Institut de Recerca

Hospital Universitari Vall d’Hebron

Proteòmica i Metabolòmica:

Tècniques disponibles,

planificació i disseny

d'experiments

25 de Març de 2014

RICARDO GONZALO

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Introducció a la metabolòmica.

•Introducción a la metabolómica. PrincipalesTécnicas utilizadas.

•Diseño de experimentos

•Análisi de dades de metabolómica

CONTENIDO:

METABOLOMICA. Definiciones

Definición Estudio de los procesos químicos de los metabolitos

Cualquier molécula

intermediaria o producida

durante el metabolismo

“Estudio sistemático de la única huella química

que los procesos celulares dejan atrás”

MetabolomaRepresenta la colección de metabolitos de una célula, de

un tejido, de un órgano o de un organismo, los cuales son

los productos finales de los procesos celulares.

METABOLOMICA. Definiciones

Genómica Proteómica Metabolómica

Nos explican lo que ha pasado

después de un estímulo,

mutación,...

Explica lo que está pasando

después de un estímulo,

mutación,...

Seria muy interesante poder integrar estos tres tipos de

datos para saber lo que está pasando en un organismo

METABOLOMICA. Adquisición de datos

Técnicas de separación:

•Cromatografía de gases (GC)

•Cromatografía líquida (UPLC)

Técnicas de detección:

•Espectrometría de masas (MS)

•Resonancia magnética nuclear (NMR)

Combinación de técnicas:

•GC-MS

•H/UPLC-MS

1

METABOLOMICA. Adquisición de datos.

Sirve para separar diferentes componentes de una muestra

Es un método físico de separación en el que los componentes a

separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en

reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se

mueve en una dirección definida.

Técnicas de separación

•líquido o gas

•Alta pureza

•Inerte químicamente

•Sólido, líquido o gas

•Sólido = partículas empaquetadas

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación

Cromatografía de gases

•Fase movil: gas inerte.

•Fase estacionaria: columna

•Permite la separación de mezclas órganicas

complejas

•Suele requerir derivatización química

(sólamente los compuestos químicos volátiles

pueden ser analizados sin derivatización)

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación

Cromatografía líquida. HPLC/UPLC

•Permite la separación de mezclas muy complejas

•Menor resolución cromatográfica

•Pueden ser analizados un amplio rango de metabolitos (analitos poco volátiles)

•UPLC permite trabajar a P mucho mayores y así reducir tiempo y costes

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de separación

Cromatografía líquida. HPLC/UPLC

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección

GC H/UPLC

Separan, identifican y cuantifican compuestos....¿qué pasa si hay muestras

que coeluyen...?

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

•Permite identificar, cuantificar y elucidad la estructura de manera casi inequívoca

cualquier sustancia pura

•Necesita que las sustancias estén previamente separadas (espectros generados

son complejos)

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección

Muestra es ionizada (=destruída)

pierde algunos electrones y

se fragmenta dando

diferentes iones

Iones son acelerados por

un campo magnético

hacia un detector

Cada compuesto se ioniza y

fragmenta de una

determinada y única manera

(relación masa/carga)

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Detector

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-Qtof

MS-Tiempo de vuelo (Qtof)

•Un ión con determinada relación masa/carga es analizado en el tiempo

•Los iones son acelerados bajo un campo eléctromagnético de fuerza conocida

•La velocidad del ión dependerá de su relación masa/carga

•Se mide el tiempo que tarda el ión en llegar al detector

1

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-QQQ

•Sistema fluídico y de adquisición de

muestras Acquity.

•4 líneas de solvente, el usuario tiene de

escoger 2.

•Flujo de 0.01 a 2.00 mL/min

•Presión máxima 15.000 psi

•Capacidad para procesar 96 muestras

•Detector masas Txevo TQ

•Fuente en Zspray. Capacidad de ser

ESI/APCI/ESCi

•Dos cuadrupolos analizadores de alta resolución.

•Celda de colisión T-Wave

•Rango de masas: 2 – 2048 m/z

MS-QQQ

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección. MS-QQQ

1

METABOLOMICA. Adquisición de datos. Técnicas de detección

Resonancia magnética nuclear

•No se basa en la separación de los analitos. La muestra se suele poder recuperar

•Detecta todos los metabolitos a la vez. No es selectiva

•Principales ventajas es la alta reproducibilidad y facilidad de preparación de las

muestras

•Es menos sensible que MS

METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental

Diseño experimental:

•Definición: La estadística que sucede antes del experimento. Técnica estadística que

permite identificar y cuantificar las causas de un efecto dentro de un estudio

experimental.

•Beneficios:

un buen diseño puede ahorrar tiempo y dinero (evita repeticiones)

reduce el tiempo de análisis y la probabilidad de error.

buena estimación del error

reduce el tiempo experimental al mínimo.

permitirá una validación amplia de los resultados (=muestra de una población)

METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental

Varianza, análisis de

clusters y potencia

Experimento

Validación

de los datos

Análisis estadístico Análisis preliminar

METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental

•Fases en las que interviene el diseño estadístico:

PreadquisiciónPlanificación y discusión del experimento global

Estudiar las fuentes de variabilidad

Elección de la metodología a utilizar

Definir el/los objetivo/s del estudio

Obtención del especimenElegir las muestras a utilizar

Determinar el número de muestras

Forma de recolección de las muestras

Pooles

Diseño del ensayo Número y tipo de replicados

Gente que va a manipular, kits, ...

Si hay más de una tanda de adquisición, repartir bien las muestras

METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental

Número de muestras necesario:

•¿Cuánta variabilidad tiene mi sistema de estudio?

•¿cuántas muestras necesito?

•¿Qué nivel de significación se necesita?

Fuentes de variabilidad

•Biológica (la que nos interesa)

•Técnica (protocolo, operador....)

•Sistemática (instrumentos, reactivos,...)

Se debería estimar la

magnitud de las tres

fuentes de variabilidad

Estudio Piloto

Cambios sutiles requieren elevado número de replicas

METABOLOMICA. Análisis de datos. Diseño experimental

Diseño del ensayo

Principios básicos del diseño experimental:

• Aleatorización: Asignar de forma aleatoria las muestras a los grupos

• Réplicas: Aplicar el mismo tratamiento de forma independiente a más de una

muestra. El número de replicados dependerá de la precisión del equipo.

Tipos: biológicos/técnicos

•Bloqueo o control local: Muestras pueden no ser homogéneas (hombres/

mujeres), pueden existir diferencias debidas a los bloques. Asignar

correctamente el tratamiento entre los bloques.

METABOLOMICA. Análisis de datos

Datos metabolómica

espectros digitalizados

lista de medidas sobre metabolitos

Se genera una matriz donde

las filas corresponden a las

muestras y las columnas

corresponden a los niveles

analizados en los metabolitos.

Suelen ser análisis complicados que requieren de personal y equipo

especializado

METABOLOMICA. Análisis de datos.

Tipos de análisis que se pueden hacer:

1. Análisis exploratorio

i. Revisión de los resultados

ii. Detección de “outliers”

iii. Patrones de agrupación

3. Clasificación

i. Construcción de un modelo para la predicción/clasificación de nuevas

muestras

2. Descubrimiento de biomarcadores

i. Identificar metabolitos que son significativamente diferentes entre grupos

METABOLOMICA. Análisis de datos.

Aspectos del análisis de datos

1. Normalización de los datos crudos

• Eliminar la variabilidad sistemática entre las condiciones experimentales que no estén

relacionadas con las diferencias biológicas (diluciones, varios operadores, “dyes”…)

• Hacer todos los datos comparables

2. Problema del Multi-testing

• Al realizar muchos test estadísticos (miles) hay que ajustar el p valor para que no

aparezcan falsos positivos.

3. Agrupaciones

• No supervisados

• Muy interesantes porque permiten echar un vistazo a los datos rápidamente

• Ej. PCA, Heatmap, dendogramas, ….

METABOLOMICA. Análisis de datos.

PCA (Análisis de componentes principales)

•Analiza y extrae la variabilidad sistemática en los datos

•No necesita conocer la naturaleza de las muestras antes de hacer el análisis

•Nos mostrará cualquier diferencia significativa entre los grupos de muestras (sea o no

sea importante para el estudio en sí)

METABOLOMICA. Análisis de datos.

4. Clasificación

• Métodos supervisado (conocemos la naturaleza de las muestras)

• Muchos métodos estadísticos tradicionales no se pueden utilizar (pocas muestras con

miles de datos)

• Se han desarrollado métodos nuevos, algunos derivados del análisis de datos de

microarrays

PLS (Partial Least Square)

• Similar al PCA, pero se utiliza la información sobre que se

conoce de las muestras (supervisado)

• Recomendado cuando se estudian dos grupos

• Se maximiza la covarianza entre los resultados obtenidos

y la información previa conocida de las muestras.