INFORME FINAL DE SERVICIO 4 FLOR DE MARIA …148.206.53.84/tesiuami/UAM20034.pdf · ccombustibles...

CCOMBUSTIBLES POR FERMENTAClON BIOMETANACION RAPIDA DEL LIRIO ACUATICO

INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL QUE PRESENTAN

4 FLOR DE MARIA CUERVO LOPEZ . ANA LILIA VELAZQUEZ SOLIS

l/'. ALUMNAS DE LA CARRERA DE INGENIERIA BIOQUIMICA

INDUSTRIAL

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA - IZTAPALAPA

l C . B. S .

/- 15 DE NOVIEMBRE

UÁSESOR: M. en c. OSCAR MONROY

FLOR DE .WIA CUERVO LOPE^ ANA LILIA VELAZQUEZ SOLIS

TELEFONOS : 6 - 51 - 55 - 54 91 - 595 - 4 - 15 - 64

MATRICULAS : 80330612 80330061

CLAVE : .z 3 3 0 0 4 / 8 5

CARRERA : INGENIERIA BIOQUIMICA INDUSTRIAL

TRIMESTRE : 85 - I

HORAS SEMANA: 20

LABORATORIO DE FERMENTACIONES Y MICROBIO I_

LOGIA INDUSTRIAL (S-154)

FECHA DE INICIO: 15 de FEBRERO 1985

FECHA DE TERMINACION: 15 de NOVIEMBRE 1985

ASESOR: M. en C. OSCAR MONROY HERMOSILLO JEFE DEL DPTO. BIOTECNOLOGIA

TITULO : COMBUSTIBLES POR FERMENTACION BIOMETANACION RAPIDA DEL LIRIO ACUATICO

- ----- Ana Lilia Vel

E ,a

-2-

Se ha llegado a la conclusión de que los tiempos de retención deben ser altos, la ve1ocidad.de alimentación de la celulosa debe controlarse para que no haya acumulacián y esto provoque una inhibición por producto.

Para la producción en continuo de enzima (celulasas) se utiliza un hongo celulolftico T. harzianum que es un micro- organismo prototrófico capaz de crecer en un medio inorgánico suplementado solo con una fuente orgánica de carbono; otra so- lución es el uso de bacterias y hongos celulolfticos.

OBJETIVOS GENERALES:

1.- Determinar el proceso óptimo de pretratamiento de las fibras celul6sicas en función de los rnetabolitos obtenidos en la acidogénesis. Se probarán combinaciones de tratamientos mecánicos, químicos y biológicos. Los datos se obtendrán experimentalmente en cultivos cerrados para ob - tener un modelo en sistema continuo.

2.- Obtener un modelo cinético que nos permita predecir la rapidez de formación de metabolitos en función del tama- ño de partfcula, concentración de sustrato y microorga- nismos.

METAS :

1.- Aprender técnicas de producción de enzimas a partir de T. harziarium y medición de la actividad celulftica.

2.- Manejar cultivos mixtos bacterianos celulolfticos.

3.- Manejar fermentaciones en estado sólido con hongos celulolfticos.

4 . - Desarrollo de ui-a tecnologfa para la degradación rápida del lirio acuático.

-67-

RESUMEN.

Reconociendo la importancia del uso del lirio acuático en plantas de tratamiento de aguas res& duales, en este proyecto se atacó el problema del pretratamiento de las fibras del lirio, con obje - to de acelerar la degradación de la hemicelulosa y celulosa.

Con el fin de encontrar el mejor tratamiento que mejor se adapte con una segunda fase consis tente en la acetog6nesis.y metanacibn se estudia ron los siguientes:

1) Mecánico 2) Térmico-alcalino 3) Enzimático 4 ) Micdtico

De los cuales los mejores resultaron ser los tratamientos térmicos con un tratamiento enzimá . .. tic0 posterior.

Debido a la contaminación que presenta el lirio acuático las condiciones para el tratamiento micó- tic0 no fueron favorables.

- I N D I C E -

INTRODUCCION

OBJETIVOS GENERALES

METAS

ACTIVIDADES REALIZADAS

DE CARROLL0 EXPE R1MENTP.L

RESULTADOS

DTSCUSION Y CONCLUSIONES

RESUMEN

ANEXO

REFERENCIAS

1

2

2

3

4

14

62

67

68

80

-1-

A la conversión de residuos celulósicos a combustibles se le ha prestado gran atención en los Gltimos años.

La hidrólisis enzimática de los residuos celulósicos es muy lenta debido a que el sustrato presenta resistencia a este ataque debido a los siguientes factores:

1) La celulosa tiene una estructura cristalina altamente re- sistente.

2 ) La lignina que rodea la celulosa forma una barrera ffsica.

3) Los sitios disponibles para el ataque enzimático son limi- tados.

Por lo que es necesario dar un pretratamiento a l a s

fibras para aumentar la susceptibilidad de la actividad enzi- mática.

Un pretratamiento ideal ser€a reducir la cristalini- dad, reducir el contenido de lignina y aumentar el área super- ficial. Fan (1981) demostró que los pretratamientos químicos con sosa caústica son mejores y más económicos que los ffsicos.

Además del pretratamiento Khan (1983) ha iriiciado experimentos para la digestión continua en dos fases. La pri- mera fase es el pretratamiento que consiste en la liberación de lignina y en el ataque enzimático. La segunda fase consiste en la ácido y acetogénesis seguida de la metanogénesis.

Los problemas a los que se han enfrentado son tiempos de. retención hidráulicos, velocidades de alimentación de la celulosa y la producción continua de enzimas.

-3-

ACTIVIDADES REALIZADAS __-----.--__

1. PRODUCCION DE CELULASAS

A) Fermentación Líquida Cinética Producción

B) Fermentación sdlida Cinética Produccidn

2. ANALISIS PROXIi.IAL DE LIRIO ACUATICO

3 . HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO Pretratamientos:

Térmico Térmico-alcalino

4 . PRODUCCION DE CELULASAS SOBRE LIRIO ACUATICO A) pH no regulado B) pH controlado

5. HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO CON CELULASAS DE Trichoderma harzianum __-.-.-- __._I.

6. HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO Pretratamiento:

Térmico

7 , HTDROLISIS DE LIRIO ACUATICO Pretratamiento:

Térmico-alcaiino

1 -

I -4-

D E S A R R O L L O

E X P E R 1 M E N T P . L i

1

-5-

CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRODUCCION DE CELULASAS.

l.A FERMENTACION LIQUIDA.

El cultivo se llev6 a cabo dentro de un fermentador Biolafitte de 2 1 Conteniendo 1250 ml de medio de cultivo, utilizando como sustrato bagazo y salvado de tri - go (4:l).

Se realiz6 un pretratamiento del sustrato en autocla ve a 120°C durante 1 Hr, conteniendo el fermentador la- solución mineral de Mandels y Weber con la siguiente - composición:

Sulfato de amonio Urea Fosfato monopotásico Agua destilada PH Sustrato

0.975 g 0.238 g 0.50 g 1000 ml 5.6 10.0 g/1

7 Se inoculó con una suspensión de esporas de 3 X 10 esp/g sustrato P.S.

CONDICIONES DE CULTIVO: Temperatura A.eración Agitacibn PH Antiespumante

29OC + l0C io ifir

No regulado Aceite, Tween 80

ANALISIS DE MUESTRAS. A diferentes intervalos de tiempo se toman muestras

de 10 ml del fermentador. La evolución del inOculo se observa al microscópio en una preparación con Blue Cotton. Las muestras se congelan para analizarlas todas juntas posteriormente. Las muestras descongeladas y hornogeneizadas con un Potter se someten a los siguientes análisis:

-6 - I:

PH Azúcares reductores (mas) t Azúcares totales (Antrum)

Proteína (Lowry j Actividad enzimática (APF, ACMC)

, Los resultados se reportan en mg de producto formado o sus trato consumido, las actividades enzimáticas en UI/g sus= trato P.S.

l.B FERMENTACION SOLIDA. LOE cultivos se realizaron en dispositivos diseñados

por Raimbault & Alazard (1980), utilizando como sustrato salvado de trigo y bagazo (1:4).

Solucibn mineral para 100 g de sustrato: Sulfato de amonio Urea Fosfato monopotásico Agua destilada PH

9.75 g

5.0 g 2.38 g

100 ml 5.6

al sustrato finamente molido se le adiciona 100 ml de la solución mineral, se mezcla bfen y se esteriliza en au clave a 12OoC durante 1 Hr.

da de esporas en relación de 3 x 10 esp/g sustratc? P.C. tomando en cuenta que la humedad inicial sea de 60-70 %.

I_

La inocuiacibn se reaiizb con uya suspensibn concentra -

CONDICIONES DE CULTIVO: Humedad inicial 60 - 70 % Temperatura 2 9 W + l0C E” NO regulado El medio de cultivo inoculadose reparte en columnas

de incubacibn aproximadamente 20 g y se coloca dentro de un baño marfa a 29OC.

La aeracion del cultivo se realiza con aire saturado de agua con un flujo de 7 l/hr.

ANALISIS DE MUESTRAS. A diferentes intervalos de tiempo se saca de la incu

badora una columna de fermentación, el producto se homoge neiza con una espátula y 2.5 g de muestra se homogeneiza- con 100 ml de agua y se congela; el producto restante se

- -7-

utiliza para determinar humedad y para-observaciones al microscopio en las que se puede observar la evolución del inóculo en funcidn del tiempo.

Se descongelan las muestras y se homogeneizan con un Potter, se hacen diluciones apropiadas y se someten a los siguientes análisis:

PH Azúcares reductores ( DNS 1 Azúcares totales (Antrona) Actividad enzimática (APF, ACMC) Proteínas (Lowry) Los resultados se reportan en mg de producto formado o

de sustrato consumido y las actividades enzimáticas en UI/ g sustrato P.S.

2 . ANALISIS PROXIMAL DEL LIRIO ACUATICO.

%

PROTEINAS HUMEDAD FOSl3OR.O

NITROGEN0 POTASIO CALCIO CLORO CENIZAS NTD (B.S.)

1.14 92.0

0.42 2.4 1.81 0.02 3.0

14.27 41.34

-8- I

3 . HIDROIJSIS DEL LIRIO ACUATICO. Se diseñaron experimentos para conocer e l mejor pretra

tamiento de las fibras del lirio acuatico Consistentes en- térmicos y térmicos-aicalines, posteriormente se realizó - una hidrólisis para cuantificar la liberación de adcares reductores provenientes de las fibras, por lo que se probó en base seca y base hlimeda de cada uno de los pretratamien - tos.

PRETRATAMIENTOS

11 LIRIO SIN TRATAMIENTO,

2 ) LIRIO TERMICO 30 ' 15 lb/in2

3) LIRIO TERMICO 60' 15 lb/inz

4 ) LIRIO TERMICO 30 ' 15 lb/in2 Aicalino (NaOH 1%)

51 LIRIO TERrlICü 60' 15 lb/in2 ALCALINO (NaOH 1%)

PRETRATAMIENTOS: Térmicq:

Térmico-alcalino:

50 g de Lirio Acuático se ponen en autoclave a 15 lb/in durante 30 ' y 60'.

50 ml de NaOH 1% y se pusieron en autoclave a 15 lb/in duran te 30 ' y 60'. Posteriormente el sustrato se lavo hasta que eT agua fuera neutra.

mentación sólida en lote dad

50 g de Lirio acuático se mezcl2n con

La fuente de celulasas fue del cultivo producido por fer con una activi- con T . harzianum

papel filtro de 9-10 uI/g'~us~r~o~ermentado P.H.

METODO DE HIDROLISIS. La mitad del sustrato pretratado se seca durante la noche

a 80°C y la otra mitad se utiliza húmeda. 5 g de Lirio acudti co y 50 g de lirio acuático húmedo son puestos en matraces d e 250 ml con 5 ml de Buffer Citrato 1 M (pH 4 . 8 ) , 4 0 ml de agua destilada y 2 . 4 g de celulasas. Los matraces ponen en una in cubadora a 5OoC y 200 rpm; fuga y el sobrenadante se analiza para azúcares reductores con (DNS) el tiempo de hidróiisis fue de 8 hrs.

después de cierto tiempo se centri

1 . II

-9-

4.A PRODUCCION DE CELULASAS SOBRE LIRIO ACUATICO pH NO REGULADO

El cultivo se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 150 ml de solución mineral y utilizan do como sustrato lirio acuático con 4 % de sólidos totales.

Pretratamiento del sustrato: A) Térmicos: 1 5 ' y 30'

B) Térmico-alcalino: 1 5 ' y 30'

Solución mineral: Sulfato de amonio Urea Fosfato monopotásico Agua destilada

0.39 g

0.02 g 0 . 0 9 5 g

1000 ml -

Se esteriliza a 15 Lb/in2 durante 20' Sustrato: Lirio acuático con 4 % de sólidos totales. Inóculo: ~uspensión de esporas de Trichoderma

Condiciones de cultivo:

- -_- .- .- harzianum de 4 . 8 x l o 8 / ml - ---.-

Temperatura Agitación PH

29'C + l0C Constaiite NO regulado

Análisis de muestras: A diferentes intervalos de tiempo se toman muestras de

1 0 ml de cada matraz. La evolución del inóculo se observa al microscopio en una preparación con blue cotton, las -- muestras se congelan para analizarlas todas juntas posteriormente.

Las muestras descongeladas y hornogeneizadas se someten a los siguientes análisis:

PH Azúcares reductores (DNS ) Actividades enzimáticas (PF y CMC) Los resultados se reportan en mg de AR/g Lirio seco y

las actividades enzimdticas en mg de AR/g Lirio seco hr.

-10-

89 110 120 124

4.B PRODUCCIOX DE CELULASAS SOBRE LIRIO ACUATICO pn CONTROLADO

120 150 180 30 60 12 o 15 30 60 10 20 45

Se utili26 medio de cultivo igual al anterior, lirio acuático con 4% de sdlidos totales y los mismos pretratamientos.

Condiciones de cultivo: Temperatura 29'C + - l0C Agi taci6n Cons tante PH 5.6

Análisis de muestras: A diferentes intervalos de tiempo se toman muestras de

10 ml de cada matraz. La evolucidn del indculo se observa al microscopio en una preparacidn con blue cotton, las muestras se congelan para analizarlas posteriormente todas juntas.

a los siguientes análisis: Las muestras descongeladas y homogeneizadas se someten

PH Azúcares reductores (DNS) Actividad enzimática (APF y ACMC) Los resultados se reportan en mg AR/g lirio seco y las

actividades enzimáticas en mg AR/g lirio seco hr.

5. HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO CON CELULASAS DE Trichoderma harzianum --.----- _---_

Se probaron diferentes tiempos y temperaturas de esteri - iizacibn.

(T OC I TIEMPO (MIN) 1.0 1 1.4 2.05 2.25

-11-

La hidrblisis se realizb en dispositivos diseñados por Raimbault & Alazard (1980).

Método de hidrólisis: 10 g de lirio acuático fresca molido, se inocularon con

7 . 4 2 g de celulasas (B!'H.) con una actividad de papel filtro de 9-10 UI/g sustrato fermentado P.H.

El lirio acuático pretratado e inoculado se coloca en columnas de hidrblisis y se mantiene a baño maría a 50°C.

- La aeración del cultivo se realiza con aire saturado de agua, con un flujo de 7 llhr. El tiempo de hidrdlisis es de 8 hrs.

Análisis de muestras: A diferentes intervalos de tiempo se saca de la incuba

dora una columna de hidrolisis. El producto se homogener za con una espátula y 2.5 g de muestra se mezclan con 100 ml de agua destilada y se congelan para analizarlas todas juntas posteriormente. De las muestras descongeladas se - hacen diluciones apropiadas y se someten a los siguientes análisis :

Azúcares reductores (DNS) Actividad enzimática (APF y ACMC) LOS resultados se reportan en mg AR/ g de lirio seco y

las actividades enzimáticas en mg AR/g lirio seco hr.

6. HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO

Condiciones de hidrblisis: Temperatura de esterilización: 124OC Temperatura de hidrblisis: 5OoC Tiempos de esterilizacibn: 15', 3 0 ' , 45', 60' Tiempo de hidrblisis: a hr

Método de hidrblisis: 10 q de lirio acuático fresco molido, se inoculan con

5 g de celulasas (B .H. ) con una actividad papel filtro de 2-3 UI/g de sustrato fermentado P.H.

El lirio acuático pretratado e inoculado se coloca en columnas de hidrblisis y se mantiene a 5OoC en baño marla.

La aeracién del cultivo se realiza con aire saturado de agua con un flujo de 7 l/hr.

-12-

Junto con este experimento se corri6.una muestra de en zima como testiqo para verificar la actividad enzimbtica- durante el tiempo de hidrólisis.

Análisis de muestras: Se toman muestras iniciales y cada dos horas durante

el tiempo de hidrólisis de cada columna. El producto se homogeneiza con una espátula y 2.5 g de muestra se homogeneiza con 100 ml de agua y se congelan para analizarlas todas juntas posteriormente. De las muestras descon geladas se hacen diluciones apropiadas v se someten a los siguientes análisis:

Azúcares reductores (DNS) Actividad enzimática (APF y ACMC)


El lirio acuático se trata térmicamente a tres diferen tes tiempos de esterilización y alcalinamente con una so= lución de sosa 1% .

Temperatura de esterilización: 124OC Temperatura de hidrólisis: 5OoC Tiempo de esterilización: 3 0 ' , 45', 60' Tiempo de hidrblisis: 8 h r Al moler el lirio acuático se obtuvieron dos tamaños de

partícula diferentes caracterizados como fibra y pulpa, con diferente concentración de sólidos czda uno:

Fibra Pulpa

91.635 % Humedad 93.965 % Humedad

En base a estos porcentajes de humedad se modifica la - cantidad de sustrato inicial para la hidrdlisis con el fin de obtener resultados comparables con los experimentos an- teriores :

Fibra Pulpa

8 . 8 g lirio fresco molido 11.4 g lirio fresco molido

Tratamiento térmico-aicaiino: 8 . 8 g de fibra y 11.4 g de pulpa de lirio acuático se

mezclan por separado con 4.4 ml de sosa y 5.7 ml de 50s" respectivamente y se pusieron en autoclave a 15 Lb/in du rante 30 ' , 45' y 60'. Posteriormente el sustrato se neutra liza con HCi 0.25 M. _.

-13-

Método de hidrblisis: 8;8 y 11.4 g de lirio acuático frescó molido de cada

tipo3se inocula con 5 g y 0 . 5 g de celulasas (B.H.) con una:ectividad papel filtro 1-2 UI/g sustrato fermentado P .H .

Lirio acuático pretratado e inoculado se coloca en ma -

Análisis de muestras: Se toman muestras iniciales y cada dos horas durante

el tiempo de la hidr6lisis de cada matraz. 1 CJ de producto se homoqeneiza con 50 ml de agua destilada y se - congelan para analizarlas todas juntas posteriormente. De las muestras descongeladas se hacen diluciones apro piadas y se someten a los siguientes análisis:

Azúcares reductores (DNS) Actividad enzimdtica (APF Y ACMC)

traces de 125 ml y se mantienen a 5OoC en baño marfa.

1

-14-

RESULTADD.

1. PRODUCCION DE CELULASAS A) Fermentacibn Lfquida B) Fermentación Sólida


4 . PRODUCCION DE CELULASAS SOBRE

LIRIO ACUATICO A) pH no regulado

B) pH controlado

5. HIDROLISIS DE LÍRIO ACUATICO Con Celulasas de T. - harzianum

6. HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO TRATAMIENTC! TERMICO

TABIA

7

8 .A 8 .B

9 .A 9.B

11. '

1 2 .

7 . HIDROLISIS DE LIRIO ACUATICO TRATAMIENTO TERMICO-ALCALINO 13.A

13 .B

ANEXO.

GRAFICA

1, 2

3

7 . A , 7.B

8.A - 8.L 9.A (1) - 9 . A ( 6 ) 9.B (1) - 9.B (18)

11.A, 11.B, 11.c

lZ.A (1)- ( 5 )

1 2 .B

A. 1 A.2 A.3

1 I

-15-

3: a

h & c Y

2 F: w

o z

,

O o N

v) N

O m Q Ln

00 UY

o 4 N m * m a b

v) v ) W W a S O - 4 h <

N Q E 4 W a

3 3 t -

X a

m w w m c n m w m m m ~ . c n . . m m - r w m - r

m N * N N w w w o m ~ . m m m m c l c l c l 0 0 0 0 0 0

. . m m

w m r l ~ t - m m m w w w m

. .

O W cl

O N

m N

O * m w

N

m

1 . ~~ . .. . - . .~*. .. . .. . . . .~ .. ..

-17-

h 4 v

O' z

-7 -r

c v

m i

-18-

h 4 v

z 2 w b I

I.

m d n m I k

F

-19-

. . . . . .

i o m i o o m i o c r o m i o i o Q \ O O I b W b h . . . . . . d

4

4 c O o

O % :c cl

$L 8 -4

u u x

9 m k-

o 4

.d U

. . . r 4 r l 4 C . i ; ;

I

-20-

- - O m

< I5

o' z -

ln u) \o m N N * N

In o\ o\ o\ W m

m N -F N ln 4 N N -F * O

O 4 N m b< ln

a m

m

I

. ,

-21-

-2%-

u 4 b

u < b . . . . .

3 4

. . . . . 4 4

I

. . . . . 3 4 4 3 d

2 -

m b

u b . . . . .

-+----- . . . . .

. . . . . 3

m a m m m w a m m w w m m m m . . . . . U O

m a * m m * 3 w m w w w N O W N O I

Nd 4 . . . . . 6)

- m

O

m m m rl' m H :

. . . . o . . . . . 4

. . . 00

u

-23-

t

a m a0 ba hb NN NN N N NN a3 4 a a - 3 4 - 3 0

lo'd 3 ,lo' m a;" ON u.m m m 8 o;"

$2 NN

c O

4 3 4 3

m U (3

4 uuuu moo* 4 m 4 m N

333 Id

0 0 0 0

I

I

I

-24-

3 U a m > o

2 .- U

!

I

j

I

i I i i I 1

I I

!

h 3

- U c

<

É c

- u. w

C a c

Y e

- C r

; t

- C P

C c

c + e

VI- L

%$ 8

hlnlnlnln m 3 l n I n I n

inN ln m m m ~ m

NinNN m 3 m m

OdNmv o' Z -

I

vj I

-26-

- 5 4 a E e

- C n:

C e: e

c c

vi i

4 4

E"

vi M $p E

h 4 c v

8 F:

d * b h m o o m m c o v m m m m . . . . .

o N * \ o c o

- 1 ,u>

-28-

C O O O H O O

- \ I VI3 N W ip I-

VI

I- O

c-’ VI

N O

e N H L I M z 8 - w 5 0 cl

W VI

a O

I

I

1- o

N o

w O

P O

vi O

m O

< O

c) N

-29-

o H 2

Y m

H u t ) brn

W 5. vi

-30- a a

O

!- O

N O

W O

4 O

cn O

O N

I I I

I I I

I I

I

I t I

I

I I

I

I

I I I I I

1 !g im )O . -

m w O 0 - -

I

~. . . .. . . . . . ... I., .. . " .-. . , L ..,- : -.

I

I I I I I I I I I I I I I I

1

I w Lo .-

-31-

w ip F I I

ln n

i

G 8.A

PROD. CELULASAS SOBRE L.A C A R > 8 . 8 %

1 1

L 4 $ 4

3 2

2

G 8.B

i -33- I

G 8.D N G

I -,

-34-

Pi G

R A i

C i L 9

PROU.CELULñSñS SOBRE L.Ei. <ñPF> 1.2t G 8 . E

G 8.F

0 9 I S 27 36 45 TIEllPO (HR)

, -35-

PROG.CELULASAI SOERE L.A.<CMC>

H G

& I c 1.6--

L

G. 8.G

PROG.CELULA5AC COBRE L.A.<CMC> 2 . 4 * G 8 . H

0 9 18 27 36 4 s

TIEPlFO (HR)

P 1

-36- 4

I

PROD.CELULISAS SOBRE L.A. <CilC> 2.8t

c

G 8 . 1

1 , 9 K .....I I-".: ,.."+I"~ I .... t ..... " -..... "....I -.-._...._. ".+ 0 9 16 27 36 45

TiEPlFO (HR)

G 8 . J

5 . 4

-37-

7

7 P H

6

5

.4// .*

0 9 E7 36 4s

TIEMPO (HR)

9 a&PROD.CELULA%S SOBRE L . A . <PH>

I / n

G a.K

B 8.L

9 16 27 36 45

TIEMPO (HR)

1 v

-3e-

a .

7 .

c d.

5 . ........ 1 --...... I 1 .._.- ".." ....... 4 ._--...... "..._+" ........... -t. 0 9 18 27 36 45

TIEflPO < H R )

G 9.A (2)

G 9 . A (1)

? 4.74-

1 . a

I4

I

,

l f l - -39-

P H

7 . 7 t PROD.CELULASAS SOBRE L . A . I" .,.*

TIEAPO (HR?

a . ~ + . PROO.CELULICAS COBRE L.A. PH

G 9.A ( 3 )

G 9.A ( 4 )

4 . d i P

H

TC 1

t. 9 ? 8 27 36 45

B ...I " ..... ".I --.....-- ..-.-.............. .... " -...._._-... I..."..." 1 0

TIEBFO <HR)

,, .~ . . ~ . .. . . . . ~ . I ~ . ..

-40-

H

PR0D.CELULASAS CGBRE L . A . PH

I 6 . 7 4

i

9 16 E7 36 45

PROú.CELULASAS SOBRE L.A. PH . - 5 . 8 4

i TR-C

I 4 . 3 - h

I . 4

G 9.A (5 )

G 9.A ( 6 )

1

-4 1-

1 6 . 8 % 7ROG.CELULASAS SGERE ' L . A G-9

I +-.. ............. f _.._-_-. +" I-.. "..I ...... .+ ....... ....-...- +. il 3 16 27 36 45

7IEPlPD <Hi?)

, i !

G 9 . B (1) i

I

-42-

TROú.CEiULbSAS SOBRE L . í i ,5 .J t

L 3 i .J

c d

1 a 9 I S 2 7 36

TIENPO (HR)

?Küü.CELULASíiS SOBRE L . A . 15 .5%

n ,- G ail

G 9.B (3)

G 9.B ( 4 )

-43-

I

Í i E I l F O ( H R )

>iRnrt. CELLILASAS SOBRE L . A .

I I 1

a i." I...." ....... +"".."" ...... +" " ....... *" " ..._- 1. a 3 1s 27 S6 4s

TXEIIFG CHR)

G 9.B (5 )

i G 9.B (6) ~

7 .

-44-

01 PROD.CELULASAS SOERE L.A. APF

r 1i

TIEFIFG (WR)

i I

G 9.B ( 7 )

G 9.B ( 8 )

4. El 9 16 27 36 45

iIEflF0 i H R )

I ...--....... 4 ............ I-.. 1 ......

1 Is_

-4 5-

G 9.B (9) 1

0 9 10 L7 36 45 TIEMPO (HR>

i

PRÜD.CELULASAS SOBRE L . A . APF

.

i. t 0 3 I S L? 36 45

0 +--.-.......t-....--.-....- i ""-".-.""$-.-.-.-..t~""- "."".... .

TIEPlfO (HR)

I

G 9.B ( 1 0 )

!

1

-46-

G 9.B (11)

G 9.B (12) PRGú.¿ELULASAC MERE L.A. APF

U

/ .5+

4

-47-

..

1 , 9 R r ~ ~ ~ . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ SOBRE 1 . a . Acne

TIEflPO < H R )

PROú.CELULASAS SUBRE L . 0 . ACMC

ú L

4. 0 3 16 27 36 4s

TIEPlPO ( H R )

G 9.B (13)

G 9.B (14)

-48-

?ROD.CELULASAS SOáRE L.'A. ACMC 2 . B * 1 G 9.B (15)

j, #,*-.'. . 68 "....̂ --"....+"..".............+ :+..::::"_..."E"."..."..".-...!." ..--.....- t .

9 18 f7 36 45 I e

TIEilPO <tiR)

TRGD.CELULASAS SGBRE L.A ACMC

4

G 9.B (16)

I

-49-

?ROO.CELULASAS SOBRE L.A. K H C 2 .9 .k

L I *. *I

TIEllPO (HR)

G 9.B (17)

e 1-- ...-.... """+"" ..---. +.." .......... " .... .I...". " .... " ........ 1 ...................... t 0 3 18 27 36 45

TIEMPO <HR)

-50-

P

N

w

4

cn

m

4

m

3 io

5i m

\

m m

w m O 0

I t

- - o n wl- o m - -

a m w u

-5 1-

I- tu W ip VI O O O O O

o P W mmmo o

w r I - w a - r o> o NViOONO o - o a - - 0 - -

Y

Y : ,

n o H P

o g U o O

I- e W

-52-

c. c c c P O N P o> m O O O O O

N O

P

N

W

P

vi

ul

4

m

s; 3j m mm w m e O O N - -0

I I o o

W O P - v i

-

- P c

o

1 ' . -~ 1

-53-

. ............. .............. ........... 4 i- t -..._I." t ........._... "

0 2 4 6 8

TIEIIPO <HR>

<.I e+ HIURDLISIS DE L.h. TERIIICO AR * . ,.a@ i M

G 12.A (1)

G 12.A (2)

-54- )

,+

4 . 0

A

L 3.6

. 3 . 5

3 . 3 E

1 A

H I G R O G S I S DE L . A . TERIIICO PF 4.9+ I 11, I i . I

I F, R 4 . z ~ ,' .*' i I'

I t I .i I

G 12.A ( 4 )

G 12.A (3)

- 0 L 4 6 c1

TIEl lFO ( H e )

..

-55-

t E 2 . 2 4

2 A

'5 2, 04 1 ...................... t t .......................... :.+ 0 2 4 6 €

TIEPlFO (HR)

> C L L H I G R O L I S I S DE L . A . TERMICO CNC

68

"I".-..-

'. 2

G 12.A (5)

G 12.A (6)

1 +

-56-

AJUSTES POLINOMIALES DE PRIMER GRADO.

A z ú c a r e s r e d u c t o r e s 15'

C = 516.95 + 4.2368t


C = 568.20 - 2.70t


C = 495.34 + 18.8929t


C = 533.11 + 21.595t

Donde :

r2 = 0.0448 C o r r = 0.2117

S t d = 81.822

2 r = 0.0454 C o r r = 0.2132

S t d = 45.1796

r = C.8597 C o r r = 0.9271

Std = 27.87

2 r = 0.5119 C o r r = 0.7155

S t d = 76.984

C = c o n c e n t r a c i d n de a z ú c a r e s r e d u c t o r e s

t = tiempo de h i d . r d l i s i s

-57-

13.B

.......... "...,......"..... . t - 4 . 3

- .- <I u

- -58-

REGRESION MULTIVARIABLE.

Para datos de azdcares reductores.se obtuvo l a siguiente ecuación:

C = 422.36 + 1.76T + 10.63t

Sum St = 92.293.249 STest = 57 111.632 RTest = 0.381

Donde : C = concentracidn de azúcares reductores T = Tiempo de esterilización t = tiempo de hirirólisis

Adimensionalizaci6n:

C = 584.144 + 26.415 + 21.267

-59-

1.

WIDRIiLISIS T-/i LIRIO A . ........

.... 5 N.9 0 1 . 1

L 3 5 . 3 - $ 2 6 7 { ' 17.87-

117 5

..... ..... ....

L 5 2 . 2 4 s 2 9 . 2 +

I

I ' 26.1-

13 1 1

\ L-45

G. 13.B (1)

G 13.B (2)

8 l ............................................ .. ..-................. (. i B L 4 6 8

TlENPO í H R I

-- -60-

G 13.3 (3)

_ _ .. . . . ~*... ..I . .~ ... . .

-61-

G 13.B (1)

G 13.B (2)

DISCUSION Y CONCLUSIONES:

1.- Las celulasas son enzimas adaptativas, su síntesis está controlada por un mecanism6 inductivo-represivo, de mo- do que el medio inductor para producir celulasas es la celulosa y el represor de la slntesis la glucosa.

La cinética comparativa de la biosíntesis de celulasas en medio sólido y en medio líquido no muestra diferen- cias significativas, a excepción que las protehas pro- ducidas por T. harzianum en fermentación sólida son más estables y se encuentran en mayor concentración, lo que constituye una gran ventaja, ya que con menos cantidad de sustrato sólido fermentado se puede obtener una mayor actividad enzimática.

En cuento a costos, la producción de celulasas en medio sólido es la más conveniente ya que sólo requiere control de temperatura y aeración, a diferencia de la líquida que además de éstos requiere agitación, el cual es un factor que influye directamente en el costo de producción.

3 . - De los resultados obtenidos, se observa que no hubo un ataque enzimático a las fibras del lirio acuático en am - bos experimentos (base seca y base húmeda), debido probablemente a que en los tratamientos térmicos no se lo- gró una esterilización completa del sustrato y a que en los térmicos-alcalinos hubo pérdida del mismo en el mo- mento del lavado para eliminar la alcalinidad.

La concentración de azbcares disminuye en todos los tra - tamientos debido probablemente a una contaminación, ya que durante la hidrólisis no se mantuvieron condiciones de esterilidad.

La diferencia de concentración de azúcares reductores entre el tratamiento térmico-alcalino en base seca y ba - se húmeda, posiblemente se debe a la influencia de los

residuos alcalinos que permanecen en la fibra del lirio acuático dificultando el ataque enzimático. En cuanto a los tratamientos térmicos, no hay gran diferencia en su comportamiento.

4.A. En los resultados se observa que no hay producción de celulasas debido a la influencia del pH que se incremen ,ta durante la misma, alejándose del óptimo (5.6 - 4 . 2 )

teniendo como consecuencia que la evolución del inóculo no fuera adecuada. Esto se confirmó al hacer preparacio nes al microscopio en las cuales se observó que a las 18 horas de iniciada la producción, la mayoría de las esporas no habían germinado, a diferencia de la produc- ción de celulasas sobre bagazo y salvado, en las que la germinación casi se completaba a partir de las 1 6 horas.

-

-

4.B. En este experimento se controló el pH durante toda la producción a 5.6 que es el óptimo para el desarrollo de T. harzianum, presentando aún así el mismo comportamien to que el anterior.

-

En los pretratamientos térmico-alcalinos la variación del pH fue menos drástica, &to muestra que la concen- tración de contaminantes disminuyó con este tratamiento, pero no lo suficiente para obtener una buena producción de celulasas.

Los resultados de ambos experimentos se deben a las siguientes causas:

-- Una alta contaminación bacteriana principalmente del lirio acuático que provoca una gran variación en el comportamiento del pH. .i . ,

-- Presencia de inhibidores enzimáticos.

En conclusión, para poder obtener una producción de celulasas sobre lirio acuático es necesario aumentar el tiempo y la temperatura de esterilización.

_I

-64-

5.- En este experimento los pretratamientos sólo fueron ter - micos y con la finalidad de encontrar la temperatura 6p tima de esterilización.

Los mejores resultados fueron obtenidos del pretratamiento a 124OC, en el que las actividades enzimáticas se mantuvieron más constantes debido a la mayor esteri- lización del lirio acuático, por lo que los tratamientos posteriores se realizaron a esta temperatura.

6.- El objetivo de este experimento fue encontrar la cinéti- ca de hidrólisis además del tiempo de esterilización 6p- timo. Al mismo tiempo se trabajó con una muestra de enzima como testigo para verificar la actividad enzimdtica durante la hidrólisis.

Con los datos obtenidos de la hidrólisis, se hicieron ajustes polinomiales de primer grado para encontrar las ecuaciones que describieran el comportamiento de cada tratamiento. De éstas, se calcularon las derivadas aC/dt para encontrar la relación entre la aparición de azúcares reductores durante el tiempo de la hidrólisis con cada tratamiento térmico.

Con estos resultados se llegó a la conclusión de que la liberación de azúcares reductores durante la hidrólisis es directamente proporcional a los tiempos de esterili- zación y como en las muestras de enzima no hubo libera- ción de azúcares, los azúcares cuantificados en las mues - tras del lirio acuático provienen del mismo.

Para obtener una ecuación del tipo C = a que relacionara el tiempo de esterilización (TI y el tiempo de hidrólisis (t) con la concentración de azbcares reductores liberados se hizo una regresión multivariable, posteriormente, esta ecuación se adimensionalizó para determinar la influencia de cada uno de los factores, encontrando que el valor de la constante de la ecua-

+ alT + a2t O

- -65-

cion es muy grande en relación al de los coeficientes de las variables. De aquí se concluye que ni el tiempo de esterilización ni el tiempo de'hidrólisis son los factores determinantes en el proceso, sino otras causas que no han sido consideradas como la contaminación del lirio acuático entre otras.

7 . - Con la finalidad de =]orar y comparar los resultados del tratamiento térmico anterior, se diseñó este tratamiento térmico-alcalino.

En los resultados se observa que no hubo liberación de azúcares reductores, que la actividad enzimática disminuye considerablemente y que no hay diferencia en el comportamiento de los dos tamanos de partícula, así como del tamaño del inóculo de celulasas.

En base a lo anterior se concluye lo siguiente:

-- Por la falta de agitación durante la hidrólisis, la enzima no tuvo contacto con las fibras del lirio acuático (a pesar de haber estado en exceso), impi- diendo la liberación de azúcares reductores.

-- El experimento no puede ser comparable con el anterior, ya que el tratamiento térmico fue sólido y éste fue líquido, debido a la solución alcalina y ácido que se utilizó para su neutralización.

-- Del tratamiento térmico se obtuvieron mejores res@ tados que del térmico-alcalino.

Como conclusión final de este trabajo, se puede afirmar que el lirio acuático presenta una alta contaminación que dificulta los tratamientos enzimáticos y micóticos para su hidrólisis; que los tratamientos térmicos necesarios deben ser prolongados para lograr una disminución de los contaminantes, situación que no sería costeable

-66-

para una planta de tratamiento de aguas residuales. Como una solución a este problema se sugiere utilizar para la hidrólisis del lirio acuático un tratamiento con las mismas bacterias que lo contaminan, de esta for ma los costos se abatirían, puesto que se evitarían taE to la producción de celulasas como los tratamientos tér micos necesarios para disminuir la contaminación.

-

-

A N E X O

A. MEDIOS DE CULTIVO

MEDIO DE MANTENIMIENTO.

Maltosa 10 9 Agar 15 9 Agua destilada 1000 ml Esterilizar a 120' C , 30'

MEDIO DE ESPORUSACION.

Yuca 4 0 9 Sulfato de amonio 4 9 Urea 1 9 Fosfato monopotásico 2 9 Agar 15 9 Agua destilada 1000 ml PH 5.6 Esterilizar a 1200C, 30'

MEDIO DE PRODUCCION CELULASAS LIQUIDO.

Sulfato de amonio 0.975 g ,Urea 0.238 g

Agua destilada 1000 ml PH 5.6

Esterilizar a 120°C, 1 Hr

Fosfato monopotásico 0.5 g

Sustrato 10 9/1

MEDIO DE PRODUCCION CELULASAS SOLIDO.

Soluci6n mineral para 100 g de sustrato:

Urea 2.38 g

Agua destilada 100 ml PH 5.6 Esterilizar a 120°C, 1 Hr

Sulfato de amonio 9.75 g

Fosfato monopotásico 5.0 g

c)

-70-

B. METODOC DE ANALISIS. --.-I-.--

ANALISIS DE AZUCAREC REDUCTORES

METODO DE MILLER (DNS)

< . El ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido en ácido

3-amino-5-nitrosalicílico y los grupos aldehFdo de los azúcares son oxidados a carboxilo. Un color amarillo- cafS se desarrolla cuando se ha llevado a cabo la reac ción. La lectura se hace en un espectofotbmetro a 575-m.

. 2 ml de la solución a medir convenientemente dilui

. 3 ml de reactivo DNC

Se agita en un vortex, se pone a baño maría a 100DC

- da.

durante 5 minutos, l a reacción se detiene con un enfria .- miento brusco. La curva estandar va de O a 1 g/1 de glucosa.

ANALISIC DE AZUCAREC TOTALES

( ANTRONA)

Por calentamiento en medio ácido, los azúcares con de - rivados dkl furfural pueden reaccionar con antronol en equilibrio con antrona para donar un compuesto azul-ver _ _ de. La lectura se hace a 625 nm.

Los tubos se ponen en baño de hielo. - . . 5 ml de la solución de antrona refrigerada.

Cuando la serie de tubos está obscura, se mezcla rápi damente en un vortex y los tubos se pasan a baño maría a 100°C durmte 10 minutos. La reacción se detiene cuando se pone en hielo durante 5 minutos. La curva estandar va de O a 50 mg/l de glucosa.

2.5 ml de la soiuci6n a medir convenientemente di - luída.

ANALISIS DE PROTEINA ( LOWRY ) ( 7 )

La solución de proteínas se calienta en medio alcalino sobre una cantidad de reactivo de Folin-Ciocalteau. ~a coloración azul obtenida es el resaltado di la reacci6ii de Biuret (formación de un complejo pdrpura entre los en laces peptídicos y los ines cdpricos en meaio a1calino)-y de la reducci6n del reactlvo fosfomolíbdico y fosfotúngs tic0 con la tirosina el triptofano y la cisteína. -

. 1 ml de la solución a medir correctamente diluida . 1 ml de NaOH 1 N (no agitar los tubos) Calentar a iOO°C durante 5 minutos, enfriar bruscamente Adicionar 5 ml de una soluci6n A + B + C en una relación de 50:l:l v/v Mantener en la obscuridad 30 minutos a la temperatura del laboratorio Agregar 1 ml del reactivo de Folin-Ciocal- teau dilufdo en 9 ml de agua, agitar bien Mantener 30 minutos en la obscuridad a tem peratura ambiente, hacer la lectura a 750- nm.

La curva estandar va de O a 300 mg/l de SeroalbGmina.

CONTROL DE ACTEJIDADES ENZIMATICAS

ACTIVIDAD CARBOXIMETILCELULOSA (CMC) (10)

. 1 ml de una solución 1% Carboximetilceulosa sobre una solucidn de Buffer Citrato 0.05 M pH 4 . 8 . 1 ml de la soluci6n a medir Incubar 30 minutos a 5OoC en baño maría. Despues hacer tratamiento DNS y leer a 575 nm

-l_l_

i -72-

ACTIVIDAD PAPEL FILTRO

. 50 mg de papel Wathrnan No. 1 (1.3 x 5 cm) . 1 m l de Buffer c itrato 0 . 0 5 M pH 4.8 . 1 m l de l a soluci6n a medir Incubar 6 0 minutos a 50°C en-baño maria Después hacer tratamiento Dlos y leer a 515 nm

I

I -73-

DETERMINACION DE PROTEINA- (K JELDALH) (10)

La determinación de proteínas por el método Kjeldalh se basa el la descomposici6n de compuestos de nitrógeno orgá - nice por ebullicidn con ácido sulfúrico.

El hidrdgeno y carbono de la materia orgánica se oxi - dan hasta aqua y COZ, el ácido sulfúrico se transforma en - SO el cual reduce el material nitrogenado como sulfato de a m k o .

El amoniaco se libera después por la adicidn de hidró xido de sodio, y se destila xecibiendose en una solución de- ácido bórico al 4%. El nitrdgeno amoniacal se titula con - una soiucidn valorada de ácido, de donde se obtiene el % de nitrogen0 presente en la muestra; El % de proteína se obtie ne al multiplicar el contenido de nitrógeno por un factor. -

. Pesar 1 g de muestra en un matraz Kjeldalh, añadir 2 g de sulfato de cobre, 10 g de sulfato de sodio anhidro, 25 ml de ácido sulfúrico concentrado y unas perlas de vidrio. . Colocar el matraz en el. digestor y calentar hasta que la solución esté completamente cristalina.

. Enfriar y afiadir 250 ml de agua destilada, 6 6 7 gránulos de Zinc y 70 ml de hidróxido de sodio al 50%

. Conectar el aaarato de destilación, recibir el des tilado en un matraz erlenmeyer de 500 ml que conten ga 50 ml de ácido bÓrico (la parte terminal del tu- bo debe introducirse en el ácido). Destilar hasta llegar a un volumen de 300 ml.

sulfúrico 0.1 N : Quitar el matraz y titular el destilado con ácido

Calculos :

% de Nitrógeno =

En donde: v = ml de ácido sulfÚrico valorados usados

V x N x 0.014 x loo/ P

en l a titulación.

!

!

- !

-74-

N = Normalidad de la solucidn valorada de ácido

P = Peso de la muestra suifGrico

calcular el % de proteínas multiplicando per el factor correspondiente.

,

I

- __I __I

-75-

C. SOLUCIONES. --I--

REACTIVO DNS

AC. 3,5-Dinitxosaiicílico Hidrdxido de sodio Sulfato de sodio anhidro Fenol Agua destilada

CURVA ESTANDAR: Glucosa Agua destilada

REACTIVO DE ANTRONA

Antrona Acido sulfuric0 95%

CURVA ESTANDAR: Glucosa Agua destilada

1 g 1 9 0.05 g 0.20 g 100 ml

500 mg 1000 ml

200 lug 100 ml

500 mg 1000 ml

REACTIVO DE BIURET

(A + B + C 50:l:l V/V)

al 2% en una solución de NaOH 0.4% A. Na2C03

B. cuco4 al 1% en agua destilada

C. Tartrato aoble de sodio y potasio al 2% en

CURVA ESTANDAR: Seroalbhina 300 mg Agua destilada 1000 ml

agua destilada

.Reactivo Folin-Ciocaiteau diluido en agua 1:lO

.Hidróxido de sodio 1 N, 0.1 N al 4 y 0 . 4 % de agua destilada

-76- í

.BrJFFER CITRATO 0.05M pH 4.8 Ac. cftr2co.H O PM 210.11 4.8323 g Citrato tris68ico.5H20 PM 375 9.639 g Agua destilada 1000 ml pH 4.8 (ajustar con NaOH 1 N )

.CARBOXIMETILCELULOSA 1% Carboximetilceiulosa 1.0 g Buffer Citrato 0.05 M pH 4.6 100 ml

. PAPEL FILTRO WATHMA" Po. 1 ~

50 mg en rectángulos (1.3 I 5 cm)

-17-

vi O

I- O O

O

c.

O

N

O

w

O

e

O

vi

a <L1 \ a

II O

W W 4

w I-

. . . .. . .. __ . . ,~~ ~~

-78-

O

O F

O

O h>

O

O W

O

O P

O

c VI

O

O m

O

O 4

O

O co

O

c

Y

\ '.

VI o O O

n C

$

si N C

; v,

si N

. .. .- . . . ~. .~ .. . .

. . .

I- O O

N O O

W O O

a 9 \ 3 c.'

.. .

\

. .

4

O

W W - m

.

.

.

1

-80- I

REFERENCIAS:

1.- Fan, L. T.; Gharphuray, M. M.; Yanq Hyung Lee "EVALUA- TION OF PRETREATMENTS FOR ENZYMATIC CONVERSION OF ORGANIC RESIDUES" Biotech L Bioeng Symp No. 11, 29-45 (1981).

2.- Favela, E.; Monroy, O. I11 Informe al CONACYT del proyecto "TF!ANSFOPMACION FERMENTATIVA DEL LIRIO ACUATICO EN CONCENTRADO PROTEICO" (1982) .

3.- Khan, A. W.; Lamb, K. A. "USED OF PRETRATED LIGNOCELLULOSE FOR THE PRODUCTION OF CELLULASES" Biotechnology Letters (1984).

4.- Khan, A. W . ; Murray, D. W. "DVELOPMENT OF A TWO-PHASE COMBINATION FERMENTER FOR THE CONVERSION OF CELLULOSE TO METHANE" Biotech L Bioeng, Vol. XXV, 1571-1579 (1983).

5.- Khan, A. W . ; Murray, W. D. "SINGLE STEP CONVERSION OF CELLULOSE TO ETHANOL BY A MESOPHILIC COCULTURE" Biotech Letters, Vol. 4, 3 177-180 (1982).

6.- Khan, A. W . ; Trottier, T. M.; Patei, G. B.; Martin, S .

M. "NUTRIENT REQUIREMENT FOR THE DEGRADATION OF CELLULOSE TO METHANE BY A MIXED POPULATION OF ANAEROBES" Journal of General Microbiol: 112, 365-372 (1979).

7.- Lowry, O. H.; Rosebrough, N. J.; Farr, A. L.; Randall, R. J. "PROTEIN bE&SJREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT" J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951).

8.- Mandeis, M.: Andreotti, R.; Roche, C. "MEASUREMENT OF SACCHARIFYNG CELLULASE" Biotech L Bioeng Symp No. 6, 21-23 (1976).

9.- Miller, G. L. "USED OF DINITROSALICYLIC AC. REAGENT FOR DETERMINATION OF REDUCING SUGAR" Analyt. Chem 31: 426- 428 (1959).

10.-

11 .- - .

1 2: - ' t

'13.-

.

. ~. -~ . . . . . -81- \

.. - ROUSSDS, S. "ETUDE DE L'HYDROLYGE DS LA CELLULOSE PAR . .

DES MOISSURES CULTIVEES EN, MILIEU SOgDE" IRCHA (1981) . .

. Sternberg, D . "PRODUCTION OF CELLULASE BY TRICXODERMA"

.I

B i o t e c h 8 B i o e n g Symp No. 6 , 35-53 (1976).

W o l v e r t o n , B. C.; McDonald, R. C. "UPGRADING FACULTATIVE

WASTE-WATER LAGOONS WITH VASCULAR AQUATIC PLANTS"

305-313 '11979). JWPC,

Wolverton, B . C . ; McDonald, R. C. "VBSCULAR PLANTS FOR

NASA MSTL, M i s s 39529. B i o E ne r g y 80 Conference A t l a n t a ,

Georgia (1980) . . WATER POLLUTION CONTROL á ñENOVABLE.COURCES OF ENERGY"

-.

INFORME FINAL DE SERVICIO 4 FLOR DE MARIA …148.206.53.84/tesiuami/UAM20034.pdf · ccombustibles...

Documents

Transcript of INFORME FINAL DE SERVICIO 4 FLOR DE MARIA …148.206.53.84/tesiuami/UAM20034.pdf · ccombustibles...