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INFORME TÉCNICO

ANISOLES Y BRETTANOMYCESCausas, efectos y mecanismos de control

ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA ...................................7

CONTROL DE CALIDAD DE LOS LOTES DE TAPONES NUEVOSPARA PREVENIR EL RIESGO DE CONTAMINACIÓN POR CLOROANISOLES......................................20

ORIGEN Y BIOSÍNTESIS DE TCA EN EL CORCHO:MECANISMOS MOLECULARES EN EL HONGO TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM..............33

MÉTODO ROSA PARA LA REDUCCIÓN DE TCA EN EL TAPÓN DE CORCHO ......................................... 81

LA CONTAMINACIÓN DE LOS VINOS POR BRETTANOMYCES DURANTE LA VINIFICACIÓN Y LA CRIANZA ..................................................87

COMPARATIVA ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO DE BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA CHARDONNAY .........................................97

PRETRATAMIENTO DE DATOS EN ANALISIS SENSORIAL...............................107

Ind

ice

ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUEN-CIA DE LA PRESENCIA DE ANISO-LES EN EL MUNDO VINÍCOLA

Cloroanisoles y Bromoanisoles resultan de la susti-tución del núcleo llamado “anisol”, presente en grannúmero de moléculas volátiles y odoríferas, porambos halógenos. Esta modificación de la estructuramolecular da lugar a una molécula de característicasorganolépticas de carácter “mohoso” y de granpotencial contaminante para la industria alimentariay en concreto la vinícola.En este documento encontraremos el origen y lasconsecuencias de dichas contaminaciones en elvino.

Pascal CHATONNET

Laboratoire EXCELLMERIGNACFrancia

Informe Técnico 9

Introducción

La estructura química metoxibencil, correspondien-te al núcleo llamado "anisol", está presente en ungran número de moléculas volátiles y a menudoodoríferas. Estas diversas moléculas están muypresentes en la naturaleza, y en especial en el

entorno vinícola. La sustitución del núcleo anisol por átomosde cloro o de bromo para originar haloanisoles da lugar a laformación de una molécula con propiedades organolépticasparticulares. En un contexto vinícola, estas moléculas secaracterizan concretamente por olores relativamente des-agradables, que evocan el carácter "mohoso". Además, ensu mayoría presentan umbrales relativamente reducidos dedetección olfativa. Estas características confieren a los halo-anisoles en su conjunto un potencial contaminante conside-rado muy serio por el sector. En este trabajo, estudiamoslas principales moléculas de cloroanisoles y de bromoaniso-les que se pueden encontrar en el mundo vinícola, indican-do, para cada una de ellas, tanto su origen como sus conse-cuencias en la calidad de los caldos.

1- Los cloroanisolesEn los vinos, los olores con carácter "mohoso" son uno delos defectos organolépticos más desagradables y más seve-ramente juzgados tanto por los catadores expertos comopor los consumidores. Se han identificado diversas molécu-las que transmiten ese aroma desagradable a los caldos.Entre ellas, los cloroanisoles, y en especial el 2,4,6-tricloroa-nisol (TCA) y el 2,3,4,6-tetracloroanisol (TeCA) constituyenlos compuestos identificables con mayor frecuencia en los

vinos considerados "mohosos" o "con sabor a corcho" en lacata.2,4,6-tricloroanisol (TCA) 2,3,4,6-tetracloroanisol (TeCA) pentacloroanisol

Índole, origen y consecuencia dela presencia de anisoles en elmundo vinícola

10 Anisoles y Brettanomyces

(PCA)

Figura 1 - Principales cloroanisoles considerados contaminantes

de los vinos y responsables de los defectos tipo "mohoso".

El carácter "con sabor a corcho", que indica una contamina-ción procedente del tapón de corcho utilizado tradicional-mente para el taponado de las botellas, se aplica equivoca-damente con frecuencia, pese a ser cierto que,efectivamente, el cor-cho procedente de lacorteza del alcorno-que (Quercus suber)puede transmitir TCAa los caldos si lacalidad de la materiaprima o el procesode fabricación de lostapones no sonsatisfactorios(Tanner et al., 1981,Buser et al., 1982,Tanner et Zannier, 1983). El lavado con cloro, largo tiempoutilizado por los corchotaponeros, era un factor agravante,pero en ningún caso una causa de contaminación del cor-cho por el precursordirecto del TCA: el2,4,6-triclorofenol(TCP). El abandonode ese método en laactualidad no porello ha suprimido lacontaminación delos tapones, lo cualdemuestra clara-mente que el origende la contaminacióndel corcho es múlti-ple, y no obedeceúnicamente a unacontaminación inicialde la materia primapor TCP.Ulteriormente a suabandono, se hapodido identificar otras fuentes de contaminación por cloroa-nisoles. Y es que el corcho es un material da estructuramicroporosa rica en lípidos que puede fijar fácilmente loscontaminantes presentes en fase gaseosa en la atmósferade almacenamiento; tapones nuevos indemnes de contami-nación pueden acabar contaminados a niveles molestos sihan permanecido almacenados en dependencias contamina-das (Chatonnet et al., 1994, Chatonnet et Labadie, 1995).El pentacloroanisol (PCA), poco oloroso (umbral de percep-ción > 50 µg/l), y sobre todo el 2,3,4,6-tetracloroanisol(TeCA), son moléculas procedentes de la degradación bioquí-

mica de algunos plaguicidas a base de 2,3,4,6-tetraclorofe-nol (TeCP) o, más frecuentemente, de pentaclorofenol (PCP)que contiene TeCP como impureza (entre un 10 y un 15 %de TeCP en el PCP técnico industrial). La metilación de losclorofenoles debida a una actividad O-metilasa, frecuente ennumerosísimos microorganismos y en especial en losmohos existentes en las bodegas, produce el cloroanisol

correspondiente (figura2). A partir de una molé-cula poco volátil y prácti-camente inodora, seobtiene un cloroanisolque se transmite fácil-mente a la atmósfera yque resulta muy malolien-te. Estos compuestostambién pueden contami-nar el caldo sin que éstehaya entrado en contactocon corcho (Dubois et

Rigaud, 1981, Chatonnet et al., 1994). Los mecanismos dedegradación de estos precursores y las condiciones de con-

taminación a distancia,por vía de la atmósfera,han sido descritos deta-lladamente (Chatonnet etal., 1994). Resulta suma-mente fácil la contamina-ción del vino durante sumanipulación al aire, suconservación en recipien-tes microporosos (barri-cas) o por contacto conmateriales contaminadosindirectamente (taponesde silicona, madera delas barricas, bentonita,colas, tapones de cor-cho…).El uso inconsiderado deproductos de desinfec-ción a base de sales de

hipoclorito también puede causar la contaminación de losmateriales orgánicos (en especial la madera) que están encontacto con el caldo o del ambiente de la bodega tras laformación química de TCP (Burtschell et al., 1959) y sudegradación por ciertos hongos filamentosos (Maujean etal., 1985, Álvarez-Rodríguez et al., 2002). La utilización delcloro es indeseable para la limpieza y desinfección de cual-quier material poroso o microporoso, incluido el cauchonatural utilizado para la fabricación de canalizaciones flexi-bles o de ciertos tapones para el cierre de las piqueras delas barricas.

ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LAPRESENCIA DE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA

Figura 2 - Metilación bioquímica del 2,3,4,6-tetraclorofenol en 2,3,4,6-tetracloroanisol

Figura 3 - Formación de 2,4,6-triclorofenol por cloración química a partir desolución clorada situada en un entorno ácido y al entrar en contacto connúcleos fenilos

Informe Técnico 11

La reacción del cloro con el látex o los sedimentos de poli-fenoles produce químicamente TCP que se acumula en elpolímero y que posteriormente se puede degradar bioquími-camente generando TCA (figura 3). Por el contrario, las sili-conas son insensibles a la acción del cloro. La formaciónde tetra y de pentaclorofenol por esa misma reacción sólose puede producir con pH inferiores a 6, pero siempre eslimitada debido a la polaridad del medio de reacción(Noilet, 1996).El TCA tiene un umbral de detección olfativa relativamentebajo (300 pg L-1 en el agua, según Curtis, 1972; o 30 pg L-

1 según Griffiths, 1974). Dependiendo del tipo de caldos,las alteraciones del olor y sobre todo del aroma retroolfati-vo son significativas entre 1,5 y 3 ng L-1 (Duerr, 1985). El análisis de las primeras muestras de vinos contamina-dos por TeCA en la época en que se empezó a tomar seria-

mente en cuenta el problema en el mundo vinícola se realizósobre muestras que presentaban niveles de contaminaciónsumamente altos (varios µg/l) y se sobreestimó en buenamedida los umbrales de alteración (CHATONNET et al.,1994). Se sospechaba entonces que el TeCA contaminabalos caldos a partir de 150 ng/l. En realidad, aunque en efec-to el TeCA es menos oloroso (4 ng L-1 en el agua segúnCurtis, 1972) que el TCA, actualmente se detectan alteracio-nes notables a partir de 10-15 ng L-1 en los vinos tranquilosy de menos de 5 ng L-1 en los vinos espumosos(Chatonnet et Labadie, 1995).En todos los casos de contaminación atmosférica de labodega - atmósferas a menudo húmedas y cerradas - la eli-minación de la contaminación exige ante todo la identifica-ción exhaustiva y previa de las fuentes contaminantes y sueliminación. El aumento de la ventilación de las estancias

Tabla 1. Contenidos de halofenoles y haloanisoles en diversos vinos alterados por un carácter "mohoso" en la cata.Evidencia de la presencia de TBA

MUESTRAS DE CALDOS( NG L-1 )

123456789101112131415161718192021222324252627282930

TCA

ndndndndndndndndndndndndndnd

trazas2,9ndnd2,6

trazastrazas

ndndndndndndndndnd

TCP

11,5ndndnd

trazasnd

trazasndnd6,57,68,57,15,4

trazastrazastrazas12,317,121,572,014,3trazas

ndtrazas11,764,63,2

trazasnd

TeCA

ndndndndnd

trazasndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndnd

TeCP

ndnd

22,413,271,07,56,9ndndndndndndndndndndndnd

23,9ndndnd

27,0ndndndnd

59,2nd

PCA

trazasnd

trazasnd

trazastrazastrazastrazastrazastrazas

ndtrazas

ndtrazas

ndtrazas

ndtrazastrazastrazas

ndndndndndnd

11,0122,9trazas

nd

PCP

16,8113,519,533,78,3

675,4147,648,0ndnd

40,228,5ndnd

trazastrazas

nd8,329,845,210,712,9nd

87,7nd

23,7nd

38,081,2nd

TBA

12,934,42,13,912,12,212,00,02,5

trazas12,326,713,19,126,117,93,8nd3,56,3nd

13,716,812,837,928,34,04,06,56,3

TBP

68,517,8trazas8,35,4

252,867,068,311,17,237,131,313,414,632,436,17,53,637,418,8trazas43,5104,178,2108,1100,89,630,1392,644,9

TeBP

ndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndnd

PBP

ndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndndnd

nd: nd < DL trazas: > DL, < QL


siempre es deseable, pero no necesariamente suficiente.Todo depende del caudal de contaminantes emitida por la olas fuentes. La climatización de los locales a menudo agra-va la contaminación del aire al reducir la renovación de laatmósfera; la introducción de aire fresco es pues una nece-sidad imperiosa en las estancias destinadas al almacena-miento de vinos a granel.2- Los bromoanisolesSe ha recurrido mucho a los cloroanisoles para explicar lapresencia de defectos de carácter "mohoso" en los vinos.Ahora bien, existen algunos caldos que presentan exacta-mente el mismo tipo de defecto organoléptico en la catapero que no contienen cantidades suficientes de cloroani-soles para explicar la presencia de un carácter "mohoso".Soleas et al. (2002) señalan que en el control de un grannúmero de muestras de vinos, sólo una fracción menor(27 %) contenía una cantidad significativa de TCA (> 2 ngL-1). No obstante, estos autores no han procedido a ladosificación de los TeCA; por lo tanto no permiten una cer-teza concluyente sobre la intervención de otros cloroaniso-les.La investigación y la dosificación exhaustiva de los diver-sos cloroanisoles en un número suficientemente importan-te de vinos comparativamente sospechosos tras su cataen nuestro laboratorio nos ha permitido identificar clara-mente situaciones que conducen a una frecuencia de alte-ración elevada sin que se pueda detectar o cuantificar TCAo TeCA a un nivel suficientemente alto para poder comuni-car un defecto.Por primera vez, hemos evidenciado la presencia de 2,4,6-

tribromoanisol (TBA) (figura 4) en caldos significativamente"mohosos" pero que no contenían cantidades suficientesde cloroanisoles para comunicar un defecto. Esta nuevaforma de contaminación se ha podido demostrar en vinoscon o sin contacto directo con materiales susceptibles dehaberlos contaminado por contacto directo (Chatonnet etal., 2004). Se ha especificado el umbral de percepción ylas condiciones de contaminación de los vinos en el trans-curso de su elaboración, almacenamiento o crianza.

2.1- Identificación y aislamiento del 2,4,6-tribromoanisol en

caldos que presentan un carácter "mohoso" en la cata.La tabla I presenta el resultado de la dosificación de diver-sos cloroanisoles y clorofenoles, considerados contami-nantes clásicos de los vinos que presentan un defecto decarácter "mohoso", así como del TBP y del TBA. Conexcepción de algunas muestras que contienen un conteni-do reducido de TCA, los vinos seleccionados en este traba-jo son en su mayoría pobres (cantidades dosificadas infe-riores al umbral de alteración) o incluso carentes decloroanisoles (< límite de cuantificación). Se observa quela intensidad relativa del defecto "mohoso", medida sobreuna escala arbitraria de intensidad de 0 a 5, presentauna correlación significativa (p< 0.05) con el contenido deTBA del vino y no con los demás cloroanisoles estudiados(figura 5). En los casos de fuerte contaminación por TBA(> 20 ng L-1), además de un intenso carácter "mohoso",los vinos presentan un carácter "fenólico" y "yodado"más o menos intenso. Este defecto se percibe fundamen-talmente en la cata del vino, en retro-olfato, y persistelargo tiempo en boca. El olor evoca el del TBP, pero laintensidad del defecto no está vinculada de forma eviden-te con las concentraciones dosificables en los caldos.Además, el contenido de TBA de los vinos tampoco estácorrelacionado significativamente con el TBP dosificable

ÍNDOLE, ORIGEN Y CONSECUENCIA DE LA PRESENCIADE ANISOLES EN EL MUNDO VINÍCOLA

Figura 4 - estructura molecular del 2,4,6-tribromoanisol (TBA)

Figura 5 - Relación entre la intensidad relativa del defecto "moho-

so, con sabor a corcho" en vinos que no contienen o contienen

pocos cloroanisoles pero sí 2,',6-tribromoanisol

Informe Técnico 13

en esos mismos caldos, lo cual hace pensar que la trans-formación del TBP no se lleva a cabo en el vino, sino queprocede de una contaminación externa. A diferencia delpentabromofenol, del tetrabromobisfenol A (TBBPA) y delos éteres difenilpolibromados (polibrominated diphenylethers, PBDEs), moléculas utilizadas masivamente comoignífugos (Brominated Flame Retardants, BFR) que podrí-an ser perturbadores endocrinos (Ilonka et al., 2000), elTBA y el TBP no parecen tener una toxicología severa enlas concentraciones medidas.El TBA se ha identificado como un contaminante pre-sente en trazas en la fauna marina y en cier tos sedi-mentos marinos (Miyazaki et al., 1981; Watanabe etal., 1983) y en la atmósfera (Wittlinger andBallschmiter, 1990). El TBA deriva de su precursordirecto, el TBP, tras su O-metilación por microorganis-mos bacterianos (Allard et al., 1987). El TBP está pre-sente en estado natural en numerosos organismosmarinos (Whitfield et al, 1992a, Whitfield et al., 1992b, Whitfield et al., 1988, Boyle et al., 1992, Whitfieldet al., 1995) y concretamente en cier tas algas quepueden sintetizar de novo el TBP a par tir de los bro-

muros de contenidos en el agua de mar, mediante unequipo enzimático específico (Flodin and Whitfield,1999).El TBA es conocido por causar potentes defectos decarácter "mohoso" y "terroso" en la fruta embalada encajas contaminadas por TBP degradado en TBA porPaecelomyces variotii (Whitfield et al., 1997), unhongo filamentoso también conocido por su capacidadde transformar el TCP en TCA por O-metilación (Tindaleet al., 1989). Wylie (1997) también señala la presen-cia de TBP y de TBA en peras, aun cuando no se utili-cen dichos productos en las huer tas. Hoffman etSponholz (1997) también han señalado la contamina-ción indirecta de productos farmacéuticos a través deobturadores de polietileno contaminados por contactode la madera de los palets impregnados de TBP. Porúltimo, se sabe que el TBA en estado de trazas causaeste mismo tipo de defecto organoléptico en las redesde abastecimiento de agua (Lahoussine, 2000,Malleret and Bruchet, 2001, Malleret and Bruchet2002).Los umbrales de percepción del TBA contenidos en el

agua son sumamente bajos. Saxby et al (1982) hanmedido un umbral de 8 pg L-1; Whitfield et al. (1997)20 pg L-1; Malleret y Bruchet (2002) un umbral de 30pg L-1. Estos umbrales convier ten al TBA en uno delos contaminantes más potentes de todos los identifi-cados; su potencial de perjuicio es parecido al delTCA, cuyo umbral de percepción en el agua tambiénes próximo a 30 pg L-1 (Grif fiths, 1974). En el casodel vino, solución hidroalcohólica ácida (pH 3,5 a 4,0)que contiene entre un 10 y un 15 % vol. de etanol, losumbrales que hemos estimado en un 50 % de loscatadores (entrenados pero no expertos) en un medio

modelo (Pt) o en un vino estándar (Rt) arrojan valoresclaramente más altos. El umbral de percepción Pt a: 50% se estima en 3.4 ng L-1 y el umbral de recuperaciónRt a: 50 % en 7.9 ng L-1 (figura 6). Estos resultadosson compatibles con las catas de los vinos sospecho-sos estudiados en este trabajo (tabla I), pero es posi-ble que el TBA altere la calidad y la tipicidad de los cal-dos por debajo de su umbral de detección o deidentificación (umbral de recuperación).El TBP se puede formar químicamente en las aguas tra-tadas con cloro en presencia de iones bromuro y de tra-zas de fenoles orgánicos. El cloro puede oxidar los

Figura 6 - Estimación del umbral de percepción y del umbral de recuperación del TBA


iones bromuros, liberando bromo que se puede combi-nar rápidamente con muchos contaminantes orgánicosy producir, además de clorofenoles, bromofenoles y bro-moclorofenoles (Patnaik et al., 2002). En presencia dehipoclorito de sodio y de radiaciones UV, los bromurospresentes en las salmueras pueden formar 2-bromo-2-metilfenol capaz de comunicar un potente olor "fenóli-

co" o "químico" identificable en algunos quesos Gouda(Mills et al., 1997). En el presente estudio no se hainvestigado ese compuesto, pero tal vez pueda explicarel carácter "yodado" y de "fenol" observado en algunoscaldos además del carácter "mohoso".2.2- Origen de la contaminación de los vinos por TBA El análisis de las diversas muestras de vinos tintos


Tabla 2. Análisis de diversas atmósferas de bodega por atrapado estático en kits EXCELL

ATMÓSFERA( NG G-1 ABSORBENTE)

12345

TCA

ndndndndnd

TCP

ndndndndnd

TeCA

ndndnd5464

TeCP

2ndnd52

PCA

15ndnd

210393

PCP

17928263010

TBA

26725200

TBP

nd14812

TeBP

ndndndndnd

PBP

ndndndndnd

nd: nd < DL trazas: > DL, < QL

Tabla 3. Características físico-químicas de los halofenoles y haloanisoles (Fuente: PhysProp Database Syrres Inc. (2003))

MOLÉCULA[ NºCASR]

TCA [87-40-1]

TCP [88-06-2]

TBA [607-99-8]

TBP [118-79-6]

TeCA [938-86-3]

TeCP [58-90-2]

PCA [1825-21-4]

PCP [87-86-5]

PUNTO DEEBULLICIÓN

° C760 MM Hg

241

246

298

286

-

232

-

309

PUNTO DEFUSIÓN

° C760 MM Hg

61

69

88

95

84

70

108

174

Presiónde vapor

10-3.mm Hg

0,228

2,500

0,644

0,303

3,190

0,666

0,592

0,110

LOG P

OCTA-NOL/AGUA

4,11

3,69

4,74

4,18

4,65

4,09

5,29

SOLUBILIDADEN AGUA

MG L-1

10,0

800,0

1,0

70,0

1,4

23,0

0,4

14,0

CTEDE HENRY

130,000

2,600

20,200

0,035

96,100

8,840

1930,000

0,025

cuyas condiciones de vinificación y de almacenamientoen diversas bodegas ha permitido evidenciar variosmodos de contaminación de los caldos. Al igual que loscloroanisoles derivados del PCP y del TeCP capaces decontaminar indirectamente los vinos a distancia a tra-vés de la atmósfera (Chatonnet et al., 1994, Chatonnetet al., 1995), se ha detectado TBA procedente a todasluces de la degradación microbiológica de TBP en laatmósfera de diversas bodegas. Los ambientes conta-minados por derivados del PCP y del TeCP no contienen

derivados del TBP y viceversa; nunca se ha identificadoTeBP ni PBP en los casos estudiados (tabla III). Las características físico-químicas de estos contaminan-tes (tabla III) explican que, pese a sus puntos de ebulli-ción elevados, los halofenoles y haloanisoles considera-dos se puedan encontrar tan fácilmente en lasatmósferas de estancias que contienen fuentes de emi-sión de dichas moléculas. Todos los contaminantes encuestión tienen una hidrofobia similar (log P). La escasapresión de vapor saturado de TeCA explica la facilidad de

En la bodega A (tabla IV), tanto los vinos conservados endepósito de acero inoxidable, libre de cualquier traza decontaminación, como los conservados en barricas que hanacumulado contaminantes pueden presentar altos niveles

de contaminación. En este caso, el TBP poco volátil emitidopor una fuente contaminante primaria se degrada microbioló-gicamente en TBA, más volátil y maloliente, que pasa fácil-mente al aire. El vino manipulado en ese ambiente puede

Informe Técnico 15

(ha) parte externa del material, con espesor de 0-3 mm nd: < DL trazas: > DL, < QL

Tabla 4. Concentración de halofenoles y haloanisoles en las atmósferas y en diversos materiales de la bodega (A)

disolver los contaminantes presentes en la fase gaseosa, ocontaminarse indirectamente por contacto con los materia-les porosos fácilmente contaminados con los que está encontacto directo (madera de las barricas).En la bodega B (tabla V), la fuente que originaba contamina-ción fue suprimida varios años antes, pues en esa bodegasólo quedan barricas que no estaban contaminadas a su lle-gada. Aún así, todavía se puede detectar la presencia decantidades notables de TBA en la atmósfera. Los contami-nantes residuales, adsorbidos por la estructura microporosade la bodega recubierta de ladrillo de tierra, que representauna considerable superficie desarrollada de intercambio, sevolatilizan poco a poco en el aire.En la bodega C (tabla VI), los vinos criados en barricassufren una fuerte contaminación por TBA y TBP. La concen-tración de contaminantes en el vino aumenta regularmentecon la edad de las barricas, es decir con el tiempo quepasan en esta bodega; el grado de contaminación de lamadera de las barricas aumenta en el mismo sentido. Perola contaminación de los vinos también debe proceder de lostapones de silicona utilizadas para obturar las piqueras,pues éstos se encuentran en contacto directo con el vino.Igual que ocurre con los cloroanisoles, los materiales plásti-cos en general y las resinas elastómeras de silicona en par-ticular pueden adsorber fácilmente el TBA, y en menor medi-da el TBP, igual de hidrófobo pero menos volátil (menorpresión de vapor saturado y constante de Henry mucho másalta). El material a base de polietileno o de poliéster, las jun-tas de caucho vulcanizado y los tapones de silicona de las

barricas pueden fijar fácilmente los contaminantes del aire ycederlos después a los caldos. El análisis de diversos mate-riales en contacto con la atmósfera de esta bodega permitedemostrar que los elementos estructurales de madera sehan impregnado masivamente de TBP que se degrada pro-gresivamente en TBA debido a la acción de la microfloraambiente. Además, algunas pinturas contienen TBP en suformulación.Más difícil de explicar resulta el análisis de los vinos enbotellas taponadas y contaminadas por TBA y, en ciertoscasos, por TCA (tabla VII). Y es que en esta fase del proce-so, ya no se sabe si la alteración del caldo se ha producidode resultas de la contaminación de los tapones almacena-dos en una atmósfera contaminada antes de su la utiliza-ción (en las depedencias del corchotaponero o del usuario),o si, como en el caso descrito para los TCA, la contamina-ción se debe a un tapón contaminado por TBA formado ensitu en el corcho. Es obvio que evidencia de la presencia deimportantes cantidades de contaminantes en tapones depolietileno extrusionado (PET) almacenados en un ambienteviciado demuestra que es posible una contaminación aeroló-gica de los obturadores a gran distancia, a través de laatmósfera y de los embalajes, igual que en el caso de lostapones de silicona estudiados más arriba. Este resultadose debe considerar asimismo a la luz de las observacionesde Whitfield et al. (1997) sobre el TBA y el TCA en láminasde envasado de PET, y de Hoffman and Sponholz (1997) entapones PET roscados almacenados sobre palets de made-ra tratados con TBP. Ahora bien, no sabemos en qué propor-

MATERIALES

Atmósfera de bodega(en ng g-1 adsorbente)Bodega de cubasBodega de barricas

Caldos guardados en la bodega(en ng L-1)Guardados en cubas de acero inoxidableGuardados en barricas de 12 meses de antigüedad

Fuentes de contaminación potenciales (ha)

(en ng g-1)Barricas de roble de 12 meses de antigüedadBarricas de roble de 14 meses de antigüedad

Estructura de madera nueva de la bodega decubasEstructura de madera antigua de la bodega decubas

TCA

ndnd

ndnd

ndnd

nd

nd

TCP

ndnd

nd3

ndtrazas

nd

nd

TeCA

ndnd

trazasnd

ndnd

nd

nd

TeCP

ndnd

87

ndnd

nd

nd

PCA

ndnd

trazastrazas

ndnd

nd

nd

PCP

ndnd

675148

trazas6

nd

nd

TBA

46162

212

143224

nd

33

TBP

134

25367

9021158

nd

835

TeBP

ndnd

ndnd

ndnd

nd

nd

PBP

ndnd

ndnd

ndnd

nd

nd



Tabla 5. Concentración de halofenoles y haloanisoles en las atmósferas y en diversos materiales de la bodega (B)

MATERIALES

Atmósfera de bodega(en ng g-1 adsorbente)Bodega subterránea 1Bodega subterránea 2

Caldos guardados en la bodega(en ng L-1)Guardados en bodegas de barricas nuevas1+2

Fuentes de contaminación residual (ha)

(en ng g-1)Bodegas de suelo de tierra 1+2Bodegas con paredes de hormigón 1+2Bodega con paredes de ladrillo 1

TCA

ndnd

nd

ndndndnd

TCP

ndnd

5

ndndndnd

TeCA

ndnd

nd

ndndndnd

TeCP

ndnd

8

ndndndnd

PCA

ndnd

nd

ndndndnd

PCP

ndtrazas

trazas

ndtrazas

ndnd

TBA

15122

13

ndtra-zas2

TBP

tra-zas15

78

ndtra-zas

TeBP

ndnd

nd

ndndndnd

PBP

ndnd

nd

ndndndnd


Tabla 6. Concentración en halofenoles y haloanisoles en las atmósferas y en diversos materiales de la bodega (C)

MATERIALES

Atmósfera de bodega(en ng g-1 adsorbente)

Caldos guardados en la bodega(en ng L-1)Guardados en barricas nuevasGuardados en barricas de 12 meses de antigüedadGuardados en barricas de 24 meses de antigüedad

Fuentes de contaminación residual (ha)

(en ng g-1)Barricas de roble nuevas (9 meses en la bode-ga)Barricas de roble de 12 meses de antigüedadBarricas de roble de 24 meses de antigüedadBarricas de roble de 36 meses de antigüedadSoportes de barricas Tapones de silicona

Estructura de madera de la bodega:Parte superficial (0-3 mm)Parte interior (3-15 mm)Barniz

TCA

nd

ndnd

nd

ndndndndndnd

ndndndnd

TCP

tra-zas

nd4

12

ndndtra-zastra-zasndnd

nd

TeCA

nd

ndnd

nd

ndndndndndnd

ndndndnd

TeCP

trazas

ndnd

nd

ndndndndndnd

ndndndnd

PCA

nd

ndnd

nd

ndndndndndnd

ndndndnd

PCP

nd

ndnd

nd

tra-zastra-zas6

tra-zastra-zasnd

TBA

190

1338

28

22143224197321851337

234201tra-zas

TBP

38

78108

101

2409021158294313127

57

8236396339

4933

TeBP

nd

ndnd

nd

ndndndndndnd

ndndndnd

PBP

nd

ndnd

nd

ndndndndndnd

ndndndnd


Informe Técnico 17

ciones pueden migrar al vino los contaminantes adsorbidospor el PET.2.3- Origen del TBP en los ambientes vinícolasLos casos de contaminación de caldos por TBA y TBPevidenciados en este trabajo proceden a todas luces deelementos de madera o a base de madera impregnadoso tratados super ficialmente con TBP, de forma similar alo descrito sobre el PCP en contacto directo (Wurdig,1975) o indirecto (Dubois and Rigaud, 1981, Chatonnetet al., 1994). En los vinos y materiales estudiados nose ha detectado PBP y TeBP, precursores potencialesdel TBP, o, en todo caso, sólo en estado de trazas nocuantificables. El TBP y diversos derivados bromofenóli-cos se utilizan ampliamente como tratamiento fungicidade la madera en Latinoamérica, como alternativa al PCP(Towa Mokuzai, 1982; Pulido and Ayzaguer, 1991) yantiincendios (pirorretardante), pero también en nume-rosos materiales plásticos (Takashi and Sato, 1992;Nishibori and Kondo, 1993; Hoffman and Sponholz,1997). A diferencia del PCP, cuyo uso está regulado en buenamedida en todo el mundo o incluso prohibido, como esel caso concretamente en Europa (CEE, 1991), el TBPno está sujeto a restricción alguna. Además, el usomuy extendido de derivados del TBP como agentes igní-fugos en numerosos materiales hace temer un riesgomuy generalizado de contaminación ambiental. La cre-ciente utilización de materiales reciclados, tanto a basede madera como de polímeros plásticos que puedenestar más o menos impregnados de TBP o sus deriva-dos, podría constituir una fuente de contaminaciónlatente susceptible de contaminar los productos alimen-tarios sensibles, pero también las aguas subterráneasen caso de almacenamientos inconsiderados. La exten-sión de la presencia del TBP y de sus derivados mere-

cería pues investigaciones más amplias.

ConclusionesPrácticamente ha desaparecido la utilización del cloropara el lavado de tapones, sin que haya disminuido porello la frecuencia de contaminación de los caldos debi-da al TCA aportado por cier tos tapones de corcho. Elcorcho y el proceso de fabricación tradicional de tapo-nes resultan fácilmente infestados por microorganismoscapaces, en ocasiones, de sintetizar grandes cantida-des de TCA. Por lo tanto, el control de la calidad de loslotes de tapones sigue siendo necesario. Otros materia-les, como la madera de roble de las barricas nuevas,presentan en ocasiones una contaminación aleatoriapor TCA. El origen de esta contaminación, poco frecuen-te, aún no se conoce bien; también por ello resultaimperativo el control de la ausencia de anisoles.La contaminación por productos de degradación de pla-guicidas organoclorados a base de PCP utilizados en elinterior de las bodegas, concretamente para el trata-miento de la madera o de los productos a base demadera, tiende a disminuir, pero se sigue produciendo.Nuestros trabajos han evidenciado claramente la posibi-lidad de contaminación de los caldos a distancia, a tra-vés de la atmósfera. La atmósfera contaminada tam-bién puede contaminar los productos que están encontacto directo con el vino, y por último los propioscaldos. Aunque la utilización del PCP ya está prohibidaen Europa, siguen subsistiendo numerosas fuentes decontaminación antiguas, impregnadas o contaminadasindirectamente por TeCA y accesoriamente por TCA.Para reducir el riesgo de contaminación accidental, con-viene cerciorarse siempre de la ausencia de dichos pro-ductos en el entorno de las bodegas, y más especial-mente en los materiales que entran en contacto directo


MATERIALES

Atmósfera de bodega(en ng g-1 absorbente)

Tapón de corcho nacional nuevo(ng por tapón)Tapón sintético de PET nuevo(ng por tapón)

Vino embotellado contaminado:Vino (ng L-1)Tapón usado (ha) (ng por tapón)

TCA

nd

16

nd

nd27

TCP

nd

13

nd

128

TeCA

tra-

zas

3

51

TeCP

trazas

nd

106

ndnd

PCA

trazas

15

107

25

PCP

5

24

872

1748

TBA

14

9

39

13275

TBP

2

33

294

68117

TeBP

nd

nd

nd

ndnd

PBP

nd

nd

nd

ndnd

(ha) una vez retirado 1/3 de la parte externa del tapón para evitar el riesgo de contaminación a través de la atmósfera nd: < DL trazas: > DL, < QL


con el vino. La selección de los materiales y revesti-mientos utilizados para la construcción o la reforma delas naves vinícolas sigue siendo muy útil para garanti-zar una buena fabricación y unas buenas condicionesde transporte y almacenamiento.La reciente identificación de TBA en bodegas indemnesde clorofenoles impone el mantenimiento de una pre-sión de control suficiente. La utilización del TBP comosucedáneo del PCP procede contaminaciones idénticasa las observadas con PCA y TeCA. La utilización de estetipo de derivados órganobromados en numerosos pro-ductos complica la identificación y la rápida erradica-ción de las fuentes de contaminación.Los anisoles constituyen una fuente de contaminación delos caldos relativamente extendida. La multiplicidad demoléculas implicadas, las reducidas cantidades de conta-minantes suficientes para crear un defecto organolépticoy la gran variedad de circunstancias que permiten la con-taminación invitan a una vigilancia especialmente rigurosade todos los materiales y condiciones susceptibles derepresentar un riesgo de contaminación molesta de losvinos.

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Informe Técnico 19

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Informe Técnico 21

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3- Alternativas al dióxido de azufreEl ácido sórbico no es eficaz respecto Brettanomyces sp. enlas dosis clásicas, y no se puede utilizar en los vinos tintosdebido a su inestabilidad en presencia de bacterias lácticas. El pirocarbonato de etilo, propuesto por BAYER desde 1995con el nombre de Baycovin™ actúa sobre las levaduras ybacterias. Este compuesto no permanece estable en el vino,pues se hidroliza rápidamente en etanol y en gas carbónico,generando productos secundarios menores, entre ellos elcarbonato de etilo, que puede transmitir al vino cierto olor"afrutado". La producción de uretanos (carbamato de etilo)ha descartado su utilización en enología. Actualmente, esteproducto muy antiguo reaparece en forma de dimetilo con elnombre de Vercorin™ o DMDC. La dosis de 60 mg/l es fun-gistática para S. cerevisiae y la dosis de 150 mg/l es fungi-cida. B. bruxellensis se inhibe a partir de 120 mg/l, peropara su destrucción total son necesarios más de 200 mg/l.La utilización del DMDC permite la destrucción eficaz de losgérmenes presentes, pero no una protección duradera, puesla hidrólisis de este tipo de compuesto en el vino es muy

rápida (figura 10), y tanto más cuanto más alta es la tempe-ratura. Por lo tanto, sólo se puede aplicar con dosificadoresespeciales cuando no hay posibilidad de recontaminación(por ejemplo, al embotellar). En el caso contrario, habría quereajustar continuamente la dosis de principio activo. Demomento, este producto está prohibido en Europa.

ConclusiónEl desarrollo de técnicas modernas de detección adecuadaspara el seguimiento de la crianza de caldos y la elaboraciónde métodos de desinfección y de control de los recipientesde madera eficaces y que respeten el material permitiránsin duda en un futuro próximo controlar perfectamente eldesarrollo de estos gérmenes de contaminación para redu-cir sus efectos indeseables, preservando al mismo tiempola pureza y la tipicidad del aroma de los vinos.

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TIPO DE ENSAYO

simple

reforzado

Nº de taponesensayados

80

200

Defecto grave (a)

NQA = 1,5

Aceptado: 3Rechazado: 4


Defecto crítico (b)

NQA = 0,65



Clasificaciónde la calidad

del lote

Buena (1)Media (2)

Media (2)Mala (3)

(1) defectos graves: ligero sabor a corcho, ligero sabor a moho, gasolina, cola(2) defectos críticos: sabor a corcho medio, sabor a corcho fuerte, sabor a moho medio, sabor a moho fuerte, terroso fétido, estanca-

CHATONNET P., DUBOURDIEU D., BOIDRON J.N. et PONSM., 1992. The origin of ethylphenols in wines. J. Sci. FoodAgric., 60, 165-178 .Introducción


CONTROL DE CALIDAD DE LOS LOTESDE TAPONES NUEVOS PARA PREVENIREL RIESGO DE CONTAMINACIÓN PORCLOROANISOLES

Figura 1 - TCA total en diver-sos lotes de tapones deChampagne evaluados y cla-sificados previamentemediante análisis sensorialindividual

Figura 2 - Figura 2 -TCA total en diversoslotes de tapones decorcho natural previa-mente evaluados yclasificados medianteanálisis sensorial indi-vidual.

Figura 3 - Relación entre el TCA total de los tapo-nes de corcho natural y el TCA dosificado en losvinos embotellados

Informe Técnico 23

La contaminación de los vinos por los tapones decorcho es uno de los temas de mayor preocupa-ción para la industria vinícola mundial. Los obtu-radores utilizados pueden causar diversos tiposde defectos que afectan más o menos grave-

mente a la calidad de los productos embotellados. Noobstante, debido a su impacto y a las repercusiones eco-nómicas que conlleva, el problema del "sabor a tapón" esel que más atención moviliza hoy en día. Las tergiversa-ciones de ciertos fabricantes a la hora de reconocer laíndole y la amplitud del problema, la exageración irracio-nal de la frecuencia de alteración por este tipo de defectomuy concreto, la tentación de sustituir el taponado de cor-cho por diversos tipos de obturadores totalmente sintéti-cos sin una previa reflexión profunda, y el eco excesivo enlos medios de comunicación han contribuido en buenamedida a la pérdida de racionalidad para atender y solu-cionar este delicado problema.Los tapones de corcho o a base de corcho pueden cederdiversos contaminantes a los caldos (BUSER et al.,1982., RIBOULET, 1982., LEFEBVRE et al., 1983, BOI-DRON et al., 1984., MAZZOLENI et al., 1993), incluidoslos sintéticos (CHATONNET et al., 1999, CHATONNET et

Labadie, 2003). Aunque se puede sospechar de otroscontaminantes organolépticamente muy activos (TANNERet BUSER, 1981, CHATONNET, 1994, SOLEAS, 2002), dehecho es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) identificado inicial-mente por TANNER y BUSER en 1981, la molécula respon-sable de la gran mayoría de defectos calificados de"sabor a tapón", pero que en realidad corresponden a unolor a "moho"" (AMON et al., 1989). Los métodos defabricación tradicional de los tapones y las condicionesque propician el desarrollo de un gran número de microor-ganismos en el material suberoso originan la aparición deeste contaminante en los tapones y de la contaminaciónde los caldos (LEE y SIMPSON, 1993).En este trabajo, realizado a partir de casos concretosobservados en la industria, estudiamos la distribución dela contaminación de lotes de tapones compuestos utiliza-dos para el taponado de los vinos espumosos (discospegados a un cuerpo de corcho aglomerado) y de taponesde corcho natural empleados para el taponado de losvinos tranquilos. Se comparan distintos enfoques demedición del contenido y de la migración del TCA de lostapones, con objeto de evaluar objetivamente el riesgo deutilizar un lote de obturadores determinado. La primera

Figura 4 - Estimación de la variabili-dad de la migración del TCA totalde los tapones en el interior de losvinos embotellados juzgados signi-ficativamente alterados en la cata

(número de muestras: corcho natural

= 85, disco y aglomerado de corcho

compuesto = 33, corchos enteros

naturales = 57)

parte se dedica a un enfoque que toma en cuenta el con-tenido total (extraíble mediante un disolvente orgánicopotente, CHATONNET et al., 2003) de TCA presente en losobturadores; la segunda parte trata sobre el interés delconcepto de TCA fácilmente extraíble desarrollado másrecientemente.

1-Utilización de la dosificación de los contaminantes tota-les presentes en los tapones

El control de calidad de los lotes de tapones medianteanálisis sensorial es una técnica laboriosa y más compli-cada de lo que podría parecer, pero hoy por hoy siguesiendo la única técnica que permite un análisis individualde una muestra sin resultar demasiado costosa. En elmundo se utilizan diversos enfoques. Cada uno de ellospresenta sus ventajas y sus inconvenientes, pero todosellos exigen mucho tiempo, personal y competencia. Loslotes de tapones estudiados se han evaluado mediante la



cata individual de maceraciones acuosas de tapones; lafrecuencia de contaminación de los lotes de tapones porolores de carácter "mohoso" permite clasificar los lotesen diversos niveles de calidad. Los tapones tomadoscomo muestras de lotes de 140.000 unidades se aplicana medias botellas que contienen 125 ml de agua mineralcontrolada previamente mediante cata. Las botellas sealmacenan boca abajo durante 6 días. Pasado ese tiem-po, se abren y catan individualmente les maceracionesanotando la intensidad (sobre una escala que varía de 0a 3) y el tipo de defecto detectado, en su caso (Tabla I).

Los tapones de corcho natural nuevos no han sido someti-dos a lavado, y proceden de una selección visual realizadaentre la 2ª y la 3ª calidad según la escala de referencia dela Fédération Nationale des Syndicats du Liège (FNSL,1999) y una 1ª calidad para los tapones de Champagnesegún la escala de referencia CIVC (1999). Los lotes lla-mados "buenos" son los lotes aceptados en su mayormedida en un control de calidad rutinario, y en el controlde recepción presentan como máximo un tapón defectuo-so. Los lotes "medios" se rechazan en el ensayo simple,pero se aceptan en el control reforzado. Los lotes "malos"

Figura 5 - Distribución del TCA total enlos discos de corcho natural y en el cuer-po aglomerado de diversos tapones deChampagne

Figura 6 - TCA liberable medido en diversos lotes de tapo-nes de Champagne evaluados previamente por análisissensorial

Figura 7 - TCA liberable medido en diversos lotes de tapo-nes de corcho natural evaluados previamente por análisissensorial

Informe Técnico 25

son lotes rechazados en el control reforzado.La dosificación del TCA total del corcho se lleva a cabosobre una muestra de entre 25 y 50 tapones nuevos tritura-dos (CHATONNET et al., 2003). Se extrae una alícuotamediante un disolvente orgánico por agitación durante 60minutos. El extracto así obtenido se separa del corcho, seconcentra y se analiza por cromatografía en fase gaseosacombinada con la espectrometría de masa. La detecciónespecífica del TCA y de su precursor directo, el TCP, por frag-mentometría de masa permite detectar de niveles de conta-minación muy bajos.1.1-Heterogeneidad de la contaminación de los tapones enlos lotes comercialesEl estudio de la distribución de la contaminación dentrode cada lote de tapones de corcho natural o compuestoindica claramente que el TCA no está repartido uniforme-mente dentro de cada lote. Incluso en los lotes de riesgoescasamente utilizados a la vista del resultado de losensayos sensoriales, sigue existiendo una proporción detapones que pueden contener grandes cantidades deTCA. El nivel medio de contaminación de TCA total no per-mite diferenciar los lotes de alto riesgo de los de bajoriesgo. Los lotes de riesgo potencialmente alto sólo sedistinguen de los lotes de bajo riesgo por una mayor pro-porción de tapones contaminados por encima de 50 ng/tapón. En la práctica, se puede considerar que no existenlotes totalmente indemnes de contaminantes y por tantode riesgo sea cual sea el tipo de obturadores (figuras 1 y2).

1.2-Utilización del contenido de TCA total para predecir lacalidad de los lotes Se observa poca o ninguna correlación significativa entreel contenido total de TCA de los obturadores y la canti-dad de TCA que afecta a los caldos (figura 3). En efecto,la migración del contaminante de los tapones al conteni-

do de la botella depende de diversos factores, y no sólode la cantidad de contaminante. En el marco de un tapónde corcho natural, o a fortiori compuesto, la contamina-ción no es homogénea.

El estudio de un número considerable de casos de conta-minación de vinos embotellados por sus tapones de cor-cho indica por una parte que en el vino sólo se difundeuna fracción de los contaminantes totales, y por otraparte que la magnitud de la migración es bastante varia-ble (figura 4). En los tapones de corcho natural, los casosmarginales de fuerte migración (> 25% del TCA total)representan en torno a un 2,4%. Este porcentaje es próxi-mo a la tasa máxima de alteración de un lote de botellaspor encima de la cual son frecuentes las reclamaciones(en torno a un 3% según nuestra experiencia). En estascondiciones, teóricamente los obturadores no deberíancontener más de 15 ng/ tapón de TCA total, considerán-dose un límite máximo admisible de 3 ng/l de TCA en elcaldo. Pero en este caso, sólo estará en contacto con elvino una fracción imprevisible del tapón. Salvo que se seaexcesivamente severo, esto impide sacar cualquier con-clusión objetiva e irrefutable.En los tapones de Champagne, el uso del tapón tiene unaorientación clara. A pesar de ello, la situación es máscompleja, debido a la estructura compuesta y a la granvariabilidad inter-individual del nivel de contaminación delos discos y del aglomerado (figura 5). Por su fabricación,la migración del TCA de los discos es fácil. Sólo se opo-nen débilmente a una contaminación que puede procederdel cuerpo aglomerado. Si también aquí se considerara lafracción marginal del índice de migración (> 25%) con dis-cos en contacto directo, situación que representa a unagran mayoría de los casos observados (> 40%), habríaque admitir como máximo 6 ng de TCA total en la fraccióncorrespondiente a los discos (considerándose una canti-

Figura 9 - Correlación entre el TCA liberable medido en las maceraciones individuales de tapones de corcho natural y elnivel de calidad estimado a partir de la evaluación sensorial de los lotes. Calidad del lote según el ensayo sensorial: 1 = bueno,

2 = medio, 3 = malo(LD: límite de detección = 0,6 ng/l; LQ: límite de cuantificación = 1,4 ng/l)



dad máxima admisible de TCA de 1.5 ng/l vino espumo-so); es decir alrededor de 3 ng/g de TCA total en los dis-cos de corcho natural. Dado el estado actual de las técni-cas de fabricación, resulta bastante difícil garantizarsistemáticamente un nivel de contaminación tan bajo.2- Utilización de la dosificación de contaminantesconsiderados fácilmente extraíbles o "TCA liberable"Habida cuenta de los resultados expuestos más arriba,de la localización superficial del TCA en las partes exter-nas de los tapones (HOWLAND et al., 1997) y de laausencia de migración a través de importantes espesoresde tejidos suberosos (CAPONE et al., 2002), se estudiala noción de "TCA fácilmente extraíble", es decir quemigra fácilmente en contacto con una solución hidroalco-hólica modelo que simula el comportamiento de un obtu-rador en una botella. Se trabaja con muestras de entre25 y 50 tapones o con muestras múltiples de 10 taponespor lote. Los tapones enteros se sumergen en una solu-ción hidroalcohólica a 12% vol de etanol durante 24 h. Alcabo de ese tiempo, se mide el TCA que ha migrado a lasolución (TCA liberable) para representar la fracción delTCA del corcho susceptible de migrar al vino. Se utiliza latécnica de "head-space solid phase micro-extraction"(HSSPME) combinada con la cromatografía en fase gaseo-sa y con la detección de masa por fragmentometría("selected ion monitoring" o SIM) para poder detectar ydosificar el TCA a niveles muy bajos (en torno a 1,5 ng/l).Aparte de los trabajos del Cork Quality Council enEstados Unidos (HERVE et al, 1999), no se ha realizadoningún otro trabajo de validación seria de este concep-to. En efecto, la mayor parte de los trabajos se ha con-centrado en la técnica de dosificación del TCA aplicandoel principio propuesto inicialmente por EVANS et al.1997 (BUTZKE et al., 1998, RIBOULET et al., 2003),pero nunca en la interpretación de los resultados obte-nidos, es decir en la relación potencial entre el conteni-do medio de TCA extraíble medido en una muestra de

trabajo y la frecuencia de alteración previsible en casode utilización del lote de tapones en cuestión. En efecto,desde un punto de vista práctico, no importa tanto cono-cer el contenido potencial de TCA cedido por el tapón sino se puede estimar el número de botellas potencial-mente afectadas por la utilización de tal o cual lote detapones.

2.1 -Estudio de la distribución del TCA liberable en loslotes de tapones de corcho natural o compuestosEn los tapones compuestos destinados al taponado devinos espumosos, clasificados previamente en diversosniveles de calidad mediante cata individual, se observaque no se puede diferenciar los lotes de tapones de usomás o menos arriesgado en función de su contenidomedio de TCA liberable. En un lote de bajo riesgo(bueno) se pueden encontrar algunos tapones capacesde liberar cantidades importantes (> 7 ng/l) de TCA(figura 6). Tampoco existe una diferencia obvia entre loslotes considerados de riesgo "medio" y "alto". La únicadiferencia existente entre los lotes de tapones clasifica-dos como de bajo o alto riesgo reside en la proporciónde tapones que liberan más o menos de 3 ng/l de TCAliberable. Aunque se lleve a cabo una maceración orien-tada, limitando el contacto con la parte aglomerada delos tapones de Champagne, el cuerpo, con frecuenciamás contaminado (figura 7), perturba la medida del TCAliberable. Dado el estado actual de las técnicas de fabri-cación y a la luz de los trabajos realizados en este estu-dio, parece pues más difícil prever la calidad de estetipo de obturador mediante la dosificación del TCA libe-rable (figura 8a).Por lo que se refiere a los tapones de corcho natural, seobserva que en ciertos casos, los lotes consideradossatisfactorios por el ensayo sensorial individual puedencontener asimismo un porcentaje considerable de tapo-

Figura 9 - Relación entre la dosificación del TCA liberable en maceración individual o conjunta (25 tapones/500 ml)

a) corcho natural b) tapón de champagne

Informe Técnico 27

nes contaminados por encima de 8 ng/l/ tapón (figura 2). El contenido medio de TCA liberable de los tapones de

Figura 10 - Correlaciones existentes entre el contenido de TCA liberable medido en maceración individual o conjunta y lafrecuencia de contaminación medida en el lote para diversos tipos de tapones

Tabla 2 - Relación entre el riesgo de utilización teórico y la dosificación de TCA liberable obtenida a partir de maceracio-nes conjuntas de tapones de corcho natural

Ensayo

Nº total de tapones

Número de Tapones sin contaminación*

Número de tapones con un potencial significativode contaminación (> 6 ng/l) y nivel individual de contaminación (ng/l)

Riesgo real de utilización %

TCA liberable en la maceración conjunta

Riesgo evaluado (1) %

Teórico(ng/l)

Medido(ng/l)

1

25

25

0

0

0

nd*

0

2

25

24

1 [13 ng/l]

4

nd

trazas **

0

3

25

24

1 [121ng/l]

4

4,8

13

24,2

4

25

23

2 [13, 28ng/l]

8

1,7

5

7,9

5

25

22

3 [14, 17, 21ng/l]

12

6,5

9

16,1

6

25

21

4 [ 12, 8, 7, 6 ng/l]

16

1,6

2

1,8



corcho natural permite diferenciar más fácilmente loslotes de riesgo del resto. Se observa una buena corre-lación entre el nivel medio de TCA liberable dosificadopor maceración individual y la calidad del lote estimadapor el procedimiento de evaluación sensorial (figura 8b).

2.2- Utilización de la medida del TCA liberable para laprevisión del riesgo de la utilizaciónSi se admite que el muestreo de trabajo utilizado esrepresentativo de la realidad de un lote, la dosificacióndel TCA liberable por maceración individual de los tapo-nes de corcho natural y de los tapones de Champagnedebe permitir determinar la proporción de tapones cuyautilización presenta un riesgo. Como sólo disponemosde los datos obtenidos por HERVE et al (1999), consi-deraremos, como primera hipótesis, que la migraciónefectiva del TCA liberable del tapón al vino es idéntica a

la observada en los tapones de corcho natural, es decirde alrededor de un 50%. En estas condiciones, admi-tiendo que una concentración de TCA superior a 1,5ng/l en los vinos espumosos y a 3 ng/l en los vinostranquilos puede causar un trastorno organoléptico, lostapones que liberan individualmente más de 3 ng/l enel primer caso y más de 6 ng/l en el segundo podríancausar contaminaciones excesivas y representan lo quehemos llamado tapones de riesgo.En un primer tiempo, hemos comparado el resultado dela dosificación del TCA liberable obtenida a partir demaceraciones conjuntas o individuales de lotes detapones comerciales de corcho natural y deChampagne. Los resultados de la dosificación del TCAliberable se presentan en las figuras 9 a) y b). Seobserva que existe una buena correlación entre el con-

tenido de TCA liberable medido en una maceración con-junta (25 tapones/500 ml) y la media de las dosificacio-nes individuales de los mismos tapones de corcho natu-ral y de Champagne. Además, en los tapones de corcho natural, existe una

buena correlación entre el contenido de TCA medido enuna maceración conjunta o en maceraciones individua-les, y la frecuencia de contaminación por encima de 3 ode 6 ng/l (figura 10). En el caso de un bajo potencialcontaminante (próximo al límite de detección en losvinos, es decir en torno a 3 ng/l), la calidad de la corre-lación es más satisfactoria con los resultados proceden-tes de las maceraciones individuales que con los obteni-dos a partir de las maceraciones conjuntas. En el casode los tapones de Champagne, la correlación es másbaja, y no disponemos de ningún dato sobre la cuota demigración del TCA liberable a la botella.Para comprobar estos resultados, después hemos traba-jado sobre muestras formadas por tapones de corchonatural. Se han utilizado series de 25 tapones (2-3ª cali-dad de selección visual sin tratamiento superficial) nocontaminados (TCA liberable < 0,6 ng/l) en las quehemos incluido una proporción variable de tapones idén-ticos contaminados naturalmente a muy diversos niveles(de 1 a 4 tapones por cada 25) y seleccionados tras lamaceración individual. Los resultados de la tabla II presentan la relación exis-tente entre el riesgo de utilización real y el riesgo esti-mado por el modelo de regresión obtenido a partir delas maceraciones conjuntas de tapones de corcho natu-ral. Así pues, los tapones contaminados a un nivel nodetectable (< 0,6 ng/l) desembocan en una ausencia deriesgo de la utilización (ensayo 1). En el caso de lotescon una proporción de tapones contaminados a un nivelmoderado (13 ng/l individual de TCA liberable, potencial

Figura 11 - Correlaciones existentes entre el contenido deTCA liberable medido en maceración individual o conjuntay la frecuencia de contaminación medida en el lote paradiversos tipos de tapones

Figura 12 - Variabilidad y niveles de contaminación de diver-sos tipos de tapones por el TCA liberable (maceracionesindividuales)

Informe Técnico 29

de migración = 6.5 ng/l si la migración admitida es del50%), pero cuyo riesgo de utilización ya es alto (1tapón/25: 4%), la dosificación del TCA liberable a partirde una maceración conjunta no permite estimar la fre-cuencia de contaminación (ensayo 2). En el ensayo 3,con la misma proporción de tapones contaminados(4%), pero esta vez con un nivel muy alto (potencialcontaminante = 60 ng/l), el riesgo de utilización estima-do por la dosificación está muy sobrevalorado (24%frente al 4% en la realidad). Cuando los tapones tienenun potencial contaminante bastante moderado (migra-ción teórica de 6-10 ng/l) y están presentes con unafrecuencia superior al 4%, el riesgo de utilización seaprecia bien mediante la dosificación del TCA liberableen una maceración conjunta (ensayos 4 y 5). Pero en elcaso de una contaminación frecuente (ensayo 6) portapones cuyo potencial contaminante (3 a 6 ng/) supe-ra más escasamente el límite de percepción organolép-tica del TCA (# 3 ng/l), el riesgo de utilización está muyinfravalorado (2% frente al 16% en realidad).En cuanto a los tapones de corcho natural, según elmodelo obtenido a partir de nuestras observaciones(figura 10b) y si se fija un riesgo máximo de utilizaciónen un 3% de tapones contaminantes (que liberan almenos 6 ng/l de TCA liberable), no se debería aceptarlotes de tapones que liberen más de 2,6 ng/l en mace-ración conjunta (25 tapones/500 ml) para los vinostranquilos (alteración por encima de 3 ng/l de TCA). Siel riesgo de utilización se reduce al 1%, el TCA liberablemáximo alcanza 1,6 ng/l, es decir aproximadamente ellímite de cuantificación de la dosificación.a) tapones contaminados a partir de 3 ng/l de TCA libera-ble (potencial contaminante teórico > 1,5 ng/l de vino)2.3- Caso especial de los tapones sintéticos a base de cor-cho ALTEC de SABATELa aparición de una nueva generación de tapones industria-les fabricados a base de granulados de corcho y de diversoscoadytuvantes texturizantes ha permitido obtener obturado-res técnicos muy eficaces y de calidad muy superior a la delos tapones aglomerados tradicionales. Se han sucedidovarias fabricaciones tras el lanzamiento del tapón Altec deSABATE en Francia. Diversas peripecias en la selección dela materia prima utilizada y las técnicas de fabricación hanpodido afectar a la calidad de ciertas remesas, y han altera-do la confianza en este tipo de obturador.Taras varias modificaciones del proceso de selección degranulados y de métodos de fabricación, el grupo SABATEha recurrido a nosotros para validar los procedimientos decontrol de calidad de los tapones Altec de nueva genera-ción, para permitir certificar la presencia de TCA y posibleel riesgo de contaminación de los lotes de tapones fabrica-dos.

Habida cuenta de los métodos de fabricación de los gra-nulados empleados, de las diversas etapas de mezcla degranulados con los distintos agentes aglomerantes y tex-turizantes utilizados y del moldeo individual de cadatapón, hemos demostrado que la utilización de la dosifica-ción del TCA liberable en maceración individual o conjuntaa partir de una muestra de tapones Altec nuevos dabaresultados sumamente homogéneos entre tapones (figura11). Comparados con los demás tipos de obturadores yconcretamente con otros tipos de obturadores sintéticosa base de corcho inspirados en el modelo Altec, todos losdemás tapones presentan un índice de variación del con-tenido de TCA contaminante muy superior (figura 12). ConAltec, para una misma categoría, y dentro de un mismolote, la variación media es de 0,13 n/l de TCA liberable,con una desviación mínima que varía entre 0,2 y 0,6 ng/l(0,33 ng/l en promedio). Para un mismo tipo de fabricación,la variación entre lotes es de 0,37 ng/l para un potencialcontaminante de 1,48 ng/l (la desviación mínima varía de0,87 a 2,15 ng/l).

En los tapones de corcho naturales o los tapones compues-tos, que siempre presentan un grado de variabilidad consi-derable, la problemática del muestreo representativo siem-pre resulta difícil de resolver. Con los tapones Altec, la granhomogeneidad medida permite predecir fácil y seriamente lacalidad de un lote de fabricación a partir del análisis de unsolo tapón. Asimismo, en caso de mezcla de lotes conside-rados similares a raíz de un control previo, el control de cali-dad de lotes de Altec resulta infinitamente más sencillo, ypermite certificar el riesgo de utilización con mucha másgarantía.

3- ConclusionesLos lotes de tapones de buena calidad no están necesaria-mente libres de tapones contaminados; en realidad sólo sediferencian del resto por una menor proporción de taponessignificativamente contaminantes. Aunque sólo la frecuenciade contaminación dentro de un lote es realmente represen-tativa de su riesgo de utilización, hemos demostrado que sepuede establecer una relación entre la calidad de los lotesde tapones de corcho natural y su contenido medio de TCAliberable, pero no con su contenido de TCA total. Esta rela-ción es mucho menos evidente en los tapones compuestosde Champagne estudiados en este trabajo, pues, aunque serealice una maceración orientada conforme a sus condicio-nes de uso, su composición heterogénea afecta mucho alos resultados de dosificación. La dosificación del TCA liberable en maceraciones conjuntasestá relativamente bien correlacionada con las dosificacio-nes en maceraciones individuales para todos los tipos detapones. En los tapones industriales a base de corchoAltec, la gran homogeneidad de fabricación permite utilizar



muy fácilmente la dosificación del TCA liberable para contro-lar la calidad de los lotes.En el corcho natural, la frecuencia de tapones contamina-dos individualmente por encima de 3 o de 6 ng/l de TCA sepuede relacionar satisfactoriamente con la dosificación delTCA en una maceración conjunta. Por lo tanto, y a condiciónde admitir que el muestreo de trabajo utilizado es realmen-te representativo, se puede estimar la frecuencia de conta-minación de un lote de tapones en función del número detapones de riesgo, es decir por los tapones capaces deliberar una cantidad suficiente de TCA para alterar la calidadde un vino tranquilo, a partir de la dosificación de unamaceración conjunta. No obstante, los experimentos realiza-dos sobre muestras compuestas demuestran bien que estametodología puede conducir a una infravaloración del riesgocuando el potencial contaminante de los tapones es mode-rado (3-6 ng/l) pero no por ello molesto. Por el contrario,una fuerte contaminación de los tapones puede provocaruna importante sobrevaloración del riesgo y motivar elrechazo de lotes que son no obstante utilizables, puesposeen una frecuencia de tapones contaminados perfecta-mente aceptable. Por lo tanto, se podría considerar un con-trol fácil y económico de los lotes de tapones antes de suuso, siempre que se ponderen las conclusiones a la luz delos resultados expuestos. Y es que según estos, los nivelesde 4 a 6 ng/l utilizados a menudo en la actualidad comolímite de rechazo parecen considerablemente excesivos.Queda por estudiar más finamente la relación entre el TCAliberable medido en las condiciones de dosificación en labo-ratorio y la migración real durante la crianza en botella. Hoypor hoy, no disponemos de medidas suficientes para permi-tir la admisión y la generalización del valor aproximado de50% medido por HERVE et al. (1999) en condiciones preci-sas. Es posible que en esta migración influyan la calidadfísico-mecánica del corcho y algunos de los tratamientosaplicados a los tapones. Es pues necesario llevar a caboestudios complementarios para valorar mejor su variabilidaden condiciones de uso reales. A partir de ese dato, sinduda se podrá mejorar la estimación del riesgo de utiliza-ción en función del contenido medio de TCA de una macera-ción conjunta. No parece que se pueda apreciar tan sencillamente la cali-dad de los tapones compuestos que combinan corchos dediversas procedencias. La estructura heterogénea de estosobturadores y el riesgo de migración de TCA a partir de laparte aglomerada a pesar de la aplicación de uno o devarios discos de corcho natural complica mucho el proble-ma. No se sabe si este razonamiento se puede generalizara todos los tapones compuestos. Por lo tanto, es necesarioacometer trabajos específicos sobre este tipo de obturado-res.Hemos demostrado que la distribución de la contaminaciónde los tapones, tanto en términos de TCA total que de TCA

liberable, dentro de un mismo lote no sigue claramente laley normal de distribución. Ahora bien, la mayor parte de lastécnicas de muestreo y de interpretación de resultados,como ANSI/ASQC Z 1.4-1993 Plan/US Military Standards(FUSELSANG et al.., 1995, AFNOR, 2000) se basan en lahipótesis de una distribución homogénea que cumple la leynormal o del binomio. El Sequential Probability Ratio Test(SPRT) (SIMPSON y VEITCH, 1993) exige tomar muestrashasta alcanzar el umbral de rechazo; esta solución resultapues muy pesada y poco compatible con las condiciones detrabajo en enología. En realidad, es más conveniente utilizar,como modelo de distribución de la contaminación por elTCA, la ley de Poisson, que permite considerar los inciden-tes de escasa probabilidad dentro de una serie larga, en vezde la ley de Laplace-Gauss. En la práctica, sólo se puedeutilizar el Fraction Defective Sampling Plan (FDSP) (BUTZKE ySURPRENANT, 1997). Además, incluye la noción de riesgode proveedor a (probabilidad de rechazar un lote de calidadaceptable) y de riesgo de usuario b (probabilidad de aceptarun lote de mala calidad) para un nivel de calidad determina-do (Average Quality Level AQL y la proporción de taponesdefectuosos que debe ser rechazada Pt), cosa que no hacenel ANSI/ASQC o el SPRT.Salvo para los tapones de tipo Altec que presentan muypoca variación, la cuestión de la representatividad de lamuestra sigue completamente abierta. Hoy por hoy, habidacuenta de la distribución y de la frecuencia de la contamina-ción del corcho observada en los lotes de tapones, es cier-to que el examen de muestras de trabajo limitadas a 10, 25o 50 unidades para controlar la calidad de un lote que con-tiene varias decenas de miles de tapones sólo permite des-cartar los lotes de peor calidad. La multiplicación de loscontroles a escala de los subembalajes, que sólo contienenalgunos miles de unidades, es desde luego deseable, perotodavía queda por especificar un método serio y práctico demuestreo que responda satisfactoriamente a las exigenciasde los fabricantes y de los usuarios de tapones.


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Informe Técnico 33

Informe Técnico 35

1.- Introducción

1.1.- Breve historia del corcho y sus aplicaciones.El corcho es un biopolímero de origen vegetal obtenido apartir de la corteza externa del alcornoque (Quercussuber L). Este árbol es típico de la región mediterránea yocupa extensas zonas de España, Portugal, Francia,Italia, Grecia, Argelia, Marruecos y Túnez. En estos paí-ses existen aproximadamente unas 2.178.000 hectáreasde alcornocales. La mayor extensión corresponde aPortugal con 725.000 hectáreas (33%), situándoseEspaña a continuación con 510.000 hectáreas, que selocalizan principalmente en Extremadura y Andalucía.El corcho es un producto que tiene como principales pro-piedades una baja densidad, gran elasticidad, adherencia,impermeabilidad y compresibilidad. Además, posee otraserie de cualidades fundamentales: es compacto, resis-tente y se puede considerar inalterable. Estas característi-cas son bien conocidas desde la antigüedad. De hecho, yase utilizaba 3000 años antes de Cristo en China como ele-mento de flotación en artes de pesca. Más tardíamentese utilizó en la Grecia antigua para cerrar vasijas de vino yaceite. Los romanos también conocían las extraordinariaspropiedades del corcho como elemento capaz de propor-cionar un cierre eficaz, como lo atestigua el hallazgo deánforas cerradas con corcho en excavaciones enPompeya, Campania o en numerosos barcos romanos hun-didos a lo largo del Mediterráneo, y que en algunos casoshan permitido mantener inalterable el contenido de dichosrecipientes.Son las propiedades anteriormente reseñadas las quedeterminaron que desde el siglo XVIII se empezara a usarregularmente en la industria, sobre todo después de queel abad D. Perignon reinventara el tapón de corcho ya uti-lizado por griegos y romanos, aunque otros autores creenque tomó la idea de peregrinos españoles que visitabanla abadía. Ya en 1750 se estableció en la frontera franco-española la primera factoría de tapones de corcho. En la

Origen y biosíntesis de TCA en el corcho


actualidad la principal aplicación del corcho es la fabrica-ción de tapones para embotellar vinos y espumosos,alcanzando la producción mundial los 25.000 millones deunidades anuales ( http://www.amorimcork.com). Enmenor medida, el corcho también se utiliza en la fabrica-ción desde utensilios domésticos hasta pernos, plumillas,papel de corcho, chalecos salvavidas, etc. Además esimportante como elemento aislante y decorativo en cons-trucción.Desde un punto de vista económico la producción mundialde corcho alcanzó en 1999 las 335.000 toneladas, sien-do Portugal el primer país productor (55% de la produc-ción mundial), seguido de España, cuya producción seelevó hasta 88.000 toneladas (26% del total). Sin embar-go, y en lo que se refiere a producción de tapones,Portugal ocupa el primer puesto (78% de la producciónmundial), mientras que la producción en España se redu-ce al 20%. Estos dos países prácticamente copan la pro-ducción mundial de tapones. De estos datos podemosdeducir que al valor económico intrínseco del proceso demanufactura del corcho hay que sumarle el extraordinariovalor ecológico de los alcornocales, sin duda uno de losmás típicos ejemplos de bosque mediterráneo.Sin embargo, la enorme importancia económica del tapónde corcho se ve en la actualidad amenazada por el proble-ma conocido como cork taint o contaminación del corcho,fenómeno por el cual el tapón sería el responsable decontaminar el vino con metabolitos de origen microbianoque le proporcionan olores y/o sabores desagradablesque impiden su consumo.

1.2.- Composición química y estructura del corcho.La pared celular es uno de los rasgos más característicosde las células vegetales. Hay casos, como el del alcorno-que, cuyas células tienen la capacidad de producir unapared celular secundaria muy engrosada (además de laprimaria) que es lo que conocemos como corcho.

1.2.1. Composición química del corcho.El corcho es un heteropolímero muy complejo en el quequímicamente se distinguen varias fracciones:- La suberina es el componente mayoritario del corcho(45%) y el principal agente responsable de su elasticidad.Desde un punto de vista químico, la suberina de corchoes una mezcla compleja de ácidos fenólicos (especialmen-te ácido ferúlico) esterificados a ácidos grasos de cadenalarga (C14-C30). También encontramos ácidos α,ω-dicarbo-xílicos y ω-hidroxiácidos (García-Vallejo et al., 1997).Análisis realizados con suberina de peridermo de patataindican que los principales componentes de la fracciónfenólica son polímeros derivados del ácido hidroxicinámi-co (Bernards et al., 1995). Una representación de suestructura se puede apreciar en la Figura 1.1.

- La composición en polifenoles del corcho es muy varia-ble (aproximadamente el 33% en peso), pero el principalcomponente de esta naturaleza es la lignina. La lignina(aproximadamente el 27% en peso) es un polímero forma-do por restos fenilpropanoides derivados casi exclusiva-mente de los ácidos p-cumárico, coniferílico y sinapílico,unidos entre sí por enlaces éter o carbono-carbono(Azcón-Bieto y Talón, 1993). Es una estructura muy esta-ble y extremadamente resistente a la degradación, hechoque contribuye a aumentar tanto la resistencia químicacomo física del corcho. Su objetivo fundamental es actuarcomo elemento de soporte que contribuye a la unión delresto de los componentes.Otros polifenoles presentes en corcho son los taninos(aproximadamente el 6% del peso) responsables, en últi-mo término, de la peculiar coloración del corcho.Muchos de estos polifenoles se descomponen, posible-mente por acción microbiana, en sus componentes bási-cos, de manera que en el corcho podemos encontrar unagran cantidad de fenoles de bajo peso molecular comoácidos (cinámicos, gálico, vainíllico, cafeico, ferúlico, pro-tocatecuato y elágico), aldehídos (benzaldehído, vainillina,

etilvainillina y aldehido coniferílico) y cumarinas (Conde etal., 1997; Peña-Neira, et al., 1999).

- Los polisacáridos (en torno al 12% del peso) se localizansobre todo en la pared celular y contribuyen a definir la tex-tura del corcho. Los más importantes son la celulosa y lahemicelulosa. La celulosa es un polímero lineal no ramifica-do de alto peso molecular, formado por unidades de β-D-glu-copiranosa unidas por enlaces glicosídicos β(1®4). Lashemicelulosas son polímeros de pentosas y hexosas asocia-

ORIGEN Y BIOSÍNTESIS DE TCA EN EL CORCHO

Figura 1.1. Representación simplificada de la estructurade la suberina (Kolatukkudy, 1981). Se indican en recua-dros algunos de los derivados fenólicos más significati-vos.

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das a celulosa y lignina en la pared celular (Cabral, 1988).- Las ceras (aproximadamente el 5% del peso) son compo-

nentes muy hidrófobos que reducen drásticamente la per-meabilidad del corcho al agua y solutos. (Azcón-Bieto yTalón, 1993). Están formadas por mezclas complejas decompuestos alifáticos, siendo los mayoritarios los alcanosde número impar de carbonos (C29-C31). También podemosencontrar compuestos terpenoides, concretamente triterpe-nos como cerina y friedelina (Caldas et al., 1985).- El 5% restante está constituido por agua, minerales, salesy otros componentes minoritarios como el glicerol.

1.2.2. Estructura del corcho.El corcho estructuralmente se podría definir como un parén-quima suberoso, producido por el meristemo felodérmico deQuercus suber, que recubre el tronco y ramas del árbol, yque tiene una gran capacidad de regeneración cada vez quees retirado del árbol, por término medio cada 8-11 años. Almicroscopio está compuesto por células poligonales, ligera-mente aplanadas, ocupadas principalmente por aire (Pérez yPérez, 1996) y que presentan una disposición bastanteregular en capas superpuestas. Esta estructura particulares consecuencia del proceso de suberificación durante elciclo vegetativo de la planta. Con este proceso el lumencelular se restringe y el protoplasto desaparece al ser total-mente reabsorbido. De la célula original sólo queda lapared, formada por tres capas:1.- Una capa celulósica, en contacto con las cavidades celu-lares.2.- Otra capa suberificada de mayor espesor, compuesta porestratos superpuestos de suberina y cera y que es la queconfiere al corcho su elasticidad.3.- Otra más externa o capa lignificada.El tejido suberoso no es homogéneo, y de hecho está atra-vesado en su interior por poros o canales, con paredes máso menos lignificadas, que constituyen las lenticelas, relle-nas de polvo rico en taninos (Suárez, 1992). La forma,tamaño y porcentaje de lenticelas son responsables de laporosidad del corcho y dependen fundamentalmente de fac-tores genéticos.

1.3.- Microbiota del corcho.El corcho es desde el punto de vista microbiano un ecosis-tema muy complejo en el que encontramos gran cantidad yvariedad de microorganismos, y ello a pesar de que el cor-cho es un material que por sus características tiende a limi-tar el crecimiento de los microorganismos. Entre ellas cita-remos, la relativamente baja concentración de nutrientes ysu baja actividad de agua. El valor de actividad del agua calculado para tapones de cor-cho almacenados en bolsas herméticamente cerradas esde 0.55-0.56, valor por debajo del límite del crecimientomicrobiano (Beuchat, 1983; Sarrete et al., 1992), aunque

suficiente para permitir la supervivencia de los microorganis-mos. La disponibilidad de agua no siempre es un factor limi-tante, ya que a lo largo del proceso de fabricación del tapónexisten fases que suponen un gran incremento del nivel dehumedad del corcho. De hecho, tras una incubación de tapo-nes durante una semana en cámaras con humedad atmosfé-rica se aprecia un aumento gradual en sus niveles de hume-dad, obteniéndose valores de actividad de agua de0.86-0.89 (Danesh et al., 1997), adecuados para el creci-miento microbiano.En cuanto a la baja disponibilidad de nutrientes, debemostener en cuenta que la compleja estructura del corcho deter-mina que sólo aquellos microorganismos con capacidadsuberolítica, ligninolítica, o con capacidad para degradar celu-losas y hemicelulosas, puedan mediante su capacidaddegradativa acceder a compuestos más sencillos y fácilmen-te metabolizables. Ambos factores determinan que los micro-organismos se desarrollen preferentemente en la superficiedel corcho. No obstante, algunos pueden penetrarlo profun-damente y desarrollarse en las lenticelas, casi siempre comoconsecuencia de heridas producidas mecánicamente o porinsectos. Estudios realizados con técnicas de microscopía electrónicaconfirman que en la mayor parte de los casos los hongosfilamentosos (los de mayor capacidad invasiva) no penetranen profundidad más allá de ocho a 15 niveles celulares(Silva Pereira et al., 2000a).Estos microorganismos se pueden dividir en dos grandesgrupos:I).- Aquellos con capacidad para crecer a expensas del cor-cho (microorganismos saprófitos del corcho).II).- Microorganismos naturales de otros nichos ecológicos(suelo, material vegetal, etc.) y que aparecen como contami-nantes ocasionales del corcho.Sin embargo, diferenciar entre ambos grupos es práctica-mente imposible. Si acaso los primeros presentarían unadistribución prácticamente universal, mientras que la apari-ción de los segundos en el corcho sería ocasional. Dehecho, la mayoría de los microorganismos aislados seencuentran en el corcho ya en el momento de la extraccióndel árbol, mientras que otros colonizan el corcho durante laetapa de reposo en patio, en el proceso de manufactura, enla fase de bodega o durante el almacenamiento en fábrica(Silva Pereira et al., 2000a). La microbiota del corcho es muy variada y podemos destacarla presencia de un elevado número de bacterias, hongos fila-mentosos y levaduras. En la tabla 1.1 se indican los microor-ganismos más frecuentemente aislados a partir de corcho(Bureau et al., 1974; Davis et al., 1981; Lefebvre et al.,1983; Simpson y Lee, 1990; Lee y Simpson, 1993; Daneshet al., 1997). Otros autores han descrito la presencia ocasio-nal de otros microorganismos no incluidos en la tabla parano alargarla excesivamente.


Algunos de estos estudios se han realizado en España. Así,a partir de corteza de alcornoques y diferentes muestras decorcho (correspondientes a distintas etapas del proceso defabricación de tapón) obtenidas de robledales de Cataluñase han aislado numerosos microorganismos: casi 50 espe-cies de hongos filamentosos o mohos, tres levaduras(Cryptococcus sp., Rhodotorula glutinis y Saccharomycescerevisiae) y varias cepas bacterianas pertenecientes anueve géneros diferentes (Codina et al., 1993, Calvo et al.,1993; Calvo y Agut, 1996; Calvo et al., 1995).Por otro lado Muñoz et al. (1996) han detectado en la cor-teza de alcornoques del Parque Nacional de losAlcornocales (Cádiz) un total de 112 hongos de los cualesdos son zigomicetos, 24 ascomicetos, 42 basidiomicetos y43 deuteromicetos.

La mayor parte de estos estudios se han centrado en lacaracterización de la microbiota de hongos filamentosos. AsíLee y Simpson (1993) indican que los hongos predominan-tes en corcho recién recogido son los Penicillium, y enmenor medida Trichoderma y Acremonium. Por el contrario,en una partida de tapones de Australia los géneros domi-nantes fueron Penicillium, Trichoderma, Cladosporium yRhizoctonia (Simpson y Lee, 1990). Otros autores indicanque el hongo dominante en muestras de corcho portuguéses Chrysonilia sitophila (Danesh et al., 1997).En todo caso, la microbiota del corcho puede variar conside-rablemente dependiendo de su origen, tipo de muestra (cor-teza, tapón, etc.) y condiciones ambientales. A pesar de laslimitaciones del corcho para el crecimiento de los microorga-nismos, se trata de un material capaz de soportar poblacio-


BACTERIAS

Bacillus CorynebacteriumFlavobacteriumKurtiaListeriaMicrococcus

M. luteus NocardiaPseudomonasStreptomyces

HONGOS FILAMENTOSOS

AcremoniumAlternariaAphanocladiumAspergillus

A. nigerA. flavus

ArmillariaAureobasidiumCladosporiumChrysonilia (Monilia)

C. sitophilaEurotiumFusarium

MucorM. hiemalisNeurosporaPaecilomycesPenicillium

P. glabrumP. chrysogenumP. citrinumP. decumbensP. frequentansP. granulatumP. glabrumP. meleagrinumP. purpurogenumP. spinolosumP. variabile

PhomaRhizopusStachybotrysTrichoderma

T. longibrachiatumT. viride

TroncatellaVerticillium

LEVADURAS

CandidaC. famata

CryptococcusRhodotorula

R. glutinisSaccharomycesSporodiobolus

S. johnsonii

Tabla 1.1.- Microorganismos detectados con mayor frecuencia en muestras de corcho.

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nes microbianas enormes. Así, en corteza de corcho se handetectado hasta 3 x 106 hongos filamentosos y 7 x 105 bac-terias por gramo. Estos niveles aumentan hasta alcanzarseen la fase de maduración en bodega unos valores máximosde 1 x 108 hongos filamentosos y 5 x 103 bacterias porgramo (Calvo y Agut, 1996).No obstante y a pesar de su alto contenido microbiano sabe-mos muy poco acerca de la posible influencia de la microbiotaasociada a corcho en la calidad final del tapón. Sin embargo, los productores mantienen que los hongos quecrecen sobre corcho tendrían un efecto beneficioso, ya queproducirían un emblandecimiento que favorecería su manejo,además de producir el colapso de las lenticelas, lo cual resul-ta en un tapón más compacto y con menores pérdidas. Sinembargo, estas afirmaciones deben ser tomadas con cautela,ya que no existen datos experimentales que las confirmen(Silva Pereira et al., 2000a).

1.4.- Los microorganismos del corcho y el problema delcork taint o contaminación del corcho (sabor a corchoo sabor a moho de los vinos).El término cork taint, o contaminación del corcho, hace alu-sión al aroma terroso y/o mohoso que presentan en ocasio-nes los vinos, y que impide su comercialización. Este fenóme-no es reconocido como un problema muy serio en la industriadel vino, ya que a bajos niveles causa la pérdida de suscaracterísticas frutales y enmascara su aroma (Amón et al.,1989). Según algunos autores, la incidencia del problema oscilaentre el 2-7% del total de botellas (Butzke et al., 1999). Paraotros el porcentaje es ligeramente más bajo, variando entre el0.5-6% (Lee y Simpson, 1993). No obstante, independiente-mente de la incidencia real del problema, se estima que elvino estropeado por este fenómeno supone a las bodegas detodo el mundo unas pérdidas anuales de 10.000 millones dedólares, incluyendo las causadas por fugas y oxidaciones pordefectos físicos del corcho (Butzke et al., 1999).Son muchas (unos 100 compuestos volátiles) las sustanciasidentificadas como posibles agentes causantes del cork taint

(Amón et al., 1989). Ver Tabla 1.2. Entre ellos destacan loscloroanisoles como el pentacloroanisol (PCA), el 2,3,4,6-tetra-cloroanisol (2,3,4,6-TeCA) y especialmente el 2,4,6-tricloroani-sol (2,4,6-TCA) como los agentes que contribuyen en mayormedida a este problema. Especialmente importante es elpapel del 2,4,6-TCA, considerado como el compuesto respon-sable del 80% de los casos detectados, y que en un estudiosobre vinos australianos afectados por este problema, llegó adetectarse en el 100% de las botellas (Pollnitz et al., 1996).Además, algunos estudios establecen una clara correlaciónentre la presencia 2,4,6-TCA en vino y tapón o entre la pre-sencia de 2,4,6-TCA e intensidad de la contaminación del cor-cho (Peña-Neira et al., 2000).Otro compuesto importante es el guayacol (un derivado delácido vainíllico) que proporciona al vino un sabor medicinal,fenólico o a quemado y que podría originarse por la acción demicroorganismos que degradarían la lignina (Maga, 1978).De menor importancia citaremos la geosmina (proporcionaaromas y sabores terrosos) y el 2-metilisoborneol, que aportadesagradables sensaciones a lodo.Ocasionalmente también se han detectado compuestos alifáti-cos como octanol, octanona-3-octanal, 1-octeno-3-ona y 1-octen-3-ol. Finalmente, citemos pirazinas y metoxipirazinas ydiferentes sesquiterpenos identificados en muestras de cor-cho contaminadas por Penicillium roquefortii (Amón et al.,1989).Se cree que estas sustancias son producidas por microorga-nismos que crecen sobre el corcho utilizado en el taponadode las botellas de vino, aunque las evidencias al respecto sonescasas. Sin embargo, es necesario mencionar que el fenó-meno de la contaminación del corcho es muy complejo, yaque a menudo no es posible establecer una relación directaentre el cork taint y una única sustancia en una matriz quími-camente tan compleja como el vino. Así, Silva Pereira et al.(2000a) sostienen que es probable que en muchos casos,varios compuestos contribuyan de forma simultánea y sinérgi-ca a este fenómeno, siendo la contribución parcial de cadacompuesto difícil de determinar.

Tabla 1.2. Principales compuestos químicos y sus características organolépticas responsables de la contaminación del corcho.

COMPUESTO QUÍMICO

Cloroanisoles (2,4,6-TCA;2,3,4,6-TeCA y PCA)

Guayacol

Geosmina

2-metilisoborneol

Compuestos alifáticos: octa-nol, octanona-3-octanal, etc

Pirazinas y metoxipirazinas

Terpenos (sesquiterpenos)

CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS

Sabor y olor a corcho y/o moho

Sabor y olor fenólico, medicinal o a quemado

Sabores y olores terrosos

Sabores y olores a lodoSabores y olores a moho

Sabores y olores terrosos y/o a moho

Sabor y olor a moho

POSIBLES MICROORGA-NISMOS PRODUCTORESHongos filamentosos?

Actinomicetos?

Actinomicetos?

Penicillium? / Aspergillus?Penicillium? / Aspergillus?

Penicillium? / Aspergillus?

Penicillium roquefortii


1.4.1.- Posibles mecanismos de formación del 2,4,6-tricloroa-nisol.A pesar de la gran importancia del 2,4,6-TCA en el fenómenodel cork taint, el conocimiento que existe acerca de los meca-nismos que conducirían a su formación es más bien escaso.Aunque son varias las hipótesis enunciadas, los datos experi-mentales para intentar confirmarlas o refutarlas son casiinexistentes. Los hipotéticos mecanismos para su formaciónse resumen en la Figura 1.2.1.4.1.a.- Síntesis por catabolismo (deshalogenación y bio-metilación) de fenoles altamente clorados. El 2,4,6-TCA se originaría por catabolismo de fenolesaltamente clorados (mecanismo 1 en Figura 1.2) como elPCP o el 2,3,4,6-TeCP (Maarse et al ,1989; Tanner et al.,1981). También el hexaclorobenceno o el lindano (hexa-clorociclohexano) podrían originar 2,4,6-TCA por deshidro-halogenación (Neidlemann y Geigert, 1986). Estos com-puestos son muy tóxicos y su metilación para dar lugar aanisoles podría ser un mecanismo de detoxificación,puesto que los fenoles menos clorados tienen una menortoxicidad y además son más fácilmente biodegradablespor microorganismos anaerobios (Nicholson et al., 1992;Mohn et al., 1992).

1.4.1.b.- Deshalogenación de anisoles altamente clorados.El 2,4,6-TCA podría originarse por la eliminación de áto-mos de cloro (deshalogenación) de anisoles cloradoscomo el PCA o el 2,3,4,6-TeCA (Maarse et al., 1989;Tanner et al., 1981). Ver mecanismo 2 en Figura 1.2.

1.4.1.c.- Síntesis por halogenación (cloración) de anisolpor lavado de corcho con hipoclorito. Otros autores apuntan que la biometilación del fenolpodría ser anterior a la cloración (Neidleman y Geigert,1986). Así, los cloroanisoles se formarían a partir de ani-sol (metoxibenceno) durante la etapa de lavado con hipo-clorito que en ocasiones se realiza en el proceso de fabri-cación del tapón (mecanismo 3 en Figura 1.2). Algunosestudios indican que el 18% del corcho lavado con hipo-clorito contenía de 6 a 13 ng de 2,4,6-TCA por gramo ytodos contenían 2,4,6-TCP en el rango 19-301 ng porgramo de corcho (Sponholz y Muno, 1994). Por ello, elbaño clorado ha sido reemplazado por un lavado conperóxido de hidrógeno al 10% (conteniendo un 5% deamonio). Este proceso de cloración podría ser un procesode destoxificación que algunos microorganismos poseerí-an para eliminar átomos de cloro presentes en el ambien-te en el que crecen. También se ha postulado que la lim-pieza en la bodega con hipoclorito de los palés yestanterías donde se almacenan las botellas de vinosería otra posible causa de contaminación (Maujean etal., 1985).

1.4.1.d.- Síntesis endógena del núcleo fenólico y posterior

cloración y metilación.Maujean et al., (1985) sugieren que el núcleo fenólico del2,4,6-TCA podría formarse a partir de glucosa; ésta a tra-vés de la ruta de las pentosas fosfato originaría ácidosiquímico que sería el precursor del fenol, el cual seríaclorado para dar lugar a 2,4,6-TCP. Finalmente, este com-puesto sería metilado para su destoxificación medianteuna actividad metiltransferasa, en presencia de ácido fóli-co como cofactor y S- adenosilmetionina (SAM) comodonador de grupos metilo (mecanismo 4 de la Figura 1.2).1.4.1.e.- Biometilación a partir de clorofenoles como el2,4,6-TCP. En este caso el 2,4,6-TCA se formaría por biometilacióndirectamente a partir del 2,4,6-TCP (modelo 5 en Figura 1.2)(Silva Pereira et al., 2000b). Una posible fuente de clorofe-noles sería su absorción por la corteza del árbol. Los cloro-fenoles podrían tener su origen en la contaminación ambien-tal, debido a su uso como fungicidas y pesticidas en losalcornocales, o durante el almacenaje de las planchas paraprevenir el crecimiento de microorganismos (Kun y Suflita,1989). Independientemente de cual sea el proceso que dalugar a la formación de anisoles, parece claro que existeuna relación directa entre la contaminación del corcho conclorofenoles y la aparición de cloroanisoles. No podemos dejar de mencionar que los clorofenoles hansido ampliamente utilizados durante décadas como pestici-das y preservantes de la madera, tanto en agricultura comoen industria. En consecuencia han llegado a convertirse encontaminantes que pueden encontrarse en prácticamentecualquier ecosistema (Chaudhry y Chapalamadugu, 1991).De hecho, algunos estudios han demostrado que el 2,4,6-TCP y el 2,4,6-TCA son contaminantes de los ecosistemasacuáticos de agua dulce en Suecia (Nystrom et al., 1992).Este hecho se agrava por la elevada recalcitrancia de estoscompuestos a la degradación, lo que determina su persis-tencia en los ecosistemas durante periodos de tiempo muylargos.

1.4.2.- Los microorganismos del corcho y la producción de2,4,6-TCA. A pesar de que el 2,4,6-TCA es el principal agente respon-sable del cork taint (Amon et al., 1989; Buser et al.,1982), no existen apenas estudios que de manera inequí-voca identifiquen microorganismos productores de estecompuesto. La mayoría de los autores sugieren que loshongos filamentosos son los responsables de la síntesisde este compuesto: así Daly et al., (1984) y Sponholz yMuno (1994) hablan de un hongo que produce esporasnegras que cuando crece sobre corcho puede producir2,4,6-TCA. Silva Pereira y colaboradores (2000b) afirmanque algunos hongos aislados del corcho tienen bajopotencial de producción de 2,4,6-TCA a partir de 2,4,6-TCP (0.03% a 9,5%). Destacan el caso de Chrysonilia sito-phila, hongo que tras la fase de cocido y durante el alma-


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cenamiento en bodega experimenta un desarrollo incon-trolado (Calvo et al.,1995), debido a que la elevadahumedad relativa favorece su desarrollo.

A pesar de ello este hongo apenas puede sintetizar 2,4,6-TCA (sólo un 0.03% de 2,4,6-TCP es biometilado), lo cuales un hecho muy beneficioso para el corcho dado que su

Figura 1.2. Posibles mecanismos para la formación de 2,4,6-TCA: 1.- Síntesis por catabolismo de compuestos clora-dos (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981; Neidlemann y Geigert, 1986; Nicholson et al., 1992; Mohn et al,1992). 2.- Síntesis por deshalogenación de anisoles altamente clorados (Maarse et al., 1989; Tanner et al., 1981).3.- Halogenación de anisol mediante lavado de corcho con hipoclorito (Neidleman y Geigert, 1986; Sponholz y Muno,1994; Maujean et al., 1985). 4.- Síntesis endógena del núcleo fenólico y posterior halogenación y biometilación(Maujean et al., 1985). 5.- Biometilación directa de 2,4,6-TCP (Kun y Suflita, 1989; Silva Pereira et al., 2000b).

crecimiento imposibilitaría el crecimiento de otros microor-ganismos posiblemente nocivos, la mayoría de los cualeshabrían sido eliminados por el proceso de cocido.

1.4.3.- Posibles mejoras del proceso de fabricación paraevitar el cork taint o contaminación del corcho.El grave problema que para las industrias que manufactu-ran tapón de corcho ha llegado a ser el cork taint hahecho que algunos investigadores hayan propuesto que eltapón debiera ser considerado como una parte del vino yen consecuencia, tratado como un producto alimenticio a

lo largo de todo el proceso de fabricación.Así, Butzke et al. (1999) han propuesto las siguientesmedidas posibles a fin de disminuir la incidencia de esteproblema, y que tienen como principal objetivo minimizar elcontacto de la materia prima, tanto con organoclorados,como con posibles microorganismos productores de 2,4,6-TCA:1).- El uso de pesticidas y fungicidas conteniendo trazasde clorofenoles debería ser prohibido en los alcornocalesy áreas próximas, y los árboles sistemáticamente analiza-dos para verificar que están libres de este tipo de com-


puestos.2).- Puesto que ciertos niveles de clorofenoles y 2,4,6-TCA se han encontrado en muestras de corteza de alcor-noques, los alcornocales deberían, en lo posible, ser pro-tegidos de la polución industrial y aérea.3).- La corteza del alcornoque una vez retirada del árbolno debería entrar en contacto con el suelo, para evitar lacontaminación microbiana.4).- Las planchas de corcho no deberían almacenarse enel bosque, en condiciones ambientales que favorecen eldesarrollo de microorganismos, sino en instalacionesindustriales aireadas y saneadas (suelo de cemento).5).- Las planchas no deberían ser almacenadas o trans-portadas en palés u otra estructura de madera que puedacontener clorofenoles como conservantes de la madera.6).- El crecimiento microbiano sobre el corcho debería serevitado a lo largo de todo el proceso de fabricación.7).- El agua en que se cuece el corcho debería ser librede cloro y cambiada frecuentemente.8).- El tratamiento blanqueador con hipoclorito debería sereliminado y en general se debería evitar el uso de cual-quier agente halogenante.9).- Los lotes de tapones deberían ser almacenados encondiciones de baja humedad para evitar el desarrollo demicroorganismos, y siempre lejos de las planchas inicia-les de alto contenido microbiano.10).- Los tapones deberían ser almacenados en recipien-tes cerrados, sin contacto directo con el aire, para evitarla contaminación microbiana y la absorción de clorofeno-les y cloroanisoles presentes en la atmósfera.

1.5.- Los anisoles en la naturaleza.Los anisoles no son compuestos que hayan merecido unagran atención por parte de los investigadores. Vamos acontinuación a repasar las escasas referencias relaciona-das con este tipo de compuestos.

1.5.1.- Significado de la O metilación de clorofenoles: loscloroanisoles como productos resultantes de la destoxifi-cación de clorofenoles.Los clorofenoles son algunos de los xenobióticos másrecalcitrantes que podemos encontrar en la naturaleza,con el agravante de su amplia utilización como pesticidasy fungicidas en la agricultura o para la conservación de lamadera. Además, constituyen la base en muchas indus-trias químicas para la síntesis de otros plaguicidas máscomplejos y efectivos. No es pues de extrañar quemuchos investigadores se estén centrando en la búsque-da de posibles estrategias degradativas de estos com-puestos altamente contaminantes.Algunos estudios han demostrado que diversos anisoles ytioanisoles se pueden formar por O metilación a partir declorofenoles y clorotiofenoles por bacterias de los géneros

Rhodococcus, Acinetobacter y Pseudomonas aisladas delMar Báltico y de sedimentos de lagos de Suecia (Neilsonet al., 1988). Estos autores demuestran que dos espe-cies del género Arthrobacter (aisladas de muestras desuelo) son capaces de llevar a cabo la O metilación demono, di, tri y tetracloroguayacoles y PCP para dar lugar alos correspondientes anisoles derivados (Neilson et al.,1983). Esta reacción de O metilación no está limitada a microor-ganismos procariotas. Así Cserjesi y Johnson (1972) ais-laron a partir de material vegetal de un bosque canadien-se una cepa del hongo Trichoderma virgatum capaz debiometilar PCP para producir PCA.Otros autores han demostrado la O metilación de varioscompuestos fenólicos por el alga Euglena gracilis (Drotary Fall, 1985a y 1985b), el protozoo Tetrahymena thermo-phila (Drotar y Fall, 1986) y la levadura Saccharomycopsislipolytica (Drotar et al., 1987).

Esta reacción de O metilación sería un mecanismo quealgunos microorganismos han desarrollado para destoxifi-car o neutralizar los clorofenoles altamente tóxicos,mediante la metilación de su grupo hidroxilo muy reactivo.Ello supone su transformación en cloroanisoles con unatoxicidad despreciable si se compara con la del clorofenoldel que proceden. De hecho, la importancia de la reac-ción de O metilación de clorofenoles como mecanismo dedestoxificación ha sido señalada por varios autores(Cserjesi, 1967; Cserjesi y Johnson, 1972; Allard et al.,1987 y Neilson et al., 1988).Sin embargo, la información disponible sobre las reaccio-nes de O metilación que conducen a la formación de ani-soles es limitada. No obstante, en algunas bacteriascomo Rhodococcus, Acinetobacter y Pseudomonas se hadetectado una metiltransferasa constitutiva dependientede S-adenosilmetiononina (SAM) implicada en la forma-ción de anisoles y tioanisoles. Esta actividad puede meti-lar una amplia variedad de sustratos (cloro y bromofeno-les, clorotiofenoles, cloro y bromoguayacoles y cloro obromocatecoles) en mayor o menor grado, aunque mues-tra una mayor actividad hacia tiofenoles (Neilson et al.,1988).Por otro lado en el basidiomiceto Phanerochaete chrysos-porium (hongo ligninolítico que causa la podredumbreblanca de raices), se han detectado varias O-metiltransfe-rasas. Estas enzimas podrían estar implicadas en ladegradación de lignina y secundariamente intervendríanen la metilación de fenoles clorados y dioxinas, cuyadegradación parece tener lugar a través de intermediariosmetoxilados. De hecho, se cree que en estos procesosdegradativos el papel de la O metilación sería generar unsustrato intermediario capaz de ser atacado más fácil-mente por las lacasas y lignina peroxidasas de este


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hongo (Jeffers et al., 1997). Hasta la fecha se han descrito en P. chrysosporium tresmetiltransferasas diferentes implicadas en reacciones deO metilación:- Una 3-O-metiltransferasa específica de posición meta,con alta actividad hacia el grupo 3-hidroxilo de varios áci-dos benzoicos sustituidos (Jeffers et al., 1997).- Una 4-O-metiltransferasa que podría participar en lametilación de productos de degradación de la ligninacomo ácidos vainíllicos y siríngicos específicamente en laposición para (Eriksson et al., 1984).- Una O-metiltransferasa específica de fenoles 2,4-disusti-tuídos (Coulter et al., 1993). Esta enzima es interesanteporque, aunque metila preferentemente 3-metoxi y 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzaldehídos y ácidos benzoicos y ace-tofenonas 3,5-disustituídas, también puede metilar efi-cientemente 2,4-diclorofenol y 2,4-dibromofenol, paragenerar los correspondientes anisoles. Aunque el rangode sustratos de esta enzima sugiere un papel en el cata-bolismo de lignina, no podemos excluir la posibilidad deque sea responsable de la formación de 2,4,6-TCA y PCAobservados cuando P. chrysosporium crece bajo condicio-nes no limitantes de fuente de nitrógeno (Bhasker Reddyet al., 1998 y 2000).Debemos mencionar también que se han descrito reac-ciones de O metilación en las que intervienen metiltrans-ferasas que usan clorometano como donador de gruposmetilo en vez de SAM. Estas enzimas son responsablesde la producción de alcohol veratrilo (3,4-dimetoxibencilalcohol) por P. chrysosporium (Harper et al., 1990) y enel hongo Phellinus pomaceus de la producción de aniso-les a partir de distintos compuestos como 2-, 3- y 4-clo-rofenol y 2,6-diclorofenol (Harper et al., 1989; McNally etal., 1991).

1.5.2.- Los cloroanisoles como intermediarios en ladegradación de clorofenoles por basidiomicetos lignino-líticos.La lignina es el biopolímero más abundante en la natu-raleza y es muy resistente a la degradación dada sugran estabilidad química, debida a su estructura polife-nólica, muy parecida a la de la suberina (ver Figura1.1). Existen sin embargo algunos hongos basidiomice-tos que causan la podredumbre blanca de la raíz, comoPhanerochaete chrysosporium, que tienen una grancapacidad de degradación de este biopolímero.Curiosamente la batería de enzimas ligninolíticas son

de un gran interés como agentes que pueden degradarclorofenoles. Bhasker Reddi et al., (1998) han demos-trado que este hongo es capaz de mineralizar 2,4,6-TCPcuando crece en un medio en el que existe una limita-ción de la fuente de nitrógeno. Curiosamente cuandoeste microorganismo crece en un medio sin limitaciónde nitrógeno no degrada el 2,4,6-TCP sino que lo metila,aunque muy lentamente para producir 2,4,6-TCA.

1.5.3.- Los anisoles y su importancia en la industria ali-mentaria.Además del papel ya mencionado de los anisoles comoresponsables del cork taint, podemos encontrar en labibliografía algún ejemplo más en los que se cita a losanisoles como agentes responsables de olores y sabo-res desagradables en distintos alimentos. La primeramención que se conoce en la literatura sobre el papelde los cloroanisoles como contaminantes de alimentosdata del año 1966, cuando Engel y colaboradores infor-maron de la presencia de 2,3,4,6-TeCA en partidas dehuevos y pollo con un desagradable sabor a moho(Engel et al., 1966).Más tarde se demostró que el 2,3,4,6-TeCA era el agen-te responsable del mal olor de un lote de pollos (Curtiset al., 1972 y 1974). Estos autores demostraron que laformación de este compuesto podía tener lugar a partirde 2,3,4,6-TeCP por hongos filamentosos que crecíansobre el pollo como Penicillium crustosum, Aspergillussydowi y Scopulariopsis brevicaulis. Estos microorganis-mos también podían metilar PCP.En un trabajo paralelo Gee y Peel (1974) aislaron a par-tir de restos de comida de la basura en un restauranteun total de 116 aislados fúngicos pertenecientes a untotal de 26 especies. De ellos 99 (el 85.3%) podíanmetabolizar 2,3,4,6-TeCP, mientras que 68 de 116(58.6%) metilaban este compuesto a 2,3,4,6-TeCA, sien-do las especies más eficientes en ese procesoPenicillium corylophilum, Paecilomyces variotii yAspergillus sydowi.También se ha demostrado la implicación del 2,4,6-TCAy el 2,3,4,6-TeCA en el desagradable olor y sabor de unlote de frutas secas. En este caso se concluyó queestos compuestos se originaron a partir de los clorofe-noles presentes en grandes cantidades en los embala-jes de cartón reciclado utilizados, de donde pasaron alos alimentos (Whitfield et al., 1985; Tindale et al.,1989). El microorganismo identificado como responsa-ble fue el hongo Paecilomyces variotii (Whitfield et al.,


1991).También se ha demostrado la presencia de cloroanisolesen una partida brasileña de café contaminada con undesagradable olor fúngico (Spadone et al., 1990).Estos compuestos también han sido señalados comoproductores de olores y sabores desagradables en aguapara el consumo humano en Suecia (Nystrom et al.,1992). Así, el análisis de muestras de agua, tanto clora-das como no cloradas, permitió detectar niveles signifi-cativos de 2,4,6-TCA. Este estudio muestra que estecompuesto está presente en los ecosistemas acuáticosde agua dulce (ríos y lagos) de Suecia. Los autores indi-can que el 2,4,6-TCA probablemente se originaría pormetilación de 2,4,6-TCP, el cual podría aparecer en lasmuestras de agua como consecuencia del proceso decloración. En este estudio se aislaron varios microorga-nismos responsables de la metilación del 2,4,6-TCP:hongos filamentosos de los géneros Acremonium,Phialophora y Penicillium y sorprendentemente, tambiénvarios actinomicetos con esta capacidad. 2.- RESULTADOS Y ANÁLISIS

APARTADO 2A: CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIO-TA ASOCIADA A MUESTRAS DE CORCHO EXTREMEÑO.

Objetivo: Dado el escaso conocimiento de la microbiotaasociada a corcho en la Comunidad de Extremadura, pre-tendíamos profundizar en el análisis de la evolución de lapoblación microbiana a lo largo del proceso de fabrica-ción del tapón, así como caracterizar aquellos grupos demicroorganismos aislados que pudieran ser de interés.

2A.1.- Aislamiento de microorganismos a partir de mues-tras de corcho.Nuestro estudio comenzó con el aislamiento de microor-ganismos a partir de muestras de corcho correspondien-tes a distintas etapas del proceso de fabricación de tapónde corcho aglomerado. Se aislaron un total de 55 microor-

ganismos diferentes, inicialmente seleccionados en basea propiedades morfológicas y/o fisiológicas fácilmenteobservables y típicas de cada grupo. De esta manera inicialmente seleccionamos un total de69 aislados que parecían diferentes y que fueron artifi-cialmente agrupados como sigue:- Hongos filamentosos. Se seleccionaron en base a carac-terísticas morfológicas macroscópicas un total de 25 ais-lados (denominados F1 a F25) que pertenecieron a 14especies diferentes (ver apartado 2A.2.1).- Levaduras. Un total de 11 aislados, llamados Y1 a Y11,que correspondieron a ocho cepas diferentes (ver tabla2.2)

2A.2.2. Su identificación se llevó a cabo mediante lasecuenciación del ADNr 26S.- Bacterias no filamentosas. Aislamos 20 cepas (B1 aB20). Se seleccionaron en base a forma y coloración dela colonia en medio PCA, crecimiento a 30 ó 37ºC, tinciónde Gram, producción de endosporas y morfología celular.- Finalmente, aislamos un total de 13 actinomicetos, (A1a A13), seleccionados en base a su típica morfología fila-mentosa y el desarrollo de micelio en medio sólido. Loscaracteres empleados en su diferenciación fueron: colorde micelio sustrato y micelio aéreo, capacidad de esporu-lación y producción de exudado en medio MEY sólido, asícomo la producción de pigmentos en medio YPD líquido.

2A.2.- Caracterización de los microorganismos aislados.

2A.2.1.- Identificación de los hongos filamentosos aisladosde corcho.La identificación, en colaboración con la ColecciónEspañola de Cultivos Tipo (CECT), se llevó a cabo en basea aspectos morfológicos de la colonia, característicasmorfológicas macro y microscópicas del micelio y propie-dades fisiológicas (capacidad de crecimiento en distintosmedios a diferentes temperaturas).


AISLADO

F1, F2, F4, F5, F10F3F6F7, F20, F25F8F11F12F13, F17F14, F24F15, F22, F23F16F18F19F21

ESPECIE

Penicillium decumbensAcremonium strictumFusarium oxysporumTrichoderma longibrachiatumCladosporium oxysporumMucor plumbeusTrichoderma virideChrysonilia sitophilaPenicillium purpurogenum

Penicillium citreonigrumPaecilomyces viridisVerticillium sp.Penicillium chrysogenumMortierella alpina

DEPÓSITO EN LA CECT

Aislado F2: CECT 20418CECT 20419CECT 20420Aislado F25: CECT 20431CECT 20421CECT 20422CECT 20423Aislado F13: CECT 20424Aislado F14: CECT 20425Aislado F15: CECT 20426CECT 20427CECT 20428CECT 20429CECT 20430

Tabla 2.1. Listado de las diferentes especies de hongos filamentosos aisladas a partir de corcho.

Informe Técnico 45

Para la identificación a nivel de especie del aislado F18recurrimos a la secuenciación de su ADNr 28S, mientrasque las especies de Trichoderma se identificaron median-te un análisis RFLP de la región del ADNr 5.8S que contie-ne las regiones espaciadoras ITS1 e ITS2. Los hongos aislados pertenecían a 14 especies diferen-tes (ver tabla 2.1). El género dominante fue Penicilliumcon un total de cuatro especies aisladas. A continuacióndestacaba el género Trichoderma (dos especies), mien-tras que sólo se aisló una especie de los génerosAcremonium, Fusarium, Cladosporium, Mucor, Chrysonilia,Paecilomyces, Verticillium y Mortierella.

En general se trata de hongos cosmopolitas que se pue-den encontrar en suelo, aire y restos vegetales, especial-mente cuando las condiciones ambientales son de hume-dad elevada. Muchos de ellos ya habían sido aislados decorcho por otros autores (ver tabla 1.1 en introducción),aunque hay que destacar que algunas especies como P.citreonigrum, M. alpina o Verticillium sp. han sido detecta-das en corcho por primera vez.2A.2.2.- Identificación de las levaduras aisladas de corcho.La identificación se llevó a cabo mediante la secuenciaciónparcial de una región del ADN ribosomal 28S que incluye lasregiones D1 y D2. Las especies identificadas se recogen en la

Tabla 2.2. Listado de las diferentes especies de levaduras aisladas a partir de corcho.

AISLADO

Y1

Y2

Y3

Y4

Y5

Y6, Y9

Y7, Y8

Y11

ESPECIE

Cryptococcus sp. Y1

Rhodosporidium kratochvilovae

Debaryomyces hansenii var. fabryi

Sporobolomyces nylandii

Rhodotorula slooffiae

Sporobolomyces salmonicolor

Sporidiobolus johnsonii

Aureobasidium sp. Y11

TIPO

Basidiomiceto

Basidiomiceto

Ascomiceto

Basidiomiceto

Basidiomiceto

Basidiomiceto

Basidiomiceto

Levadura negra (Hongo imperfecto?)

Nº DE ACCESIÓN EN GENBANK

AY167602

AY167603

AY167604

AY167605

AY167606

AY167607

AY167608

AY167611

tabla 2.2. Apreciamos como la mayor parte de las levadurasaisladas son basidiomicetos, con la excepción del aislado Y3perteneciente a los hongos ascomicetos, y del aislado Y11perteneciente al enigmático grupo de las levaduras negras declasificación incierta, aunque algunos investigadores incluyenel género Aureobasidium dentro de los hongos imperfectos(Muñoz et al., 1996). Un total de seis levaduras se identificaron a nivel de especie,mientras que dos de ellas fueron sólo identificadas a nivel degénero y posiblemente se trate de nuevas especies.

2A.2.3.- Caracterización de las bacterias filamentosas aisladasde corcho.Se aislaron un total de 13 bacterias filamentosas con unaclara capacidad de formar micelio, y que por tanto se seleccio-naron como actinomicetos. De ellas únicamente se identificaron tres que para nosotrostenían algún interés como microorganismos con capacidadpara degradar ácido vainíllico y producir guayacol (datos nomostrados). En concreto, se trataba de los actinomicetos A3,A5 y A13.Para su identificación se secuenció su ADNr 16S. Lassecuencias obtenidas han sido depositadas en el

GenBank con las calves de acceso AY154478 (ADNr 16Sdel actinomiceto A3) y AY154479 (la entrada uno corres-ponde al ADNr 16S del actinomiceto A5 y la entrada dosal ADNr 16S del actinomiceto A13).Las tres secuencias mostraron una homología mayor del97% con secuencias de ADNr 16S de varias especies delgénero Streptomyces. Por tanto, podemos afirmar que lostres actinomicetos analizados pertenecen al géneroStreptomyces y por ello han sido denominadosStreptomyces sp. A3, Streptomyces sp. A5 yStreptomyces sp. A13.

2A.2.4.- Caracterización de las bacterias no filamentosasaisladas de corcho.Tradicionalmente las bacterias no filamentosas son elgrupo de microorganismos al que menos interés se haprestado en cuanto a su posible papel en el cork taint. Ennuestro caso obtuvimos 20 aislados diferentes, perodado su escaso interés como posibles productores de clo-roanisoles nuestro estudio se centró en identificar aque-llas cepas que pudieran llevar a cabo la degradación delácido vainíllico, como posibles responsables de la conta-minación del corcho por guayacol.


- El número de microorganismos decae notablemente apartir de la obtención del granulado (muestra E), posible-mente debido a los procesos químicos (mezcla con látex,poliuretano, colas, etc) y físicos (desintegración mecáni-ca) a que se somete el granulado para la obtención deltapón, y que son nocivos para los microorganismos.- En el producto final (tapón aglomerado tratado con SO2 omuestra G) el nivel de microorganismos es prácticamentenulo. Sólo ocasionalmente se aislaron hongos filamentososo bacterias no filamentosas en un número máximo de 4-6por gramo. En esta etapa nunca se detectaron levaduras niactinomicetos.- El mayor número de microorganismos correspondió a lamuestra almacenada en bodega (muestra C) donde sedetectaron los siguientes valores de microorganismos:* 2.23 (± 0.61) x 104 bacterias no filamentosas.* 6.19 (± 2.36) x 106 hongos filamentosos.* 6.90 (± 3.25) x 105 actinomicetos.* 5.35 (± 1.35) x 103 levaduras.En esta etapa y a diferencia con el resto de las muestraslos hongos filamentosos constituyen el grupo predominante.Esto es debido a que las condiciones de baja temperatura(20-24ºC) y alta humedad en bodega favorecen su creci-miento masivo.- Hay que destacar también que las poblaciones de bacte-rias no filamentosas predominan siempre sobre los actino-micetos. Esta tendencia se invierte en la muestra C, dondeel número de actinomicetos se dispara y llega a triplicar elnúmero de otras bacterias. Aunque no hay una explicaciónclara para este fenómeno podemos suponer que el granaumento de hongos filamentosos en esta fase podría resul-tar en la producción de antibióticos que llegarían a limitar elcrecimiento bacteriano, excepto en el caso de los actinomi-cetos, grupo que por su alta capacidad de producción deantibióticos han desarrollado unos elevados niveles de

resistencia.- Finalmente mencionemos que excepto en la muestra C elgrupo dominante es el de las bacterias no filamentosas, adiferencia de lo descrito por otros autores, que apuntan alos hongos filamentosos como población dominante a lolargo del proceso de fabricación.

2A.3.1.- Evolución de la población de hongos filamentososa lo largo del proceso.Tradicionalmente se ha considerado que los hongos fila-mentosos jugarían un papel fundamental en el proceso demaduración del corcho y en la calidad final del tapón (Leey Simpson, 1993; Silva Pereira et al., 2000a). Por ello,una vez realizada la cuantificación de la población de hon-gos filamentosos decidimos tratar de determinar quecepas aparecían en cada etapa del proceso de fabrica-ción, a fin de determinar la posible predominancia dealguna especie en cada paso. Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 2.4. Lasconclusiones que pudimos obtener de este estudio son:- Todas las especies pudieron ser aisladas a partir de cor-teza (muestra A). - Además, dos de los aislados, Mortierella alpina y Mucorplumbeus, sólo pudieron ser detectados en esta etapa.- El cocido o calentamiento del corcho (muestra B) provo-ca la desaparición de buena parte de los hongos filamen-tosos, puesto que un total de cinco especies nuncapudieron ser aisladas en esta etapa. - La posterior incubación en bodega o a la intemperie pro-voca que dos de estas especies vuelvan a aparecer encorcho (Acremonium strictum y Verticillium psalliotae).- El tratamiento químico y/o mecanico que sufren lasmuestras en la elaboración del tapón provoca en lasmuestras E y F la desaparición de un buen número deespecies, manteniéndose sólo aquellas más resistentes a


MUESTRA

(A) plancha no procesada de corcho crudo con corteza

(B) plancha cocida (hervida)

(C) plancha almacenada en bodega durante 3 semanas

(D) plancha almacenada a la intemperie un periodo de tiempo indeterminado

(E) granulado de corcho de 2-4 milímetros de diámetro

(F) tapón aglomerado y suavizado

(G) tapón aglomerado suavizado y tratado con SO2 (producto final)

Nº DE MICROORGANISMOS TOTALES/GRAMO DE CORCHO

3.57 (± 1.21) x 105

1.17 (± 0.45) x 105

6.91 (± 2.22) x 106

6.67 (± 2.34) x 106

1.35 (± 0.41) x 104

1.55 (± 0.68) x 101

0.40 (± 0.29) x 101

Tabla 2.3. Número de microorganismos totales aislados a partir de las diferentes muestras correspondientes al proceso de fabricación de tapón de corcho aglomerado.

Informe Técnico 47

este tipo de tratamientos.- En el producto final (muestra F) sólo se han podidodetectar de manera ocasional Cladosporium oxyspo-rum, Penicillium citreonigrum y Trichoderma longibra-chiatum.

- El tratamiento del tapón con SO2 es efectivo, puestoque el número de microorganismos en el productofinal se reduce considerablemente. Este tratamientotambién produce una disminución de la variedad deespecies detectadas, ya que pasamos de siete espe-

HONGO FILAMENTOSO

Acremonium strictum

Chrysonilia sitophila

Cladosporium oxysporum

Fusarium oxysporum

Mortierella alpina

Mucor plumbeus

Paecilomyces viridis

Penicillium chrysogenum

Penicillium citreonigrum

Penicillium decumbens

Penicillium purpurogenum

Trichoderma longibrachia-

tum

Trichoderma viride

MUESTRA A

3.0 (0.2)

6.6 (0.4)

10.4 (1.2)

2.1 (0.1)

1.8 (0.2)

2.4 (0.2)

5.2 (0.1)

12.9 (0.5)

10.2 (0.2)

14.8 (0.7)

4.0 (0.4)

13.2 (1.0)

10.3 (0.9)

3.1 (0.4)

MUESTRA B

ND

2.8 (0.3)

6.3 (0.4)

ND

ND

ND

8.4 (0.7)

9.2 (0.7)

15.2 (0.9)

2.8 (0.1)

12.1 (0.5)

20.3 (1.6)

18.5 (1.4)

4.4 (0.1)

MUESTRAC

0.8 (0.1)

57.4 (3.9)

6.4 (0.3)

ND

ND

ND

2.5 (0.2)

3.4 (0.1)

3.0 (0.1)

4.6 (0.2)

1.0 (0.1)

11.3 (0.6)

9.6 (0.6)

MUESTRA D

0.8 (0.2)

6.1 (0.3)

15.0 (1.0)

1.6 (0.2)

ND

ND

6.0 (0.7)

10.5 (0.8)

20.8 (1.2)

9.9 (1.0)

17.9 (2.0)

5.1 (0.4)

3.1 (0.4)

3.2 (0.4)

MUESTRA E

ND

2.2 (0.2)

20.4 (1.7)

ND

ND

ND

ND

ND

38.0 (4.1)

ND

22.4 (3.3)

10.2 (1.2)

6.8 (0.7)

ND

MUESTRA F

ND

1.3 (0.3)

38.5 (2.8)

ND

ND

ND

ND

8.4 (0.5)

38.6 (3.2)

3.0 (0.2)

ND

7.2 (0.8)

3.0 (0.5)

ND

MUESTRA G

ND

ND

34.2 (4.6)

ND

ND

ND

ND

ND

57.4 (7.8)

ND

ND

8.4 (1.3)

ND

ND

Tabla 2.4. Abundancia relativa (%) de las distintas especies de hongos filamentosos detectados en cada etapa del proceso de fabricación del tapón de corcho aglomerado.

Muestras de corcho: (A) plancha no procesada de corcho crudo con corteza; (B) plancha cocida (hervida). (C) plancha almacenada en bodega

durante tres semanas; (D) plancha almacenada a la intemperie un tiempo indeterminado; (E) muestra de corcho granulado; (F) tapón aglomerado

y suavizado; (G) tapón aglomerado suavizado tratado con SO2 (producto final). Los valores mostrados son la media de estimaciones hechas por

duplicado en 3 experimentos independientes. La desviación estándar se muestra entre paréntesis.

ND: no detectado.

Figura 2.1. Evoluciónde la población demicroorganismos a lolargo del proceso defabricación del tapónaglomerado de cor-cho. (A) plancha noprocesada de corchocrudo con corteza;(B) plancha cocida(hervida). (C) planchaalmacenada en bode-ga durante tres sema-

nas; (D) plancha almace-nada a la intemperie untiempo indeterminado; (E)muestra de corcho granu-lado; (F) tapón aglomera-do y suavizado; (G) tapónaglomerado suavizado tra-tado con SO2 (productofinal). Los valores mostra-dos son la media de esti-maciones hechas porduplicado en 3 experimen-tos independientes. Ladesviación estándar semuestra entre paréntesis.


APARTADO 2B: ANÁLISIS DE LA FORMACIÓN DE 2,4,6-TRICLOROANISOL POR HONGOS FILAMENTOSOS AIS-LADOS DE CORCHO.

Objetivo: El objetivo de este apartado era profundizar enel conocimiento del origen y los posibles mecanismosimplicados en la producción de 2,4,6-TCA por hongosfilamentosos aislados de corcho.

2B.1.- Análisis de la formación de 2,4,6-TCA por hongosfilamentosos creciendo directamente sobre corcho.Aunque son varias las hipótesis que intentan explicar elorigen del 2,4,6-TCA en corcho, los datos disponibles enla bibliografía, sin ser concluyentes, indicaban que elmecanismo más probable para la formación del 2,4,6-TCA sería la O metilación de 2,4,6-TCP. Con estos ante-cedentes decidimos ensayar la posible capacidad detodos los hongos filamentosos aislados para realizaresta bioconversión, cuando creciesen directamentesobre corcho. Para ello se desarrolló un ensayo que nospermitió imitar las condiciones de crecimiento de loshongos filamentosos en bodega durante el proceso defabricación del tapón. Los resultados obtenidos se reco-gen en la tabla 2.5.En ella vemos como 11 de las 14 especies analizadasincrementaban significativamente los niveles de 2,4,6-TCA en corcho cuando el granulado de partida fue suple-mentado con 2,4,6-TCP. Por el contrario, las muestrasde corcho no inoculadas con hongo filamentoso, o aque-llas a las que no se adicionó 2,4,6-TCP, no mostraronun incremento apreciable de los niveles endógenos de

2,4,6-TCA. Por tanto, podemos concluir que la conver-sión de 2,4,6-TCP a 2,4,6-TCA es un proceso biológicomediado por la acción, en nuestro caso, de un hongofilamentoso. En función de los resultados obtenidos loshongos filamentosos se clasificaron en 4 grupos:- Grandes productores de 2,4,6-TCA. Aquellas especiescomo T. longibrachiatum, T. viride y F. oxysporum quepodían bioconvertir más del 25% del precursor.- Moderados productores. La eficiencia de bioconversiónoscilaba entre el 10 y el 25%. En este grupo se incluíanA. strictum, C. sitophila y C. oxysporum.- Bajos productores, cuando el grado de bioconversiónera del 5-10%. En este grupo se encontraban P. viridis,P. chrysogenum y V. psalliotae.- Finalmente los no productores. Aquellos como M. alpi-na, M. plumbeus y P. decumbens para los que el porcen-taje de bioconversión fue siempre menor del 5%, ya quesólo pudieron ser detectadas trazas de 2,4,6-TCA (ladiferencia del contenido en 2,4,6-TCA respecto del con-trol no era superior al 0.15%). Estas pequeñas variacio-nes podrían ser achacadas a variaciones normales delmétodo de medida. Es necesario indicar que de estastres cepas sólo P. decumbens mostró capacidad paracrecer sobre granulado de corcho, por lo que la ausen-cia de 2,4,6-TCA en el caso de los cultivos de M. alpinay M. plumbeus podría ser debida a una falta de creci-miento más que a una incapacidad para sintetizar 2,4,6-TCA. Sin embargo, puesto que en cultivos en mediolíquido de estas tres especies, tampoco se detectaronniveles apreciables de 2,4,6-TCA podemos concluir quesu ausencia en los cultivos sobre corcho debería atri-


HONGO FILAMENTOSO

Muestra de corcho no inocula-

da

Acremonium strictum

Chrysonilia sitophila

Cladosporium oxysporum

Fusarium oxysporum

Mortierella alpina

Mucor plumbeus

Paecilomyces viridis

Penicillium chrysogenum

Penicillium citreonigrum

Penicillium decumbens

Penicillium purpurogenum

Trichoderma longibrachiatum

Trichoderma viride

2,4,6-TCAa

(- 2,4,6-TCP)

9.9

11.0

18.0

12.4

6.0

5.5

6.3

9.9

9.7

11.0

9.5

6.4

20.5

17.2

6.5

2,4,6-TCAa

(+ 2,4,6-TCP)

10.1

153.4

128.2

155.5

292.5

6.6

6.6

88.7

86.5

143.8

10.6

116.6

396.1

278.9

75.5

BIOCONVERSION (%) DE2,4,6-TCP EN 2,4,6-TCA

0

14.24

11.02

14.31

28.65

0.11

0.03

7.88

7.68

13.28

0.11

11.02

37.56

26.17

6.90

CRECIMIENTO SOBRECORCHO

ND b

+ c

+

+

+

- d

-

+

+

+

-

+

+

+

+

Tabla 2.5. Análisis por cromatografía de gases-masas de los niveles de 2,4,6-TCA formado a partir de 2,4,6-TCP por hongosfilamentosos creciendo directamente sobre granulado de corcho.

Informe Técnico 49

buirse a la incapacidad de estas cepas para su forma-ción. 2B.2.- Formación de 2,4,6-TCA a partir de distintos pre-cursores.Diversos autores han postulado que el 2,4,6-TCA podría for-marse por varios mecanismos diferentes a partir de distin-tos precursores. Por ello, una vez que habíamos identificadoa T. longibrachiatum como el hongo filamentoso que podíaproducir con mayor eficiencia 2,4,6-TCA por O metilación de2,4,6-TCP, y que además presentaba una alta capacidad decrecimiento sobre corcho, decidimos ensayar la posible exis-tencia en este hongo de otros posibles de mecanismos deformación de 2,4,6-TCA. Para ello, muestras de corcho con-teniendo diferentes precursores, se inocularon con estehongo (tanto en ausencia como en presencia de hipocloritosódico como agente halogenante) determinándose tras unperiodo de incubación adecuado el contenido de 2,4,6-TCA

a Los valores indicados en ng/g de corcho son la media de medidas hechas por duplicado en dos experimentos inde-pendientes según la metodología descrita por Álvarez-Rodríguez et al., (2002a)b ND, no detectado.c El número de UFCs por gramo de corcho tras la incubación fue mayor de 5.5 x 105.d El número de UFCs por gramo de corcho tras la incubación fue menor de 4.5 x 105.

del corcho.Los resultados de este experimento (tabla 2.6) fueron lossiguientes:- Los diclorofenoles, sólos o en presencia de hipoclorito, noson sustratos efectivos para la formación de 2,4,6-TCAmediante un mecanismo de O metilación y halogenación.- Tampoco detectamos niveles apreciables de 2,4,6-TCA enmuestras que contenían como posibles precursores com-puestos clorados como el hexaclorociclohexano, hexacloro-benceno, pentacloroanisol, 2,3,4,6-tetracloroanisol, PCP o2,3,4,6-TeCP. En estos casos el 2,4,6-TCA podría haberseformado mediante un proceso degradativo que implicaríanecesariamente la O metilación y deshalogenación del pre-cursor. - Entre los triclorofenoles ensayados el único sustrato efecti-vo para la formación de 2,4,6-TCA fue el 2,4,6-TCP: el nivelde conversión detectado era del 34.72%.

PRECURSOR

---2,3-DCP2,3-DCP2,3-DCP2,4-DCP2,4-DCP2,4-DCP2,5-DCP2,5-DCP2,5-DCP2,6-DCP2,6-DCP2,6-DCP3,4-DCP3,4-DCP3,4-DCPHexaclorociclohexanoHexaclorobencenoPCPPCA2,3,4,6-TeCP2,3,4,6-TeCA2,3,6-TCP2,4,5-TCP2,4,6-TCPAnisolAnisolAnisolFenolFenolFenol

HIPOCLORITOSÓDICO

--+-++-++-++-++-++----------++-++

T. LONGIBRACHIATUM

-++++-++-++-++-++-+++++++++++-++-

2,4,6-TCAa

8.6c

9.613.28.09.68.04.58.94.77.29.715.56.23.13.28.39.16.87.07.09.77.39.94.61.57.5

355.88.818.815.517.425.213.6

BIOCONVERSIÓN (%) DEL PRE-CURSOR EN 2,4,6-TCAb

---0

0.1000

0.0300

0.110.83

0000

0.05000

0.110

0.13000

34.720

1.020.690.881.660.50

Tabla 2.6. Análisis por cromatografía de gases-masas de la formación de 2,4,6-TCA por el hongo filamentoso T. longibrachiatum a partir de diferentes posibles precursores.


- Tampoco detectamos niveles apreciables de 2,4,6-TCA encultivos suplementados con anisol (ni siquiera en presenciade hipoclorito), compuesto a partir del cual el 2,4,6-TCApodría haberse producido directamente por halogenación. Una situación similar se dio en los cultivos desarrolladosen presencia de fenol. En este caso la producción de2,4,6-TCA implicaría una reacción de O metilación y unahalogenación para introducir átomos de cloro en la molé-

cula.Por tanto, podemos decir que en el hongo T. longibrachia-tum el único mecanismo efectivo detectado para la for-mación de 2,4,6-TCA es la O metilación de 2,4,6-TCP.Dicha reacción, que resulta en la introducción de ungrupo metilo sobre el grupo hidroxilo del clorofenol,podría ser llevada a cabo por un enzima metiltransferasaque podría usar S-adenosilmetionina (SAM) como dona-


a Los valores mostrados en ng/g de corcho son la media de dos experimentos independientes realizados por duplica-do según la metodología descrita por Álvarez-Rodríguez et al., (2002a).b Los valores indicados son el resultado de restar en cada caso el contenido endógeno de 2,4,6-TCA del corcho.c Valor considerado como contenido endógeno de 2,4,6-TCA del granulado de corcho utilizado en este experimento.

dor de grupos metilo, como podemos apreciar en la figu-ra 2.2. Una actividad enzimática similar, implicada en laformación de anisoles y tioanisoles, ha sido detectadaen bacterias aisladas a partir de lodos del Mar Báltico(Neilson et al., 1988). 2B.3.- Bioconversión de 2,4,6-TCP a 2,4,6-TCA en mediolíquido y su regulación.Los resultados resumidos en el apartado 2B.1 fueronimportantes porque demostraban la capacidad de varioshongos filamentosos, y más específicamente de T. longi-brachiatum, de producir 2,4,6-TCA en unas condicionesnaturales similares a las de maduración del corcho enbodega. Sin embargo, los ensayos a partir de cultivos sobre cor-cho nos planteaban varios problemas metodológicos gra-ves: incubaciones muy largas en el tiempo (25-30 días) yun complejo y costoso procedimiento de extracción del2,4,6-TCA de las muestras.Para evitar estos inconvenientes decidimos ensayar laposible producción de 2,4,6-TCA en medio líquido y su

valoración a partir de sobrenadantes de cultivos porHPLC, equipamiento disponible en nuestro laboratorio.

2B.3.1.- Desarrollo de un método para identificar 2,4,6-TCPy 2,4,6-TCA por HPLC en sobrenadantes de medios de cul-tivo.

Nuestro primer paso consistió en la puesta a punto de unmétodo de HPLC que nos permitiera separar eficazmenteen sobrenadantes de cultivos el 2,4,6-TCP y el 2,4,6-TCA,(además de otros compuestos como el 2,3,4,6-TeCP y el2,3,4,6-TeCA utilizados como estándares internos). La columna elegida fue una columna de fase reversaZórbax SB-C8 y se ensayaron diferentes fases móviles(metanol:agua, acetonitrilo:agua y acetonitrilo:ácido fórmi-co 5mM) en distintas proporciones, y tanto en régimenisocrático (lineal) como en gradiente. Tras varios intentos

Figura 2.2. Probable mecanismo de formación por T. longibrachiatum de 2,4,6-TCA por Ometilación de 2,4,6-TCP en una reacción catalizada por una actividad enzimática O-metil-transferasa (2,4,6-TCP metiltransferasa) que quizás pudiera usar SAM como donador degrupos metilo.

Informe Técnico 51

se consiguió una eficaz separación de estos compues-tos, que eluían en condiciones de régimen isocrático conuna fase móvil de metanol:agua (75:25) con los siguien-tes tiempos de retención: 2,3,4,6-TeCP (2.7 minutos);2,4,6-TCP (3.2 minutos), 2,4,6-TCA (5.8 minutos) y2,3,4,6-TeCA (6.8 minutos), como podemos apreciar enla figura 2.3.

Figura 2.3. Perfil cromatográfico de elución por HPLCde varios clorofenoles y cloroanisoles a una concentra-ción de 50 mg/ml en una columna Zórbax SB-C8. Laseparación se realizó en una fase móvil demetanol:agua (75:25) a un flujo de 1 ml/minuto en régi-men isocrático. Los compuestos se detectaron a unalongitud de onda de 230 nm.

2B.3.2.- Análisis de la bioconversión de 2,4,6-TCP en culti-vos en medio líquido.

Una vez que disponíamos de un método de análisis porHPLC y a fin de profundizar más en el mecanismo de lareacción de O metilación decidimos comprobar si T. longi-brachiatum podía producir 2,4,6-TCA en medio líquido. Paraello realizamos en paralelo dos cultivos en caldo extractode malta: en uno adicionamos el precursor 2,4,6-TCP y enotro no. A continuación tomamos muestras a distintos tiempos decultivo en las que determinamos los siguientes parámetros:crecimiento (determinado como peso seco de micelio), nive-les de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA en sobrenadantes y niveles dela hipotética actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa asociadaa micelio que sería responsable de la formación de 2,4,6-TCA. Los resultados se recogen en las figuras 2.4 y 2.5.La figura 2.4 nos muestra el resultado de analizar porHPLC los sobrenadantes del cultivo desarrollado en pre-sencia de 2,4,6-TCP en los que detectamos un compues-to cuyo tiempo de retención coincidía con el del 2,4,6-TCA. Así, apreciamos como en un cultivo de cero horas

(panel A) se aprecia un pico muy evidente de 2,4,6-TCP.Este pico decrece rápidamente a las 24 horas (panel B),a la vez que comienza a detectarse un pico incipiente de2,4,6-TCA. Los mayores niveles de este compuesto sedetectan entre las 48 y 72 horas de cultivo, momento enque los niveles de 2,4,6-TCP son indetectables (panel C).La identificación de este compuesto como auténtico2,4,6-TCA se basó en los siguientes datos:- Su presencia en el medio de cultivo es dependiente dela adición del precursor 2,4,6-TCP, no detectándosenunca en caso contrario (datos no mostrados).- La adición a un sobrenadante de cultivo de 72 horas deuna pequeña cantidad de 2,4,6-TCA exógeno produjo unincremento del pico identificado como 2,4,6-TCA (panel Dde la figura 2.4).- Este compuesto migra como auténtico 2,4,6-TCA en cro-matografía en capa fina (datos no mostrados).De las gráficas mostradas en la figura 2.5 podemosextraer varias conclusiones:- El hongo T. longibrachiatum tiene capacidad para trans-formar el 2,4,6-TCP presente en el medio de cultivo,como se puede concluir al ver su desaparición progresivaen el panel A. De hecho este compuesto no es detectadodespués de las 60 horas de cultivo.- Aproximadamente el 32% del 2,4,6-TCP es transforma-do a 2,4,6-TCA. Podemos apreciar como en el panel A yadetectamos la presencia de este compuesto a las 48horas de cultivo, acumulándose de manera progresivapara alcanzar un máximo en torno a las 60-72 horas.Posteriormente los niveles detectados decaen ligeramen-te hasta el final de la fermentación (120 horas). Nosabemos a que se debe esta ligera disminución de losniveles de 2,4,6-TCA en el cultivo. Podría deberse a unproceso de fijación al micelio, o a la posible evaporaciónal abrir los matraces para tomar las muestras (el 2,4,6-TCA es un compuesto relativamente volátil). Tampoco sepuede descartar una posible degradación, aunque cree-mos que es bastante improbable dada la gran estabili-dad química de este compuesto.- Es muy importante reseñar que no existe una correla-ción directa entre la cantidad de 2,4,6-TCP que desapare-ce del cultivo y la cantidad de 2,4,6-TCA que se produce.El 68% restante de 2,4,6-TCP podría ser degradado, oalternativamente convertirse en otro producto no detecta-do que fuese secretado al medio o metabolizado.Sin embargo, debemos mencionar que ensayos de mine-ralización de 2,4,6-TCP [C14] por T. longibrachiatum reali-zados en el laboratorio de la Dra. Mª Jesús Martínez(CIB, CSIC, Madrid) resultaron negativos. Por tanto, pode-mos concluir que el 2,4,6-TCP que no es convertido a2,4,6-TCA no se degrada hasta CO2. Este dato puedesugerir que parte del 2,4,6-TCP podría ser degradadohasta algún producto intermediario que pudiera ser incor-



Figura 2.4. Cromatogramas de HPLC correspondientes a sobrenadantes de un cultivo de T. longibrachiatum. (A).Cultivo de 0 horas. (B). Cultivo de 24 horas. (C) Cultivo de 72 horas y (D) cultivo de 72 horas al que se ha añadido2,4,6-TCA exógeno para confirmar la identidad de este compuesto. Los picos correspondientes a 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA se indican con flechas.

Figura 2.5. Comportamientode un cultivo de T. longibra-chiatum crecido en presen-cia (A) y ausencia (B) de2,4,6-TCP. Las gráficas mos-tradas son el resultado deanalizar por duplicado mues-tras correspondientes a tresexperimentos independien-tes. Los niveles de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA se determi-naron por HPLC a partir desobrenadantes de cultivos.

Informe Técnico 53

porado como material celular, aunque la confirmación deesta hipótesis requeriría complejos estudios.- La producción de 2,4,6-TCA es absolutamente depen-diente de la presencia de 2,4,6-TCP en el medio de culti-vo (nótese la ausencia de 2,4,6-TCA en el panel B). Estedato sugiere que al menos en las condiciones de nuestroensayo no hay síntesis endógena de 2,4,6-TCA a partirde precursores celulares. - Como era previsible detectamos asociada a micelio unaactividad O-metiltransferasa, que denominamos 2,4,6-TCPmetiltransferasa (ver panel A). Esta enzima sería la responsa-ble de la O metilación del precursor 2,4,6-TCP. Esta actividadcomienza a detectarse a las 36 horas de cultivo, alcanzandosu actividad máxima alrededor de las 48 horas, precediendopor tanto en unas 12 a 24 horas la máxima acumulación de2,4,6-TCA en sobrenadantes. A partir de las 48 horas, coinci-diendo con la desaparición del precursor 2,4,6-TCP, esta acti-vidad decae rápidamente. Este comportamiento, y el hechode que esta actividad es sólo residual en cultivos desarrolla-dos en ausencia de 2,4,6-TCP, (ver panel B), sugiere que setrata de un enzima inducible por sustrato. - Finalmente, se aprecia como en el caso del cultivo desarro-llado en presencia de 2,4,6-TCP existe inicialmente un retar-do notable del crecimiento del hongo de unas 20-24 horas(compárense los paneles A y B). Coincidiendo con la desapa-rición del 2,4,6-TCP, a partir de las 60 horas, ambos cultivostienen un comportamiento similar. De hecho, los máximosniveles de crecimiento se producen con un pequeño desfasede sólo 6 horas, entre las 60 y 72 horas de cultivo y sonparecidos en ambas condiciones. Estos datos sugieren unclaro efecto tóxico del 2,4,6-TCP sobre el hongo, efecto tran-sitorio que sin embargo desaparece en cuanto los niveles de2,4,6-TCP en el medio de cultivo son bajos o indetectables.

2B.3.3.- Regulación de la formación de 2,4,6-TCA por glucosay amonio en cultivos en medio líquido.En un intento de profundizar en la regulación de la formaciónde 2,4,6-TCA en T. longibrachiatum y dado el gran desconoci-miento sobre los procesos implicados en la formación deeste compuesto, decidimos abordar el estudio de su posibleregulación por mecanismos generales, como la represióncatabólica por fuente de carbono (glucosa) o la represión porfuente de nitrógeno (amonio). Para ello desarrollamos cultivosen caldo extracto de malta, en presencia de 2,4,6-TCP (10mg/ml), que fueron suplementados con glucosa (2%), amonio(50 mM) y glucosa más amonio. De estos cultivos procedi-mos a tomar muestras de sobrenadantes a distintos tiem-pos, en las que determinamos crecimiento (peso seco demicelio) y niveles de 2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA.Los resultados obtenidos se reflejan en la figura 2.6, de cuyoanálisis podemos extraer las siguientes conclusiones: - La formación de 2,4,6-TCA no está sujeta a regulación porglucosa (2%), amonio (50 mM) o una combinación de ambos,puesto que la eficiencia de bioconversión obtenida en todoslos casos fue muy parecida, variando ligeramente entre el29.2 y el 39.5%. De hecho, el nivel de 2,4,6-TCA detectadoen sobrenadantes de medios de cultivo es muy similar entodos los paneles (A, B, C y D), aunque con ligeras variacio-nes. - La desaparición del 2,4,6-TCP de sobrenadantes de mediosde cultivo no está sometida a regulación nutricional. No obs-tante, se aprecia un aumento en el nivel de crecimiento delcultivo que va asociado a un incremento de la velocidad conque el 2,4,6-TCP desaparece del medio (compárense lospaneles A y D). Este dato es perfectamente lógico: una mayortasa de crecimiento va a permitir una eliminación más veloz


APARTADO 2C: PURIFICACIÓN Y

CARACTERIZACIÓN DEL ENZIMA 2,4,6-TCP METIL-

TRANSFERASA DE Trichoderma longibrachiatum

IMPLICADA EN LA FORMACIÓN DE 2,4,6-TRICLO-

ROANISOL.

Objetivo: El objetivo fundamental de esta parte denuestro estudio era la purificación y caracterizaciónde la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa deTrichoderma longibrachiatum implicada en la for-mación de 2,4,6-TCA.

2C.1.- Análisis de la inducción de la actividad 2,4,6-TCPmetiltransferasa implicada en la formación de 2,4,6-TCAComo se indica en el apar tado 2B.3.2, los resultadosmostrados en la figura 2.5 sugerían que la actividad2,4,6-TCP metiltransferasa se comportaba como unenzima inducible. Para tratar de confirmar esta posibi-lidad realizamos un experimento con un sistema decélulas en reposo. Los resultados obtenidos (figura2.7), indicaban claramente la inducción de la actividadmetiltransferasa por su sustrato 2,4,6-TCP. En dichafigura se aprecia como en ausencia de 2,4,6-TCP laactividad asociada a micelio es sólo residual, mientrasque por el contrario los niveles de actividad enzimáticadetectados aumentaban considerablemente en micelioinducido. El efecto inductor se apreciaba rápidamenteuna hora después de la adición de 2,4,6-TCP y losniveles de actividad aumentaban notablemente hastaocho horas después de la inducción, para descender acontinuación.Una vez demostrado el carácter inducible de esta enzi-ma nos planteamos analizar el posible efecto inductorde varios clorofenoles, anisoles y otros compuestosclorados, así como también de compuestos aromáti-cos no halogenados. Como se aprecia en la figura 2.8el mayor efecto inductor correspondió al 2,4,6-TCP, alque arbitrariamente atribuimos un valor inductor de100. Otros clorofenoles clorados como el 2,4,5-TCP, el2,3,4,6-TeCP y el PCP también mostraron un claroefecto inductor.Por el contrario, tanto el 2-CP como el resto de dicloro-fenoles ensayados no fueron buenos inductores, pues-to que los valores de actividad relativa obtenidos osci-laban entre el 5.89% (± 0.94) para el 2-CP y el13.75% (± 0.81) del 3,4-DCP. Tengamos en cuentaque un cultivo no inducido (control negativo) mostróuna actividad relativa del 4.02% (± 0.28). Otros compuestos clorados, derivados o no del bence-no, como el hexaclorobenceno, el hexaclorociclohexa-no o el 1,3,5-triclorobenceno no actuaron como induc-

tores. Resultados similares se obtuvieron con anisolescomo el PCA o el 2,4,6-TCA, aunque en este caso siapreciamos una mayor actividad relativa (5.21% ±0.28) respecto del control negativo.

Por otro lado, los compuestos aromáticos no clorados(fenol, ácido vainíllico, guayacol y catecol) no actuaroncomo inductores. Estos resultados sugieren que lainducción de esta actividad enzimática es ejercida demanera específica por clorofenoles, especialmente sitienen tres o más átomos de cloro en su molécula.Un estudio complementario consistió en determinar lacantidad mínima de 2,4,6-TCP que podía inducir la sín-tesis del enzima. Para ello a un sistema de células enreposo se añadieron cantidades de 0, 1, 2.5, 5, 7.5,10, 12.5, 15, 20, 30 y 40 mg/ml de 2,4,6-TCP. La can-tidad más baja de este compuesto que fue capaz deinducir un aumento de la actividad fue 7.5 mg/ml. Losniveles de máxima actividad se obtuvieron para valoresde inductor comprendidos entre 10 y 20 mg/ml, mien-tras que cantidades superiores tenían un efecto negati-vo y producían un descenso de la actividad catalíticadetectada, posiblemente debido a que a estas concen-traciones se pone de manifiesto el carácter tóxico delcompuesto.


Figura 2.7. Inducción de la actividad 2,4,6-TCP metil-transferasa de T. longibrachiatum por el sustrato 2,4,6-TCP en un sistema de células en reposo.

Informe Técnico 55

2C.2.- Optimización del ensayo enzimático para la activi-dad 2,4,6-TCP metiltransferasa.Los primeros ensayos para detectar la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se realizaron según el método deNeilson et al. (1988). Los niveles así detectados eranbajos (Álvarez-Rodríguez, 2001) por lo que se intentómejorar el rendimiento del ensayo enzimático. Para elloanalizamos el efecto de varios parámetros en la reac-ción: pH, temperatura, tiempo de reacción, adición dedistintos compuestos, concentración de sustrato (2,4,6-TCP) y donador de grupos metilo S-adenosilmetionina(SAM).

2C.2.1.- Efecto de distintos compuestos sobre la actividad2,4,6-TCP metiltransferasa.La tabla 2.7 muestra el efecto de varios compuestossobre dicha actividad. Podemos apreciar como la reac-ción es absolutamente dependiente de la presencia deldonador de grupos metilo SAM en la mezcla de reacción.La presencia de EDTA, compuesto cuya inclusión en lamezcla de reacción es esencial para la actividad metil-transferasa de Rhodococcus sp. 1395 (Neilson et al.,1988) no tuvo el mismo efecto en nuestro caso. Dehecho, su adición provocó un ligero descenso de la activi-dad enzimática.La adición de metiltetrahidrofolato (MTHF), compuestoutilizado por algunas metiltransferasas como cofactor,produjo un ligero aumento de la actividad enzimática.Además su adición permitía contrarrestar el ligero efecto

negativo que el EDTA tenía sobre la actividad.Por el contrario, varios agentes reductores con grupos tíolcomo el ditiotreitol (DTT), el β-mercaptoetanol y la cisteínano incrementaron la actividad.El fluoruro de p-metilenfenilsulfonilo (PMSF), uno de losinhibidores de serina-cisteína proteasas más ampliamenteutilizados (Turini et al., 1969) para evitar problemas dedigestiones proteolíticas en mezclas proteicas, tampocotenía un claro efecto inhibidor de la actividad, a diferenciade lo que ocurre con otras metiltransferasas (James etal., 1995). Sorprendentemente la utilización conjunta deDTT y PMSF provocó un aumento del 47% en la actividadobtenida, revertiendo el pequeño efecto inhibidor delPMSF.Finalmente, la inclusión de glicerol al 10% (p/v) supusoun incremento de casi el 36% en los niveles de actividad,supuestamente debido a un efecto estabilizador sobre elenzima.A la vista de estos resultados decidimos incluir en la mez-cla de reacción glicerol (10%,), DTT y PMSF (1 mM). Por elcontrario, decidimos no incluir el EDTA en la mezcla dereacción, ni tampoco el MTHF, ya que aunque éste teníacierto estimulante dejó de ser suministrado por los fabri-cantes.

2C.2.2.- Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad2,4,6-TCP metiltransferasa.Para determinar el efecto del pH sobre la actividad enzi-mática obtuvimos extractos proteicos en diferentes tam-pones que cubrían el rango de pH 5-10. Los resultados

Figura 2.8. Análisis devarios compuestos aromá-ticos como posibles induc-tores de la actividad enzi-mática 2,4,6-TCPmetiltransferasa. El mayorefecto inductor observadocorrespondió al 2,4,6-TCPal que se asignó un valorarbitrario de 100. Los res-tantes datos mostradosson valores relativos res-pecto de ese valor. La acti-vidad metiltransferasa sedeterminó según la meto-dología descrita por Coqueet al., (2003).


Tabla 2.7. Efecto de diferentes compuestos sobre la actividad enzimática 2,4,6-TCP metiltransferasa.

obtenidos al valorar la actividad 2,4,6-TCP metiltransfera-sa de las distintas preparaciones se muestra en elpanel A de la figura 2.9. El enzima mostró su máximode actividad en un estrecho rango de pH de 8.2-8.5. ApH 8.0 y 9.0 el enzima retenía un 83.3% de actividad yun 87.5% respectivamente. El descenso de actividad eraacusado para pHs superiores a 9.0 o inferiores a 7.0.De hecho a pH 5.0, 6.0 ó 10.0 la actividad enzimáticadetectada era casi nula. Por lo que respecta a la temperatura (figura 2.9, panelB), vemos como la máxima actividad se detectó en elrango 25-28ºC, disminuyendo rápidamente a temperatu-ras superiores. La caída en los niveles de actividad esapreciable a 30ºC y acusada a 37ºC, mientras que a42ºC la actividad era sólo residual. A la vista de estosresultados seleccionamos como temperatura óptima deensayo 28ºC y como pH óptimo de reacción el valor de

8.2.

2C.2.3.- Efecto del tiempo de incubación sobre la activi-dad 2,4,6-TCP metiltransferasa.Se trataba de determinar durante cuanto tiempo la reac-ción enzimática tenía lugar de manera lineal. Para ellorealizamos varias reacciones enzimáticas con el mismoextracto proteico, que fueron paradas a distintos tiem-pos, determinándose en cada caso la cantidad de 2,4,6-TCA acumulada. Los resultados obtenidos se representan en la figura2.10. De la observación de esta gráfica se deduce que enlas condiciones del ensayo el enzima mantiene su activi-dad durante las cuatro primeras horas de incubación deuna manera casi lineal. Se trata de un aspecto llamativopuesto que no es normal que en una mezcla de reacciónun enzima sea activa por un periodo de tiempo tan prolon-


REACCIÓN

Normal- SAM- 2,4,6-TCP+ MTHF+ EDTA+ MTHF + EDTA+ β-Mercaptoetanol+ L-Cisteína+ DTT+ PMSF+ DTT + PMSF+ Glicerol

CONCENTRACIÓN(MM)

--0011

1 + 11111

1 + 11085.7 (10% p/v)

ACTIVIDAD ESPECÍFICA a

11.7100

13.9710.0111.959.8110.2510.629.3117.2215.91

ACTIVIDAD RELATIVA (%)b

10000

119.385.5102.083.887.590.785.2147.0135.9

a La actividad específica se expresa como picomoles de producto formados por minuto por mg de proteína. Los valoresmostrados son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado. Las variaciones detectadas entodos los casos fueron menores del 10%.b Arbitrariamente se atribuyó el valor de 100 a la actividad de una reacción enzimática normal sin ningún aditivo. Laactividad metiltransferasa se determinó según la metodología descrita por Coque et al., (2003).

2C.2.4.- Influencia de la concentración de los sustratosde reacción (2,4,6-TCP y SAM) sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.Otros parámetros que tratamos de optimizar para mejo-rar el ensayo enzimático fueron la influencia de la con-centración de los sustratos de reacción, 2,4,6-TCP ySAM sobre la actividad enzimática. Para ello realizamos dos series diferentes de reacciones:a).- reacciones en las que la concentración de 2,4,6-TCP enla mezcla de reacción variaba en el rango 0.04-4 MM, mante-niéndose constante la concentración de SAM en un valorsaturante de 2 MM. El resultado obtenido se resume en elpanel A de la figura 2.11. Podemos apreciar como la máximaactividad se obtuvo para una concentración de sustrato 0.25

MM, mientras que para valores superiores la actividad enzi-mática disminuía a valores de actividad relativa comprendi-dos entre el 41.6% y el 62.7%. Esta disminución del rendi-miento de la reacción podría deberse a un fenómeno deinhibición por altas concentraciones de sustrato, como seindica también en el apartado 2C.6.4.b).- reacciones en las que la concentración de 2,4,6-TCP semantuvo constante en 0.25 MM y variamos la concentracióndel donador de grupos metilo SAM para valores comprendi-dos entre 0.25-2.5 mM. Los resultados obtenidos (panel Bde la figura 2.11) sugieren que la actividad enzimáticaaumenta cuando se incrementa la concentración de SAM,hasta alcanzar el máximo de actividad para una concentra-ción 2 MM. En el ensayo decidimos, por una pura cuestión

Informe Técnico 57

Figura 2.9. Efecto del pH (A) y la temperatura (B) sobrela actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa. Los resultadosmostrados corresponden a la media de los valores obte-nidos en tres experimentos independientes realizadospor duplicado. La actividad metiltransferasa se determi-nó según la metodología descrita por Coque et al.,(2003).

Figura 2.10. Formación de 2,4,6-TCA por extrac-tos acelulares de T. longibrachiatum a lo largodel tiempo. Los resultados mostrados son lamedia de tres experimentos independientes rea-lizados por duplicado.

Figura 2.11. Efecto de la concentración de 2,4,6-TCP ySAM sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa.

económica, utilizar una concentración 1 mM de SAM, a pesarde que la actividad enzimática detectada era aproximada-mente un 36.75% menor.Una vez analizados estos parámetros realizamos en paralelodos tipos diferentes de reacciones enzimáticas:a).- reacciones según el ensayo inicialmente descrito porNeilson y colaboradores (1988) para una metiltransferasabacteriana.b).- reacciones en las cuales se modificaron varios paráme-tros, de acuerdo a los resultados descritos anteriormente depH y temperatura óptimas, influencia de distintos componen-tes en la mezcla de reacción, tiempo de reacción y concen-tración de sustratos, a fin de optimizar la reacción enzimáti-ca. Un resumen de las condiciones iniciales de reacción ytodas las mejoras y modificaciones realizadas en el ensayoenzimático se recogen en la tabla 2.8. Las mejoras obteni-das en el ensayo enzimático nos permitieron aumentar demanera muy notable el nivel de actividad enzimática detecta-da, como se pone de manifiesto en la figura 2.12.


Obsérvese la ausencia de actividad cuando el ensayo dereacción no incluía SAM (panel A), la débil actividad detec-tada con el ensayo descrito por Neilson et al., (1988)(panel B) y la mejora considerable de actividad detectadacon el ensayo optimizado en este trabajo (panel C), que

nos permitió pasar de una actividad específica de 108.7pmoles minuto-1 mg de proteína-1 en el panel B, a unaactividad específica en el panel C de 523.2 pmolesminuto-1 mg de proteína-1, lo que supuso una mejora deun 381.3%.


Tabla 2.8. Cambios realizados a fin de optimizar el ensayo enzimático de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa (laactividad se valoró según la metodología descrita por Coque et al., (2003).

Figura 2.12. Optimización delensayo de reacción para laactividad 2,4,6-TCP metil-transferasa. (A) Reacciónnegativa sin SAM; (B)Reacción realizada de acuerdocon el ensayo desarrollado porNeilson et al., (1988). (C)Reacción optimizada realizadasegún las condiciones indica-das en la tabla 2.8.

REACCIÓN INICIAL BASADA EN EL ENSAYODESCRITOPOR NEILSON ET AL., (1988)

* Tampón fosfato 100 mM pH 7.0

* MgCl2 1 mM

* EDTA 1 mM

* MTHF 0.04 mM

* 2,4,6-TCP 0.06 mM

* SAM 0.1 mM

* Temperatura de reacción: 30ºC

* Tiempo de reacción: 1 hora+ Glicerol

REACCIÓN MEJORADACOQUE ET AL., (2003)

* Tris 50 mM pH 8.2

* MgCl2 1 mM

* No EDTA

* No MTHF

* 2,4,6-TCP 0.25 mM

* SAM 1 mM

* Temperatura de reacción: 28ºC

* Tiempo de reacción: 3 horas

* DTT 1 mM

* PMSF 1 mM

* Glicerol 10% (p/v)

Informe Técnico 59

2C.3.- Estudios previos a la purificación de la actividad2,4,6-TCP metiltransferasa.

2C.3.1.- Precipitación con sulfato amónico.La precipitación con sulfato amónico es una técnicausada rutinariamente en la purificación de proteínas,generalmente como paso inicial del proceso. A vecestambién se utiliza para precipitar y concentrar las pro-teínas presentes en una mezcla. En nuestro casovarios experimentos de precipitación de las proteínaspresentes en un extracto crudo libre de células de T.longibrachiatum, con distintos porcentajes de sulfatoamónico, nos permitieron obtener las siguientes con-clusiones:- La actividad enzimática se repar tía como sigue: un0% en la fracción correspondiente a un porcentaje desal del 0-40%; un 32.1% en la fracción 40-60%; un66.8% en la fracción 60-80% y sólo el 1.1% en lafracción 80-100%.- El 93.4% de la actividad precipitaba con un porcen-taje de sal del 50-75%, mientras que en la fraccióncorrespondiente a un porcentaje de saturación 75-100% se detectó únicamente el 6.6% de la actividadrestante.- Estos estudios mostraron que concentraciones ele-vadas de sulfato amónico tenían un fuer te efecto inhi-bidor sobre la actividad metiltransferasa: la actividaddetectada tras el fraccionamiento por precipitaciónnunca era superior al 10% de la actividad inicialmentepresente en el extracto. La actividad, además, no serecuperaba aunque el sulfato amónico se eliminasepor diálisis prolongada o por desalado en una colum-na de Sephadex G-25.

2C.3.2.- Interacción de la actividad 2,4,6-TCP metil-transferasa con columnas de interacción hidrofóbica.Para comprobar la interacción de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa por interacción hidrofóbica convarias resinas utilizamos el HiTrap HIC Selection Kit(Amersham Pharmacia Biotech). A fin de favorecer lainteracción del enzima con cada resina se ensayarontres condiciones salinas diferentes: NaCl 3.5 M, tam-pón fosfato 1.5 M y Na2SO4 0.5 M. El uso de tampón fosfato se desechó porque a latemperatura de trabajo de 4ºC se producía precipita-ción proteica e indicios de precipitación salina. Demanera similar el uso de Na2SO4 se descar tó porquea 4ºC precipitaba en grandes cantidades y tenía unefecto inhibitorio de la actividad. Por tanto, la sal ele-gida fue el NaCl que no planteaba ningún problemade precipitación o inhibición de la actividad.El compor tamiento de las diferentes columnas del kit

se indica en la tabla 2.9. Como podemos ver la colum-na HiTrap Phenyl HP fue la que mostró un mejor com-por tamiento y por tanto la elegida para su uso en elproceso de purificación.

2C.3.3.- Interacción de la actividad 2,4,6-TCP metil-transferasa con columnas de intercambio iónico.Para comprobar la interacción de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa con varias resinas por intercam-bio iónico utilizamos el HiTrap IEX Selection Kit(Amersham Pharmacia Biotech). El tampón utilizadopara ensayar la interacción con resinas de intercambioaniónico fue Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), mientras que enel caso de intercambio catiónico utilizamos un tampónfosfato 50 mM (pH 6.8).El compor tamiento de las diferentes columnas del kitse indica en la tabla 2.9. Podemos apreciar como lametiltransferasa no se unía a los intercambiadorescatiónicos. Entre los intercambiadores aniónicos, losque mostraron un mejor compor tamiento fueron elHiTrap DEAE FF (intercambiador débil) y el HiTrap Q FF(intercambiador fuer te) por lo que se seleccionaronpara su uso en el proceso de purificación.

2C.3.4.- Estudio de la interacción de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa con matrices cromatográficas porafinidad o pseudoafinidad.Las técnicas cromatográficas de afinidad y pseudoafi-nidad son muy útiles para purificar proteínas ya quetienen la ventaja de permitir un alto grado de purifica-ción en un único paso. Así, metiltransferasas de hojasde Wollastonia biflora (James et al., 1995) y deBrassica oleracea (Attieh et al., 1995) han sido purifi-cadas gracias al uso de resinas de AMP-agarosa. Setrata de una técnica de pseudoafinidad basada en elparecido estructural que existe entre el AMP y la molé-cula de SAM. En nuestro caso intentamos dos estrate-gias diferentes para intentar purificar la metiltransfera-sa:

a).- una cromatografía de pseudoafinidad a una matrizde AMP-agarosa. Desafor tunadamente todos los inten-tos realizados fueron negativos y aunque se repitieronvarias veces en distintas condiciones (variando la fuer-za iónica y el pH, inclusión o no de glicerol en el tam-pón, etc.) el resultado siempre fue el mismo: la activi-dad 2,4,6-TCP metiltransferasa no era retenida porninguna de las dos matrices empleadas. Este resulta-do se puede considerar como normal, ya que dehecho, sólo un pequeño porcentaje de metiltransfera-sas interaccionan con matrices de AMP-agarosa(James et al., 1995).b).- una cromatografía de afinidad sobre una resina


a Fracciones ensayadas: extracto crudo (A); fracción no unida a la columna (B); lavado de la columna (C); eluído (D).b Nivel relativo de actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa: actividad detectada superior al 90% (+++); actividad detectadaentre el 60-90% (++); actividad detectada entre el 30-60% (+); actividad detectada inferior al 30% (+/-); actividad nodetectada (-).

En cuanto a la columna de 2,4,6-TCP-sefarosa creemos que la inmoviliza-ción del sustrato 2,4,6-TCP a travésde su grupo hidroxilo reactivo puedesuponer un impedimento a la interac-ción del sustrato con el enzima, yaque es obvio que para que tengalugar el proceso catalítico, y posible-mente también el reconocimiento delsustrato, el grupo hidroxilo debeestar libre.

2C.3.5.- Estabilidad a 4ºC y -20ºC.El conocimiento del grado de esta-bilidad del enzima 2,4,6-TCP metil-transferasa a 4ºC era de interés,ya que todo el proceso de purificación se realizaría adicha temperatura. El estudio se llevó a cabo con unapreparación proteica semipurificada, correspondiente alpaso 4 del proceso de purificación (columna DEAE FF.Ver apartado 2C.4.4). La muestra en tampón A [Tris-HCl50 mM (pH 8.0), MgCl2 2 mM] se suplementó convarias sustancias: glicerol al 10% (p/v), DTT 1 mM y


Tabla 2.9. Interacción de la actividad enzimática 2,4,6-TCP metiltransferasa con varias columnas cromatográficas deinteracción hidrofóbica e intercambio iónico.

Figura 2.13. Estabilidad a 4ºC del enzima 2,4,6-TCPmetiltransferasa en tampón A (pH 8.0) suplementadocon distintos compuestos. Los resultados mostrados sonla media de medidas realizadas por duplicado en dosexperimentos independientes. La actividad metiltransfe-rasa se determinó según la metodología descrita porCoque et al., (2003).

COLUMNA

1.- HiTrap Phenyl FF (high sub)

2.- HiTrap Phenyl FF (low sub)

3.- HiTrap Phenyl HP

4.- HiTrap Butyl FF

5.- Hitrap Octyl FF

1.- HiTrap DEAE FF

2.- HiTrap Q FF

3.- HiTrap ANX FF

4.- HiTrap Q XL

5.- HiTrap CM FF

6.- HiTrap SP FF

7.- HiTrap SP XL

NIVEL RELATIVO DE ACTIVIDAD 2,4,6-TCP METIL-TRANSFERASA DETECTADO EN CADA FRACCIÓN:

Col

umna

sde

inte

rac-

ción

hidr

ofób

ica

Col

umna

sde

inte

rcam

bio

ióni

-

catión

ico

anió

nico

Aa

+++b

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

B

-

-

-

-

+/-

-

-

-

-

+++

+++

+++

C

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

D

+

++

+++

+

++

+++

+++

+

++

-

-

-

Informe Técnico 61

SAM 0.1 mM, solas o en combinación y a continuaciónse mantuvo a 4ºC hasta un máximo de 15 días. Los resulta-dos obtenidos se pueden apreciar en la figura 2.13.El enzima mostró en tampón A una estabilidad pobre (vidamedia de 50 horas): tras cuatro días de incubación a 4ºCsólo retenía el 26.9% de la actividad inicial y únicamente el6.6% cuando la incubación se prolongó a 15 días. Estecomportamiento no mejoró significativamente por la inclu-sión de un 10% de glicerol (p/v) en el tampón. La estabili-dad aumentó por la adición de SAM (0.1 mM): el enzimaretenía el 24.7% de actividad el día 15 y su vida mediaaumentó hasta las 170 horas. Fue, sin embargo, el DTT (1mM) el compuesto que produjo un efecto más notable: elenzima retenía el cuarto día el 100% de actividad y en tornoal 60.1% el día 15, siendo su vida media de 290 horas. Porello, en todos los pasos de purificación se procedió a incluirDTT 1 mM a las preparaciones proteicas.El estudio de estabilidad del enzima a -20ºC se realizó en elmismo tampón A conteniendo glicerol al 10% (p/v): el enzi-ma retenía más del 85% de actividad tras 6 meses de con-gelación. Por otro lado, cuando el enzima fue sometida acuatro ciclos de congelaciones y descongelaciones sucesi-vas experimentó una pérdida de actividad de aproximada-mente el 35%.Finalmente, indicar que el enzima mostró una alta inestabili-dad tras el último paso de purificación (filtración en gel enSuperdex 200. Ver apartado 2C.4.6): su vida media a 4ºCen tampón A conteniendo DTT decayó a 20 horas y la activi-dad se perdía casi completamente tras congelación de laspreparaciones a -20ºC.

2C.3.6. Estabilidad a 42ºC.También se ensayó la estabilidad del enzima a 42ºC: la pre-paración proteica en tampón A suplementado con DTT 1mM, se incubó a esa temperatura, retirando muestras a dis-tintos intervalos en las que valoramos la actividad metil-transferasa a 28ºC. Los resultados obtenidos se recogen enla figura 2.14. El enzima mostró una baja tolerancia a laincubación a 42ºC. De hecho tras 15 minutos de exposiciónel enzima retenía sólo el 45.7% (±5.8) de actividad; paraincubaciones de 60 minutos la actividad disminuyó hasta el8.4% (±2.3) y hasta el 4.6% (±1.8) para prolongaciones de240 minutos.

2C.4.- Purificación de la actividad 2,4,6-TCP metiltrans-ferasa.Los resultados de aplicar técnicas convencionales para lapurificación a homogeneidad de la actividad 2,4,6-TCP metil-transferasa se resumen en la tabla 2.10. El enzima se puri-ficó 222.67 veces hasta una aparente homogeneidad, obte-niéndose una preparación de una actividad específica de550.00 pmoles minuto-1 mg de proteína-1. El rendimientodel proceso fue del 0.92%.

2C.4.1.- Paso 1. Obtención de extractos enzimáticos acelu-lares.El primer paso del proceso de purificación se realizó a par-tir de 6.0 gramos de micelio inducido con 2,4,6-TCP. A par-tir de dicho micelio se obtuvo por sonicación un extractocrudo que fue filtrado en columnas PD-10 (G-25) a fin deeliminar pequeñas moléculas, especialmente trazas de2,4,6-TCP y 2,4,6-TCA que pudieran interferir en los ensa-yos de valoración enzimática. Tras dicha filtración obtuvi-mos un total de 20 ml de extracto crudo que contenía480.89 mg de proteína (aproximadamente 24.04 mg deproteína por ml de cultivo) y una actividad total de1189.65 pmoles min-1.

2C.4.2.- Paso 2. Cromatografía de interacción hidrofóbicaen una columna Resource PHE.El segundo paso del proceso de purificación fue una cro-matografía de interacción hidrofóbica en columnaResource PHE que nos permitió captar la mayor parte dela actividad presente en el extracto. De hecho el rendi-miento de este paso fue del 80.95%. La actividad, unida a la columna en condiciones de altafuerza iónica (3.5 M de NaCl), se liberó a continuaciónusando un gradiente decreciente de NaCl, eluyendo la metil-transferasa en el intervalo 1.26-0 M de NaCl (ver figura2.15).Este paso fue realmente el más efectivo de todo el proce-so de purificación: sólo una pequeña fracción de las prote-

Figura 2.14. Estabilidad a 4ºC del enzima 2,4,6-TCPmetiltransferasa en tampón A (pH 8.0) suplementadocon distintos compuestos. Los resultados mostrados sonla media de medidas realizadas por duplicado en dosexperimentos independientes. La actividad metiltransfe-rasa se determinó según la metodología descrita porCoque et al., (2003).


ínas del extracto crudo fueron retenidas en la columna,

2C.4.3.- Paso 3. Ultrafiltración.Posteriormente las fracciones activas de la columnaResource PHE (20 ml) se concentraron por ultrafiltración enun Vivaspin 6 (con una membrana de polietersulfona de bajaadsorción de proteínas) con límite de exclusión molecular de50.000 Da. Este paso nos permitió eliminar una buena canti-dad de proteína (especialmente de tamaños nativos menoresde 50.000 Da), obteniéndose una muestra purificada 14.3veces con una actividad total de 667.37 pmoles min-1.

2C.4.4.- Paso 4. Cromatografía de intercambio aniónico encolumna HiTrap DEAE FF.La muestra se sometió luego a un intercambio aniónico débil(DEAE FF) a pH 8. La actividad se eluyó de la columna utili-zando un gradiente discontinuo de NaCl, detectándose activi-dad en las fracciones que eluían en el intervalo 40 a 125mM de NaCl (máxima actividad a 75 mM), como podemosapreciar en la figura 2.16. Este paso, aunque con una pérdi-da alta de actividad, nos permitió obtener una preparaciónpurificada 22.62 veces con una actividad total de 289.40pmoles min-1.

2C.4.5.- Paso 5. Cromatografía de intercambio aniónico encolumna Resource Q.El comportamiento de la actividad enzimática en una colum-na del intercambiador aniónico fuerte Resource Q a pH 8.2se representa en la figura 2.17: la actividad eluía en unrango muy estrecho de concentración de NaCl 25-65 mM(máximo alrededor de 45 mM). Este paso nos permitió obte-ner una muestra purificada 37.63 veces, aunque el rendi-miento del proceso decayó considerablemente al 6.33%(equivalente a una actividad total de 75.31 pmoles min-1).

2C.4.6.- Paso 6. Cromatografía de gel filtración en columnaSuperdex 200.El último paso del proceso de purificación fue una cromato-grafía de filtración en gel en una columna Superdex 200 quefracciona proteínas cuyo peso molecular se sitúa entre


Tabla 2.10. Etapas en la purificación de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum.

Fig. 2.15. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCPmetiltransferasa en una columna de interacción hidrofó-bica Resource PHE.

ETAPA DEPURIFICACIÓN

1.- Extracto crudo2.- Resource PHE3.- Ultrafiltración4.- HiTrap DEAE5.- Resource Q6.- Superdex 200

ACTIVIDAD TOTAL(pmoles min-1)

1189.65963.12667.37289.4075.3111.00

PROTEÍNA TOTAL(mg)

480.8933.6718.895.180.810.02

ACTIVIDAD ESPECÍFICA

(pmoles min-1 mgde proteína-1)

2.4728.6035.3255.8792.97550.00

RENDIMIENTO (%)

100.0080.9556.1024.336.330.92

PURIFICACIÓN (veces)

111.5814.3022.6237.64222.67

Fig. 2.16. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCPmetiltransferasa en una columna de interacción aniónicoHiTrap DEAE FF.

Informe Técnico 63

10.000 y 600.000 Da. Aunque el rendimiento obtenido eneste paso bajó hasta el 0.92% y la actividad total recuperadafue de 11.00 pmoles min-1, se trató de una técnica efectiva,ya que nos permitió obtener una preparación en la que lametiltransferasa eluía en un pico bien definido (ver figura2.18) que correspondía al enzima purificada aparentementea homogeneidad (el enzima había sido purificada 222.67veces).El análisis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida(SDS-PAGE) de las fracciones correspondientes al pico en elque detectamos actividad nos permitió detectar una única

banda proteica, que correspondía a un tamaño molecular de52.500 Da (ver figura 2.19.)

2C.5.- Identificación del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasapor fotomarcaje con sustratos radiactivos.Algunas metiltransferasas han podido identificarse mediantefotomarcaje (cross-linking inducido por luz ultravioleta) utilizandoun sustrato radiactivo (Som et al., 1990; Ruíz et al., 1998). Ennuestro caso utilizamos dos sustratos diferentes: - SAM[metil-3H]. En las fracciones correspondientes a los pasosfinales 4, 5 y 6 del proceso de purificación detectamos una pro-teína de un peso molecular aproximado de 52.000 Da, quecoincidía en tamaño con el enzima purificada, y que era marca-da débilmente con SAM tritiada (figura 2.20). La reacción defotomarcaje era inhibida cuando la muestra se preincubabadurante 10 minutos con SAHC 1 mM (compárense los carriles3 y 4 de la figura), lo que indica la especificidad del fotomarca-je. - La utilización de 2,4,5-TCP [UL-14C] en los experimentosde fotomarcaje resultó insatisfactoria, debido al alto númerode bandas que se marcaban, incluso en muestras corres-pondientes a los pasos 4 y 5 del proceso de purificación(datos no mostrados). Ello podría deberse a la gran reactivi-dad del grupo hidroxilo de los clorofenoles (responsable desu alta toxicidad), el cual reaccionaría de manera inespecífi-ca con una gran cantidad de proteínas. No obstante una

banda del tamaño esperado (52.500 Da)

se marca-ba conuna inten-sidad lige-ramentesuperior alresto

(datos no mostrados).

Fig. 2.17.Comportamientode la actividad2,4,6-TCP metil-transferasa enuna columna deintercambio anió-nico Resource Q.

Fig. 2.18. Comportamiento de la actividad 2,4,6-TCPmetiltransferasa en una columna de filtración en gelSuperdex 200.

Figura 2.20. Detección de la2,4,6-TCP metiltransferasa (indi-cada por una flecha) por fotomar-caje con SAM[metil-3H]. Carriles1 y 2: tinción con Azul Brillantede Coomasie de marcadores depeso molecular (carril 1) y mezcla de las fracciones activasdel paso 4 del proceso de purificación -columna DEAE FF-(carril 2). Carriles 3 y 4: reacciones de fotomarcaje de lamuestra proteica en ausencia (carril 3) y presencia (carril 4)de SAHC. También se detectó fotomarcaje del enzima purifica-da y en una mezcla proteica de las fracciones activas de lacolumna ResourceQ (datos no mostrados).

Fig. 2.19. SDS-PAGE del enzima2,4,6-TCP metiltransferasa obtenidatras el último paso de purificación(Superdex 200). Carrill 1: marcado-res de peso molecular; carril 2: enzi-ma purificada.


2C.6.- Caracterización de la actividad enzimática 2,4,6-TCPmetiltransferasa.La purificación de la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa nospermitió abordar una serie de estudios que requieren un alto

grado de pureza de la preparación proteica.La mayor parte de los estudios que se indican a continuación (aexcepción de la determinación del peso molecular nativo) se lle-varon a cabo con una preparación proteica semipurificada


Tabla 2.11.Efecto de tioles y otros compuestos, así como diferentes cationes sobre la actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum

COMPUESTO AÑADIDOa

NingunoMTHFGlicerolb-mercaptoetanolDTTL-CysTioglicolatoPMSFPMSF + DTT

CONCENTRACIÓNFINAL (MM)

--1

1085.7 (10% p/v)11111

1 + 1

ACTIVIDAD RELATIVA (%)b

100122.5121.7104.896.791.5102.580.6142.5

CATIÓN AÑADIDOa

Ca2+

Cu2+

Fe2+

Hg2+

Mg2+

Zn2+

Ag+

Cs+

Li+

NH4+

CONCENTRACIÓNFINAL (MM)

1

1

1

0.1

1

0.1

1

1

1

1

ACTIVIDADRELATIVA (%)b

84.5

3.8

82.0

3.75

96.8

18.2

5.9

84.6

100.9

84.1

correspondiente al paso 5 del proceso de purificación (columna Resource Q).2C.6.1.- Efecto de tioles y otros compuestos.El efecto de varios tioles (β-mercaptoetanol, DTT, L-Cys y ácido tioglicólico) y otros compuestos como el glicerol, el cofactorde metiltransferasas metiltetrahidrofolato (MTHF) o el reactivo para residuos de Cys y Ser PMSF se recoge en la tabla 2.11.

La adición de glicerol o MTHF a la mezcla de reacción produ-jo un ligero incremento en la actividad (como ya vimos en elapartado 2C.2.1).a La preparación enzimática en Tris-HCl 50 mM (pH 8.0) sepreincubó con cada compuesto o catión durante 10 minutosa 4ºC antes de añadir el resto de los componentes de lareacción.b Los valores de actividad relativa mostrados resultan deasignar a la reacción sin aditivos el valor de actividad 100.Los datos mostrados son la media de muestras ensayadaspor duplicado en dos experimentos independientes.Por el contrario, los distintos tíoles ensayados no mostraronun claro efecto inhibidor ni estimulante del proceso catalíti-co. Sin embargo, la adición conjunta de PMSF y DTT produ-cía de manera repetida un claro incremento del 42.5% de laactividad metiltransferasa. Resultados similares se obtuvie-ron con extractos crudos (apartado 2C.2.1).

2C.6.2.- Efecto de iones metálicos.Con frecuencia las metiltransferasas, sobre todo de plantasy animales, exhiben su máxima actividad en presencia de uncation bivalente como el Mg2+, mientras que otros como elHg2+ pueden tener un claro efecto inhibitorio (Poulton,1981). El efecto de varios cationes mono y divalentescomúnmente utilizados en este tipo de estudios, sobre laactividad 2,4,6-TCP metiltransferasa se recoge en la tabla2.11. La preparación enzimática en Tris-HCl 50 mM (pH 8.2)

se preincubó con cada ión durante 10 minutos a 4ºC, antesde la adición del resto de los componentes de reacciónNinguno de los cationes, ni siquiera el Mg2+, mostró unclaro efecto estimulatorio, lo que permite concluir que laactividad 2,4,6-TCP metiltransferasa no presenta requeri-mientos por cationes. Por el contrario, los cationes Hg2+ y Zn2+ (0.1 mM) y Cu2+ yAg1+ (1 mM), ejercieron un fuerte efecto inhibitorio.

2C.6.3.- Efecto de varios inhibidores de metiltransferasas.Cálculo de Ki para SAHC.La búsqueda de inhibidores se limitó a una serie de com-puestos que con frecuencia actúan como tales para lasmetiltransferasas dependientes de SAM. Entre ellos podemos citar tres tipos fundamentales: en pri-

Figura 2.21.Representaciónde Lineweaver-Burk para deter-minar el efectoinhibitorio de laSAHC sobre laactividad 2,4,6-TCP metiltransfe-rasa.

Informe Técnico 65

mer lugar reactivos de grupos tiol como la iodoacetamida, laN-etilmaleimida o el ácido p-cloro-mercuriobenzoico; ensegundo lugar quelantes catiónicos, como el EDTA y final-mente inhibidores competitivos como la S-adenosilhomocis-teína (SAHC). De hecho una de las características más nota-bles de las metiltransferasas que utilizan SAM comodonador de grupos metilo es el fuerte efecto inhibitorio queel producto desmetilado, SAHC, ejerce sobre ellas (Poulton,1981). El efecto de todos estos compuestos sobre la activi-dad se refleja en la tabla 2.12. En primer lugar podemosapreciar como entre los reactivos de grupos tiol únicamenteel p-cloro-mercuriobenzoato mostró un claro efecto inhibito-rio.

Por el contrario, el EDTA no se comportó como inhibidor, deacuerdo con las observaciones realizadas en el apartadoanterior que indicaban la ausencia de un requerimiento decationes para la actividad enzimática. Finalmente y comoera de esperar la SAHC mostró un claro efecto inhibidor. Afin de determinar el tipo de inhibición así como la constantede inhibición (Ki) se recurrió a una representación gráfica deLineweaver-Burk. El efecto de la SAHC (a una concentración400 mM) sobre la actividad enzimática se analizó para unaconcentración constante de 2,4,6-TCP (200 MM) y concen-traciones variables de SAM (100, 150, 250, 350 y 400MM).La gráfica obtenida (figura 2.21) confirmaba que la SAHC secomporta como un inhibidor competitivo de la metiltransfe-rasa, ya que se obtenían dos líneas rectas que se cortabanen el eje de ordenadas en un punto de valor 1/Vmax. Elvalor deducido de Ki fue de 378.84 MM.

2C.6.4. Análisis cinético: cálculo de los valores de Km.La 2,4,6-TCP metiltransferasa es una típica enzima bisustra-to en la que intervienen el 2,4,6-TCP como sustrato aceptory la SAM como sustrato donador del grupo metilo. Los valo-res de Km se determinaron, recurriendo a la representaciónde Lineweaver-Burk (figura 2.22). En primer lugar medimos

Tabla 2.12. Inhibición de la 2,4,6-TCP metiltransferasapor varios compuestos.

Figura 2.22. Representación de Lineweaver-Burk paradeterminar el tipo de reacción bisustrato y los valores deKm para los sustratos SAM (A) y 2,4,6-TCP (B) del enzi-ma 2,4,6-TCP metiltransferasa.

INHIBIDOR (1 MM)

Ninguno IodoacetamidaN-etilmaleimidap-cloro-mercuriobenzoatoEDTAS-adenosilhomocisteína

INHIBICIÓN (%)a

018.3 ± 2.916.5 ± 1.945.2 ± 6.65.8 ± 0.387.1 ± 5.6

a Los datos mostrados son la media de tres experimentosindependientes por duplicado.

la influencia en la velocidad de reacción de diferentes con-centraciones de SAM (100, 150, 250, 350, 450 y 600 MM)para cuatro cantidades constantes de 2,4,6-TCP (100, 150,200 y 300 MM).La representación gráfica generó varias líneas rectas que secortaban en el segundo cuadrante, en un punto que corres-

pondía a una Km para el sustrato donador SAM de 284.1MM (figura 2.22, panel A).Análogamente una Km de 136.0 MM se dedujo para el sus-trato aceptor, o 2,4,6-TCP, de la representación (figura 2.22,panel B) de los valores de velocidad de reacción que seobtuvieron para concentraciones variables de 2,4,6-TCP de50, 100, 150, 200, 250 y 300 MM respecto de cuatro con-centraciones constantes de SAM (100, 200, 300 y 400MM). En ambos casos comprobamos como el uso de con-centraciones de 2,4,6-TCP superiores a 300 mM provoca-ban una pérdida de la linealidad de los resultados, lo cualsugiere un fenómeno de inhibición por altas concentracionesde sustrato. Una conclusión similar se deduce de los resul-tados del apartado 2C.2.4.Como en el caso anterior, se obtuvieron una serie de rectasque se cortaban en un punto del segundo cuadrante. La grá-fica obtenida es típica de enzimas bisustrato que presentan


un mecanismo de reacción secuencial al azar. Esto es, elenzima tiene en su centro catalítico dos centros de unión,uno para cada sustrato. Ambos centros, además no sonindependientes, puesto que la unión de un sustrato va afavorecer la unión del otro, de tal manera que en el transcur-so de la reacción los sustratos pueden unirse al enzima demanera alternativa en cualquier orden.

2C.6.5. Determinación del tamaño molecular de la proteínanativa.Como se ha indicado anteriormente en el apartado 2C.4, elanálisis en geles de poliacrilamida de la proteína purificadanos permitió estimar un tamaño molecular de unos 52.500Da para su forma desnaturalizada. Para calcular el tamañode la forma nativa recurrimos a la cromatografía de filtraciónen gel, utilizando una preparación proteica correspondientea la quinta etapa del proceso de purificación (columna

Resource Q). Un estudio previo nos había permitido determi-nar que la actividad enzimática eluía en el volumen muertoen una columna Superdex 75 HR 10/30 (AmershamPharmacia Biotech), que tiene un rango efectivo de fraccio-namiento de 3.000 a 70.000 Da y un límite de exclusión de100.000 Da para proteínas globulares, lo que obviamentesugería que el enzima presentaba un tamaño mayor al dellímite de exclusión de dicha columna.Por tanto utilizamos una columna Superdex 200 HR 10/30,que tiene un límite de exclusión para proteínas globularesde 1.300.000 Da y un rango efectivo de fraccionamiento de10.000 a 600.000 Da. La columna, en las mismas condi-ciones en que se realizó el ensayo, había sido previamentecalibrada con varias proteínas globulares de peso molecularconocido: tiroglobulina (669.000 Da), ferritina (440.000 Da),aldolasa (158.000 Da), albúmina sérica bovina (67.000 Da)y anhidrasa carbónica (29.000 Da). Con los valores de Kav


Figura 2.23. Determinación del tamaño molecular del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa por filtración en gel en unacolumna Superdex 200 HR 10/30. El perfil de elución proteico de una mezcla de las fracciones activas del paso 5del proceso del purificación (columna Resource Q) se muestra en negro, mientras que en azul se indica la detecciónde la actividad enzimática en las fracciones recogidas. La calibración de la columna (ver recuadro de la parte supe-rior derecha de la figura) se realizó con varias proteínas de tamaños conocidos.

obtenidos de los volúmenes de elución se construyó unarepresentación gráfica frente a los logaritmos de los pesosmoleculares correspondientes (ver recuadro pequeño de lafigura 2.23). Como podemos ver en dicha figura la actividad 2,4,6-TCP

metiltransferasa eluyó entre los picos correspondientes a laaldolasa y la albúmica sérica bovina, con un valor de Kav de0.254, que correspondía a un peso molecular aproximadode 112.202 ± 2000 Da. El valor obtenido sugiere que en suforma nativa el enzima es un dímero, hecho por otro lado

Informe Técnico 67

Tabla 2.13. Especificidad de sustratos del enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa

SUSTRATO

Ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico Ácido 3-hidroxi-4-metoxibenzoicoÁcido 3,4-dihidroxibenzoico2-Metoxifenol1,2-Dihidroxibenceno3,4-Dihidroxibenzaldehído4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehídoFenol2-Clorofenol3-Clorofenol4-Clorofenol2,3-Diclorofenol2,4-Diclorofenol2,5-Diclorofenol2,6-Diclorofenol

GRADO DE METILACIÓNa

00000000

9.6100

22.51100.0019.5810.36

SUSTRATO

3,4-Diclorofenol

3,5-Diclorofenol

2,3,4-Triclorofenol

2,3,6-Triclorofenol

2,4,5-Triclorofenol

2,4,6-Triclorofenol

2,3,4,5-Tetraclorofenol



Pentaclorofenol

2,4-Dibromofenol

2,4,6-Tribromofenol

2,4,6-Trifluorofenol

2,4,6-Triyodofenol

GRADO DE METILACIÓNa

9.26

0

93.33

55.58

64.19

59.91

10.73

0

0

10.07

36.80

12.98

0

+ (NC)b

a Los datos mostrados son relativos respecto al sustrato metilado con más eficiencia (2,4-DCP), al que se le atribuyó unvalor arbitrario de 100. Los valores son la media de dos experimentos independientes realizados por duplicado. La actividadmetiltransferasa se determinó según la metodología descrita por Coque et al., (2003) pero variando en cada caso el sustra-to de reacción.b El sustrato 2,4,6-TIP fue metilado pero la cuantificación del producto 2,4,6-TIA no fue posible por no estar comercialmentedisponible.

relativamente común para muchas metiltransferasas (Jefferset al., 1997), aunque también es normal que puedan sermonomeros, dímeros o incluso tetrámeros (James et al.,1995; Dhar et al., 2000).2C.6.6. Análisis de especifidad de sustratos de la activi-dad 2,4,6-TCP MT.Una vez purificada el enzima 2,4,6-TCP metiltransferasarealizamos un análisis sobre los posibles sustratos sus-ceptibles de ser metilados por el enzima. Para ello ele-gimos una amplia variedad de alcoholes aromáticos yderivados, tanto halogenados como no halogenados,que se indican a continuación:-- Fenoles no halogenados como fenol, 1,2-dihidroxiben-ceno (catecol) y 2-metoxifenol (guayacol).-- Aldehídos aromáticos como el 3,4-dihidroxibenzaldehi-do y el 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina). -- Ácidos benzoicos hidroxilados como el 4-hidroxi-3-metoxibenzoico (ácido vainíllico), el 3-hidroxi-4-metoxi-benzoico (ácido isovainíllico) y el ácido 3,4-dihidroxiben-zoico-- Una amplia variedad de fenoles halogenados, sobre

todo clorofenoles (mono, di, tri, tetra y pentaclorofeno-les) y algunos otros fenoles halogenados con bromo,yodo y fluor. Los resultados obtenidos se resumen en latabla 2.13, pudiéndose realizar el siguiente análisis:- La reacción es altamente específica para fenoles halo-genados. De hecho el enzima no usa como sustratosalcoholes aromáticos no halogenados como el fenol, 2-metoxifenol o el 1,2-dihidroxibenceno, benzaldehídos yderivados hidroxilados del ácido benzoico.- El sustrato metilado con mayor eficiencia fue el 2,4-DCP, mientras que el nivel de metilación de otros DCPsdisminuyó progresivamente para 2,3-DCP, 2,5-DCP, 2,6-DCP y 3,4-DCP y no se detectó metilación del 3,5-DCP.- Entre los TCPs el mayor nivel de O metilación corres-pondió al 2,3,4-TCP, disminuyendo sucesivamente para2,4,5-TCP, 2,4,6-TCP y 2,3,6-TCP.- El único TeCP biometilado fue el 2,3,4,5-TeCP, mien-tras que no se detectó el anisol correspondiente en elcaso de los sustratos 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP.- Además el enzima puede metilar otros fenoles haloge-nados diferentes de los clorofenoles. De hecho se



detectó O metilación de bromofenoles como el 2,4-DBrPy el 2,3,4-TBrP, además de fenoles yodados (2,4,6-TIP).Curiosamente el derivado fluorado 2,4,6-TFP no fuemetilado.En todos los casos el nivel de metilación detectado fueinferior al del clorofenol correspondiente, lo cual sugie-re que el enzima tiene una mayor preferencia por el usode clorofenoles. De estos datos parece deducirse que lahalogenación de la posición dos (orto) parece ser importan-te para la actividad enzimática. Por otro lado, en clorofeno-les con la posición dos (orto) ocupada y que tienen dos omás atomos de cloro, la introducción adicional de un átomode cloro en la posición seis (orto) parece suponer un impe-dimento para la actividad enzimática. 3.- DISCUSIÓN GENERAL

3.1.- Caracterización de la microbiota asociada a muestrasde corcho extremeño.La caracterización de las especies microbianas, especial-mente fúngicas, que pueden ser aisladas a partir demuestras de corcho ha sido abordada por diversos auto-res (Davis et al. 1981; Lee y Simpson, 1993; Danesh etal.,1997). Algunos de estos trabajos se han realizado enEspaña: así se ha caracterizado la microbiota de alcorno-ques y corcho de bosques catalanes (Codina et al., 1993;Calvo et al., 1993 y 1995; Calvo y Agut, 1996), o delParque Nacional de los Alcornocales de Cádiz (Muñoz etal., 1996). Los géneros y especies identificados másrepresentativos se han recopilado en la tabla 1.1. Estos trabajos nos muestran que la microbiota fúngicaque podemos aislar de corcho es variable y está condicio-nada por la procedencia de las muestras, las condicionesambientales y otros factores locales propios de la regiónorigen de la muestra (Silva Pereira et al., 2000). Existen, sin embargo, una serie de especies que son ais-ladas de manera recurrente y que por tanto deberían serconsideradas como microorganismos saprófitos del cor-cho, ya que su presencia es casi universal, independien-temente del origen de las muestras. Entre ellas podemoscitar a Chrysonilia sitophila que es el hongo dominantedurante la fase de crecimiento en bodega (Danesh et al.,1997; Silva Pereira et al., 2000a y 2000b), especies deTrichoderma como T. viride y T. longibrachiatum y variasespecies del género Penicillium.En nuestro caso hemos aislado un total de 14 hongosfilamentosos de los cuales 11 habían sido previamentedescritos en corcho. Sin embargo, en nuestro trabajohemos detectado por primera vez en corcho las especiesMortierella alpina, Penicillium citreonigrum y Verticilliumpsalliotae (Álvarez-Rodríguez et al., 2002a y 2003b).Del total de especies aisladas un total de 11 pudieroncrecer de manera eficiente sobre corcho (ver tabla 2.5).

Sin embargo, M. alpina, Mucor plumbeus y Penicilliumdecumbens no fueron capaces de crecer sobre granuladode corcho, lo que quizás sugiere que más que microorga-nismos saprófitos del corcho podrían ser consideradoscomo contaminantes ocasionales de las muestras (Álva-rez-Rodríguez et al., 2002a, 2003b y 2003c).En cuanto a la aparición de los aislados a lo largo de lasdistintas etapas de fabricación del tapón podemos desta-car (ver tabla 2.4) como sólo las especies C. oxisporum,P. citreonigrum y T. longibrachiatum pudieron ser aisladasa lo largo de todo el proceso. Además, el tratamiento deltapón con S02, como método antimicrobiano, para preve-nir el crecimiento de microorganismos durante el transpor-te y almacenamiento de los tapones es sólo parcialmenteefectivo en el caso de los hongos filamentosos, puestoque pasamos de un total de siete especies detectadas enla muestra F (no tratada), a sólo tres en la muestra G,tras el tratamiento con este producto.A diferencia del elevado número de estudios analizandolas poblaciones de hongos filamentosos asociadas a cor-cho, apenas si se han realizado intentos de aislar y carac-terizar las levaduras presentes. Como consecuencia, delas ocho levaduras aisladas en este trabajo, todas excep-to Sporidiobolus johnsonii, Aureobasidium sp. Y11 yCryptococcus sp. Y1 han sido detectadas por primera veza partir de corcho (Álvarez-Rodríguez et al., 2003a). Encuanto a las bacterias presentes en corcho, tradicional-mente se ha venido aceptando que su papel como micro-organismos implicados en el cork taint es menos impor-tante. Por ello en nuestro caso nos hemos centradoúnicamente en la caracterización de aquellas con capaci-dad de degradación de ácido vainíllico.

3.2.- Mecanismo de formación de 2,4,6-TCA por hongosfilamentosos creciendo directamente sobre corcho. De entre la amplia variedad de microorganismos que pudi-mos aislar de corcho los hongos filamentosos eran loscandidatos más probables como agentes responsablesdel cork taint. Por ello este trabajo se ha centrado funda-mentalmente en su análisis.

3.2.1.- Formación de 2,4,6-TCA por O metilación de 2,4,6-TCP.De todos los mecanismos posibles para la formación de2,4,6-TCA propuestos por diferentes autores la O metila-ción de 2,4,6-TCP nos pareció el más probable. Para partirde esta hipótesis tuvimos en cuenta los trabajos previos deCserjesi y Johnson (1972) que habían detectado biometila-ción de PCP por T. virgatum y los trabajos de Curtis et al.,(1972, 1974) y Gee y Peel (1974) que habían detectado enpollos la presencia de 2,3,4,6-TeCA sintetizado a partir de2,3,4,6-TeCP por varios hongos filamentosos. Otros autoreshan postulado que diferentes hongos filamentosos son losprincipales responsables de la producción de este com-

Informe Técnico 69

puesto (Daly et al.,1984; Sponholz y Muno, 1994; SilvaPereira et al., 2000a), y apuntan a los géneros Penicilliumy Trichoderma como los principales candidatos.Los resultados mostrados en la tabla 2.5 son de gran inte-rés, ya que es la primera vez que se demuestra de maneraconcluyente que hongos filamentosos, creciendo directa-mente sobre corcho, pueden ser los responsables de laformación de 2,4,6-TCA y su acumulación en el tapón decorcho.Sorprendentemente un total de 11 de los 14 aislados(78.6%) mostraron capacidad, en mayor o menor medida,para sintetizar este compuesto. Ello sugiere que la Ometilación de clorofenoles, en este caso 2,4,6-TCP,podría ser una reacción muy común en los hongos fila-mentosos. De hecho Gee y Peel (1974) apuntan que de116 aislados de muestras de pollo un total de 68 podíanproducir 2,3,4,6-TeCA, porcentaje del 58.6% que es sensi-blemente inferior al obtenido en nuestro caso.De manera llamativa, en nuestro estudio C. sitophilaquedó incluido dentro del grupo de los moderados produc-tores (eficiencia de bioconversión del 11.02%). Este resul-tado es de signo opuesto al apuntado por Silva Pereira etal., (2000b), que indican que este microorganismo exhibeuna eficiencia de biometilacion del 2,4,6-TCP del 0.03%.Esta diferencia en los resultados obtenidos podría deber-se a la diferente metodología empleada, o quizás a unadistinta capacidad metabólica de las cepas empleadas enambos estudios.

3.2.2.- Análisis de otros posibles mecanismos de forma-ción de 2,4,6-TCA por T. longibrachiatum.Una vez establecido que un porcentaje elevado de loshongos filamentosos aislados podían producir 2,4,6-TCAdecidimos elegir a T. longibrachiatum como microorganis-mo modelo de estudio. Para ello nos basamos en lossiguientes hechos:a).- fue el hongo filamentoso que presentó un mayor nivelde bioconversión.b).- mostraba una buena capacidad de crecimiento sobrecorcho.c).- se trata de un microorganismo para el que existendistintas técnicas de manipulación genética puestas apunto que podrían sernos de utilidad en un futuro.El análisis de otros posibles mecanismos para la formaciónde 2,4,6-TCA a partir de otros sustratos y por diferentesmecanismos fue negativo (ver tabla 2.6). Esto no es sor-prendente si tenemos en cuenta los siguientes razonamien-tos:1).- Parece improbable que el 2,4,6-TCA pueda originarsea partir del catabolismo de otros fenoles o anisoles alta-mente clorados como el PCP, PCA, hexaclorociclohexano,hexaclorobenceno, 2,3,4,6-TeCP o 2,3,4,6-TeCA comoplantean diferentes autores (Maarse et al., 1989; Tanner

et al., 1981; Neidlemann y Geigert, 1986; Nicholson etal, 1992; Mohn et al, 1992). Tengamos en cuenta que ladegradación de clorofenoles es un proceso complejo en elque se originan intermediarios de tipo quinonas, comoresultado de reacciones del tipo deshalogenación oxidati-va (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000; Wieser et al.,1997; Xun, 1996 y Xun y Orser, 1991) que en ningúncaso permiten explicar la aparición de 2,4,6-TCA comoproducto intermedio.2).- Tampoco detectamos formación de 2,4,6-TCA por unmecanismo de síntesis endógena de fenol y posteriorhalogenación para dar lugar a 2,4,6-TCP que debería serbiometilado. Parece muy extraño que un microorganismosintetice un compuesto tan tóxico como el fenol o el2,4,6-TCP, con el elevado gasto energético que conlleva,para luego tener que detoxificarlo por un mecanismo de Ometilación.3).- El tratamiento de corcho con hipoclorito sódico enpresencia de distintos compuestos susceptibles de serclorados, como fenol, anisol o varios diclorofenoles(mecanismo propuesto por autores como Neidleman andGeigert, 1986; Sponholz y Muno, 1994 y Maujean et al.,1985) tampoco nos permitió detectar niveles apreciablesde 2,4,6-TCA.4).- La biometilación directa de 2,4,6-TCP fue el únicomecanismo que permite explicar la formación de 2,4,6-TCA. El uso como posible precursor de otros triclorofeno-les también dio resultados negativos, lo cual es lógicoporque la O metilación de 2,3,6-TCP debería producir2,3,6-TCA y no se conoce ningún mecanismo que puedaexplicar la transformación de éste a 2,4,6-TCA.Los resultados obtenidos, sin embargo, no nos permitenexcluir la posibilidad de que el 2,4,6-TCA pueda ser sinte-tizado por alguno de estos mecanismos u otros, comoresultado de la acción conjunta de dos o más microorga-nismos presentes en el corcho, en un típico ejemplo decometabolismo.

3.3.- Análisis de la bioconversión en medio líquido de 2,4,6-TCP por T. longibrachiatum.En un trabajo previo (Álvarez- Rodríguez, 2001) ya había-mos demostrado que T. longibrachiatum era capaz de bio-metilar aproximadamente un 35% de 2,4,6-TCP para darlugar a 2,4,6-TCA, mientras que el resto de precursor des-aparecía del cultivo líquido.

3.3.1.- O metilación del 2,4,6-TCP.El estudio realizado en medio líquido que se representaen la figura 2.5 confirmó que una parte del 2,4,6-TCP pre-sente en el medio de cultivo era O metilado a 2,4,6-TCA.Este estudio nos permitió además extraer otra serie deconclusiones importantes:1).- En ausencia de precursor no pudimos nunca detectar


ORIGEN Y BIOSÍNTESIS DETCA EN EL CORCHO

2,4,6-TCA, lo cual sugiere que no se sintetiza de maneraendógena, como podemos también deducir de los resulta-dos recogidos en la tabla 2.5. 2).- Se ha detectado una actividad enzimática 2,4,6-TCPmetiltransferasa asociada a micelio que mostraba unacinética de expresión típica de enzimas inducibles. El aná-lisis de la regulación de esta actividad enzimática por glu-cosa y amonio fue negativo (ver figura 2.6). De hecho losniveles de 2,4,6-TCA detectados en sobrenadantes de cul-tivo en todas las condiciones ensayadas fueron muy pare-cidos, oscilando el nivel de bioconversión en el rango 29-39%. Este hecho es significativo si tenemos en cuentaque en el caso del basidiomiceto P. chrysosporium se haobservado formación de 2,4,6.-TCA y PCA, a partir de2,4,6-TCP y PCP respectivamente, cuando el microorganis-mo crece en un medio que contiente amonio 12 mM(Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000). Sin embargo, enausencia de amonio el 2,4,6-TCP es mineralizado a CO2 yno se detectan niveles de 2,4,6-TCA, lo que sugiere laexistencia de mecanismos regulatorios por fuente de car-bono y nitrógeno que controlan la degradación de clorofe-noles y lignina y la reacción de O metilación de estoscompuestos en este hongo basidiomiceto.

3.3.2.- ¿Qué ocurre con el resto del 2,4,6-TCP que no es Ometilado a 2,4,6-TCA?.La degradación de clorofenoles en condiciones aeróbicases un fenómeno ampliamente estudiado tanto en hongosbasidiomicetos (Bhasker Reddi et al., 1998 y 2000; Ullahet al., 2000; Leontievsky et al., 1997 y 2000) como enbacterias (Xun y Orser, 1991; Xun, 1996; Wieser et al.,1997). Sin embargo, no existen en la literatura trabajossobre la degradación de estos compuestos por hongosfilamentosos, a pesar de que como indican Gee y Peel(1974) un total de 99 de 116 aislados fúngicos de pollopodían metabolizar 2,3,4,6-TeCP. También Cserjesi yJohnson (1972) detectaron que T. virgatum podía metabo-lizar PCP.En este trabajo hemos detectado que T. longibrachiatumes capaz de biometilar del 29.2 al 39.5% del 2,4,6-TCPpresente en el medio de cultivo, mientras que el resto delprecursor desaparece totalmente (Álvarez-Rodríguez et al.,2002a y 2003c). Existen varias posibilidades para expli-car este hecho:1).- Puede que el 2,4,6-TCP sea fijado por el micelio delhongo. La extracción de éste con metanol y el posterioranálisis por HPLC no permitieron detectar trazas de estecompuesto, lo cual sugiere que no es esta la causa de sudesaparición.2).- Otra posibilidad es que el compuesto sea degradadototalmente hasta CO2 (mineralización). Sin embargo, estu-dios de mineralización de 2,4,6-TCP[14C] realizados en ellaboratorio de la Dra. Mª Jesús Martínez (CIB, CSIC,

Madrid) resultaron negativos, lo cual sugiere que T. longi-brachiatum no puede mineralizar este compuesto.3).- Una tercera posibilidad es que el 2,4,6-TCP sea par-cialmente degradado hasta un intermediario incorporado abiomasa celular o eliminado al medio de cultivo. Dada ladificultad técnica de este tipo de análisis abordamos elestudio de esta hipótesis intentando detectar en el hongoalguna actividad enzimática que pudiera explicar su degra-dación.En condiciones aerobias la degradación de 2,4,6-TCP yPCP consiste en unos pasos iniciales de deshalogenaciónoxidativa (en bacterias y hongos) o deshalogenaciónreductora (detectada en P. chrysosporium) que producenintermediarios tipo quinonas, que normalmente son hidro-xilados (ver figura 3.1). Sin embargo, las enzimas que lle-van a cabo este paso inicial de deshalogenación son dife-rentes en bacterias y hongos:- en bacterias la desahalogenación inicial es catalizadapor monooxigenasas intracelulares como la clorofenol 4-monooxigenasa de Burkholderia cepacia (Xun, 1996) ola 2,4,6-TCP-4-monooxigenasa de Azotobacter sp. cepaG1 (Wieser et al., 1997), que convierten 2,4,6-TCP en2,4-diclorobenzoquinona; o la pentaclorofenol hidroxilasade Flavobacterium sp. ATCC 39723 (Xun y Roser, 1991),que transforma PCP en tetraclorodihidroxibenceno.- por el contrario, en hongos la deshalogenación iniciales llevada a cabo por enzimas extracelulares del siste-ma ligninolítico. Así lignina peroxidasa y manganesoperoxidasa purificadas de Phanerochaete chrysosporiumpueden catalizar la conversión de PCP a tetraclorodihi-droxibenceno (Bhasker Reddy et al., 2000) o de 2,4,6-TCP a 2,6-dicloro-1,4-dihidroxibenceno (Bhasker Reddy etal., 1998). En otros basidiomicetos como Panus tigrinuso Coriolus versicolor, el 2,4,6-TCP se transforma en 2,6-dicloro-1,4-dihidroxibenceno por la acción de manganesoperoxidasas y lacasas (Leontievsky et al., 2000).En nuestro laboratorio y en las condiciones en las quedetectamos formación de 2,4,6-TCA y desaparición de2,4,6-TCP hemos sido incapaces de detectar actividadmonooxigenasa sobre diferentes sustratos como 2,4,5-TCP, 2,4,6-TCP o PCP. Este hecho lo podríamos conside-rar como normal ya que se trata de actividades bacteria-nas.Por el contrario, el análisis realizado con sobrenadantesconcentrados de cultivos nos ha permitido detectar lapresencia en T. logibrachiatum de débiles actividadesarilalcohol oxidasa, lacasa y peroxidasa independientede manganeso. Estos datos sugieren que la desapari-ción de 2,4,6-TCP detectada podría deberse a la acciónde estas actividades. En estas preparaciones no pudi-mos detectar actividad manganeso peroxidasa o ligninaperoxidasa. En apoyo de esta posibilidad debemos mencionar que la

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presencia de lacasas está bien documentada en hongosfilamentosos, aunque su función no es bien conocida:así en Aspergillus nidulans (Scherer et al., 2001) lalacasa TILA aparece en el extremo de hifas en creci-miento, aunque su papel se desconoce; en Botrytiscinerea las lacasas están implicadas en la degradaciónde la fitoalexina resveratrol que actúa como un protectorfrente a infecciones fúngicas (Schouten et al., 2002);por último en Penicillium chrysogenum se han detectadovarias lacasas implicadas en la degradación de lignina(Rodríguez et al., 1996).4).- Otra posibilidad es que el 2,4,6-TCP no sea degra-dado, sino polimerizado por alguna lacasa para generarpolimeros de alto peso molecular. Así lacasa purificadade Coriolus versicolor puede destoxificar PCP generandopolímeros de alto peso molecular y sin que exista libera-ción de cloro (deshalogenación) al medio (Ullah et al.,2000).En resumen, estudios preliminares sugieren que la des-aparición de 2,4,6-TCP observada en las condiciones decultivo utilizadas no es debida a la mineralización delcompuesto o su unión a micelio, y sin descartar unaposible polimerización, podría deberse a una accióndegradativa mediada por una actividad lacasa o peroxi-dasa independiente de manganeso.

3.4.- Caracterización de la actividad enzimática 2,4,6-TCP metiltransferasa del hongo filamentoso T. longibra-chiatum.Una vez detectada esta actividad enzimática en T. longi-brachiatum abordamos su caracterización.

3.4.1.- La actividad 2,4,6-TCP metiltransferasa es inducible.Como hemos demostrado la actividad 2,4,6-TCP metil-transferasa de T. longibrachiatum es inducible. Estehecho es una diferencia notable con la metiltransferasabacteriana implicada en la formación de anisoles y tioani-soles detectada en Rhodococcus y Acinetobacter (Neilsonet al., 1988), que es constitutiva, por lo que para realizarla O metilación de un sustrato no se requiere una exposi-ción previa a clorofenoles. Es posible que el carácterinducible del enzima de T. longibrachiatum proporcione alhongo alguna ventaja, ya que probablemente resulte enuna respuesta más fuerte frente a clorofenoles en untiempo más corto, con la posibilidad adicional de unamodulación de la intensidad de la respuesta y el consi-guiente ahorro energético para la célula.El análisis de diferentes compuestos aromáticos y orga-noclorados como posibles inductores indicó que esta acti-vidad es inducida de manera eficaz y específica no sólopor 2,4,6-TCP, sino por clorofenoles con al menos tresátomos de cloro en su molécula.Otros compuestos clorados y derivados o no del fenol

como triclorobenceno, hexaclorobenceno y hexaclorociclo-hexano no se comportaron como inductores, como tampo-co el fenol y otros compuestos aromáticos no clorados. El efecto inductor parece ser independiente de las condi-ciones nutricionales del cultivo, como se deduce de lasgráficas de la figura 2.6. En efecto, los niveles de biocon-versión detectados variaban ligeramente en el rango 29.2-39.5%, aunque en el medio hubiese una alta concentra-ción de glucosa (2%), amonio (50 mM) o ambos. Por elcontrario, la formación de 2,4,6-TCA y PCA por P. chrysos-porium (Bhasker Reddy et al., 1998, 2000) está reguladanutricionalmente, ya que sólo se detecta en condicionesHCHN (del inglés High Carbon-High Nitrogen); esto es,cuando el cultivo se desarrolla en condiciones no limitan-tes de fuente de nitrógeno (amonio 12 mM). Cuando elcultivo se realiza en condiciones limitantes de nitrógeno(condiciones HCLN) no se detecta producción de anisoles.La ausencia de regulación nutricional de la 2,4,6-TCPmetiltransferasa de T. longibrachiatum sugiere un posiblepapel de la O metilación de clorofenoles en la destoxifica-ción de estos compuestos altamente contaminantes.Parece claro que en la naturaleza podría ser peligrosopara un microorganismos estar expuesto a clorofenoles enunas condiciones de represión de la reacción de O metila-ción, lo que evitaría su detoxificación y podría resultar enla muerte del microorganismo.

3.4.2.- Características de la 2,4,6-TCP metiltransferasa.La producción de anisoles está ampliamente documentadaen la naturaleza. De hecho se han encontrado como conta-minantes en alimentos como huevos y pollos (Engel et al.,1966; Curtis et al., 1974), patatas (Cserjesi y Johnson,1972), frutas secas (Tindale et al., 1989), café (Spadoneet al., 1990) y agua para bebida (Nystrom et al., 1992).Además se ha detectado la producción de anisoles porcepas de Rhodococcus y Acinetobacter (Allard et al.,1987, Neilson et al., 1988), el alga unicelular Euglena gra-cilis (Drotar y Fall, 1985a y 1985b), el protozooTetrahymena termophila (Drotar y Fall, 1986), la levaduraSacharomycopsis lipolytica (Drotar et al., 1987) y hongosbasidiomicetos como Phanerochaete chrysosporium(Bhasker Reddy et al., 1998 y 2000) y Phellinus poma-ceus (Harper et al., 1989; McNally y Harper, 1991). A pesar de ello, el significado biológico de las reaccionesde O metilación es poco conocido: únicamente se hacaracterizado de manera muy preliminar una metiltransfe-rasa de Rhodococcus sp. 1395 implicada en la formaciónde anisoles y tioanisoles (Neilson et al., 1988) y se hapurificado una metiltransferasa específica para fenoles2,4-disustituídos de P. chrysosporium (Coulter et al.,1993), que puede O metilar 2,4-DCP y 2,4-DBrP.La 2,4,6-TCP metiltransferasa de T. longibrachiatum mues-tra una serie de características que podemos destacar:


- El pH óptimo del enzima se sitúa entre 8.2-8.5 (figura2.9) frente a un pH de 7.0 del enzima de Rhodococcussp. 1395 y un rango amplio de pH (7-9) en el caso de lametiltransferasa de P. chrysosporium.- La reacción transcurre de manera lineal durante las cua-tro primeras horas de reacción (figura 2.10), mientras queen el caso del enzima bacteriana la linealidad sólo semantiene durante la primera hora de reacción.- El enzima fúngica no requiere EDTA para su actividad, adiferencia del enzima bacteriano.- La influencia de varios grupos tíoles sobre la actividadenzimática fue escasa: únicamente la adición conjunta deDTT y PMSF supuso un incremento notable del rendimien-to de la reacción (42.5%). Por otro lado, el efecto inhibito-rio de varios reactivos de grupos tiol (iodoacetamida, N-etilmaleimida o p-cloro-mercuriobenzoato) quegeneralmente se comportan como inhibidores de metil-transferasas fue pobre. Únicamente el p-cloro-mercurio-benzoato (1 mM) supuso una inhibición de la reacción del45.2% (± 6.6). Estos datos parecen sugerir la existenciaen el centro activo de al menos un grupo sulfidrilo (-SH),aunque su papel en el proceso catalítico pudiera no seresencial, dado el escaso efecto inhibitorio de este tipo decompuestos.- Una de las características más notables de las metil-transferasas que utilizan SAM como donador de gruposmetilo es que la reacción es fuertemente inhibida por elproducto de la reacción SAHC (Poulton, 1981). Estanorma también es aplicable a la 2,4,6-TCP metiltransfera-sa de T. longibrachiatum: la inclusión de SAHC 1 mM enle mezcla de reacción producía una inhibición del 87.1%(± 5.6).

3.4.3.- Rango de sustratos utilizados por la 2,4,6-TCP metil-transferasa.Las dos metiltransferasas conocidas hasta la fecha impli-cadas en la formación de anisoles tienen una ampliorango de sustratos. Así el enzima de Rhodococcus sp.1395 es capaz de llevar a cabo la O metilación de unaamplia variedad de cloro y bromofenoles, cloro y bromo-guayacoles y cloro y bromocatecoles.Por otro, la O-metiltransferasa específica para 2,4-fenolesdisustituídos de Phanerochaete chrysosporium tiene,como indica su nombre, una alta afinidad por fenolesdisustituídos en posiciones orto y para (Coulter et al.,1993). De hecho metila una gran variedad de 3-metoxi y3,5-dimetoxi 4-hidroxibenzaldehídos, 4-hidroxiácidos ben-zoicos y 4-hidroxiacetofenonas. Ello sugiere un posiblepapel de esta enzima en la O metilación de compuestosgenerados en la degradación de la lignina, posiblementepara hacerlos más fácilmente atacables por enzimas delaparato ligninolítico. Además, de manera secundaria estaenzima metila con alta eficiencia 2,4-DCP y 2,4-DBrP. Esta

enzima pudiera ser responsable de la formación del2,4,6-TCA y PCA detectados en cultivos de este basidiomi-ceto en condiciones no limitantes de fuente de nitrógeno.El enzima 2,4,6-TCP metiltransferasa detectada en T. lon-gibrachiatum tiene un rango de sustratos claramente dife-rente a ambas enzimas (ver tabla 2.13). Son varias suscaracterísticas destacables al respecto:- Es altamente específica de fenoles halogenados. Dehecho no es capaz de O metilar una amplia variedad decompuestos aromáticos no halogenados como fenol, gua-yacol (2-metoxifenol), catecol (1,2-dihidroxibenceno); alde-hídos como el 3,4-hidroxibenzaldehído o la vainillina (4-hidroxi-3-metoxi benzaldehído); o ácidos benzoicos comoel vainíllico (4-hidroxi-3-metoxi benzoico) o el isovainíllico(3-hidroxi-4-metoxi benzoico). Este hecho la diferencia cla-ramente de las dos enzimas antes mencionadas. A lavista de estos datos, y aunque a lo largo del texto el nom-bre que se ha utilizado para el enzima es el de 2,4,6-TCPmetiltransferasa, creemos que una denominación másacertada seria la de clorofenol O-metiltransferasa o demanera abreviada CPOMT.- Entre los fenoles halogenados el enzima metila conmayor eficiencia clorofenoles que bromo o yodofenoles.Así la actividad relativa desarrollada frente a 2,4,6-TCPfue de 59.91%; muy superior que frente a 2,4,6-TBrP(12.98%) o 2,4,6-TIP. Curiosamente no pudimos detectarO metilación de 2,4,6-TFP.Estos datos son muy interesantes ya que parecen sugerirque la capacidad de metilación de esta metiltransferasadepende de características estructurales o estéricas delos sustratos, más que de propiedades electrónicas, puesen este caso cabría haberse detectado metilación del2,4,6-TFP. Un comportamiento similar ha sido detectadopara la O-metiltransferasa específica de fenoles 2,4-disus-tituídos de P. chysosporium (Coulter et al., 1993). El enzi-ma parece poseer una mayor actividad hacia clorofenoles,posiblemente por ser más abundantes en la naturalezaque bromo y yodofenoles. De hecho a medida que el volu-men del halógeno sustituyente aumenta el actividad delenzima parece disminuir. - En función de los niveles de metilación de los diferentessustratos ensayados parece ser que la halogenación de laposición dos (orto) parece ser importante para la activi-dad, aunque no necesaria. De hecho el único CP metiladofue el 2-CP, mientras que 3-CP y 4-CP no fueron sustratosefectivos en la reacción. Además, entre los DCPs el sus-trato biometilado con mayor eficiencia fue el 2,4-DCP,mientras que la eficiencia de la reacción disminuyó demanera progresiva para el 2,3-DCP, 2,5-DCP, 2,6-DCP y3,4-DCP (no detectándose actividad sobre el 3,5-DCP).- Cuando se analiza el nivel de actividad frente a DCPs,TCP, y TeCPs se deduce que, una vez halogenada la posi-ción dos, la introducción adicional de un átomo de cloro


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en la posición seis supone un impedimento estérico parala actividad enzimática. Para realizar esta aseveraciónnos basamos en los siguientes datos:* La actividad frente a 2,4-DCP (100%) es mucho mayorque frente a 2,6-DCP (10.36%) o 2,4,6-TCP (59.91%). * Si analizamos el nivel de metilación de TCPs y TeCPsvemos que la actividad frente a 2,3,4-TCP (93.33%) esmayor que frente a 2,3,6-TCP (55.58%), mientras que lahalogenación de la posición seis del 2,3,4-TCP produce2,3,4,6-TeCP, compuesto que no es metilado. Por otrolado el nivel de metilación del 2,4,5-TCP (64.19%) essuperior que el del sustrato 2,4,6-TCP.* Entre los TeCPs el único metilado fue el 2,3,4,5-TeCP,mientras que la actividad fue nula frente a 2,3,4,6-TeCP y2,3,5,6-TeCP, ambos con un átomo de cloro en posiciónseis.* Sin embargo, es necesario hacer notar que el nivel deO metilación del PCP (10.07%) fue sólo ligeramentemenor que el del 2,3,4,5-TeCP (10.73%), cuando quizáshabría cabido esperar una ausencia total de actividadfrente a este compuesto, si tenemos en cuenta que elPCP tiene ocupada la posición seis y un átomo más decloro que 2,3,4,6-TeCP y 2,3,5,6-TeCP.3.5.- Perspectivas futuras.El trabajo que hemos descrito se enmarca dentro de unalínea de investigación (iniciada en enero de 2000) quetiene como objeto la búsqueda de posibles solucionesbiotecnológicas al problema de la contaminación del cor-cho, producido por 2,4,6-TCA. Este planteamiento tiene,sin embargo, que enfrentarse a un serio problema: elescaso conocimiento general sobre el cork taint. En efec-to, aunque los compuestos químicos responsables deeste fenómeno se identificaron en la década de los años80 (Maujean et al., 1985; Amón et al., 1989), el conoci-miento acerca de los microorganismos productores y,sobre todo, de los mecanismos moleculares implicadosen su formación es muy escaso.Nuestro trabajo ha pretendido tratar de identificar losmicroorganismos productores de 2,4,6-TCA, así como losprocesos implicados en su producción. A la vista de losresultados expuestos en este trabajo podemos establecerlas siguientes premisas:- El verdadero problema del cork taint no es la presenciade microorganismos en el corcho, sino la absorción depesticidas clorofenólicos por la corteza. Dichos clorofeno-les serían destoxificados, principalmente por hongos fila-mentosos, para producir cloroanisoles no tóxicos.- Controlar el contacto de clorofenoles con el árbol escasi imposible si tenemos en cuenta que el amplio usode estas sustancias durante décadas, unido a su recalci-trancia a la degradación, ha provocado que contaminentodos los ecosistemas aéreos, acuáticos y terrestres.- Algunos autores han postulado la posibilidad de manu-

facturar los tapones de corcho en un ambiente libre demicroorganismos (Butzke et al., 1999). Creemos que esteplanteamiento es equivocado por dos razones: en primerlugar, prácticamente todas las planchas de corcho tienenunos niveles basales de 2,4,6-TCA; por otro lado, la manu-factura de tapones en un ambiente estéril encarecería tantoel tapón que posiblemente el coste económico para lasbodegas sería inasumible. Por ello, planteamos como posi-ble solución biotecnológica el desarrollo de dos tipos deestrategias para controlar la presencia de cloroanisoles encorcho:1).- En primer lugar el desarrollo de inóculos microbianospara crecer sobre corcho basados en la cepa Trichodermalongibrachiatum CECT 20431 (caracterizada en este traba-jo), aprovechando las propiedades que hacen del géneroTrichoderma un microorganismo ideal para su uso comoagente de control biológico (Hjeljord y Tronsmo, 1998). Las características de estos inóculos serían las siguien-tes: a).- Buena capacidad de crecimiento sobre corcho. Estacepa muestra un crecimiento invasivo sobre corcho, demanera que podría evitar el crecimiento de otros hongosindeseables.b).- Capacidad de degradar el precursor 2,4,6-TCP. Enensayos en medio líquido sólo una parte del 2,4,6-TCP seconvierte a 2,4,6-TCA siendo el resto del precursor degra-dado (Álvarez-Rodríguez et al., 2002a y Álvarez-Rodríguez,2003c)c).- Incapacidad de producir 2,4,6-TCA por interrupción delgen codificante de la metiltransferasa. La purificación dela clorofenol O-metiltransferasa (CPOMT) nos permitirá ladeterminación de la secuencia de algún péptido de la pro-teína. A partir de sus secuencias podremos clonar el gen.Una vez clonado el gen se procederá a su interrupcióngénica para obtener cepas deficientes en CPOMT. d).- Producción de lacasas por expresión de genes codifi-cantes de lacasas que permitan la oxidación (polimeriza-ción) del precursor 2,4,6-TCP, evitando su disponibilidadpara la síntesis de 2,4,6-TCA. Las lacasas son enzimasque muestran una alta capacidad de oxidación de deriva-dos fenólicos (Reinhammar y Malmstrom, 1981; Bollag etal., 1988; Ullah et al., 2000). e).- Muy baja probabilidad de producción de micotoxinas.El género Trichoderma es reconocido como GRAS(Generally Recognized As Safe) (Nevalainen et al., 1994) yla producción de micotoxinas es anecdótica. Este hecho


hace del género Trichoderma un candidato ideales parasu posible uso en aplicaciones agroalimentarias.2).- Producción de preparados enzimáticos a base de laca-sas para lavar el tapón antes del envasado y eliminarcualquier resto de clorofenoles y cloroanisoles. Se tratade obtener a partir de cultivos de hongos preparados quecontengan lacasas que se utilizarían para el lavado super-ficial de tapones, a fin de eliminar cualquier resto de clo-rofenoles o cloroanisoles presentes en el tapón. La obtención de este tipo de extractos semipurificadospodría una solución adicional y barata para el problemadel cork taint. Para ello optimizaríamos la expresión degenes codificantes de lacasas de basidiomicetos en T.longibrachiatum. Una preparación de lacasa con el nom-bre comercial de SUBERASE es comercializada por NovoNordisk. Sin embargo, su utilización por las industrias quemanufacturan corcho ha sido ampliamente rechazadaante el prohibitivo precio de las preparaciones. En nuestrocaso se trataría de transferir a las empresas una tecnolo-gía barata de producción propia o en su defecto poderproporcionar una alternativa mucho más económica.Ambos tratamientos deberían permitirnos obtener taponeslibres de cloroanisoles, cuya utilización en el envasado devinos españoles podría, sin duda, aumentar su calidadfrente a vinos competidores producidos en otros países.4.- CONCLUSIONES

1.- El corcho es un ecosistema microbiano complejo apartir del cual podemos aislar una gran variedad y canti-dad de microorganismos. En nuestro caso se aislaron55 microorganismos diferentes: 14 hongos filamento-sos, 8 levaduras, 13 actinomicetos y 20 bacterias nofilamentosas.

2.- La capacidad de producir 2,4,6-TCA a partir de2,4,6-TCP está muy extendida entre los hongos filamen-tosos. De un total de 14 aislados, 11 fueron capacesde producir este compuesto cuando crecían directamen-te sobre corcho.

3.- En Trichoderma longibrachiatum el único mecanismodetectado capaz de generar 2,4,6-TCA fue la O metila-ción de 2,4,6-TCP.

4.- En cultivos en medio líquido la eficiencia de O meti-lación del 2,4,6-TCP por T. longibrachiatum oscila entreel 29.2 y el 39.5%, mientras que el resto del pesticidadesaparece del medio de cultivo.

5.- La producción de 2,4,6-TCA en cultivos de T. longi-brachiatum en medio líquido no está sometida a regula-ción catabólica por glucosa ni a represión por amonio.

6.- En T. longibrachiatum la O metilación de 2,4,6-TCPes llevada a cabo por una O-metiltransferasa inducibledependiente de S-adenosilmetionina como donador degrupos metilo que denominaremos clorofenol O-metil-transferasa.

7.- T. longibrachiatum posee unos niveles basales bajosde esta metiltransferasa, pero su síntesis es inducidade manera específica por exposición a clorofenoles,especialmente si tienen tres o más átomos de cloro ensu molécula.

8.- El enzima clorofenol O-metiltransferasa de T. longi-brachiatum ha sido purificada a homogeneidad, un totalde 222.67 veces a partir de extractos acelulares.

9.- Esta enzima tiene un peso molecular nativo de112.000 daltons, mientras que el tamaño molecular encondiciones desnaturalizantes es de 52.500 daltons, loque indica que en su forma nativa es un dímero.

10.- La clorofenol O-metiltransferasa de T. longibrachia-tum puede ser identificada mediante fotomarcaje con S-adenosilmetionina tritiada.

11.- La reacción catalizada por esta enzima es altamen-te específica de fenoles halogenados, siendo el 2,4-DCP el compuesto metilado con mayor eficiencia.

12.- La clorofenol O-metiltransferasa metila de mayor amenor eficiencia los sustratos 2,4,6-TCP, 2,4,6-TBrP y2,4,6-TIF, mientras que no metila 2,4,6-TFP. Por lo tantodesarrolla una mayor actividad frente a clorofenolesque frente a fenoles halogenados con bromo, yodo ofluor.

13.- El corcho es por tanto un ecosistema microbianoen el que podemos encontrar microorganismos poten-cialmente responsables del problema del sabor a cor-cho y/o moho de los vinos (cork taint).


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ABREVIATURAS

A: absorbanciaADN: ácido desoxirribonucleicoADNr: ADN ribosomal5'-AMP: adenosina-5'-monofosfatoARN: ácido ribonucleicoAU: unidades de absorbanciaBSA: albúmina sérica bovinaºC: grado centígradoCECT: Colección Española de Cultivos TipoCi: curioCPOMT: clorofenol O-metiltransferasaCys: cisteínaDa: daltonDEAE: dietilaminoetilDMSO: dimetilsulfóxidoDNAsa: desoxirribonucleasaDO: densidad ópticaDTT: ditiotreitolEDTA: ácido etilén diaminotetraacéticoFPLC: cromatografía líquida de desarrollo rápidog: gramoh: horaHPLC: cromatografía líquida de alta presiónKav: constante de proporcionalidad de filtración en gelkb: kilobase.Ki: constante de inhibición Km: constante de Michaelis-MentenM: molarmAU: miliunidades de absorbanciaMr: masa molecularMTHF: 5-metiltetrahidrofolatop/v: relación peso-volumenPAGE: electroforesis en geles de poliacrilamidaPMSF: fluoruro de p-metilenfenilsulfoniloRFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos de restric-ciónr.p.m.: revoluciones por minutoSAHC: S-adenosil-homocisteínaSAM: S-adenosil-L-metioninaSDS: dodecil sulfato sódicoSDS-PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida condodecil sulfato sódicoSer: serinaTris: tris (hidroximetil) aminometanoU: unidad (de actividad enzimática)UFC: unidad formadora de coloniaUV: ultravioletav: velocidad de reacciónVmax: velocidad máxima de reacciónv/v: relación volumen-volumen

Abreviaturas de compuestos aromáticos y fenoles halo-genados

CA: cloroanisolCP: clorofenolDBrP: dibromofenolDCA: dicloroanisolDCP: diclorofenol2,6-DMP: 2,6-dimetoxifenolHCB: hexaclorobencenoHCCH: hexaclorociclohexanoTBrA: tribromoanisolTBrP: tribromofenolTCA: tricloroanisol

TCB: triclorobencenoTCP: triclorofenolTeCA: tetracloroanisolTeCP: tetraclorofenolTFA: trifluoroanisolTFP: trifluorofenolTIA: triyodoanisolTIP: triyodofenolPCA: pentacloroanisolPCP: pentaclorofenol



5.- Referencias bibliográficas

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6.- Agradecimientos

El trabajo aquí expuesto ha sido posible gracias a la finan-ciación del Ministerio de Educación y Cultura y laComunidad Europea (Proyecto FEDER 1FD97-1172) y de laJunta de Extremadura -Consejería de Educación, Ciencia yTecnología- (Proyectos IPR00C004 y 2PR01A009).Deseamos agradecer también el apoyo prestado por elInstituto para la promoción del corcho (IPROCOR, Mérida),que amablemente nos ha cedido sus instalaciones parala realización de todos aquellos estudios que pudieran sernecesarios y especialmente a D. Miguel Elena Roselló yD. Luis Javier Ávila por su apoyo y su colaboración técnicaen la realización de los análisis por cromatografía degases-masas.A SANVICORK S.A. (San Vicente de Alcántara, Badajoz) yespecialmente a su director D. Andrés Gilo, por el firmeapoyo al trabajo realizado y la donación de muestras parasu análisis.

MÉTODO ROSA PARA LA REDUC-CIÓN DE TCA EN EL TAPÓN DECORCHO

ROSA es la nueva arma de Amorim para comba-tir el TCA (2,4,6 tricloroanisol) en los tapones decorcho de las botellas de vino. Los ensayos cien-tíficos demuestran que ROSA reduce espectacu-larmente los TCA y la incidencia de la contami-nación por mohos en el vino embotellado.

Miguel Cabral

AMORIMSta. María de LamasPortugal

Informe Técnico 83


MÉTODO ROSA PARA LA REDUCCIÓNDE TCA EN EL TAPÓN DE CORCHO

Los TCA siguen siendo el mayor obstáculo paramejorar la regularidad de la fabricación de cor-chos para vinos.Se estima que los TCA, contaminantes en trazascorrientes en las industrias de alimentos y bebi-

das envasados, son responsables de entre un 70 y un80% de las incidencias de contaminación relacionada conel corcho en los vinos. Confieren un sabor a humedad o amoho a la comida o las bebidas, y, en el vino, puedenempañar las cualidades afrutadas o volverlo simplementeimbebible.Los TCA son detectables en nariz y en el paladar a con-centraciones extraordinariamente bajas, una característi-ca que representa una tremenda dificultad para el con-trol de calidad del proceso de producción de tapones decorcho y de la manipulación y el almacenamiento enpost-producción. Los TCA, compuestos organoclorados

presentes en la corteza del alcornoque y en el entornode fábrica o de almacén, pueden ser absorbidos rápida-mente por el corcho prácticamente en cualquier etapade su proceso de fabricación.Derrotar un contaminante en trazas infinitesimales enestas circunstancias ha exigido tanto un enorme esfuer-zo en I+D como una gran inversión en una nueva plantay en maquinaria, que, en su momento, se extenderá atodas las fábricas que Amorim tiene repartidas por elmundo.

La estrategia anti-TCA de Amorim A finales de los años 1990, Amorim acometió un esfuer-zo coordinado para atacar las fuentes de TCA en la cor-teza de alcornoque y la formación de TCA durante el pro-ceso de transformación del corcho. El objetivo consistía

en

reducir drásticamente la incidencia de TCA en el vino, y,en última instancia, en conseguir que el corcho dejarade ser causa de contaminaciones por mohos.La estrategia adoptada por Amorim consistió en exami-nar y validar su proceso de producción y desarrollar unaserie de técnicas para prevenir o evitar los TCA y supri-mir o eliminar el contaminante en los productos de cor-cho de Amorim.Entre las técnicas preventivas aplicadas desde que seadoptó esta estrategia figuran las siguientes:·Mejora de los métodos de cosecha del corcho y sus contro-les·Controles rigurosos sobre el almacenamiento y el seca-do de la corteza bruta·Nuevos procedimientos de compra y selección de cor-cho·Sistema de cocción totalmente nuevo para la limpiezade las planchas de corcho

·Proceso de lavado agresivo (INOS I) para los discos decorcho·Aplicación de ozono para desodorizar los corchos y pre-venir la contaminación microbiana·Análisis químico exhaustivo para detectar el corcho sos-pechoso

Estas iniciativas han permitido conseguir un avance sig-nificativo en la lucha contra los TCA. Por ejemplo, elensayo químico exhaustivo de las planchas de corchopara detectar la presencia de TCA ha eliminado práctica-mente el rechazo sensorial de los tapones de corcho

Reducir los TCA

Prevención

Eliminación

Materias primas

Limpieza

Higiene

Control de calidad

· Almacenamientoselectivo

· Nuevo sistema de cocción

· Inos II

· Ozono

· Análisis químico

ROSA

Informe Técnico 85

suministrados a los clientes estadounidenses deAmorim, gracias a lo cual han cesado las reclamacionespor presencia de TCA.Gracias a la utilización de las máquinas de cromatogra-fía de gases quíntuples de que actualmente dispone eldepartamento de I + D de Amorim, esta sociedad puedeanalizar cerca de 2.500 muestras de corcho por sema-na, y detectar los TCA a muy bajas concentraciones.Una capacidad analítica de esta magnitud ha permitidoal personal identificar y aislar rutinariamente los lotesde corcho sospechosos en todas las etapas de produc-ción, mejorando significativamente con ello los procedi-mientos de control de calidad de Amorim.La introducción del sistema ROSA constituye el primerproceso a escala industrial que extrae fiable y significa-tivamente los TCA y otros compuestos volátiles de loscomponentes del corcho y de los tapones enteros.Cómo funciona ROSAROSA es la novedad más reciente, y tal vez más impor-tante hasta la fecha de Amorim en su estrategia contra elTCA.Es un sistema de purificación patentado, desarrolladopor Amorim a raíz de una intensa labor de investigaciónrealizada durante más de tres años, que ha conllevadomiles de experimentos y de análisis químicos y un pro-grama de profunda revisión del diseño de procesos.Los ensayos de validación tanto internos como externoshan confirmado que ROSA reduce los niveles de TCAvolátil hasta en un 80%.Como consecuencia de estos ensayos, actualmente seestá introduciendo progresivamente el sistema en lasfábricas de productos de corcho para el vino de Amorim.ROSA se basa en una destilación al vapor controlada,mediante la cual el vapor y el agua a presión expulsanlos compuestos presentes en cantidades infinitesimalesen las células del corcho.Para reproducir los ensayos de laboratorio de ROSA aescala semi-industrial primero e industrial después paraintegrar el sistema en el proceso de fabricación industrialde tapones de corcho, los investigadores e ingenieros deAmorim han tenido que superar numerosos obstáculos,entre los que cabe destacar los siguientes.

·Irregularidad de los niveles de reducción de TCA·Efecto adverso del proceso sobre las propiedades físicasy la apariencia visual del corcho·Recontaminación del corcho debida a la condensacióndel vapor.El tratamiento al vapor puede alterar por ejemplo laspropiedades mecánicas del corcho, reduciendo suelasticidad o compresibilidad y por ende su eficaciade cierre. También puede modificar su aparienciavisual, que afecta a su clasificación y por lo tanto al

valor comercial del corcho. En el caso de un disco decorcho o de un tapón de corcho acabado, el tratamien-to al vapor puede deformar las dimensiones físicas delproducto, y exigir una rectificación laboriosa y costosa.En su investigación de estos fenómenos, Amorim haobservado que el vapor a altas temperaturas - aúnsiendo más eficaz para eliminar los TCA - afecta pro-porcionalmente más al corcho que el vapor a menortemperatura.Esta observación ha exigido la realización de pruebaspara determinar el equilibrio óptimo entre la supresiónde TCA y el nivel de deformación o alteración mecáni-ca, una labor de investigación que continúa todavía.En 2003, ya se ha per feccionado el proceso ROSApara el serrín de corcho utilizado en la fabricación de


MÉTODO ROSA PARA LA REDUCCIÓNDE TCA EN EL TAPÓN DE CORCHO

tapones aglomerados. El resultado son los taponesaglomerados tratados con ROSA que, desde el puntode vista mecánico y funcional, son casi idénticos a lostapones sin tratar - con la salvedad de que presentanun riesgo mucho más reducido de contaminación porTCA. Al día de hoy, la sociedad sigue realizando ungran esfuerzo de I + D con objeto de optimizar el pro-

ceso para los tapones de corcho enteros.

Incorporación de ROSA a la cadena de produc-ciónDurante los años 2003 y 2004 se irá integrando pro-gresivamente el proceso ROSA en las plantas de pro-

Conversaciones en el Reino UnidoA los ocho meses de su creación, el Centro de ContactoMinorista de Amorim en el Reino Unido ya ha entabladoun diálogo productivo con todos grandes minoristas devino en Gran Bretaña. El centro dirigido por Ann Harkins,anteriormente directora de control de calidad de una des-tacada cadena de supermercados en el Reino Unido, esuna iniciativa de Amorim. Se ha creado para fomentar aúnmás el contacto directo entre los minoristas del vino y losproveedores de tapones, con objeto de propiciar una mayorcomprensión entre ellos.Uno de sus principales objetivos ha sido alejar a los minoris-tas y a los proveedores de tapones de los estériles debatespúblicos sobre asuntos referentes a los tapones de vino,para que inicien un proceso proactivo de diálogo privado yconstructivo.Tras la última ronda de conversaciones celebrada en elmes de septiembre, la retroacción ha sido especialmentepositiva.. "Los minoristas se han quedado impresionadosante el compromiso de Amorim con el mercado británico yel hecho de que haya dedicado recursos para atenderlo",dice la Sra. Harkins."También se han enterado de lo que lleva conseguidoAmorim hasta la fecha en su lucha contra los TCA, y laenvergadura del esfuerzo continuo realizado por la empre-sa en este sentido." Se espera que el centro sea benefi-cioso para las dos partes. Para los minoristas, este diálo-go es una oportunidad de conocer mejor el corcho y suscapacidades técnicas como tapón, y de transmitir directa-mente sus necesidades al proveedor de corcho.Según Ann Harkins, los minoristas valoran la formacióntécnica que Amorim está impartiendo a su personal.También han acogido favorablemente la disposición deAmorim para ayudarles a desarrollar normas para lostapones de sus vinos de marca propia.Además, por primera vez, Amorim recibe información directasobre las necesidades del negocio británico del vino y sus

Pruebas de embotelladoEl objeto de esta investigación consiste en evaluar la inciden-cia de contaminación por TCA registrada en el vino embotella-do con tapones tratados con ROSA y conservados en condi-ciones típicas de bodega.

LA CONTAMINACIÓN DE LOS VINOSPOR BRETTANOMYCES DURANTEVINIFICACIÓN Y LA CRIANZA:Incidencia, Detección y Medios delucha

La aparición de olores fenólicos, animales, conrecuerdos a cueros y orina de caballo en los vinos tin-tos se deben a la contaminación por levaduras delgénero Brettanomyces/Dekkera. Dichas levaduras sesientes especialmente confortables en ambientes conpoca higiene y son capaces de contaminar el vino ellos diferentes procesos de elaboración y crianza.Sólo una adecuada técnica de detección de la conta-minación y unos procesos de desinfección de los reci-pientes eficaces y respetuosos con el material, reduci-rá los efectos indeseables producidos por estosgérmenes.

Pascal CHATONNET

Laboratoire EXCELLMERIGNACFrancia

Figura 2-Limitación de la limpieza de barricas con los caños de

Informe Técnico 89


pollution. XIII C6-C14 organohalogens in the lower tropos-phere of the southern Indian ocean. 1990, Fresenius J.Anal. Chem., 336, 193-200.

Würdig G. Vorsicht bei der Anwendung vonFassaussendesinfektionmitteln. Die Weinwir tschaft.1975, 111, 44, 1250-1251.

Introducción

Las levaduras de contaminación pertenecientesal género Brettanomyces (o a su forma esporu-lante Dekkera) son conocidas en enología porlos numerosos disgustos que causan (figura 1).En efecto, el desarrollo de estos gérmenes pro-

voca concretamente la aparición de olores "fenólicos" y"animales" que evocan el "cuero" o la "orina de caballo"en los vinos tintos. En el marco del programa de investi-gación de la tonelería SEGUIN MOREAU, hemos demos-trado que este tipo de defecto, calificado de carácter"fenolado" de los vinos tintos, está directamente vincula-do con la presencia de una cantidad excesiva (superior alvalor de su umbral de recuperación en el vino, > 450µg/l) de etilfenoles malolientes (etil-4-fenol y etil-4guaia-col # 8:1) (CHATONNET et al., 1990, 1992). El olor típicodel etil-4-fenol pasa a ser claramente perceptible a partirde unos 600 µg/l, y especialmente dominante en concen-traciones superiores a dicho valor. Debido a su equipoenzimático especialmente adaptado, sólo las levadurasdel género Brettanomyces/Dekkera son capaces de for-mar cantidades importantes de etilfenoles en los vinostintos; las bacterias lácticas son incapaces de generarlos niveles necesarios para que aparezca un olor percep-tible (CHATONNET et al., 1997).

A-Contaminación de los vinos durante su elaboraciónBrettanomyces/Dekkera es una levadura sumamenteextendida. Siente predilección ante todo por los grifospoco limpios, los canalones, las piqueras de las barricasy las lías. Por lo tanto, no se puede hablar con propiedadde bodega contaminada o indemne: todas las dependen-cias de vinificación y de crianza alojan este tipo de gér-menes. Lo único que importa realmente es el nivel decontaminación y las condiciones de control de las pobla-ciones en la bodega.La contaminación más frecuente se produce en el caldoterminado, durante el proceso de crianza, cuando hanconcluido las fermentaciones alcohólica y maloláctica. Apartir de ese momento cesan los fenómenos de antago-nismo y de competencia entre microorganismos, yBrettanomyces bruxellensis, la especie más corriente enel vino, puede explotar las trazas de azúcares residualespresentes en todos los caldos (glucosa, fructosa, mano-

sa, galactosa, trehalosa y sacarosa). El desarrollo deestos gérmenes se puede producir en estricta anaerobio-sis; la fermentación de una cantidad próxima a 300 mg/lde azúcares residuales es suficiente para formar una can-tidad de etilfenoles equivalente al valor de su umbral depercepción (425 µg/l) (CHATONNET et al., 1995). Al finalde la fermentación maloláctica, los vinos secos contienenen promedio más de 400 mg/l de azúcares fermentablespor Brettanomyces que, teóricamente, permiten la forma-ción de cerca de 600 µg/l de etilfenoles, el valor delumbral de percepción del etil-4-fenol. Así pues, en princi-pio todos los vinos podrían presentar un carácter "fenola-do" en caso de contaminación y de desarrollo deBrettanomyces.Sin embargo, existe un "factor de terreno" importante.Los vinos más ricos, es decir de fuerte graduación alcohó-lica por proceder de las uvas más maduras, y por tanto debaja acidez y maceración prolongada, a menudo son másricos en sustratos asimilables, y por lo tanto potencial-mente más favorables al desarrollo de Brettanomyces sp.El control exacto del contenido de azúcares residuales alfinal de la fermentación alcohólica y maloláctica, en espe-cial de la suma glucosa + fructosa fácilmente accesible,indica mucho mejor la "sensibilidad" de un vino respectoal desarrollo de Brettanomyces que la clásica medición deazúcares reductores químicos, totalmente superada hoyen día. Esta dosificación basada en ciertas propiedadesreductoras de los azúcares se ve cada vez más expuestaa numerosas interferencias. Dependiendo de las cantida-des de azúcares residuales dosificados, se podrá prestarmás atención a ciertos lotes que a otros; de ese modo sepodrá razonar de forma distinta ciertas mezclas con objetode reducir el riesgo de desarrollo de los gérmenes.La crianza en barricas no induce sistemáticamente unacontaminación de los caldos ni la aparición de un carácter"fenolado". Ahora bien, la conservación en madera, la uti-lización de barricas usadas sin someterlas a un buen tra-tamiento, de bodegas de crianza inadecuadas (variacionesde temperaturas), de rellenos (oxidación excesiva) y de tra-siegos insuficientes (frecuencia de desinfección de barri-cas…), constituyen una suma de circunstancias que propi-cian la contaminación y el ulterior desarrollo de gérmenesde contaminación en general y de Brettanomyces sp. enparticular. La utilización de barricas nuevas también esfavorable al desarrollo de estos gérmenes. Se barajanmuchas hipótesis extravagantes para explicar la mayor fre-cuencia de contaminación de las barricas nuevas en cier-tas salas de crianza. La madera de barricas no aportaazúcares en cantidad suficiente para crear un medio favo-rable al desarrollo de estas levaduras contaminantes; lamadera nueva tampoco es fuente de innoculum pues eltueste esteriliza perfectamente las barricas. La realidades que, debido a su potencial oxidante mucho mayor y a

LA CONTAMINACIÓN DE LOS VINOSPOR BRETTANOMYCES DURANTE LAVINIFICACIÓN Y LA CRIANZA:Incidencia, Detección y Medios de lucha

Informe Técnico 91

la merma a menudo más alta, en especial durante elperiodo estival cuando sube la temperatura de la bodega,el contenido de dióxido de azufre libre tiende a disminuirmucho más rápidamente en las barricas nuevas que enlas usadas. Se sabe que por debajo de cierto umbral dedióxido de azufre libre (ver más abajo), cesa la inhibiciónde Brettanomyces, y aparece una alteración proporcionala la población microbiana.La contaminación de los vinos también se observa confrecuencia en caso de dificultad en la terminación de lafermentación alcohólica y / o maloláctica. En estas condi-ciones, los caldos permanecen expuestos al calor durantevinos varias semanas o incluso meses, sin ninguna pro-tección a base de dióxido de azufre y en presencia dealtos contenidos de azúcares. Si por desgracia, los caldosentran en contacto con Brettanomyces/Dekkera, el resul-tado puede ser un incremento fuerte y rápido del conteni-do de etilfenoles. En caso de detección precoz de la con-taminación, es preferible sulfitar y filtrar antes de volver asembrar, con objeto de prevenir la alteración de todo elvolumen, y sobre todo la contaminación masiva de labodega. La flash-pasteurización es un procedimiento efi-caz pero especialmente enérgico, y hay que reservarloalas situaciones más críticas.La contaminación durante la fermentación alcohólica, aun-que se puede producir, es mucho menos frecuente. Encambio, cuando se desencadena en el mosto durante lamaceración (vinificación del tinto), a menudo tiene conse-cuencias dramáticas. Además de la aparición de oloresdesagradables, Brettanomyces puede formar cantidadesimportantes de acidez volátil (ácidos grasos volátiles, y enespecial ácido acético). Hay que adelantar el trasiego,pero la contaminación rara vez se limita a una sola cuba,debido a las contaminaciones cruzadas provocadas por elmaterial de bodega. Para prevenir este tipo de accidenteson imprescindibles una higiene intachable y una sulfita-ción adecuada de la vendimia. En algunas situaciones, hemos observado que ciertasparcelas presentaban incidentes de contaminación precozdel mosto con mayor frecuencia que otras. Se ha demos-trado (CHATONNET et al., 1999) que las viñas situadas asotavento de destilerías, de desagües de bodega o demontones de orujos en ciertos casos pueden presentarcontaminación en la uva. En efecto, en ocasiones losmontones de orujos almacenados al aire libre contienengrandes cantidades de gérmenes que el viento y losinsectos que habitan ese medio (en especial las drosófi-las) pueden transportar fácilmente hasta las parcelas deviña. Normalmente, una sulfitación adecuada de la vendi-mia (al menos 5 g/hl) permite prevenir cualquier acciden-te durante la fermentación. En caso de cosecha mecáni-ca, se recomienda desinfectar las parcelas de riesgodespués de la vendimia.

B- Detección precoz de la contaminación de los caldosLas técnicas de microbiología clásica utilizan el cultivosobre medios que permiten el recuento específico de losgérmenes del género Brettanomyces/Dekkera gracias a lapresencia de inhibidores específicos. El principal inconve-niente del recuento por cultivo es el tiempo que lleva: hayque cultivar entre 5 y 8 días para obtener un recuento fia-ble. Con objeto de acelerar la respuesta, se puede combinarla técnica de cultivo con una hibridación directa de lascolonias mediante una sonda específica de

Brettanomyces sp. acoplada a una peroxidasa (STENDERH., et al., 1999). Tras el filtrado del cultivo sobre unamembrana durante al menos 40 h, tras la hibridación conla sonda las microcolonias de Brettanomyces se detectangracias a una reacción quimiluminescente. MILLIPORE™fabrica un kit comercial (Brettanomyces Assay) basado eneste principio, que teóricamente permite un recuentoespecífico en 48 h. La sensibilidad es de menos de 10colonias/ml. Sus mediocres resultados parecen ser elmotivo de la retirada temporal de este kit.Los ensayos de detección immunoquímicos (ELISA) siguensiendo pesados y poco sensibles. La reacción de polimeri-zación en cadena (PCR) permite amplificar específicamen-te determinados fragmentos de ADN. Tras la desnaturali-zación del ADN y la hibridación con ciertosoligonucleótidos para delimitar fragmentos específicos deADN, se lleva a cabo la amplificación mediante una enzi-ma termosensible (Taq DNA Polimerasa) que permite reali-zar un gran número de ciclos de amplificación con objetode obtener una señal detectable en forma de una banda

Figura 3 - Detección precoz del desarrollo de Brettanomyces en

vinos en barricas por la método Suivi BRETT® de EXCELL

(en línea de puntos … = umbral de percepción de etilfenoles #

430 µg/l, en línea continua __ = umbral de percepción del etil-

4-fenol # 600 µg/l)


de electroforesis. Este método permite un diagnóstico depresencia / ausencia, pero no una cuantificación de laspoblaciones viables realmente presentes, ni siquiera laperfecta discriminación entre gérmenes vivos y muertos. Durante la crianza, en última instancia al vinificador no leinteresa demasiado el recuento de las poblaciones degérmenes. Aparte del momento del embotellado, no seintenta ni se puede perseguir el "cero Brettanomyces"; elmantenimiento de las poblaciones a un nivel tolerable esperfectamente suficiente. Ahora bien, esta población tole-rable varía de un caldo a otro, y de una bodega a otra.Por ello, el seguimiento periódico de la evolución del con-tenido de etilfenoles durante la crianza, y concretamentedurante el periodo estival crítico (periodicidad de mensuala bimensual), permite dar una respuesta mucho másadecuada a las necesidades del enólogo y del vinificadorde terreno. El incremento del contenido de fenoles entredos controles sucesivos es un indicio indudable de unamultiplicación anómala de Brettanomyces/Dekkera. Perosobre todo, se puede comparar directamente el conteni-do de etilfenoles observado y su tasa de incremento conel umbral de alteración máximo, con objeto de determinarla estrategia de acción más adecuada para la situación(sulfitación de corrección sin trasiego, trasiego, trasiego ydesinfección de recipientes, aislamiento de lotes…). Sepuede tomar una decisión eficaz en 48h.

La Figura 3 presenta un ejemplo concreto de seguimientode bodega en 1999. En el lote A, en todo el periodo estivalpropicio al desarrollo de gérmenes de contaminación,nunca hemos detectado contaminación. El lote B de lamisma bodega (Pomerol), pero guardado en barricas distin-tas (nuevas), ha presentado un ligero incremento del conte-nido de fenoles en el mes de agosto. Dado que la medicióndel SO2 ha indicado un contenido un poco bajo (15 mg/l) yel trasiego no estaba programado hasta dos meses mástarde, el reajuste del SO2 en la barrica a un nivel suficiente(25 mg/l) ha permitido detener la formación de fenoles. Enel lote C, procedente de otra bodega (Châteauneuf-du-Pape), se ha detectado un fuerte incremento durante elmismo periodo; también en este caso, el SO2 libre erademasiado escaso (12 mg/l) pero habida cuenta de la tasade incremento de etilfenoles (rebasándose el umbral depercepción de los etilfenoles), se ha preferido adelantarmás de un mes el trasiego del lote y desinfectar el tonel(lavado con agua caliente y azufrado a 5 g) antes de volvera embarrilar el vino sulfitado a 30 mg/l. El lote D corres-ponde al mismo caldo que el lote C pero sin ninguna inter-vención: el contenido de etilfenoles ha aumentado rápida-mente, superando considerablemente el umbral dealteración (1780 g/l, indicio de carácter "fenolado" = 4(concentración / umbral de percepción)); el vino presentabaun carácter "fenolado" característico que alteraba grave-mente su tipicidad aromática. Se puede utilizar esta misma

técnica para detectar las oxidaciones anómalas o el des-arrollo de gérmenes bacterianos aerobios.El desarrollo de técnicas modernas de detección adecuadaspara el seguimiento de la crianza de los vinos y la elabora-

ción de métodos de desinfección de los recipientes demadera eficaces y que respeten el material permitirán en unfuturo próximo controlar perfectamente el desarrollo deestos gérmenes de contaminación con objeto de reducir susefectos indeseables y de preservar la pureza y la tipicidadde nuestros vinos.

C- Medios de lucha contra Brettanomyces

1-Higiene de la bodega y los tonelesLa utilización de la madera facilita la contaminación de losvinos, pues este material puede albergar y proteger fácil-mente los gérmenes. En caso de crianza prolongada enbarricas (12 meses o más), el mantenimiento de los tonelesy la higiene de la bodega son las únicas herramientas profi-lácticas de que dispone el bodeguero. Ya hemos demostra-do que, a dosis de sulfitación equivalente, las condicionesde utilización del dióxido de azufre tienen una influencia con-siderable en la protección del vino. Así pues, el azufrado delas barricas, al permitir la desinfección simultánea de lamadera y del vino, es la técnica preferente cuando no sedispone de un medio eficaz para la limpieza de las barricas.La mera sulfitación del vino no actúa sobre la madera. Loslavabarricas clásicos no permiten una limpieza suficiente delas barricas. El lavado in situ, a menos que se utilice hidro-limpiadoras de alta presión con sistemas eficaces de elimi-

Figura 4 - Evolución de la temperatura de una barrica de 225 l a

distintos niveles durante su lavado (cabezal EKINSA, 25 l/min,

temperatura de salida del agua 85°C,

Generador de agua caliente KARCHER)

La línea de puntos indica el tiempo necesario para alcanzar

55°C a 6 mm en el centro de las duelas


Informe Técnico 93

nación del agua de lavado para evitar el impacto al fondo dela barrica y para reducir el agua residual, no asegura unalimpieza suficientemente enérgica (Figura 2, Pag.89).Para reacondicionar las barricas para cambiar de caldo o deañada, es imprescindible utilizar agua caliente (85-95°C), aser posible a alta presión. Si se desea limpiar realmente lamadera, siempre hay que preferir la utilización de alta pre-sión (120-180 bar) a la baja presión. La alta presión permiteacelerar la limpieza, pero por lo general, el tiempo de trata-miento que se suele dedicar a una barrica resulta insuficien-te para desinfectar perfectamente todo el espesor (5 a 10mm de profundidad) de las barricas usadas. No hay quetemer ningún deterioro de la fibra de la madera por debajode 200 bar de presión. Siempre que se utilice agua a tem-peraturas próximas a 80°C, calentada mediante un genera-dor adecuado, el aumento de la presión y la utilización decabezales con rotación tridimensional rápida equipados contubos adecuados (chorro de pincel, chorro de pincel girato-rio…) permiten acortar el tiempo de tratamiento (que difícil-mente podrá ser inferior a 5 minutos/ barrica) y conseguirun importante ahorro de agua (45 a 75 l/ barrica) con unresultado satisfactorio (Figura 4).La desinfección profunda de las barricas contaminadasexige un lavado prolongado con agua caliente, o, mejoraún, una pasada de vapor. Incluso al vapor, necesaria-mente aplicado a madera limpiada previamente, el tra-tamiento debe durar lo suficiente para eliminar totalidadde los gérmenes, pues la madera los protege muchocontra la subida de temperatura. Sin embargo, la mani-pulación del vapor en grandes cantidades resulta difícil

e incluso peligrosa. La limpieza de grandes contenedo-res por estabulación de agua caliente durante variashoras y con agitación a fin de reducir las diferencias detemperatura entre la parte superior y el fondo del reci-piente resulta sencilla y más eficaz (Figura 5). Parareducir significativamente las poblaciones microbianas,es deseable una temperatura mínima de 65° C en elcorazón de la madera. El tratamiento de grandes conte-nedores por aspersión a baja o a alta presión permitelimpiar adecuadamente las paredes de las cubas, perono calentar la masa de la madera a una temperaturasuficientemente elevada. Incluso después del vaciado, la temperatura de lascapas profundas sigue aumentando, pues el calor delas capas super ficiales se sigue difundiendo en lamasa durante más de una hora (Figura 5). El aguacaliente se puede reciclar para tratar entre dos y trescubas seguidas, siempre que éstas hayan sido per fec-tamente limpiadas previamente.

Si se compran barricas de ocasión, es imprescindible com-probar que no estén contaminadas por contaminantes quí-micos ni microbiológicos (bacterias acéticas y

Brettanomyces). La introducción de barricas mal conocidasen un parque sano es una fuente clásica de contaminaciónde bodegas cuyas condiciones de crianza y de trabajo de losvinos son por lo demás satisfactorias. El aclarado de barricas con agua cargada de ozono (O3), ungas dotado de importantes propiedades desinfectantesdebido a su fuerte poder oxidante, se presenta actualmentecomo una técnica revolucionaria. Si bien es cierto que estasolución resulta eficaz en materiales lisos e impermeables(acero y resinas epoxias, por ejemplo), ¡hasta ahora no seha aportado ninguna prueba seria de su eficacia sobre las

Figura 5 - Desinfección de una cuba de 35 hl por estabulación

de agua caliente (temperatura de entrada 85° C, altura: 2,20

m). La flecha indica el comienzo del vaciado del contenedor

Figura 6 - Relación entre el contenido de dióxido de azufre y la

formación de etilfenoles en distintas barricas de un mismo vino

en una misma bodega (según CHATONNET et al, 1992)


barricas de madera, material poroso por excelencia y quealberga gérmenes a una profundidad de hasta varios milíme-tros! Por una parte, la reacción muy rápida del ozono conlos componentes de la madera y del vino en la superficie delas barricas puede impedir gravemente su difusión y suacción en profundidad. Por otra parte, la oxidación subsi-guiente puede favorecer la aparición de ciertas sustanciasvolátiles (aunque no necesariamente nauseabundas) quepueden influir en el aroma de los vinos y de la madera deforma similar a lo observado en el caso del tratamiento delagua potable (producción de aldehídos volátiles por oxida-ción de materias orgánicas). El uso reiterado, así como condetergentes químicos, también puede reducir más rápida-mente los aportes de la madera al vino.La utilización de productos de limpieza en las barricas sedebe limitar a las barricas muy incrustadas o cuyo origen nose conozca bien. Los productos utilizados tienen que serespecíficos para esta aplicación, y no se deben utilizar encada trasiego, sino sólo para la recuperación periódica(como mucho anual) del parque de barricas usadas. Hay

que descartar el uso de cualquier producto que contengasales de cloro que puedan entrar en contacto directo con lamadera, debido a la formación sistemática de 2,4,6-tricloro-fenol y al riesgo de degradación de este último en 2,4,6-tri-cloroanisol (TCA) especialmente maloliente (olor a "moho").Las formulaciones básicas que contienen fungicidas deamonio cuaternario son eficaces sobre Brettanomyces, aun-que siempre resultan difíciles de eliminar perfectamente enel aclarado. La utilización de detergentes químicos exigesiempre controlar la ausencia de residuos (control del pHdel agua de aclarado y de la ausencia de residuos tensoacti-vos).

2-Utilización de dióxido de azufre

En la actualidad, el dióxido de azufre es el único antisépticoactivo sobre Brettanomyces sp. y autorizado en enología.Por debajo de cierta cantidad de SO2 libre, ya no se inhibeel desarrollo de Brettanomyces y puede aumentar el conteni-do de etilfenol (Figura 6).

En realidad, lo que conviene considerar es el SO2 molecularactivo, y no el SO2 libre dosificable propiamente dicho. Lacantidad de SO2 molecular activo depende en buena parteen primer lugar del pH del vino (Figura 7) y en segundo lugarde la temperatura; también el contenido de etanol, aunqueen menor medida. El aumento del contenido de etanol y dela temperatura de crianza del vino incrementa el pK1 delSO2 lo cual favorece un aumento del SO2 molecular activo ypor lo tanto una mayor protección. Brettanomyces sp. seinhibe con valores de SO2 molecular activo superiores a0,30 mg/l aproximadamente, y se destruye rápidamentepor encima de 0,50 mg/l.Así se explica que los vinos blancos, cuyo pH a menudoestá comprendido entre 3,3 y 3,6 que permite entre un 2%y un 3% de SO2 molecular, rara vez sean terreno de desarro-llo de Brettanomyces sp y en cualquier caso nunca "fenola-do". Por ese mismo motivo, muchos de los vinos tintos, conpH comprendidos entre 3,6 y 4,0 y hoy en día a menudoentre 3,7 y 3,9, que permite como máximo entre un 1,5 yun 0,64% de SO2 activo, a menudo son terreno de impor-tante desarrollo de esas mismas levaduras, pese al mante-nimiento permanente de niveles de SO2 libre superiores a25 mg/l.Para obtener la misma eficacia antiséptica, un vino correcta-mente protegido por 25 mg/l de SO2 libre a pH 3,65 debe-

Figura 7 - Evolución del SO2 molecular activo (A) y de la forma

salificada (S) en función del pH del vino (log S/A = pH - pK con

pK1 = 1,81 y pK2 = 6,91)

Figura 8 - Influencia de las condiciones de crianza en el conteni-

do de etilfenoles de un vino (según CHATONNET et al., 1990).


Informe Técnico 95

ría contener más de 35 mg/l de SO2 libre a partir de pH3,80 y cerca de 60 mg/l con pH 4,0. El incremento regulardel pH de los vinos durante estos últimos años sin duda esresponsable en buena parte del sensible aumento de losvinos tintos "fenolados"La crianza en barricas no induce sistemáticamente una con-taminación de los vinos ni la aparición de un carácter "feno-lado". No obstante, la conservación en madera, la utiliza-ción de barricas usadas mal recuperadas, de salas decrianza inadecuadas (variaciones de temperaturas) y de tra-siegos insuficientes (frecuencia, desinfección de las barri-cas…), constituyen una suma de circunstancias que favore-cen la contaminación y el desarrollo excesivo deBrettanomyces.La utilización de barricas usadas mal recuperadas facilita lacontaminación de los vinos y los contamina precozmente, alaportar directamente etilfenoles atrapados en la masa de la madera (figura 8); este material es sumamente poroso y

alberga las levaduras a mayor o menor profundidad, lo cualdificulta su eliminación. Pero el uso de barricas nuevas tam-bién propicia el desarrollo de esos mismos gérmenes.Circulan muchas hipótesis extravagantes para explicar lamayor frecuencia de contaminación de barricas las nuevasen ciertas salas de crianza: según se dice, las barricas nue-vas se contaminan por Brettanomyces en la tonelería; o lamadera aporta azúcar asimilables en cantidades importan-tes... Pero nada de eso es cierto. La explicación es muchomás sencilla. En una situación de contaminación, únicamen-te el contenido de dióxido de azufre libre y activo permitecontrolar las poblaciones de Brettanomyces. Debido supotencial oxidativo muy superior (mayor contenido de tani-nos elágicos), sobre todo durante el periodo estival, cuando

sube la temperatura en la bodega, el contenido de dióxidode azufre libre tiene tendencia a disminuir mucho más depri-sa en las barricas nuevas que en las barricas usadas(Figura 9). Por debajo de cierto umbral, próximo a 20 mg/lcon un pH normal (3,6-3,7), ya no se inhibe Brettanomycesy aparece una alteración proporcional a la población micro-biana. Las condiciones de utilización del dióxido de azufre puedeninfluir considerablemente en la eficacia de la protección(CHATONNET et al. 1993). Para los vinos en barrica, si nose utiliza regularmente el agua caliente o el vapor, la sulfita-ción por sulfatado siempre es más eficaz que el aportedirecto al vino. La forma gaseosa del dióxido de azufre en labarrica vacía permite una desinfección más eficaz de lasuperficie interna de las barricas. La utilización de pastillasde azufre, siempre que se conserven perfectamente secas,es preferible a la de mechas, pues permite una dosificaciónmás precisa. La utilización del SO2 licuado con un dispositi-vo dosificador adecuado es muy eficaz y de rápida aplica-ción.

Las pastillas efervescentes de metabisulfito de sodio sonmuy fáciles de utilizar y permiten corregir sencillamente elcontenido de dióxido de azufre. No obstante, a veces la

Figura 9 - Evolución del contenido de dióxido de azufre libre de los vinos en barricas entre Junio y Septiembre - Influencia de la edad

de barricas

Figura 10 - Hidrólisis del pirocarbonato de etilo en el vino

SO2 libre (mg/l)

COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNI-CAS DE TOSTADO DE BARRICAS DEROBLE FRANCÉS PARACHARDONNAY

La intensidad y la técnica de tostado influyen de mane-ra decisiva sobre las características organolépticas quela barrica va a conferir al vino. La técnica sin circula-ción de aire aporta una mejor concentración de com-puestos aromáticos que la técnica con circulación deaire. Organolépticamente, el vino queda significativa-mente más marcado por los aromas procedentes de lamadera en el caso de la técnica de tostado sin circula-ción de aire, y en particular si la intensidad de tostadoes fuerte.

J. García-Berro Montilla Bodegas Miguel Torres S.A. Vilafranca del Penedès (Barcelona), España.

N. MoureyTonnellerie Radoux. Jonzac. France.

M. Torres Maczassek Bodegas Miguel Torres S.A. Vilafranca del Penedès (Barcelona), España.

R. Bobet Bodegas Miguel Torres S.A. Vilafranca del Penedès (Barcelona), España.

Con la colaboración de J.L. Puech, J.C. Boulet y A. Razungles de INRA de Montpellier.

Informe Técnico 99


De todas las fases de fabricación de la barrica,una de las que tiene una mayor incidenciasobre el carácter organoléptico final que seotorga al vino es, sin lugar a dudas, el tostado.Tradicionalmente, esta fase se confiaba al per-

sonal más experimentado de la tonelería, cuyo juicio y "peri-cia técnica" imprimían una huella muy personal al resultadofinal.Durante el proceso de tostado se producen aldehídosfuránicos (Furfural, 5-hidroxi-metil-furfural, metil-furfural)debido a la degradación térmica de los polisacáridos delas paredes celulares. Chatonnet et al. (1996) indicanuna gran concentración de estos compuestos con los tos-tados de una intensidad considerada como "media", yuna disminución con una intensidad "fuerte". La degrada-ción de la lignina da lugar a la producción de diferentesfenoles volátiles como el eugenol y el guayacol con aro-mas de especias y de tostado.Las concentraciones de isómeros Cis y Trans de la ß-metil-γ-octalactona también se ven afectadas por el proce-so de tostado, disminuyendo con los tostados más inten-sos (Pérez Prieto et al. 2001) y consiguiendo un nivelóptimo con las intensidades "medias".La mayoría de los compuestos sufren también los efectosde una pirólisis a altas temperaturas: al analizar las con-centraciones de ácido gálico, de vanillina y de siringaldehí-do en función de la temperatura de tratamiento de lamadera, Gimenez Martínez R. et al. (1996) determinanque las concentraciones máximas aparecen a una tempe-ratura próxima a los 165ºC para el ácido gálico y de185ºC-215ºC para la vanillina y el siringaldehído; HaleM.D. et al. (1999) llegan a una conclusión similar, preci-sando que la concentración óptima de vanillina y de sirin-galdehído se obtiene con temperaturas entre 180ºC-200ºC.Los principales parámetros que el tonelero puede contro-lar durante el proceso de tostado son la intensidad delfuego y la circulación de aire en el interior de la barrica.Estos parámetros condicionan la velocidad de incrementode la temperatura de las duelas, los umbrales de tempe-ratura a que se llega y la penetración del calor en el inte-rior de la madera. Matricardi L. et al. (1999) han estudia-do la influencia de estos parámetros, y han llegado a laconclusión de que limitando la circulación de aire se pro-ducen temperaturas superiores en la superficie de lamadera; una de las consecuencias de ello, entre otras, esuna mayor degradación de los elagitaninos. También hananalizado la variación en el nivel de ennegrecimiento delinterior de la barrica en relación con la concentración deelagitaninos, y han llegado a la conclusión de que el colorno es un buen indicador de la concentración de elagitani-nos de la barrica.En el trabajo presentado aquí intentaremos caracterizar

dos técnicas de tostado diferentes, prestando una aten-ción especial al carácter organoléptico final del vino.

1.- Materiales y métodos

1.1.-Fabricación de las barricasLas barricas han sido fabricadas por la Tonelería Radouxen roble francés "Tradition Radoux". Las dos técnicas detostado que evaluaremos son las conocidas como "TipoBordeaux" (BU) y "Tipo Bourgogne" (BO). Estas técnicasse diferencian, en la práctica, por el control de la evacua-ción del aire caliente en el momento del tostado.En efecto, en la técnica "Tipo Bordeaux" se limita la eva-cuación del aire caliente y la circulación de aire fresco.Los objetivos son dobles:- por un lado, conseguir una temperatura elevada en lasuperficie de la madera (> 230°C) que permita una gene-ración más rápida de aromas de tostado- por otro lado, mantener una actividad moderada del fuegoque permita un mantenimiento prolongado de la superficiede la madera a la temperatura de tostado y, en consecuen-cia, una buena penetración del calor en el interior de lasduelas.

En la técnica "Tipo Bourgogne" se permite una evacua-ción continua del aire caliente y una circulación de airefresco manteniendo abierta la barrica durante el tostado.De esta manera, la temperatura obtenida en la superficieinterior de la madera es menor (<230ºC) que en el "TipoBordeaux".La intensidad de tostado se controla mediante la duraciónde la fase de tostado. Aquí comparamos dos intensida-des: Tostado Medio (TM) y Tostado Fuerte (TF). Los fon-dos no se tuestan en ninguno de los dos casos. La codifi-cación de las muestras de ensayo es la siguiente:

- CHNM Tostado medio técnica Bordeaux- CHNF Tostado fuerte técnica Bordeaux- CHNB Tostado medio técnica Bourgogne- CHNC Tostado fuerte técnica Bourgogne

Para preparar las barricas antes de su uso, estas se lle-nan con agua fría a la que se han añadido 25 ppm deSO2, y se guardan 24 horas de esta manera antes devaciarse y entonelarse.

1.2.- VinificaciónLa vinificación empezó al final de la vendimia de 2000 enuna partida de Chardonnay. Después del prensado y des-burbado, la fermentación alcohólica tuvo lugar en unacuba de acero inoxidable hasta una densidad 1050. Acontinuación pusimos el vino en barrica para terminar lafermentación alcohólica hasta un azúcar residual inferiora los 2 g/l. Una vez terminadas las fermentaciones alco-hólica y maloláctica, añadimos 5 g/Hl de SO2 y los vinos

COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADODE BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA

Informe Técnico 101

se guardaron en lías, sin trasiego, y con un bastoneadoregular. La duración total de la crianza en barrica fue de 8meses antes de la clarificación (0,5 g/Hl de cola de pes-cado y 30 g/Hl de bentonita) y embotellado de las mues-tras. Los análisis químicos y sensoriales que se presen-tan aquí se realizaron después de una conservación de6,5 meses en botella.

1.3.- Análisis químicosPara los análisis por CLAR (cromatografía líquida de altaresolución) se ha utilizado un sistema compuesto por:- Bombas Waters 510- Inyectores Waters 712WISP- Detector de fluorescencia Waters 474- Detector Diodo-Array PDA 996

Inyección directa para Columna Teknokroma Tracer Excel120 ODSA 5µmx0,25x0,46.

Para los análisis por GC-FID hemos realizado una extraccióncon freón, con el n-decanol como patrón interno. La croma-tografía utilizada es un HP 5890 Serie II con una columnaTR-WAX (60m x 0,25mm x 0,25 µm) Tracer Ref TR-140262.

Para los análisis por GC-MS hemos realizado una extrac-ción con cartucho LiChrolut Merck EN 200 mg/3ml Ref 1.19870.000, con el n-octanol como patrón interno.La cromatografía utilizada es un detector Agilent 6890 MSRef 5973 con una columna DB-WAX (30m x 0,32mm x0,50 µm) J&W Ref 123-7333

1.4.- Análisis sensorialPara el análisis sensorial, el formulario presentaba sietedescriptores olfativos y cuatro descriptores gustativos, quedebían valorarse sobre una escala continua de 0 a 5 paracada muestra. Los descriptores utilizados eran:- Carácter de madera en nariz- Especias- Vainilla- Mantequilla- Madera verde- Tostado- Ahumado- Carácter de madera en boca- Astringencia- Amargor- Persistencia

Al final de la degustación, cada miembro del jurado (oncepersonas en total) tenía que clasificar las muestras pororden de preferencia (1ª, 2ª, 3ª, 4ª). Para eliminar el des-vío ligado a la amplitud de notación propia de cada miem-

DESCRIPTOR

Carácter de madera en nariz

Especias

Vainilla

Mantequilla

Madera verde

Tostado

Ahumado

Carácter de madera en boca

Astringencia

Amargor

Persistencia

p

0,000013**

0,903966

0,069021*

0,085139*

0,550241

0,160454

0,090739*

0,016336**

0,423483

0,251211

0,000007*

5-HMF

Metil-furfural

Trans-w-lactona

Cis-w-lactona

Eugenol

Guayacol

Siringol

Siringaldehído

Vainillina

Escopoletina

Almendra tostada

Herbáceo

Coco

Especias, clavo

Especias

Ahumado

Vainilla

Vainilla

Tostado medio

3,24

0,42

0,047

0,129

0,033

0,009

0,027

0,330

0,070

0,013

Tostado fuerte

2,98

0,49

0,039

0,135

0,032

0,018

0,058

0,380

0,073

0,010

Tostado medio

2,33

0,21

0,022

0,057

0,024

0,007

0,028

0,290

0,060

0,013

Tostado fuerte

2,36

0,39

0,025

0,063

0,029

0,012

0,051

0,345

0,061

0,009

Técnica Bourdeaux Técnica Bourgogne


bro del jurado, las notas se han centrado y reducido pormiembro y por descriptor antes de su procesamiento esta-dístico, tal como ha sido explicado por X. Tomàs et al.(2002). La obtención de los resultados del análisis senso-rial y el procesamiento estadístico de los datos se ha rea-lizado con la aplicación FIZZ. Las gráficas se han realiza-do con Microsoft Graph 2000.

2.- Resultados

2.1.- Análisis sensorialDespués de la normalización de los datos y la aplicaciónde un análisis de varianza, aparecen diferencias significa-tivas para los descriptores Carácter de madera en nariz,Carácter de madera en boca y Persistencia para unumbral de confianza del 95% (marcados **) y para losdescriptores Vainilla, Mantequilla y Ahumado para unumbral de confianza del 90% (marcados *). La p repre-senta la probabilidad del ensayo F.

Las figuras 1 a 6 nos muestran estas diferencias con lamedia y el intervalo de confianza (95%) para cada uno delos descriptores.Si comparamos las técnicas de tostado a una intensidad

de tostado equivalente con el ensayo de Student, consta-tamos que para la intensidad Media aparecen diferenciassignificativas para el descriptor Carácter de madera ennariz en el umbral del 95% y para el descriptor Carácterde madera en boca en el umbral del 90%, y que los dosson más evidentes con la técnica "Bordeaux". Las figuras7 y 8 nos muestran estas diferencias.Para la intensidad de tostado "Fuerte", aparecen diferen-cias significativas en el umbral del 95% entre las dos téc-nicas para los descriptores Carácter de madera en nariz,Vainilla, Mantequilla, Carácter de madera en boca yPersistencia; para el descriptor Tostado las diferenciasson significativas en el límite del umbral del 90%. Todoslos descriptores significativos son más marcados con latécnica de tostado "Bordeaux". Las figuras 9 a 14 nosmuestran estas diferencias.Si analizamos las preferencias de los catadores, pode-mos ver muy bien que se prefieren los tostados "TipoBordeaux" (CH1NM y CH1NF) a los tostados "TipoBourgogne" (CH1NB y CH1NC), y que la modalidad menosapreciada es la Fuerte "Tipo Bourgogne" (ver las figuras15 y 16).

2.2.- Análisis químicoLos resultados analíticos más significativos son lossiguientes:La técnica de tostado "Tipo Bordeaux" presenta las concen-

COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO DEBARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA CHARDONNAY

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00CHNM CHNF CHNB CHNC

5-HMF Metil-Furfural x 10

0,06

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01


Guayacol Eugenol Siringol

0,14

0,12

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02


t-w-Lactona c-w-Lactona

0,40

0,35

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00

CHNM CHNF CHNB CHNC

Siringaldehído

0,08

0,07

0,06

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00

CHNM CHNF CHNB CHNC

Vainillina

0,016

0,012

0,008

0,004


Escopoletina

Figura 17 Figura 18 Figura 19

Figura 20 Figura 21 Figura 22


1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5

CH1NB CH1NC CH1NM CH1NF

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5


1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5


1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5


Figura 1. Carácter de madera en nariz. Figura 2. Vainilla

Figura 3. Mantequilla. Figura 4. Ahumado.

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5


Figura 5. Carácter de madera en boca.

GRÁFICAS


COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADODE BARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARACHARDONNAY

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5Tipo Bourgogne Tipo Bourdeaux

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


Figura 9. Carácter de madera en nariz.Tostado fuerte

Figura 10. VainillaTostado fuerte

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


Figura 7. Carácter de madera en nariz.Tostado medio.

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


Figura 8. Carácter de madera en nariz.Tostado medio.

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5


Figura 6. Persistencia.


1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


Figura 11. Mantequilla.Tostado fuerte

Figura 12. Tostado.Tostado fuerte

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0


Figura 13. Carácter de madera en boca.Tostado fuerte

Figura 14. Persistencia.Tostado fuerte

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0


Figura 15. Preferencias


COMPARACIÓN ENTRE DOS TÉCNICAS DE TOSTADO DEBARRICAS DE ROBLE FRANCÉS PARA CHARDONNAY

10

8

6

4

2

0

1 2 3 4

CH1NB

10

8

6

4

2

0

1 2 3 4

CH1NC

10

8

6

4

2

0

1 2 3 4

CH1NM

10

8

6

4

2

0

1 2 3 4

CH1NF

Figura 16. Preferencias

Nº

deob

serv

acio

nes

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Introducción

La colaboración entre Tonnellerie Radoux yBodegas Torres nos ha conducido a llevar a caboun estudio sobre los diferentes tipos de tostado(tipo Burdeos y tipo Borgoña), las diferentesintensidades de tostado (tostado mediano y tos-

tado fuerte) y los diferentes orígenes de la madera de lasbarricas.Los tostados tipo " Burdeos " o " Borgoña " se diferencianen la práctica en el control de la evacuación del aire calientey en el control de la circulación del aire fresco, rico en oxí-geno.El tostado tipo " Burdeos " limita la evacuación del airecaliente y la circulación del aire fresco. Los objetivos sondobles:

-Por un lado alcanzar un nivel de temperatura elevado en lasuperficie de la madera (> 230°C), lo que permite unageneración más rápida de los aromas de tostado.-Por otro lado mantener una actividad moderada del fuego(ambiente de combustión progresivamente empobrecidoen O2) que permite un mantenimiento prolongado de lasuperficie de la madera a esta temperatura, una mayordegradación de los taninos elágicos y la generación en lamadera de aromas en profundidad (Matricardi (1)). La con-secuencia principal es una cantidad de aromas de tostadoextraíbles más importante.

El tostado tipo " Borgoña " permite una evacuación conti-nua del aire caliente y una circulación ligeramente másimportante de aire fresco. La temperatura alcanzada en lasuperficie de la madera es menor (<230°C); la actividadmoderada del fuego permite un mantenimiento prolongadoa esta temperatura.La cantidad de aromas generados es más débil y la gamade aromas ligeramente diferente.Los tostados mediano y fuerte se diferencian al final delproceso por un calentamiento (bousinage) más o menosprolongado a niveles de temperatura diferentes (situándo-se el tostado mediano a niveles de temperatura másmoderados).Para el estudio de los diferentes orígenes de las maderas,

Pretratamiento de datos en análisis sensorial


comparamos una selección de robles de la Europa delEste de grano fino (" Tradition Centre Europe ") con unaselección de robles del Centro de Francia igualmente degrano fino (" Tradition Centre France ") efectuadas segúnlas especificaciones de requisitos de la TonnellerieRadoux.En principio, es conveniente suponer que las puntuacionesde cada juez en la valoración sensorial de las diferentesmuestras serán homogéneas, de manera que cualquierdiferencia en la puntuación no se deberá más que al tipo,a la intensidad del tostado o al origen del roble. Tambiénes conveniente suponer que los jueces que tengan un sen-tido crítico utilizarán un nivel de puntuación más desfavora-ble que los jueces que tengan un sentido crítico menosestricto. Este hecho puede introducir en los resultados decualquier degustación una desviación debida al criterio pre-vio y subjetivo propio de cada juez.La posible existencia de esta heterogeneidad obliga, cuan-do se analizan los resultados de una degustación, a consi-derar a los jueces como un posible factor de influenciasobre los resultados, pudiendo llegar a desnaturalizar lasconclusiones sobre la posible existencia de diferencias sig-nificativas entre las muestras.Aparte de esta heterogeneidad, se debe considerar igual-mente la que puede provenir de las diferentes sensibilida-des (precisiones) con las cuales los distintos jueces puntú-an (evalúan) las muestras. Otra hipótesis ideal de trabajo,muy utilizada en los numerosos tests estadísticos, comopor ejemplo el análisis de la varianza, es que esta variabili-dad en la puntuación de cada juez sea también estadísti-camente homogénea para todos ellos (Bowker (2)).Todo lo que ha sido expuesto hasta el presente puede sercomprendido más fácilmente si se considera a cada juezcomo a un complejo instrumento de medida dotado de suexactitud y precisión propias.Con el fin de evitar estas dificultades, la Quimiometríaofrece la posibilidad de realizar, sobre los resultados de

un análisis sensorial, tratamientos previos a su análisisestadístico, eliminando de esta forma estas posibles hete-rogeneidades y facilitando su estudio posterior (Meloun(3)).En este trabajo en curso exponemos dos tratamientos pre-ventivos de los datos, el centrado y la normalización deéstos (en inglés " autoscaling "), aplicados a pruebas depuntuación sensorial realizadas sobre muestras del mismovino, otorgadas por diez jueces expertos

Técnicas experimentales y material utilizado

Las pruebas han sido llevadas a cabo con el vino de varie-dad Merlot, habiendo realizado su fermentación malolácti-ca en barrica y que en el momento de la degustación decontrol había permanecido 2 meses en madera. El vino vaa mantenerse todavía 10 meses en contacto con la barri-ca y va a estar sometido a otras degustaciones de control.Ha sido creado un panel de cata compuesto por personalde dos organizaciones y del INRA y que, además de lacaracterización de cada muestra (ADQ), ha procedido a daruna puntuación global (escala predefinida 0-10).

Resultados

La codificación de las diferentes muestras es la siguiente :

VINO 1 Madera francesa Tostado mediano tipo BorgoñaVINO 2 Madera francesa Tostado fuerte tipo Borgoña VINO 3 Madera francesa Tostado fuerte tipo BurdeosVINO 4 Madera francesa Tostado mediano tipo BurdeosVINO 5 Madera del Este Tostado fuerte tipo Burdeos VINO 6 Madera del Este Tostado mediano tipo Burdeos VINO 7 Madera francesa Tostado fuerte tipo Burdeos VINO 8 Madera francesa Tostado mediano tipo Burdeos

El cuadro 1 resume los resultados experimentales obteni-

PRETRATAMIENTO DE DATOS EN ANALISIS SENSORIAL

Cuadro 1.- Datos brutos tras la degustación de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces:

Nº Juez

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

VINO 1

7,8

7,6

8

8,2

7,4

7,6

6

4

5

5

VINO 2

7,5

7,5

7,2

7

7,2

7,2

5

5

3,5

2

VINO 3

7,6

7,5

7,7

8,1

7,6

7,7

6

7

4,5

3

VINO 4

7,7

7,6

7,3

8,3

7

7,9

4

5

3

3

VINO 5

7,8

7,8

8,2

8,7

8

7,5

7

5

5

6

VINO 6

7,6

7,7

8

8

7,1

8

5

7

4,5

6

VINO 7

7,7

7,9

8,2

7,9

7,2

7,6

5

6

4

3

VINO 8

7,5

7,7

7,8

7,5

7

7

4

6

4

3


Comentarios

1. El centrado de los datos

Puede ser útil transformar las muestras brutas en mues-tras centradas para minimizar los efectos de escalón pro-ducidos entre los degustadores que puntúan con severi-dad y los que lo hacen de una forma más generosa(Samson (4)).Si se admite que su percepción para diferenciar los vinosserá la misma, pero utilizando de manera diferente laescala de puntuación, el centrado de los datos puedeminimizar esta diferencia y su tratamiento estadístico ten-

drá más posibilidad de determinar las diferencias entrelos vinos.El proceso consiste en calcular la puntuación media glo-bal ( x ) y las puntuaciones medias de cada uno de los ijueces ( xi ).Se obtendrá la nota centrada según la transformación :cij=xij + ( x - xi ) donde xij es la j-ésima nota del i-ésimo juezy donde ( x - xi ) es el punto de vista del juez i.De este modo, sobre los datos brutos obtenidos en los

Cuadro 2.- Notas medias, desviación típica y desvío de cada juez.

Nº de Juez

12345678910

GLOBAL

Nota Media

7.657.667.807.967.317.565.255.634.193.886.49

Desviación típica

0.11950.14080.38170.51810.34410.33351.03511.06070.70391.55271.6813

Desvío

- 1.16- 1.17- 1.31- 1.47- 0.82- 1.071.240.862.302.61

Lo cual nos conduce a los datos centrados (Cuadro 3).

Cuadro 3.- Datos centrados tras la degustación de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces.

Nº Juez

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

VINO 1

6,64

6,43

6,69

6,73

6,58

6,53

7,24

4,86

7,30

7,61

VINO 2

6,34

6,33

5,89

5,53

6,38

6,13

6,24

5,86

5,80

4,61

VINO 3

6,44

6,33

6,39

6,63

6,78

6,63

7,24

7,86

6,80

5,61

VINO 4

6,54

6,43

5,99

6,83

6,18

6,83

5,24

5,86

5,30

5,61

VINO 5

6,64

6,63

6,89

7,23

7,18

6,43

8,24

5,86

7,30

8,61

VINO 6

6,44

6,53

6,69

6,53

6,28

6,93

6,24

7,86

6,80

8,61

VINO 7

6,54

6,73

6,89

6,43

6,38

6,53

6,24

6,86

6,30

5,61

VINO 8

6,34

6,53

6,49

6,03

6,18

5,93

5,24

6,86

6,30

5,61


Las figuras 1 y 2 nos muestran, con la ayuda de diagramas de cajas, el efecto de estos procedimientos. Hay queresaltar la homogeneización de la escala de puntuación, siempre conservando la variabilidad propia de cada juez.

Figura 1.- Datos brutos, diagramas de cajas para cada juez.


10

8

6

4

2

0

JUEZ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10

8

6

4

2

0

JUEZ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2.- Datos centrados, diagramas de cajas para cada juez.

Se puede apreciar la homogeneización de las notas centra-das sobre la media global 6,49 y la conservación de lavariabilidad de cada juez.Si se comprueba la homocedasticidad de los jueces, eltest de Bartlett conduce a desestimar la hipótesis de lahomogeneidad de las varianzas (Discriminante = 2.6899 ; p < 9,997 10 -11).Esto puede ser un problema para la aplicación posterior deotras pruebas estadísticas destinadas a la detección delas diferencias entre las muestras, como en el caso delanálisis de varianza, debido a la no ejecución de las hipó-tesis de trabajo.

2. Normalización

Un tratamiento alternativo anterior de los datos, muy fre-cuentemente utilizado en Quimiometría si se trabaja con

las variables de diferentes magnitudes y/o variabilidaddiferente, es la normalización.Esto consiste en evaluar para cada juez la puntuaciónmedia ( xi ) y su desviación típica (si), transformando acontinuación cada nota siguiendo la formula :

zij = (xij - xi ) / si

Este tratamiento previo pretende otorgar a cada juez lamisma importancia, independientemente de su percepciónpara diferenciar las muestras y de su poder de discrimina-ción, dado que las nuevas puntuaciones transformadascorresponden, desde el punto de vista estadístico, a varia-bles centradas y reducidas.De este modo, a partir de los datos brutos obtenidos enlos casos del vino Merlot, se obtienen los datos transfor-mados indicados en el cuadro 4.

Not

abr

uta

Not

ace

ntra

da


Como era de esperar, se puede apreciar la homogenización de las puntuaciones tanto en lo que concierne al valormedio como en lo que concierne a la dispersión de cada juez. Si se realiza la prueba de Bartlett sobre estas puntuacio-nes Z se aprecia que no hay diferencias significativas entre las varianzas de las puntuaciones de cada juez. En consecuencia, estas puntuaciones han sido analizadas por medio de un ANOVA con dos factores (jueces, vinos) y sehan obtenido los resultados siguientes :

Análisis de varianza: Nota Z para Vinos Merlot

La figura 3 nos muestra los diagramas de cajas del efecto de estos procedimientos. Es preciso destacar la homogeni-

zación de la escala de puntuación y la variabilidad propia de cada juez.

Figura 3.- Notas transformadas (Z), diagramas de cajas para cada juez.

2.5

1.5

0.5

-0.5

-1.5

-2.5

JUEZ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cuadro 4.- Normalización. Notas transformadas (Z) tras la degustación de 8 muestras de vino Merlot por 10 jueces.

Nº Juez

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

VINO 1

1,255

-0,444

0,524

0,458

0,254

0,112

0,725

-1,532

1,154

0,725

VINO 2

-1,255

-1,154

-1,572

-1,858

-0,327

-1,087

-0,242

-0,589

-0,977

-1,208

VINO 3

-0,418

-1,154

-0,262

0,265

0,836

0,412

0,725

1,296

0,444

-0,564

VINO 4

0,418

-0,444

-1,310

0,651

-0,908

1,012

-1,208

-0,589

-1,687

-0,564

VINO 5

1,255

0,977

1,048

1,424

1,998

-0,187

1,691

-0,589

1,154

1,369

VINO 6

-0,418

0,266

0,524

0,072

-0,618

1,312

-0,242

1,296

0,444

1,369

VINO 7

0,418

1,687

1,048

-0,121

-0,327

0,112

-0,242

0,354

-0,266

-0,564

VINO 8

-1,255

0,266

0,000

-0,893

-0,908

-1,686

-1,208

0,354

-0,266

-0,564

Fuente devariabilidad

Total

JUECES

VINOS

Residual

Suma de loscuadrados

69.9998

1.8624 10 -10

30.0961

39.0937

Grados delibertad

79

9

7

63

Cuadradomedio

2.06934 10 -11

1.29944

0.633393

Factor F

0.00

6.79

Valor P

1.0000

0.0000

Not

aZ


La muestra mejor calificada es la de roble del Este tosta-do fuerte tipo Burdeos (Vino 5). Después viene un grupoformado por el roble del Este tostado mediano tipoBurdeos (Vino 6) y el roble francés tostado mediano tipoBorgoña (Vino 1), seguido de cerca por un grupo formadopor el roble francés tostado fuerte tipo Burdeos (Vinos 3 y7).Como grupo menos bien clasificado encontramos al deroble francés tostado mediano tipo Burdeos (Vinos 4 y 8)y al de roble francés tostado fuerte tipo Borgoña (Vino 2).

3. Conclusiones

Este estudio describe dos formas de realizar un pretrata-miento de los datos provenientes del análisis sensorialde diferentes muestras de un mismo vino.Por medio del centrado de los datos brutos, se minimizanlos efectos de escalón producidos entre los degustadoresque puntúan con severidad y los que lo hacen de unaforma más generosa. Si se admite que su percepción

para diferenciar los vinos será la misma, pero utilizandodiferentemente la escala de puntuación, el centrado delos datos puede minimizar esta diferencia y su tratamien-to estadístico tendrá más oportunidad de determinar ladiferencia entre los vinos.Si además de esta heterogeneidad se pretende minimizarla que puede derivarse de las diferentes sensibilidades(precisiones) con las cuales los distintos jueces puntúan(evalúan) las muestras, la normalización ofrece una posi-bilidad alternativa a la utilización de otros tests estadísti-cos para el análisis de resultados, como por ejemplo eltest de Kruskal - Wallis o bien el test de Wilcoxon.

En este caso, el tratamiento de normalización permite (apesar de la heterogeneidad de las puntuaciones) clasificarlas muestras con diferencias significativas (α = 0.05). Lamuestra mejor calificada después de dos meses es la deroble del Este tostado fuerte tipo Burdeos y un grupo for-mado por roble del Este tostado mediano tipo Burdeos yroble francés tostado mediano tipo Borgoña, seguido decerca por un grupo formado por roble francés tostado


Por consiguiente, se puede llegar a la conclusión de que no existen diferencias significativas entre las puntuaciones delos jueces, mientras que se detectan diferencias significativas entre las 8 muestras de vino Merlot, como lo demues-tran las figuras 4 y 5.

Figura 4.-Merlot: Transformada Z. Promedio e Intervalo de confianza (95%) para cada juez.

1

0,5

0

-0,5

-1

JUEZ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2

1

0

-1

-2

Vino Marlet

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 5.- Merlot: Transformada Z. Promedio e Intervalo de confianza (95%) para cada muestra.


fuerte tipo Burdeos.Los grupos con la peor nota son los de roble francés tos-tado mediano tipo Burdeos y roble francés tostado fuertetipo Borgoña.Conviene hacer notar que los resultados son provisiona-les puesto que el vino permanece durante un año enbarricas, pero son coherentes a pesar de todo puesto quemuestras diferentes del mismo lote son calificadas de lamisma manera.

Huelga decir que la normalización confiere la mismaimportancia a los jueces con un poder de discriminaciónbajo que a los que poseen una mayor sensibilidad. Cadasituación concreta implicará el estimar la utilización deeste pretratamiento de las calificaciones.

Resumen

En un estudio sobre la incidencia de los diferentes tiposde tostado (Burdeos y Borgoña), de las diferentes intensi-dades de tostado (tostado mediano y fuerte) y de los dife-rentes orígenes (roble francés y del Este) sobre un vinode Merlot, se han llevado a cabo diferentes pretratamien-tos estadísticos de los datos resultantes y del análisissensorial. El centrado de los datos ha sido comparadocon la normalización.

Palabras clave : Análisis sensorial, Pretratamiento,Normalización, Centrado, Vino Merlot.

Dos técnicas de pretratamientos de datos, centrado y nor-malización son comparadas en el estudio del efecto deltostado (tipo Burdeos y Borgoña), la intensidad de tosta-do (mediano y fuerte) y el origen (roble francés o del Este)en la evaluación sensorial de una muestra de vino Merlot.

Palabras clave : Evaluación sensorial, Pretratamiento dedatos, Normalización, Centrado, Vino Merlot.

Agradecimientos

Hacemos presente nuestro más vivo agradecimiento a J.LPuech, A.Razungles y J.C. Boulet del INRA(*) deMontpellier.


(1): Matricardi L y Waterhouse A.L. 1999. Influence ofToasting Technique on Color and Ellagitanins of Oak inBarrel Making. Am. J. Enol. Vitic, vol 50, nº 4, 519-526.

(2): Bowker A.H. y Lieberman G.J. 1965. Méthodes statis-tiques de l'ingénieur. Dunod. Paris

(3): Meloun M., Militky J et Forina M. 1992.Chemometrics for Analytical Chemistry. Ellis Horwood.New York.

(4): Samson A.et Saint-Pierre B. 2000. Les systèmes desaisie et d'acquisition des données de l'analyse sensorie-lle. Revue Française d'Enologie.nº 182, 25-30.

(*) Institute National de la Recherche Agronomique.

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