, ,

INGENIERIA QUIMICA

Evaluacion de la produccion degases en la ferrnentocion

acetobutllica

ALBERTO DUARTE TORRESIngeniero Quimico. MSc. Profesor Asociado. Facultad de Ingeniria.

Universidad Nacional de Colombia.JOHN F. ALARCON GRANOBLES

Ingeniero Quimico. Universidad Nacional de Colombia.EDGAR R. PINEROS FORERO

Ingeniero Quimico. Universidad Nacional de Colombia.

INTRODUCCION

Los costos crecientes de las materias primas prove-nientes del petroleo, base de los procesos de sintesisde acetona y butanol, han originado un renovadointeres por los procesos fermentativos.Estos proce-sos dejaron de aplicarse en 1930por sus desfavora-bles condiciones economicas en comparacion conlos procesos sinteticos. Un ejemplo fue la planta deIllinois (EE.UU), con 96 fermentadores de 200 m"y un consumo diario de 25.000 bultos de maiz (9).

EI Instituto de Biotecnologia de la UniversidadNacional de Colombia, despues de considerar queel pais importa anualmente alrededor de 2500toneladas de butanol y el 80 % de la acetonaconsumida, inicio en 1987 un programa de desa-rrollo de la fermentacion acetobutilica a partir demelazas de caiia. De acuerdo con el estudio deprefactibilidad economica para la produccion debutanol y acetona por fermentacion, de Serrano yPinzon (10), los gases constituyen un 83 % de losingresos totales recibidos por ventas, mientras lossolventes, etanol, butanol y acetona, solo un 16 %,razon por la cual es necesaria la evaluacion de losgases producidos en la fermentacion.

1. EQUIPO DE FERMENTACrON

EI equipo utilizado es un «Microferm Fermentor»de la serie MF-100, fabric ado por la compaiiia New

Brunswick Scientific (7), diseiiado para cultivocontinuo y por lotes, y equip ado con sistemas decontrol de pH, temperatura y velocidad deagitacion. EI fermentador esta ubicado en elDepartamento de Farmacia de la UniversidadNacional.

Las condiciones anaerobicas son alcanzadasmediante la alimentacion de nitrogeno gaseosoa traves de un filtro empacado con lana de vidrio;un filtro similar se utiliza para evacuar los gasesproducidos por la fermentacion. La agitacion esproducida por un impulsor de paletas planas ycuatro pantallas deflectoras. EI control de latemperatura se realiza mediante la adicion deagua fria 0 caliente, segun el caso. EI agua entrapor una de las pantallas y sale por la pantallaopuesta. Los gases producidos en la fermen-tacion pasan por un condensador ubicado en latapa del fermentador.

2. FERMENTACION ACETOBUTiLlCA

2.1 PREPARACI6N DEL MEDIO.

Las fermentaciones se realizan con medio fermen-tativo (Tabla 1),a partir de un prein6culo preparadocon medio similar.

La preparacion de medio se realiza mediante elsiguiente procedimiento:

62 Ingenieria e Investigaci6n

Evnluocion de 10 produccion de gases en 10 fermentation acetobutdico

Tabla 1-Composici6n del medio empleado en 10

fermenlaci6n, (11).

Miel de cana 130 9K2HP04 1,8 9PABA (acido p-aminobenzoico) 3 mgExtracto de levadura 5 9Fuente de minerales 4 mIAgua, en cantidad suliciente para... 900 mI

Fuente de minerales:

NaMo4.2H20CUS04·5H20CoC12·6H20MgS04·H20CaC12.2H20H2S04 concentradoFeCI36H20Agua, cantidad sullclente para ..

2,41,70,2411,5282,71000

99999ml9ml

La melaza se disuelve en agua destilada y secentrifuga a 2000 rpm. durante 20 minutos, con elpropcsito de eliminar los solidos suspendidos.Simultaneamente se disuelve K2HP04 en aguadestilada. Entonces se adicionan al sobrenadante,extracto de levadura, acido p-aminobenzoico yminerales. Los recipientes con el medio son selladoscon papel de aluminio y esterilizados en el auto-clave a 103,388 kPa (15 psig) durante 20 minutos.Finalmente se mezclan los fosfatos con la miel ylos nutrientes en condiciones esteriles,

2.2 ACTIVACI6N DE LA CEPA.

La activacion de la cepa se realiza mediante elsiguiente procedimiento:

Se esterilizan en el autoclave diez tubos deensayo, preferiblemente roscados, con sus tapas amedio ajustar. Posteriormente, en un area esterilse adiciona a los tubos medio vegetativo hasta lamitad de su volumen. La composicion de este medioes similar a la del medio fermentativo (Tabla 1),pero con 80 g de miel de cafia, en lugar de 130 g.Entonces, se agrega a cada tubo, perfectamenteagitado, medio de cultivo con esporas de Clostri-dium acetobutylicum DSM 1732 silvestre, en unaproporcion de una parte de esporas y nueve demedio puro. Para garantizar condiciones anaero-bicas, antes de tapar los tubos se vierte parafinafundida en cada uno. AI solidificar, la parafinaforma un tap on sobre la superficie, que impide el

paso del oxigeno (aire). Finalmente los tubos sonsellados.

Los tubos perfectamente cerrados, despues deser introducidos durante 2,5 minutos en unrecipiente con agua en ebullicion y luego en otrorecipiente con agua fria, son llevados a unaincubadora a 37 'C. Veinticuatro horas mas tardeaproximadamente, y como consecuencia de la pro-duccion de gases,la parafina se levanta de la super-ficie del medio, indicando la activacion de la cepa.En este caso puede apreciarse un cambio de colordel medio, desde cafe hacia amarillo. Por el contra-

. rio, si despues de 30 horas no se observa produc-cion de gases, la cepa debe someterse a un nuevochoque termico.

Una vez activada la cepa, debe mantenerse enestas condiciones mediante repiques cada 24 horas.Los repiques consisten en un cambio de medio conesporas a los tubos, en la proporcion de 1 parte deesporas y 9 de medio puro. Antes de cambiar elmedio, los tubos son agitados hasta lograr homoge-neidad. Entonces, despues de retirarles una buenacantidad de medio fresco y adicionarles parafinafundida, son tap ados y transportados a la incu-badora. Los repiques se hacen cada 24 horas,tiempo requerido para alcanzar la fase exponencialde crecimiento del microorganismo, caracterizadapor una gran produccion de gases.

2.3 PREPARACI6N DEL PREIN6cULO.

El volumen disponible del fermentador es 12litros,distribuidos en 10,8litros de medio puro y 1,2litrosde medio con celulas activas (preinoculo). Estascantidades corresponden a una relacion volumenesde 9:1.

Inicialmente se preparan en un matraz 120 mlde medio vegetativo; la composicion de este medioes similar a la del medio fermentativo (Tabla I),pero con 80 g de miel de cafia en lugar de 130 g.Posteriormente el matraz con medio vegetativo esinoculado con la cepa activa contenida en uno delos tubos.

Entonces, en un matraz de 2litros se preparan1,1 litros de medio fermentative (rabla 1) y seprocede a inocularlo con 120 ml del matraz concelulas en su fase exponencial de crecimiento.Dumar y Granados (5), establecieron un tiempo de20 horas para lograr la densidad adecuada parainocular el medio de fermentacion, El medio secalienta en el fermentador hasta la temperaturaoptima de crecimiento celular (37'C), antes de hacerla inoculacion.

Ingenierie e Investigeci6n 63

Evaluacion de 10 produccion de gases en 10 fermentacion ocetobutdica

Tabla 2.Condiciones de fermentaci6n, (1).

Volumen del medio de fermentacionVolumen preinoculo: volumen de medioTemperaturaVelocidad de aqitacion, (4,14)Flujo de N2 (para anaerobiosis)Tiempo de burbujeo de N2Volumen de cada mueslra Iiquida

2.4 CONDICIONES DE LA FERMENTACI6N.

En la Tabla 2 se presenta un resumen de lascondiciones de la farmentacicn.

2.5 TOMA DE MUESTRAS.

2.5.1 Muestras liquidas.Para la toma de la muestra liquida se usa un tubode vidrio (Figura 2) de 150 ml de capacidad, provisto

Toma demuestras

B

12 litros1:937 ·C200 rpm.2,1 Iitroslminuto15 minutos40 mt.

de tres entradas. Despues de conectar la linea Bdel tubo con el fermentador, se hace vacio con unajeringa de 50 ml a traves de la linea de gas. Latapa del tubo es un filtro empacado con lana devidrio. Una vez tomada la muestra, se sella conuna pinza la linea B conectada con el fermentador.EI tubo descrito tambien se puede utilizar para'inocular el fermentador a traves de la linea A. Lasmuestras liquidas son analizadas (1) para determi-narles pH, concentracion de celulas, concentracionde glucosa y solventes (1,6).

r;=== Inoculaci6nA

Linea de gas

Taparoscada

LineadeIfquido

Tubodevidrio

FIGURA 2.Tubopara la lorna d. mueslras liquidas (1)

64 Ingeni.,ria e Investigaci6n

Evcf uccion de 10 producrion de gases en 10 ferrnentocion oce1obutdico

2.5.2 MUESTRAS GASEOSAS.

Las muestras gaseosas se usan para analizar lacomposicion de los gases producidos durante lafarmentacion. Antes de tomar la muestra se deter-mina el caudal de gas. Para tomar la muestra secierra la salida de gas hacia los medidores de caudalmediante la valvula de dos vias (Figura 1).Entonces, mediante la valvula de dos canales, seconecta la botella tomamuestra con la atmosfera yse abren las dos valvulas de la botella.

Despues de llenar la botalla, a traves delembudo, con agua acidulada [20 % p/v de NaCI y0,5 % p/v de acido citrico, con el proposito deminimizar la cantidad de gas carbonico disueltoen elliquido (3)],se cambia la posicion de la valvulade dos canales y se conecta la botella con la lineade gas. Entonces, se desplaza el embudo haciaabajo para llenar la botella mediante des-plazamiento de liquido (esta operacion se realiza ala misma velocidad de produccion de gases en elfermentador).

Tan pronto como el gas desaloja elliquido de labotella, mediante una adecuada manipulacion delembudo, deben equihbrarse los niveles del

improvisado manometro formado con la mangueraflexible que conecta la botella con el embudo.Cuando se logra el equilibrio se cierran la valvulasde la botella, se cambia la posicion de la valvula dedos niveles, se desaloja el liquido presente en elembudo y se reemplaza la botella tomamuestra. EIanalisis de las muestras se realiza mediantecromatografia de gases (8,12).

2.6 DETERMINACI6N DEL CAUDAL DE GAS.

De acuerdo con Beloshitskii, Lanina y 8imulik (2),el metodo de la burbuja es uno de los mas precisospara la determinacion de pequefios caudales de gasentre 2 y 200 ml/minuto. Es un sistema sencillo(Figura 1), si se considera que solo requiere unabureta calibrada, un cronometro, solucion jabonosay una conexion en T para alimentar el gas a medir.Como el volumen y la concentracion de los gasesdependen de la temperatura y la presion, estas doscantidades se mantienen constantes durante lafermentacion con el proposito de obtener datoscemparativos. Ademas, en el analisis de una mezclade gases se tiene en cuenta que cada uno de loscomponentes de la mezcla ocupa el volumen total y

Valvulade dos vias

I0 1F======e::='@'~======~==Ent==rada d~

Medidoidedisco

Bureta

Perillaelastica

Soluci6nde looon

Valvuladedoscanales

Ioponinyectable

Botellotoma-

muestras

Embudode vidrio.

Mangueraflexible

FIGURA 1.Sistema de medicion de fluio y toma de muestras 9Q$80$05 (1)

Ingenieria e Investigaci6n 65

Evaluation de la produccion de gases en 10 fermentccion ccetobutilic o

Oonoentreotdn de oalu/as, g//itro

* -~

•......

,'" /'/"z-: + .

* [] + + •

1

0, 1o 4 8 12 16 20

Ttempo de termentscton: bores24 28

Fermenteolon 1

ill Fermenteokin ()

Fermenteoion 2

-- Fermenteolon 4

+

FIGURA 3.Cinetica de 10 fermentaci6n ocetobutilica. Crecimiento de biomasa (1)

que la suma de las presiones ejercidas por loscomponentes es igual a la presion total de la mezclagaseosa.

Para medir el caudal se humedece la bureta yse presion a la perilla hasta el punta en el cuallasolucion jabonosa alcanza la entrada de gas. Eneste momenta una de las burbujas formadas iniciasu ascenso y es necesario accionar el cronornetrocuando la burbuja cruza la marca inferior de labureta y detenerlo cuando la burbuja alcanza lamarca superior. EI caudal de gas es igual alvolumen entre las marcas de la bureta dividido porel tiempo requerido para recorrerlas. Ademas, deacuerdo con la magrritud del caudal a medir, lacapacidad de la bureta se puede escoger entre 10ml y 100 ml.

EI medidor de disco utilizado en la deter-minacion de caudales superiores a 100mUminuto,totaliza el volumen de gas producido durante lafermentacion y mantiene constante el nivel depresion en el fermentador. dado que perma-nentemente evacua el gas producido. La linea desalida de gas solo se cierra cuando se evalua el flujocon el medidor de burbuja 0 cuando se recogenmuestras gaseosas (Figura 1).

3. Resultados

. Las curvas de crecimiento celular (Figura 3)difieren en la fase de adaptacion, posiblementea causa de la variacion de la concenrracioncelular del preinoculo; la fase exponencial y lafase estacionaria son similares en los 4 ensayosinform ados.

- EI consumo del sustrato (Figura 4) representaentre el 75 y el 80% de la glucosa inicial. Porconsiguiente, en este caso, el sustrato no es unfactor limitativo de la fermentacion.

-.8i se considera que las fermentaciones fueronrealizadas en la fase de produccion de acidos (faseacidogenica) y no en la fase de produccion desolventes (fase solventogenica), correspondiente ala fase estacionaria del crecimiento, los rendi-mientos de sustrato en solventes (Tabla 3 y Figu-ras 5, 6 y 7) son bajos.

- En la composicion de los gases (Figura 9) sealcanzan valores de la relacion (moles COJ/(molesHJ menores que 1. Estos valores coinciden con los

66 Ingenieri" e Investigaci6n

Evu1uUC101l de 10 produccion de gases en 10 Ier mentccion ocetobutdica

Tabla 3. Rendimiento del sustrato en solventes y gases, (1).

Fermentacion YS/S P C02 H2 YG/S

Observaciones: A B C 0 E

1 0,084 0,17 0,58 0,42 0,18082 0,095 0,20 0,54 0,46 0,17723 0,064 0,14 0,72 0,28 0,26534 0,100 0,18 0,70 0,30 0,2960

conoentreaon ae glucOBa, g/Iltro7060

60

40802010

oo

A: YSIS: Rendimianto de sustroto an solventes,expresado como grames/litro de solventes porcoda g/I de glucosa consumida.

B: P: Productividad, expresada como 10 concen-troci6n de solventas producidos an groma/litropor coda hora de ferrnentccion.

resultados de Yerushalmi y Volesky (14). Ademas,se observa que esta relacion es siempre mayor que1 en la etapa final de la fase exponencial de creei-mien to. La fraccion molar de CO2 (Tabla 3) variaentre 0,72 y 0,54 y la correspondiente a H2 entre0,46 y 0,28. Estos valores concuerdan con losinform ados por Walton y Martin (18).

C. Frocci6n molar de CO2,

D: Froccion molar de H2•

E: YGIS: Rendimiento de sustroto en gases,expresado como gromos de gas producido porgromo de glvcoso consumido.

- El rendimiento de glucosa en gases (Figura 9 yTabla 3) varia entre 18 y 29,6 gram os de gasproducido por cada 100 g de glucosa consumida.Estos resultados confirm an la importancia de laproduccion de gases en el estudio de factibilidadtecnico-economica de la fermentacion acetobu-tilica.

<, + ~.rr~

"If.~

+ ·iIJ pt .

4 8 12 16 20ttomoo de termentector: bores

28

•FarmantBclon 1

FarmantBcldn 8

24

rermenteaon 2---&- Farman teadn 4

+

FIGURA 4.Cinetica d. 10 fennentac;.,n ac.lobutfliea. Consumo d.1 suslralo (1)

Ingenieria e Investigacion 67

Evoluocion de 10 produccion de gases en 10 fermentacion ocetobuttlica

Oonoentrecton de butanol, g/Iltro3,5

3

2,6

21,5

1

0,6

oo

0

V 00

./ +

/ f+-v+ w

/ 0

~-

".« •••4 8 12 16 20

Ttempo de termenteoton, bores24 28

o Fermentacl6n 1

Fermenteckin 3

+ Fermenteoton 2

~ Fermanfaclon 4•FIGURA 5.

Cine-tica de 10 fermentacion acetobutflica. Producci6n de solventes: butanol (1)

concentrecton de ecetone, g/I/fro1,61,41,2

10,8O,tl0,40,2o

o

..

+

0 0 0

+ •• l..---"'""

... .»:"/' v.

. -'- +,v.0 •- ~ .

4 8 12 te 20ttemoo de termentector; bores

24 28

Fermenteoton 1

Fermentecldn 3

+ Fermenteoton 2

• ~ Fermentsclon 4FIGURA 6.

Cinetica de la fermentacion acetobutilica. Producci6n d. solventes: acetona (1)

68 Ingenierio e Invesligoci6n

,Ooncentrecton de eteru», a/tttro

0,4+ IT. .

-+ +

+ .:+ -=F + ~ • •~ • •~-..-l~ ..

V c->

0,3

0,2

0,1

oo 4 8 ,2 16 20

Ttempo de termentsaon. nores24 28

FermenteD/on 1

• Fermenteckin 3

+ Fermentecton 2

-- Fermontecton 4FIGURA 7.

Cinetica d. 10 fennentacion acetobutilica. Produccion de solventes: etanol (1)

Oeude), (m/ de (}as)lm/nuto250

50

Ii I'... •

/: ~•~. I- + !J" ••v: Ii <,

~ I I.•

/ + '<; . I~

I, •1/ t+ +~. Ii ft- .

200

150

100

oo 4 8 12 16 20

ttemoo de termentecton, bores24 28

,Fermenta%n 1

Ii FermentaD/an 9

+ Fermenteoton 2

-e-- FermenteD/on 4FIGURA 8.

Cinetica de la fermenlaci6n acelobulflica. Praducci6n de ga ... : H, y CO, (1)

Ingenieria e Investigacion 69

Evoluocion de 10 production de gases en 10 fenncntacion ccetobunlico

,/Oompostctori de los gases, mol C02/mol H220

8

./

/- /)

• • /' •..... - . 0+ • + • + . +

16

12

4

oo 4 8 12 16 20

Ttempo de termenteoon; bores24 28

Fermenteckin 1

Fermentacldn (3

,Fermentscton 2

-e-- Ferment8cJon 4

+

•FIGURA 9.

Com posicion de los gases producidos en la fermentacion acetobutflica.Relacion malar: (males CO,I/(males H,l, (11

70 Ingen;eria e Investigaci6n

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