Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores.
-
Upload
elena-zuniga-palma -
Category
Documents
-
view
230 -
download
2
Transcript of Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores.
ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex
Stephen P. Bell & Bruce Stillman
Cold Spring Harbor Laboratory
Nature, 357 (1992), 128
•Cualquier pedazo de DNA humano de un
tamaño suficiente confiere a un plásmido la
habilidad para ser replicado.
• En estos casos la replicación comienza en
sitios localizados al azar, no sólo en la
porción de DNA humano sino en la secuencia
del plásmido bacteriano.
•Estos resultados sugieren que no se
requeriría una secuencia consenso para
iniciar la replicación en células de
mamíferos.
Estructura del gen de la beta globina
Clonado de diferentes regiones del gen beta globina
en un vector de expresión que contiene promotores
para la RNA polimerasas de fagos T7 y T3
Preparación de sondas complementarias a
las cadenas (+) o (-) de diferentes
regiones del gen de beta globina.
Se obtienen a partir de la transcripción in
vitro de los clones con diferentes regiones
del gen de beta globina
Células
permeabilizadas+BrdU+emetina
Extracción DNA
Fragmentación (500 pb)
Gradiente de CsCl
DNA híbrido
Separación por anti-BrdU
Blotting en filtros
Hibridización con sondas (+) y (-)
Conserved Initiator Proteins in EukaryotesKimberley A. Gavin, Masumi Hidaka, Bruce Stillman Science, Vol 270, Issue 5242, 1667-1671 8 December 1995
The origin recognition complex (ORC), a multisubunit protein identified in Saccharomyces cerevisiae, binds to chromosomal replicators and is required for the initiation of cellular DNA replication. Complementary DNAs (cDNAs) encoding proteins related to the two largest subunits of ORC were cloned from various eukaryotes. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc1p were cloned from the budding yeast Kluyveromyces lactis, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe,and human cells. These proteins show similarity to regulators of the S and M phases of the cell cycle. Genetic analysis of orc1+ from S. pombe reveals that it is essential for cell viability. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc2p were cloned from Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, and human cells. The
human ORC-related proteins interact in vivo to form a complex. These studies suggest that ORC subunits are conserved and that the role of ORC is a general feature of eukaryotic DNA replication.
Mecanismos que determinan la unión específica de ORC...
o posibles respuestas a la paradoja
•Distintos tipos de ORC
•Concentración de ORC
•Actividad transcripcional
•Metilación del DNA y acetilación de histonas
•Intervención de otras proteínas
Preguntas con respuestas pendientes en el área de la replicación
• ¿Existen orígenes de replicación definidos en eucariotas?
• ¿Cómo se logra la especificidad de la proteína iniciadora ORC?
Otra pregunta con respuesta abierta:
¿Cómo se regula la actividad de los
orígenes de replicación de modo de
obtener una sóla replicación por ciclo
celular?
“Once, and only once”
•Entender la naturaleza del estado competente (G1)
•Cual es la naturaleza del activador de S
•Caracterizar el estado de incompetencia (G2)
•Caracterizar el desbloqueo y regreso a la competencia
Letters to NatureNature 430, 913-917 (19 August 2004) | doi: 10.1038/nature02813
Structural basis for inhibition of the replication licensing factor Cdt1 by geminin
Changwook Lee1, BumSoo Hong1,5, Jung Min Choi1,5, Yugene Kim1, Saori Watanabe2, Yukio Ishimi3, Takemi Enomoto2, Shusuke Tada2, Youngchang Kim4 and Yunje Cho1