGTCGATCCTAAGCCATAGGGAA
GTTCCGTTTCAAAGGGGCACTTGTGCCCCGTGTGGCGAAAGGGAAGCCGGTTAACATTCCGGCACCTGGATGTGGGTTTTG
CGCGGCAACGCAACTGAACGCGGAGACGACGGCGGGGGCCCCGGGCAGAGTTCTCTTTTCTTCTTAACGGTCTATCACCC
TGAAAACAGTTTGTCTGGAGATAGGGTTTAATGGCCGGAAGAGCCCGACACTTCTGTCGGGTCCGGTGCGCTCTCGACGTC
CCTTGAAAATCCGCGGGAGGGAATAATTCTCACGCCAGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCT
CTGGTTGATAGAACAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTT
GGGTACGTCGGGCTTTGGGCAGACGCCCTGGGAGCAGATCGCCACTAGCCGGGCAACCGGCCGGCGGCTTTCAGCATCCG
GGTGCAGAAGCCCTTAGCAGACTTCGGTCGTCCGGCGTACGTTTAACAACCAACTTAGAACTGGTACGGACAGGGGGAAT
CTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATGGCCAGAAAGTGGTGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAA
TGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCG
TCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAG
GGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGG
AGGTGTAGAATAGGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACTCCTATTGTTTTTTTACTTATTCAATTAAGCGGGG
CTGGATTTTCGTCCAACTTCTGGTTTTAAGGTCCTTCGCGGGCCGACCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGG
CTGGGGCGGCACATCTGTTAAACCATAACGCAGGTGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAA
AAGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCATGAAAGTGTGGCCTATCGATCCTTTAGTCCCTC
GAAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCG
CTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGG
GAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACCTCATCGCAATGGTAATTGAGCTT
AGTACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTGGTTTTTGCGGTTGTCCGACCGGGCAGTGCCGCGACGCTACCATCTGCTG
GATAATGGCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCCAGAACGCGATGATACCTCCAGCACGTTGTAGACGTATAAGAAT
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 74 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
AGGCTCCGGCCTCGTATCTTAGCAGGCGATTCCTCCGTTGGCCTTGAAGTGGCCAGCGGTAATTCGCGTATTGTAATTTTA
ACACGCGCTGGATCAAATCCTTTGCAGACGACTTAGATGTGCGAAAGGGTCCTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTAC
GATCTGCTGAGGGTAAGCCCTCCTTCGCCTAGATTTCCCAGTGGAAGGGTCCGCCTAACAAGCGGGCATTTACTGGGGGGT
CCCCCCGAGACTTGGTTGCCAGAGCCCGAGAGGGCGAAAGCGCCTTGCCGGAGGGAAAGTGCAGGGTAAGCAGGGACAG
GAAGGGGACTTGGTCAAGTTCAGCATCTCCCGGGTTTGGACGACGTTGCCCTGGGGGCGCGGGCGGGCCGGGCATAAGGG
GTCTGCCGTACCAGCAGCCAGCCTGCAGAAGGCTCGGTGGCTATGCATGGCACATGCCCGGGGAAGCGTCGACCGGCGCA
GTGTACGCGGGCACGGCCGGGCCGGGCCTTTGCAAGTCTTGGTGGCTGCGGTAGGTAGGGTAGGCAAGAGCGACCGACCG
AGCGGCGGCGGGGCAGGAGCGACCGGGTAGGCGAGCAATTTTTGGGCAAGCTTGCAGTTCTGGACAAGTGAATGCATTCG
CGACCGGGTTGGGTGCGGCGCCGGGTAGGCAAGCGCGTTCGAATCGTACAAGGTGGCGTAGAGAAGAGAGGGTAGGCAA
GTGCGTCCGGGCGGGTTAGGTGTGTAGGGTAGGCAGGCGCGTCTGGGCATGGAATTTTTGTGTAGATGGTGGCTGCATTG
GGAAGGCAAGGGCGAGGGCCTGTGCAGGGTAGGTAAGAAGGACCGAGAGGCTTGGGGGGGCCAAGGGGTTGCTTTCCAG
CTCCTACTGGGAGGGGCTTGTTGAAGGAAAGGGTAGGGTGATAGTAGGAGGGGGTAGGTAAGTAAAGAAGCTATGTGGT
TGAGTAAAGGTATTTGTAGCCTTTTTATTAGAAGATGTAGTAGGGTAGGTAGGAAAAGGTTGTACGGGATTGTGTTTTTAC
GTGAGGTAAAGGTATAAAGGGGGAGGCTATCTTTTTGATTTCTGGGTAGGCGAGGCGGTAGGTAGGCTACTTGGGCTGGG
AATGGTTTAGTCTTTAGGGGGGGAGCGAAAATTTCTTTCTTCTTTTTCTTTTCCTTTTTTATTTATTTATTTTTTTTCTTTCTTC
TTTTTCTCCTCCCTCTTTCTTCTTCCTACTTTTATCCTCTTTATTACTCTTCCTCCTCCCTTTCCTTTCCTCTCCGTCTTCCTTCG
TTTTGGTCCTTTTTTTCTTTTCTCTTCCTTTTTCTTTTTTCTTTTTAGCTTTTAACCTCTTTTTAGGGCTTTCCTCTCTTAATATT
TCTTTCCTTATACCTCCAAACCCCCCTCCGTTCCCTTCTTTTGTATTATATCTATACAAGGATAAAAAAGTAATATGATTAA
TATGTAAATAAAATAAAGAAGGTTCTTATTCTTCTTTTCTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>K.m. 1D5
GGCATGCCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA
GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA
AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT
TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA
CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA
>EU439450_Kluyveromyces_marxianus
TGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGAAG
AAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT
CCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG
CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA
GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTTTT
AGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGACT
GAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC
>T.d. 1AN1
GGGTATGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGTGGAGTGGTAATTTGTAGA
AGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGAAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT
CCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG
CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA
GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGGAATT
TCGCAGTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTATATC
CTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTC
TTGAAACACGGACCA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 75 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
>K.m. 1Y11
GGGTATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTGAAG
AAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT
CCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG
CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA
GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTTTT
AGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGACT
GAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCCC
>K.m. 4D2
CGGGGCTGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA
GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA
AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT
TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA
CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAA
>K.m. 4D3
GGGCGATGCCCTTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAGTAATTTGA
AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG
TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG
ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA
>K.m. 4D4
CGGGGGTTTCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTGA
AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG
TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG
ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAA
>K.m. 4D5
CGGGTGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA
GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGCCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA
AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT
TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA
CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA
>K.m. 4Y2
GGGGGATGCCTTAGTAACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTG
AAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 76 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA
GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG
GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAATCACGGACCA
>K.m. mosca7
CCGGTATGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGA
AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG
TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG
ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC
>K.m. mosca5
CCCACGGGATGCCTAGTACGGCGATGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTAGAGAGGTAATTTGA
AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGACAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG
TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG
ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAACCAACGGACC
>K.m 1Y1
AGGGAATGTCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGAA
GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA
AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT
TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA
CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAA
>K.m. 1Y9
AGGGAATGCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAGCTCAAATTTGAAAATCTGGCGTCTTCGACGTAAGAGAAGTAATTT
GAAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTAGAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA
GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG
GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCA
>T.d. 1AN5
GGGGGGATTGCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GTAGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG
AGGATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGG
GGAATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTG
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 77 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
TTATATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCC
GCCCGTCTTGA
>K.m. 1AN6
ATTTGGGGCTTTAGTTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTG
AAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA
GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG
GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAAACACGGACCA
>T.d. 1AN9
TCCCAGGGAAGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGT
AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG
AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA
TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTG
>T.d.1AN2
GGGGGTTTCCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCACATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCAGAGAGGTGATTTGT
AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCTTTGAAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG
AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA
TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTGAAAACACGGACCA
>EU879961_Torulaspora_delbrueckii
CGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAAT
TTGTAGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC
GAGGATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT
CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT
GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGG
GGGAATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGT
GTTATATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGC
CGCCCGTCTTGAACCACCGGACCAAA
>T.d.1D2
CGGGAAAGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGT
AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG
AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 78 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTGAACCACCGGACCKAA
>S.c. 1D1
GGGTATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAG
AGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA
GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAA
GCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAA
AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAAT
CTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAG
CCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGT
CTTGA
>S.c. 4Y3
CGGGTCAAGCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGATGTAATTTG
GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG
AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA
TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTGAAACCACGGACC
>S.c. mosca3
ACCGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTG
GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG
AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA
TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTAAAACACGACCA
>EU556339_Saccharomyces_cerevisiae
TGCGTGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG
AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG
GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT
ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC
CCGTCTTGAACAACGGACCAAA
>S.c. mosca1
AGGGGGGATGCCTTCTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCAGAGAAGTAATTTG
GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTTTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 79 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA
TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTCA
>S.c. mosca6
GGGTTATGCCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGG
AGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG
GAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGA
ATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTAT
AGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCC
GTCTTGAAMCMMSGGRACCATGAG
>S.c.3Y4
CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGG
AGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCTaTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG
AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA
AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAA
TCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATA
GCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCG
TCTTGAA
>S.c. 3Y8
CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA
GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG
AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA
TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC
CGTCTTGAACAaaCGGACCAA
>S.c. D2
CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT
TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC
GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT
CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT
GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG
GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT
TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG
CCCGTCTTGAACCMMSSRRMAMCA
>S.c. D3
GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT
TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC
GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT
CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 80 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG
GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT
TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG
CCCGTCTTGAAACCC
>S.c. D4
AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG
AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG
GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT
ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC
CCGTCTTGAAACCGCGAACCA
>S.c. D5
CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG
AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG
GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT
ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC
CCGTCTTG
>S.c. D6
GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG
AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG
GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT
ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC
CCGTCTTGAACACACGGGACCA
>S.c.3Y2
CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAG
AGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG
TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG
CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA
GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATC
TCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGC
CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTC
TTGAAaaacccGGaACCAAA
>Z.b. 3Y1
CCCACGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCCGAGTTGTAATTTGTA
GAAGGCGACTCTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGG
ATCCCAGTTCTTTGTAGAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 81 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA
AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCCTCGCCTCTCGTGGGTGGGGGA
ATCTCGCAGTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCCCTGGGAATGTAGCTCTACCACTTCGTGGCGGA
CGAACTTATAGTCCAGGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGAATGCGACTTTTAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTA
TATGCCGCCCGTCTTGACCAAACGGACA
>AJ966343_Zygosaccharomyces_bailii
TACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAAGGCGACTCTG
GGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGGATCCCAGTTCTTTG
TAGAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGC
GAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATT
GTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCCTCGCCTCTCGTGGGTGGGGGAATCTCGCAGTTCACT
GGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCCCTGGGAATGTAGCTCTACCACTTCGTGGCGGACGAACTTATAGTCC
AGGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGAATGCGACTTTTAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCT
TG
>S.c. 3Y3
CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT
TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC
GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT
CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT
GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG
GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT
TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG
CCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA
>Sc. 3Y5
ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG
AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG
GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT
ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC
CCGTCTTG
>P.k. 1Y10
AGGGGCTTGCTCTGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAG
GTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATG
TCGACACCTGTGAGGCCCTTTTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCT
AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGC
ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGG
GTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGT
AGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGT
CTTGAAACACGGACCCC
>AY305665_Pichia_kluyveri
CAAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGTAAATTGCAGGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCCAG
TCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAKCGTGCATGTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCG
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 82 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
AGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAA
GTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCCGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGG
GCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGTGTGGGGTTTTCCCTCCGGGCCAGACCCCCGGTTTCCC
GTTGCAGGACCTAAGGACAACCTAGTGTACCAGTAGTGCTCCCATCGAGTTCGCCCGCCATTATCGTACCCTTTTATGAAT
GTCTGGTTGTGTCCGGGGTATTTGTCT
>P.k. 4AN5
AGGGCATGCCTCGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGG
TTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGT
CGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTA
AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA
CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACAKGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGG
TTTTTCCTGGKYCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA
GATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTC
TTGAACCACGGAC
>P.k. 4D6
GAATTGCCCTCAGTAGCGGGCGAGTGAAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTAGAAAATTGCA
GGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCAT
GTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGC
TAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAG
CACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTG
GGTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTT
GTAGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCC
GTCTTGAAACACGGAC
>P.k. 4D7
CAGGATGCCTTCATAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGG
TTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGT
CGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTA
AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA
CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGT
TTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA
GATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTC
TTGAACACGGACCA
>P.k. 4Y6
AGGTCATGCCTCGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGGT
TGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGTC
GACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAA
ATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCAC
GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGTT
TTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTAG
ATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCT
TGAACCACGGACCA
>P.g.1Y12
CGCCTTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCCAAGCTCAATTTGAATCTGGCGCCTTCGGTGTCGATAGTAATTTGAAGAT
TGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCC
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 83 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
CAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCT
AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT
ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGACCCGC
ACTTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTATAGCCT
GCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGYCTTGA
AACACGGACCCA
>EU177574_Pichia_guilliermondii
GGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTG
AAGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG
ATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA
CCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTAT
AGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGT
CTTGAAACACGGACC
>P.g.1Y15
AGGTGATGCTTATAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTAGAGAGTAATTTGAA
GATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGAT
GCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAA
GCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAA
AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGACCC
GCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTATAGC
CTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGTCTT
GAAACACGGACCAM
>P.g. 4AN2
AATGGGCCTTTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTAGAGAGGATTTGA
AGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGACAATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG
ATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA
CCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTAT
AGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGT
CTTGAAACACGGACCAC
>P.g. 4AN7
CGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTCGAGATGTAATTT
GAAGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA
GATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTG
ACCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTA
TAGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCG
TCTTGAAACACGGACCA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 84 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
>P.m. 1AN3
CGAGGATGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAATAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTT
GAAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA
GATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT
AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA
AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTGGTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAG
GATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCTGGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGC
GTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC
>P.m.1Y14
TTCAAGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAATAGCTCAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTG
AAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG
ATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA
AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA
AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTGGTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAGG
ATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCTGGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCG
TCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTAATCTCTTTAGGGAACGTWTTYGGCRACWYKCKCR
MYWWSMSTMTGYSRCSRYYCCKRYSSYYKYRSSWYSYYAG
>EU809452 Pichia mexicana
ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAATAGCTCAAATTTGA
AATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGG
ACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGG
AATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAG
GAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTG
GTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAGGATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCT
GGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCGTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTGA
AACACGG
>C.l.4AN1
AGGTCATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAGCTCAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGTGGTCT
GAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTTTGCA
CCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCG
AGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTG
TTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCAAATAGACGGGGGGAACAAGGGCTAAAGAA
TGTGGCGCGCACCTTCGGGTGCGCGTGTTATAGCTCTCACTAACACCTCCATGTTTGTTTGAGGCCTGCGATTCTAGGACG
CTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA
>AY894825_Clavispora_lusitaniae
GGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGT
GGTCTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCT
TTGCACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATT
GGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGA
AATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCAAATAAACGGGGGGGATAAGGGGGA
AAGAATGTGGCGCGTGCCTTCGGGTACGCGTGTTATAGCTTTCTCTAATACCCCCATGTTTGTTTGAGGCCTGCGATTCTAG
GACGCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 85 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
>C.l.4AN3
CGGTCATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGTGGT
CTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTTTG
CACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGC
GAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATT
GTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCGAAAAGGGGGGAGGAACAAGAACTCGAGA
ATGTGGCGCGCACCTTCGGGCGCGCGTGTTATAGCTCGTGTTGACGCCTCCATCCCTTTTCGAGGCCTGCGATTCTAGGAC
GCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAACCACGGACCA
>C.l. 4Y4
AGGGTATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTATCGTG
GTCTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTT
TGCACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTG
GCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAA
ATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCGAAAAGGGGGGAGGAACAAGAACTCG
AGAATGTGGYGYGYACCTTCGGGTGCGCGTGTTATAGCTCGTGTTGACGCCTCCATCCCTTTTCGAGGCCTGCGATTCTAG
GACGCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAAACACGGAC
>P.k. 1Y16
GATTATGCTCGTCAGTAAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGAAGAGGGTGCA
GGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATG
TCGACACCTGTGAGGCCCTTCTCACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCT
AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGC
ACGTGAAATTGTTTAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGG
TTTTTTCTGGTTCAGCATCCGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGGGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA
CATGCTGCGKATGGGGACCGAAGGCTGTGGCCGACTCCTTTCCTCTCGGGAGCTGGCCCCACGGCGCTTTATCGCCCCCCC
TGAAACAAAYAACACACA
>C.p. 1Y7
TGTCTGTCCTTTATAAACGGCGATTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTAGAGAAGTAATTT
GAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA
GATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC
TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGCCT
CTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTAT
AGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCG
TCTTGAAACACGGACCAC
>EU605804_Candida_parapsilosis
AGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTCCGAGTTGTAAT
TTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGAT
GAGATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCA
TCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAG
TGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGC
CTCTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTA
TAGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCC
GTCTTGAAACACGGACCA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 86 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Región ITS1-5.8S-ITS2 de ADN ribosomal
>FJ360521_Neurospora_crassa
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATTTTTCTTACTTTCCTTCTACCTTTTTACTTTTGTAATGTCTT
GCCCCCTTAGTAAGCTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTATTCTTCTTTTCGTCCTCTTGTTCTACCTCCAAATCTTTATTAGGTA
AGGGCGTTTATAAAGTAAATAAACACTTTTAGAGTAGTAGGAGCCGGATTATAACAAGGGTAGAGGTTTTTTTTATAAAT
ATAGGAAGAAGAAGGTATTCGGAGGCGACTAAGTCGATCAACTAGAACCTATACGGTCTTGAATGAATTGTTAGGGAAGG
GCAGGTAAATAATTGATAGTAGGAAAGAAGAAAAAGAAGAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAATTTTGAAAGTAGTAG
AAGAAGAAGGGTAGTAGAATTTAGGGGGTATAAATAGTTAGTAGAGTAGGTAGGGTGTTAGGTGGCTTTGGTTGTATGGG
TAGGGAGGATATGTTGAGGTTAGTATATTAATAAAGAAGGTTGAATTGGTAAATGTAAAAAGAAAAAGATAAGAGTAAT
ATGAATACTTTTGGTATAGTTATAAGATGTTGTAAATTATATTAGGGAAGATAAAAAGTAGTTAGCTTTTTACTTAGTGGA
AACGTAGTTTGAGTGGACGCTGTAGGGTAGGCACGTCTGCTTTATATAAGAAAGGCGCGGCCGAGGTTGAAAAGGTGGAA
GAGGGAAAGGCAGTGAAGGGTGGTACTTACCGAGTGCAGGGTAGGCAAGAACGACCGGGTAGGTAAGGAAGGCGCAAT
CGACCTTTGGAAGCCGAAGTTTTGAAAAGGAAAATTGCGAGTAGGTAGCGCTTATTAAGTGTAGGGTAGGTAAGAACTAC
AGGGTAGGTACGACGGGCCTGTATGAGAAAGGTAAGATCAAAGTTGAAAAGAAAAAAGTAGTAGGCGGGTAGTACCTAC
CGAGTGCAGGGTAGGCAGGAATGACCGGGTAGGCAAGGAAGGCGCAACCAACTTGACGAGGAAGGCGTGGTCTTTGTGA
ACTTGGAGCGAGATTCCTGAGAAGGTGCGACCCAGTTGGGTGGCTGGGTGGCCGTGAGTCGATTTTTAAAATTTCCCATAC
TGGGGAATTTCGCGGGAGTTGAAAAGTCGCGGCTCAGACCGTCGGGCCGCACCGTCCCCAGACTCGAGGTCGAAGGGAAT
ACAAGAAGGAGCGGCGGAGAGCAATGGGAAAGAGCGAGCGGTAAGACTGCTCGGTCGTCCCTGCCTCCGGCTCCCTCTTA
CAGGTGTGGGCAAGGACGTACAGGGCCTGCTCCACCTGGAAGCCTTCTGCGGGAGGGCTGCTCTGGCCTGTGGCCTAGGC
ACCTTCCCGCGGTAACCTGCAAAGGAAACCAAGTTCCAGTTCATGGAGCGTTGTTATCGCGTGGCTCCCTACGGTCTGCCG
GGGAGTCAACGTTAACAGCGCGAGCCACCTCAGCACCGTTCCAGCAAGGGCTCTGCCTCTGCCGGGCGGCATCTGAGAAG
ATCCTGCAGGCGCTAGGGAGTACCCCATAAGCGCCGAGGGGTGGGCTCTGTGGATGACTGGCCGCTGGCCAAACTTATCT
ACAAGCCGCCGGGGGGTACCGGCCAGCTGGGGAAGCCTTCGGGCAGAACCTTCTGTGCTGGGCCTCCTCTTGGGGCGCAT
AGGCGGTGTGCGAGAGGCGCTCTGCGCTCTCCCGTCCTCCTGCCGACCGCGCTCTGGGGAATTCAGGAGGGGAAAGCAGA
TGCGTGTCTCGAGGCAAGTTCGGCCCTGCCGTACGAGCTTCGGACCGCCTACCTTCGTAACTTTGTGAACTCTTCCGCTCGC
TTGCGAGCGGTTGGCCTTTCCAGGCGCACGATAGTTACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA
AGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATTAAACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATAGT
ACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTA
GATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTAACTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCTGGCGATGGT
TCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGCTGGGTCTTGGCCAGCCATGGTGACAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG
CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA
CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT
AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTG
AGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCTCGGCCCGTCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGACTGGGTCGGGCCTTTT
TTCCTGGAGAACCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCGTGAACAAATCAGATCGCTCAAAG
AAGGCCTATGCTCGAATGTACTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGT
AATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACT
GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT
CTTAACCATAAACTATGCCGATTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGATAAATCAAAATGT
TTGGGCTCCTGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTG
CGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGA
TTTCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAA
CCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGG
CAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACACAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGC
CGGAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTGTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCC
TAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG
GCTCAGTGAGGCTTCCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCCAGGGCCGGAAAGCTATCCAAACTCGGTCATT
TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 87 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTC
TCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAAT
AAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT
GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCA
TTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA
CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC
GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAA
CGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAAGCTTTTGGTGA
GGCACCTTCTGAGTCCCCTGGAACGGGGCGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTATAGTCGGATGCCGATCCAATGTAAAGC
TCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAG
ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGA
AAGGGAAGCGTTTGTGACCAGACTTGCGCCGTTCCGATCATCCGGTGTTCTCACCGGTGCACTCGGGACGGCTCAGGCCA
GCATCGGTTTTGGCGGGGGGATAAAGGTCCGGGGAACGTAGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCCGGGCGTAATGCCCTC
GCCGGGACCGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA
GTCAAGGTTTTGCGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGCACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATC
ATCGACCGATCCTGATGTATTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTTAAGCCTTGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTG
GATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGAGCATG
GGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTACCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGTTCTTCAGTTT
TATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTTTTTAGCCTTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGC
CCTTGTTACTTAATTGAACGTGGGCATTCGAATGTACCAACACTAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGG
GATGAACCGAACGCGGGGTTAAGGTGCCGGAGTGGACGCTCATCAGACACCACAAAAGGCGTTAGTACATCTTGACAGC
AGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATGTACTAGCCCTGAAAATGG
ATGGCGCTCAAGCGTCCCACCCATACCCCGCCCTCAGGGTAGAAACGATGCCCTGAGGAGTAGGCGGCCGTGGAGGTCAG
TGACGAAGCCTAGGGCGTGAGCCCGGGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATACTTCAATGAGA
ACTTGAAGGACCGAAGTGGGGAAAGGTTCCATGTGAACAGCGGTTGGACATGGGTTAGTCGATCCTAAGCCATAGGGAA
GTTCCGTTTCAAAGGGGCACTTGTGCCCCGTGTGGCGAAAGGGAAGCCGGTTAACATTCCGGCACCTGGATGTGGGTTTTG
CGCGGCAACGCAACTGAACGCGGAGACGACGGCGGGGGCCCCGGGCAGAGTTCTCTTTTCTTCTTAACGGTCTATCACCC
TGAAAACAGTTTGTCTGGAGATAGGGTTTAATGGCCGGAAGAGCCCGACACTTCTGTCGGGTCCGGTGCGCTCTCGACGTC
CCTTGAAAATCCGCGGGAGGGAATAATTCTCACGCCAGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCT
CTGGTTGATAGAACAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTT
GGGTACGTCGGGCTTTGGGCAGACGCCCTGGGAGCAGATCGCCACTAGCCGGGCAACCGGCCGGCGGCTTTCAGCATCCG
GGTGCAGAAGCCCTTAGCAGACTTCGGTCGTCCGGCGTACGTTTAACAACCAACTTAGAACTGGTACGGACAGGGGGAAT
CTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATGGCCAGAAAGTGGTGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAA
TGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCG
TCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAG
GGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGG
AGGTGTAGAATAGGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACTCCTATTGTTTTTTTACTTATTCAATTAAGCGGGG
CTGGATTTTCGTCCAACTTCTGGTTTTAAGGTCCTTCGCGGGCCGACCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGG
CTGGGGCGGCACATCTGTTAAACCATAACGCAGGTGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAA
AAGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCATGAAAGTGTGGCCTATCGATCCTTTAGTCCCTC
GAAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCG
CTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGG
GAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACCTCATCGCAATGGTAATTGAGCTT
AGTACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTGGTTTTTGCGGTTGTCCGACCGGGCAGTGCCGCGACGCTACCATCTGCTG
GATAATGGCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCCAGAACGCGATGATACCTCCAGCACGTTGTAGACGTATAAGAAT
AGGCTCCGGCCTCGTATCTTAGCAGGCGATTCCTCCGTTGGCCTTGAAGTGGCCAGCGGTAATTCGCGTATTGTAATTTTA
ACACGCGCTGGATCAAATCCTTTGCAGACGACTTAGATGTGCGAAAGGGTCCTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTAC
GATCTGCTGAGGGTAAGCCCTCCTTCGCCTAGATTTCCCAGTGGAAGGGTCCGCCTAACAAGCGGGCATTTACTGGGGGGT
CCCCCCGAGACTTGGTTGCCAGAGCCCGAGAGGGCGAAAGCGCCTTGCCGGAGGGAAAGTGCAGGGTAAGCAGGGACAG
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 88 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
GAAGGGGACTTGGTCAAGTTCAGCATCTCCCGGGTTTGGACGACGTTGCCCTGGGGGCGCGGGCGGGCCGGGCATAAGGG
GTCTGCCGTACCAGCAGCCAGCCTGCAGAAGGCTCGGTGGCTATGCATGGCACATGCCCGGGGAAGCGTCGACCGGCGCA
GTGTACGCGGGCACGGCCGGGCCGGGCCTTTGCAAGTCTTGGTGGCTGCGGTAGGTAGGGTAGGCAAGAGCGACCGACCG
AGCGGCGGCGGGGCAGGAGCGACCGGGTAGGCGAGCAATTTTTGGGCAAGCTTGCAGTTCTGGACAAGTGAATGCATTCG
CGACCGGGTTGGGTGCGGCGCCGGGTAGGCAAGCGCGTTCGAATCGTACAAGGTGGCGTAGAGAAGAGAGGGTAGGCAA
GTGCGTCCGGGCGGGTTAGGTGTGTAGGGTAGGCAGGCGCGTCTGGGCATGGAATTTTTGTGTAGATGGTGGCTGCATTG
GGAAGGCAAGGGCGAGGGCCTGTGCAGGGTAGGTAAGAAGGACCGAGAGGCTTGGGGGGGCCAAGGGGTTGCTTTCCAG
CTCCTACTGGGAGGGGCTTGTTGAAGGAAAGGGTAGGGTGATAGTAGGAGGGGGTAGGTAAGTAAAGAAGCTATGTGGT
TGAGTAAAGGTATTTGTAGCCTTTTTATTAGAAGATGTAGTAGGGTAGGTAGGAAAAGGTTGTACGGGATTGTGTTTTTAC
GTGAGGTAAAGGTATAAAGGGGGAGGCTATCTTTTTGATTTCTGGGTAGGCGAGGCGGTAGGTAGGCTACTTGGGCTGGG
AATGGTTTAGTCTTTAGGGGGGGAGCGAAAATTTCTTTCTTCTTTTTCTTTTCCTTTTTTATTTATTTATTTTTTTTCTTTCTTC
TTTTTCTCCTCCCTCTTTCTTCTTCCTACTTTTATCCTCTTTATTACTCTTCCTCCTCCCTTTCCTTTCCTCTCCGTCTTCCTTCG
TTTTGGTCCTTTTTTTCTTTTCTCTTCCTTTTTCTTTTTTCTTTTTAGCTTTTAACCTCTTTTTAGGGCTTTCCTCTCTTAATATT
TCTTTCCTTATACCTCCAAACCCCCCTCCGTTCCCTTCTTTTGTATTATATCTATACAAGGATAAAAAAGTAATATGATTAA
TATGTAAATAAAATAAAGAAGGTTCTTATTCTTCTTTTCTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>EU145764_Saccharomyces_cerevisiae
CATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACA
AGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAAC
GGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCA
ACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCA
AAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA
GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTT
GGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTT
AACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTA
CGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGT
CTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG
GA
>K.m. 1Y9
CTATAGGGCGAATTGGGCCCGGCGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCGCGGGGAATTCGATTTCCTCCGCTTATTGA
TATGCTTAAGTTCAGCGGGTACACCTACCTGATTTGAGGTCAAACTTCGAGAGTTTTGGTTAAAGCCGTATGCCTCAAGGA
GACAAACACCAGCGAGTCTTTATAACACCTATGAGTCTCTATGACCCAAGCTTACCACGAATTGGCGCAAACCTAAGACG
TAGATGTGCAAGAGTCGAGTCCATAGACTTGACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGCTAGCCACTTTCAAGTT
AACCCGAGACGAGTATCACTCACTACCAAACCCAAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAAACAGGCATGCCCCCTGG
AATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTTGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCACAATACATATCGCTACTTCGC
TGCGTTCTTCATCGATGCGAGTAAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATATTAAATTTTATAGTATAATAGTTTCT
CATAATACAAAATATTGTTTGTGTTTATGTCCACTGGAGAGACGAGCTCTCCAGGGAAGTAGTTCATAGAGAAAAAACTC
CATTGTGTTTAGGATGAGAAATAGAAAACTGATAGCAGAGAATCAAGAACTGGCCGCGCAATTAAGCGCAGGCCTTGTTC
AGACGATTCCCCCAGTAATCTATTCATTCA
>S.c.D2
ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAG
CCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGC
TTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATT
CGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGT
AACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC
GATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCA
TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGG
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 89 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
CCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTT
TACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTT
CTTAAAGTTTGACCTCAAA
>S.c.D3
CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGG
GAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAG
AGTTTTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGTATTTTCCTATCTTTTCAACTTTT
TCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAAC
AAGAATTTTCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAAAACA
CATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTAT
TCCTGGGGGCTTGGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGTAATAAATT
TTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAATTGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGT
CTTTTTGGGTTTAACCACCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAAAGCGTCTAG
GCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGACCCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAA
GATAAA
>S.c3Y3
ATGATGATTCTTTTCGTTGGGCAAGAGCTGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAGGCGATGGAGAGTCGGCCGGGCCTGC
GCTTAAGGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAG
GACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGG
GGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATT
TTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT
GAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG
CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGG
ATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGG
CTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAAGTTTG
ACCT
>P.m.1Y14
ATTggGcCggCGGgGGAAAAAAAaCCCATAcACACAGtGTTTTTTGTTTATTAAAAAAActgttGCTTTGGCTTGGCGCAAGTCGG
GCCAGAGGTAAaAAcGtAAACTTCAATTTTTAATTGAATTGTTATTTTAATACAGTTGTCAATTTGTTTGATTAAATTCAAAA
ATAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATG
AATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGC
GTCATTTCTCTCTCAAACCCTTGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCA
AGAGTGTACTAGATAGTACTACCTGTTATTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAACGACTGGGCGTAAGTTTCTGG
TAATTGGCTCGGCCTTACAACAACAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
AgGCGGAGGAAGATCTTACAGTTATTACTTTCTACCAGCGCTTAATTGCGCGGTGGAAAATAACCCATACACACAGTGTTT
TTTGTTTATTaAgAACTATTGCTTTGGCTTgGcGcAGTcGGGCAGAGGTTcTACGTAAcTTCAATTTTAATTGAATgTTATTTTA
TccGttTCATTTtTTtAtTAATTaAAAaAATCcTCAAcTTTcACAcGActtTGGTTccCttttAAAaccCAAgCGATAaTAaaTtGAAtTGATTT
>EF568069 Pichia_mexicana
GATCATTACAGTTATTACTTTCTACCAGCGCTTAATTGCGCGGTGGAAAATAACCCATACACACAGTGTTTTTTGTTTATTA
CAAGAACTATTGCTTTGGCTTGGCGCAAGTCGGGCCAGAGGTTACTACGTAAACTTCAATTTTTAATTGAATTGTTATTTTA
ATACAGTTGTCAATTTGTTTGATTAAATTCAAAAATAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGAT
GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC
CTTTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCTTGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAG
TCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCAAGAGTGTACTAGATAGTACTACCTGTTATTCAATGTATTAGGTTTATC
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 90 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
CAACTCGTTGAACGACTGGGCGTAAGTTTCTGGTAATTGGCTCGGCCTTACAACAACAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGG
TAAGATTACCCGCTGAACTTAA
>S.c.D4
CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGG
AGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAG
ATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCAAATCTTTGCAACTTTTTC
TTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAA
GAATTTTCGTAACKGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCA
GCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTC
CAGGGGGCAKGCCTGTTTAAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTG
AAATKGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCG
TTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACCGGAGCGTTTTGGAACGTTTTCGAAAAAAAAAAAGCGTCCTAG
GCGAACAATTGTTTTAAAGTTTGACCCTCAAATCAGGTAGGAGKACCCCGCTGAACTAGCCTAAAAAGAGGGCGGGGGGA
GAGAGTACAAAATTTTTATATTTTTGTAAAATGGAATTTTTTTTTTTTTTTTGGMMGRGAGCTTT
>S.c.3Y4
CAAAGAAAATTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGA
GATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGT
GAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACT
TTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAA
AACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGA
ACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTG
GTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTA
ACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTAC
GGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACCGAGCGTATTGGAACGTTATCGAAAAAAAAAGAGCGTC
TAGGCGAACAAGGTTTTAAAAGTTTGCCTC
>S.c. 4Y3
CAAAATTTATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAAGCTTTTACCKGGCAAGAAAAAAAGAAAGG
GAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGA
GATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTT
CTTTGGGCATTCAAGCAATCGGGCCCCAGAGGAAACAAACACAAAAATTTTTTTTTTTTCTTAAATTTTTTGTCAAAAACA
AAATTTTTCKTAACGGGAATTTTTAAAATTTAAAAAATTTTCAACAACGGATCTCTGGGTTCCCCCATCGATAAAAACCCC
ATCGAATTGCGATACGTAAGGTGAATTGCAAATTCCCGGGAATCATCAAAACTTTAACCCCCCTTGGCCCCCCTTGGTTTT
CCAGGGGGCGGGCCTGTTTGAGCGTCTTTTCCTTCTCAAACTTTCTGTTGGGAAGGGAGGGATCCTCTTTGGAGTAAACTT
GAAATTGCGGGCCTTTTCTTTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTC
GTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGG
CGAACAATGKTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCTTAACAAAAAGCGGGGGAGAA
AA
>S.c. 3Y8
TAAATTTATAATTTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAAGAGAGGG
AGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAG
ATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCT
TTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAG
AATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG
CGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC
AGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 91 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTT
TTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGA
ACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGAAAAGAT
CATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCMARGGCATGGAGAGCTTTT
>S.c.3Y2
CAGTAATAGTTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAAACAAGAGATGGAGA
GTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAKTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTT
CTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTG
GGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAA
TTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCG
AAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTKGGTATTCCAG
GGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAAT
TGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTT
AGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTA
>S.c.3Y5
TATGATGATTTTTTTCGTTGGGCAAGAGCGGAGGTTACGGAAAAAAAAGAAGGGAGAGCAGCGGGCTGCGTTAAGTGGG
GGCTGGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGAAAATTAAAAC
CGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTA
ACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAA
AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAA
TTCCKTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTT
CTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCC
AAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTA
TACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAAAAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTT
>S.c.D5
CAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGCTAAGAACTGAAGACCTTTCTCTGGGTAAGAAGACAAAAAAGG
GAGAGCCCAGCTGGGCCTGCGCTTAAGGGCGCGGCTTTGCTAGGTTTGCAAGTTTCTTGCTCGCTCTTCCAAACGGTGAAA
TATTTCTGAGCTTTTGTTATAGGACACTTAAAGCCGTTTCATTACATCACGCTGTGGAGTTTTCACAGCTTAGCAACTTTTT
CTTGGGGCTTTCAAGCAAGCGGGGCCCAGAGGTACCAAACACAAAAAATTTCATTTCTGCATTAATTTTTAGCCAAAAAC
AAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAACATTAAAACCTTACAACAACGGATCACTTGTTTCTCGCATCGATTAACACCC
CACCGAAATGCTAATCGTACTGTGAATTGCAAAATTCCGTGAATCATCGATTCTTTGAACACACATTGCGCCCCTKGGTAT
TCCGGGGGGCAGGCCGGTTTTAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATCCTCTTAGTAGTTAACTT
GAAATTGCCGGCCTTTACCTTGGAGGTTTTTTTTCCAAAAATAGTTTCCTCTGCTTGCTTGAGGCATAATGCAAGTACGGTC
TTTTTAGGTTTAACCACCAGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCCAAAAAAAAAAAGCTTCTAGG
CCAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAACCAGGGAGGAGTCCCCGCTGAACTTAACCATTCAAAAAAGCGGAGGAAAA
AAAG
>K.m 1Y1
TATATTGAATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCCCTGCTA
TCAGTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGG
ACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATC
TCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCT
TTGAACGCACATTGCGCCMTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGT
AGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGSTGCKTGTCAAGTCTA
TGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAAGTGTTA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 92 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
TAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGACATACGGCTTTAACAAAAACTCTCAAAGTGTGAGCTCATATCAGGTAGGA
GTATCCACTGAACTTAAGCATATCTATAAGCGGGGGGAAGA
>EF568057_Kluyveromyces_marxianus
TGAATGAATAGATTACTGGGGGAATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCTCTGCTATCA
GTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACA
TAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT
TGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTG
AACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGT
GAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGG
ACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAA
AGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTA
CCCGCTGAACTTAA
>K.m. 1AN6
CTAGATACTGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTGATTCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTCT
CATCCTAAAAAAAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAAT
ATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGA
TGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCC
CTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTCT
CGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCAC
ATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTT
TGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAG
CATATCAATAAAGCGGGGGAAGG
>T.d. 1AN9
TATGATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATGGCGCGGCCAGTTTTGATTCTCTGCTATCAGTT
TTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAA
ACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
TTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAAC
GCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAG
TGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACT
CGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGA
CTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCC
GCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAGAAAAG
>K.m. 1D5
AGAAGATGTGATGATAGATTACTGGGGGAATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCTCTG
CTATCAGTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGT
GGACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGA
TCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAAT
CTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTG
GTAGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTC
TATGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGT
TATAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAG
GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGGAGAAGG
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 93 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
>K.m. 1Y11
ATGAATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTAGATTCTCTGCTATCAGT
TTTCTATTTCTCATCCTAAACAAAAAGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATA
AACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAA
CGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGA
GTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGAC
TCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAG
ACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACC
CGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGGAGAG
>AB469378 Torulaspora delbrueckii
CTAAAGATCTATATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCTGGTTCAAGACCAGCGCTTAATTGC
GCGGTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGTCTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAG
TTTTCTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATT
ATTATAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCA
TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT
GCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACT
CTGTCAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTA
ATACCGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAAC
GATTTATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAA
TACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAACGGGAAGAGAAAGGGTCAT
>T.d. 1AN5
AGATACTGGGGGATCGTCTGACAGGCTGCGCTAATTGCGCGGCAGCGAGTCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTCTCATCCTA
AAAAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAATATTTTGT
ATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGA
ACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGG
TATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTT
AACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCACATCTAC
GTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTC
CTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATC
AATAAGCGGAAAAAG
>K.m. 4D2
ATGATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTGATTCTCTGCTATCAGTTTT
CTATTTCTCATCCTAAACACAAAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAAC
ACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC
TCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCA
CATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGA
TACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGA
CTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTC
GCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCT
GAACTTAAGCATATCATTAAAAGGGGA
>K.m. 4D3
ATGATAGATACTGGGTGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCGATCTCTGCTATCAGTTTTCTATT
TCTCATCCTAAAACAAGAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAA
ACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 94 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATT
GCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACT
CGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCT
TGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTG
GTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAAC
TTAAGCATATCAATAAAAGGGGGAG
>K.m. 4D4
CGATAGATACTGGGGGATCGTCTGACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTGAGATCTCTGCTATCAGTTTTCTATTT
CTCATCCTAAAACAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAAC
AATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGC
GCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCG
TCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTG
CACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGT
GTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTT
AAGCATATCAATAAAGGGGAGAGAAGG
>K.m. mosca7
TGATAGATACTGGCGGATCGTCTGACAAGGCCTGCACTTAATTGCGCGGCCAGTCGAATCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTC
TCATCCTAAAACAAGAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAAC
AATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGC
GCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCG
TCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTG
CACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGT
GTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGGAGTACCCGCTGAACT
TAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA
>K.m. mosca5
ATATGATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTAGATTCTCTGCTATCAG
TTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACAT
AAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT
GGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGA
ACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTG
AGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGA
CTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAA
GACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTAC
CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGAGGAGAAAAGGA
>K.m. 4Y2
GATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTAGAGTCTCTGCTATCAGTTTTCT
ATTTCTCATCCTAAAACAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACAC
AAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTC
GCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACA
TTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATA
CTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACT
CTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGC
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 95 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
TGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGA
ACTTAAGCATATCAATAAGGCGGGAAGAAGGAT
>K.m. 4D5
TGATAGATACTGGGGGATCGTCTGACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCAGGCGAACCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTC
TCATCCTAAAAAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAA
TATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCG
ATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGC
CCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTC
TCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCA
CATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGT
TTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAA
GCATATCAATAAAGGGAGAAGAAGGAT
>T.d.1AN2
GAGATCTATATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGTAAAAGGGGCG
GTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGACTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTT
CTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTA
TAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGA
TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC
CCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGT
CAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATAC
CGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTT
ATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCC
GCTGAACTTAAGCATATCA
>T.d. 1D2
ATCTTATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGTAAAATGGGCGGTTGC
GGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAATATGACTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTTCTACA
CAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTATAAAC
CAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAG
AACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTG
GTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGTCAAGG
GTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATACCGAAT
TGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTTATCGT
TTGTTTGAGCTTTTCGCATACG
>EF151440_Pichia_guilliermondii
GCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTT
TAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT
TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAAC
GCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAG
TGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATG
TATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAG
TTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGGGATCTTAAGTATTCTTTTGCCA
GCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATAAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCTAGAGATGGTT
GGGCGAGGTTTTACAAAACACATTTAATTATTTTT
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 96 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
>P.g.1Y12
TGCAGCGCTACTGCGCGGCGAGAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAATCTAGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAG
GTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAAC
AACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATC
ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCC
GGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCT
GTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTAC
AACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAACGTACCGACGAAGGGATCTTA
CAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGT
TTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCAGAGGTTTACAAAACACAATTTAATTATTTT
>P.g.1Y15
GTGCGGAAGGTTCAAAGGTGTATTCTTTTGCGGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAG
AACTAAGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTAAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCA
AATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA
GTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCT
GTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAG
TATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGG
ATATTTCTGGTATTGTAGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTT
ATGCATATCAATAAGCGGAGGAAAATCTAGTAGTCGTGTTTGCAGTACTTAGCTTCCGAGTGAAATCTCACCCACATAAA
GTCTATATGATAAGTCTTGCTTTCGTTGGCTTGGGATAGAGATGCGGAGG
>P.g. 4AN2
AAGGGTTTTCTTTTTGCGGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTATAGCTTTG
GGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTAAACAAGGCACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTA
ATCTTCAAAACTTTCAACAACGGACTTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATT
GCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCA
TTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGG
TAGTACTTGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGGGTGGCGGGATATTTCTGGTAT
TGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT
AAGCGGAGGGGGGGATCTTACAGAAATCTGTTGCCAGCGATTAACGGCGCGGCGAAAAACCTCACCACAGTGTCTTTTTG
ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGAAAGGGTGGGGCAGAGGGTTTAAAACACATTTAAGTAT
>P.g. 4AN7
GGGTATTCTTTTGCCGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTG
GCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTT
CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAG
ATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCT
CTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGT
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GGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTTGCATATCTATAACCG
GAGGGAGATTTTAAGAAAATTGTTGTCAGCGATTAAGTGAGCGGCGAAAACCCTACACATTGTATCTTTTCTACAGACTCT
TGCTTTGGTTGGGCTAGAGAAAGGGGGGGCAGAGGGTTAAAAACATAATTTAAGTATTTTACGGATCGCTC
>C.l.1AN4
CAAAATAATACTTTCCCTTTGTTTTTGCGAACAAAAAAAAATTTTTTTATTCGAATTTCTTAATATCAAAACTTTAAAAAGG
TCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAAGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTT
GAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCCAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGGCGTT
GCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 97 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
ACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAGATGTTAATAATATACTTACACTTTGCTTGTGCGAACAAAAAAATAAATTTTT
TTATTCGAATTTCTTAATATCAAAACTTTCAACATTTTAMTCTTTTTTTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGATTTTGGG
ATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTGGAGGCATTCCTCGAGGCAGGCT
TTTTTGGGGCGTCCATCCCCTCTAACCCCCGGGTAGGCGTTAGCCCCTAAAATATCCACCCGCGCTTTCAAACCACGTTTTA
CGGGGCGAACTTTTTCCCCCTCTAATTTGGGGGAAGAACTTACCCCCCTCAAATTTAAAAGGTTTCGCTTAAGGGGGGGGA
AAAAA
>C.l.4AN3
GAAAAAAAATAAATTCACACTGTTTTTGCGAAAAAAAAAAAATTTTTTTATTCGAATTTCTTAATATCAAAATAACAACAA
CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAAT
CTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGG
CGTTGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGC
TGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAGGATCATTAAAATACAAATTACACACTGTTTTTGCGAACAAAAAAATAA
ATTTTTTTATTCGAATTTTTTAATATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAT
TGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGGCATTCCTCGAGGCA
TGCCTGTTTTGAGCGTCGCATCCCCCTCTAACCCCCGGGTTAGGCGTTTGCCCCTAAAATATCAACCCGCGCTTTCAAAAC
ACATTTTACAGCACGGACAATTTTGCCCCCTCTAATTTAAGGKAAGAACTTACCCCCCTCAAAAATTTAAAAGGTTTCGCT
TAAAGGGGGAGAGGAAAAAA
>AY321469_Clavispora_lusitaniae
CGATCTTAAAATACTTACCATTGTTTTTGCGAACAAAAAAATAAATTTTTTTATTCGAATTTCTTAATATCAAAACTTTCAA
CAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGT
TAGGCGTTGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTAC
CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
>C.l.4AN6
AAAAAAAATACCTTCTCTTTGGTTTTGCGAAAAAAAAAAAATTTTTTTATTCGAATCACTTAAATCAAAAATGAAAAAAAG
AACTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAAAGGAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTT
TGAACGCACATTGCGCCTCCAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGGCGT
TGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA
ACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGGTCGTTAAAAAACAATATACCCTTTGGTTTTGCGAACAAAAAAATAAATT
TTTTTATTTGTATTATCTAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGKTCTCGCATCGATAAAAAACGCAGCGAATTGC
GATACGTAGTATGACTGGCAGACGTGAATCTTCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCTCCGAGGCATGCG
TGTTTGAGGCGTCCATCCCCTCTAAACCCCGGTTTAGGCCTTTGTACCTAAAAATATAACCGCGGTGTCAAACCACATTTT
ACAGCGGCGCAACTTTTCGCCCCCTCTCTTAAGGGGGGAACTTACACCCCCCAAAAAATAAAAAGTCTCGTTAAAAAGGG
AGGAAAAAA
>C.l. 4Y4
AAAAAAAAAAACTCACCCTGTTTTTGCGAAAAAAAAAAGAACATTACACTTCTAATATATTTTTATCAAAACTTTCAACAA
CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAAT
CTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGG
CGTTGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGC
TGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGATAACTAAAAAATAATATACACACTGTTTTTGCGAACGAAAAAAAG
AACATTACACTTCTTATTTCTTTTTATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGGTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
ATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAAACGTGAATCATCGACTCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCAGTCCTCGAGGC
ATGCATGTTTGAGCGTCGCAACCCCTCTAACCCCAGGTAAGGCGTTGGAACGAAATATCAACCGCGGTGTCAAACACATT
TGCGTACGACAGTTCGCCCTCTATCTGGGAAGAGTACCCGCACAATTTAACCGACTCGCGTCGAGGAGGGAAAA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 98 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
>P.k. 1Y10
AATTACATGAAATTATATCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGAATA
ACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAA
TTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTC
GTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCTTGKACGAAGTGAACTAAACT
ATTTGGAACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAKCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT
CGGTAAGCGGAGGGAAGCTCCCACTGTGATTTATATCTTTCAGGGGGCGTGAGGCACCCACCCTAAAATTGTAATATACC
AGTCCTAAGTTTTACAAACCACTTTCCACAACGGATCTCTTGGTTCTGATCGATGAAGAGCGCAGCGAATGCAATACTAGT
GTGAATTGGCCCTCGTGAATCATGACTTCTTGAACACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGATGCCTGTTGAGCGTCTTTC
CTTCTTCGCAAGCAAATTGAGAACAGGCATGCCTTTTTCGAAAGGCGCGTCGTAGAA
>P.k. 4D7
CTGATTTATCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGTATAACAAAACAA
AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCAT
CGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTT
GCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTATTTGGAACG
CTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGG
AAATTAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTC
ACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATA
CTAGTGTGAATTCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGCATGCCTGTC
TGAGCGTCGTTTCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAAATGGCACGTCGTGGACCAAGTG
>P.k. 4AN5
TCGGGTATTATTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGAATAACAAAA
CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAG
CCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCT
TCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTATTTGG
AACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
GCGGAGAGTAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACGTGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACC
TGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGC
GATACATAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGCATG
CCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGCACGTCGTCGACAA
AGT
>P.k. 4D6
TGTATTATTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGAAATAACAAAACA
AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCA
TCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCT
TGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTATTTGGAAC
GCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG
GAGAGTAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACGTGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCTGT
CACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGAT
ACATAGTGTGAATTCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGCATGCCTG
TCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGATACAGGCTATGCCTTTTACGAAATGGCACGTCGTGGACC
>P.k. 4Y6
TAATTACTGTTATTTTTTTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGTAAT
AACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGA
ATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGT
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 99 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
CGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAAC
TATTTGGAACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA
TCAATAAGCGGAGGAAAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACGTGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTA
ATACTACCTGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGC
GAAATGCGATACTAGTGTGAATTCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGG
GCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTYCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTATTCGAAAAGGCACGTCG
TCGACCAAGG
>P.k. 1Y16
CCGGGGATTTTTTTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGTTTTAACA
AAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGAAGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTG
CAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATCGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCGTGCCTGTCTGAGCGTCGTT
CCCTTCTTGCGAGCYAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCAAAATGGAACGTGTGGACGAATGGAACTAAACTTTGG
GACCCTCWACGGCCGCAGGAGTTAGAAGCAACCTCGACCTCAGGGAGGTAGTAATACCGGTGAACATTAGTAGGTCAGT
ACGCGTAGAAAATTATAACTCGTCTC
>DQ104732_Pichia_kluyveri
AACCTGCGGAAGGATCATTACTGTGATTTATATCTTATACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTAC
CAGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATG
CGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCA
TGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGA
CGAAGTGAACTAAACTATTAGCACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCG
CTGAACTTAA
>C.p. 1Y7
AAACAGAATGAAAAGTGCTTTAACTGCATTTTTTCTTACACAGGTGTTTTTCTTTTTTTGAAAACTTTGCTTTGGAAGGCCT
GTATATGGGGCCGGCCAGAGATTAAACTCAAAAAAATTTTATTAATGTCAACCGATTATTTAATAGTCAAAACTTTCAACA
ACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGGTGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCA
TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCTCG
GGTTTGGTGTTGAGCGATACGCTGGGTTGCTTGAAAGAAAGGCGGAGTATAAACTAATGGGTAGTTTTTCCCCCCATTGTT
ACAAACTCCAAAATTTTTCCAAATTCTTTTTCATCAGGTAAGGCCCCCCGCTGAACTTAAGATGCCAATGCGGAAGAAAAC
>FM172980_Candida_parapsilosis
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGAATGAAAAGTGCTTAACTGCATTTTTTCTTACACATGTGTTTTTCTTTT
TTTGAAAACTTTGCTTTGGTAGGCCTTCTATATGGGGCCTGCCAGAGATTAAACTCAACCAAATTTTATTTAATGTCAACCG
ATTATTTAATAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA
TATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTT
GAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCTCGGGTTTGGTGTTGAGCGATACGCTGGGTTTGCTTGAAAGAAAGGCGGAGTATAAA
CTAATGGATAGGTTTTTTCCACTCATTGGTACAAACTCCAAAACTTCTTCCAAATTCGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC
CGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGA
>Z.b. 3Y1
GATAGAAAATTTCTGATTGAACGAGTCTGGAGTAGTTGTGTTCTCTCTGTTTTTTCAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGACT
AGAGCGGAGGGAGTTAAGCATAGTTACTCTGGCTTTCAATTTACACACAGTGGAGTTTCTACTTTTTTTATTCTTCTTTGGG
AGGATGGGTTCGTCCCACTCCCATAGCTAAAACAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTATACCGGCCAAAACGAA
AACTAAAAAAAAAAATTTTCAAATTTTTCACACACGGATTTTGTGTTTTCCCCCTCGAAAAAAACCCCAGCAAACCGCGCC
TAATGGGAAATGGAAAATTCCGGGAAAACCCGAATTTTTAACCCCTTGCCCCCCCGGTTTTCCCCGGGGGGATGCCCGGTG
GAGGGTCTTTTCTTCCTCCAAAAAGGGTTGGGGGGGGAGGGAAACCCTTTTTTTTGGGGGAAATAAAAACAACCCTTTTGG
GGAACCCGTGGGGGGTAGTTTTTGGGGGGAAAATTTTGTTCCTCTCTTTCCAAAAAAAGGGTTTTACGGTTTTCCCCCCCC
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 100 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
CGACAGAGGGACAAGGAAAATGGGGAAGAAAAAAAAATATCGAGCTCGGCTTATTTTTTTTTTGGGGCGCCTGGGGAAA
AAAAACCTGTCAAAGTTTSACCTCAATCAGGGAGAGAGTCCCCG
>X84732 Zygosaccharomyces bailii
TAGAAAAATTTCTGATTGACGAGTCTGGAGCAGTTGTGTTCTTTCTGTTTTTTTTAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGTCTA
GAGCGGAGGGAGTTAAGCATAGTTGCTTTGGCTTTCAATTTACACACAGTGGAGTTTCTACTTTTTTTATTCTTCTTTGGGA
GGATGGGTTCGTCCCGCTTCCAGAGGTAAACACAAACAATTTTTTTTATTTTATTTTATTTTATTATTATAATAATAATAAT
ACAGTCAAAACGAATACTAAAACAAAAAATATTCA
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 101 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
14. GLOSARIO
ADN. Molécula de gran peso molecular que está constituida por tres sustancias distintas:
ácido fosfórico, un monosacárido aldehídico del tipo pentosa y una base nitrogenada cíclica
que puede ser púrica (adenina o citosina) o pirimidínica (timina o guanina).
ADNr. Se refiere a la región de ADN donde se encuentran los genes que codifican para la
formación de los ribosomas, generalmente se encuentran en arreglos de cabeza a cola
empezando con el mediano 18S, después el pequeño 5.8S y posteriormente el grande 26S,
separados por los espaciadores internos ITS.
ADN Taq polimerasa. Es una enzima que se extrae de la bacteria Thermus aquaticus para
la replicación del ADN, la Taq ADN polimerasa, es ampliamente utilizada por sus
propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR.
Acido nucléico. Biomolécula formada por macropolímeros de nucleótidos, o
polinucleótidos. Está presente en todas las células y constituye la base material de la
herencia que se transmite de una a otra generación.
Alambique. Del árabe al - ambiq, y este a su vez del griego ambicos = vaso), es el sistema
de destilación más utilizado. El equipo consta de una caldera o pota de cobre, de capacidad
variable, un capacete condensador prolongado en un cuello de cisne (o trompa de elefante),
un condensador refrigerante cilíndrico (bidón) provisto en su interior de un serpentín de
cobre, conectable al cuello de cisne y con salida para el destilado en su parte inferior y una
base para el condensador refrigerante.
Arbol filogenetico. Es un árbol que muestra las relaciones de evolución entre varias
especies u otras entidades que se cree que tuvieron una descendencia común. Un árbol
filogenético es una forma de cladograma.
Bioedit. Es un programa bioinformatico editor de secuencias el cual permite la
manipulación y análisis de múltiples secuencias y contiene aplicaciones que facilitan su
alineamiento entre otras.
BLAST. Es un programa informático que emplea un algoritmo heurístico lleva a cabo un
alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o de proteínas. El programa es
capaz de comparar una secuencia problema (también denominada en la literatura secuencia
query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos.
Cepa. Es un grupo de aislamientos caracterizados de un microorganismo. Esencialmente
esto se aplica a aislamientos del laboratorio, cultivos o selección, raza, variedad.
Dendrograma. Tipo de representación gráfica o diagrama de datos en forma de árbol
(Dendro=ramas) que organiza los datos en subcategorías que se van dividiendo en otros
hasta llegar al nivel de detalle deseado (asemejándose a las ramas de un árbol que se van
dividiendo en otras sucesivamente).
Destilación. La destilación es el procedimiento más utilizado para la separación y
purificación de líquidos, y es el que se utiliza siempre que se pretende separar un líquido de
sus impurezas no volátiles.
Diversidad. La variación entre las especies, es lo que les ha permitido a las poblaciones
adaptarse a cambios climatológicos, así como a diferentes condiciones ambientales, la
existencia de una amplia variedad de especies (diversidad de especies) de plantas, animales
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 102 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
y microorganismos en su hábitat natural, o en comunidades con un particular medio
ambiente (diversidad ecológica) o bien variaciones genéticas entre las especies (diversidad
genética).
Electroforesis. Migración de partículas a través de una matriz (usualmente polimérica)
debido a un diferencial de campo eléctrico.
Espectrofotómetro. Instrumento empleado para medir la cantidad de luz de una longitud
de onda específica que es absorbida por una solución.
Etanol. Es un alcohol que se presenta como un líquido incoloro e inflamable con un punto
de ebullición de 78.5°C. Al mezclarse con agua en cualquier proporción, da una mezcla
azeotrópica. Su fórmula química es CH3-CH2-OH, principal producto de las bebidas
alcohólicas como el vino (un 15% aproximadamente), la cerveza (5%) o licores ( hasta un
50%).
Fermentación. Conversión biológica anaeróbica (sin oxígeno) de las moléculas orgánicas,
generalmente hidratos de carbono, en alcohol, ácido láctico y gases, mediante la acción de
ciertos enzimas que actúan bien directamente o como componentes de ciertas bacterias y
levaduras.
Fermentación alcoholica. Es un proceso biologico de fermentación en ausencia de aire
originado por la actividad de microorganismos que procesan los hidratos de carbono para
obtener como productos finales el etanol dioxido de carbono en forma de gas y ATP.
Fermentación maloláctica. Es el proceso por el cual el ácido málico presente en las frutas
se transforma químicamente en ácido láctico; por medio de bacterias de origen láctico
existentes de forma natural en el entorno, o en el interior de la fruta misma.
Fructosa. Es una forma de azúcar encontrada en las frutas y en la miel. Es un
monosacárido con la misma fórmula empírica que la glucosa pero con diferente estructura.
Gen. Segemento de ADN que codifica una cadena polipeptidica o una molecula de ARN.
Glucosa. Es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6, la misma que la fructosa
pero con diferente posición relativa de los grupos -OH y O=. Es una hexosa, es decir, que
contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en el
extremo de la molécula. Es una forma de azúcar que se encuentra libre en las frutas y en la
miel.
HPLC. Cromatografía líquida de alta eficiencia emplea una fase móvil que es un líquido
que fluye atravéz de una columna que contiene una fase líquida
Índice de diversidad. Parámetro matemático para medir la biodiversidad de un ecosistema.
Levadura. Hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para
realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.
Pares de bases. Dos nucleótidos opuestos y complementarios en las cadenas de ADN y
ARN que están conectadas por puentes de hidrógeno.
Mega 4. Es una herramienta bioinformatica para trabajar con alineamiento de secuencias
manual y automaticamente para la realización de arboles filogeneticos empleando
secuencias de las bases de datos, también estima rangos de evolución molecular y
examinando las hipotesis evolutivas.
DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO
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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 103 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES
Mezcal. Del náhualtl metl e izcalli que significa agave cocido al horno. Es una bebida
alcoholica tradicional mexicana a base de agave.
Mosto. Es el zumo de la uva sin fermentar. También nos podemos referir como las piñas
del agave que son molidas y puestas a fermentar, o cualquier otro sustrato vegetal rico en
azúcares fermentables.
Oligonucleótido. Secuencia de ácido nucléico o de una molécula relacionada que sirve
como punto de partida para la replicación del ADN.
Polimorfismo. Diferencias en la secuencia de ADN entre individuos. Variaciones genéticas
que ocurren en mas del 1% de la población pueden ser consideradas útiles para la
identificación de individuos o para el análisis de genomas con alto porcentaje de similitud.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Técnica de análisis del genoma mediante la
amplificación ilimitada de porciones específicas del ADN, aunque sean minúsculas. Es un
método revolucionario de amplificación exponencial del ADN por la intervención de una
enzima termoestable, la Taq polimerasa, inventado por el americano Kary Mullis en 1985
por lo que se le concedió en 1993 el premio Nobel. Es el proceso fundamental para la
secuenciación del Proyecto Genoma Humano.
Rep-PCR. Técnica molecular genómica donde se utilizan oligonucleótidos degenerados
que por PCR y visualización en luz UV producen patrones de bandeo característico para
cada especie.
Secuencia de ADN. Orden de encadenamiento de las bases nitrogenadas de los nucleótidos
que constituyen el ADN y que cifra toda la información genética. Cuando es codificante
(exón), define el orden de los aminoácidos que forman la proteína correspondiente.
SSCP. Es un proceso donde los productos de PCR son desnaturalizados en cadena simples
de ADN, luego renaturalizados para favorecer los apareamientos intracatenarios y
finalmente analizados en un gel de Poliacrilamida. La estructura de ADN adoptara una
conformación y permitirá la diferenciación en el gel.
Trapiche. Es un molino artesanal utilizado para extraer el jugo de determinados frutos
como el agave.