Indholdsfortegnelse - chem.au.dkchem.au.dk/fileadmin/_migrated/content_uploads/Bachelor_Mira... ·...
Transcript of Indholdsfortegnelse - chem.au.dkchem.au.dk/fileadmin/_migrated/content_uploads/Bachelor_Mira... ·...
1
INDHOLDSFORTEGNELSE
FORKORTELSER 2
ABSTRACT 3
RESUMÉ 3
1. INDLEDNING 4
1.1 GlcNAc i et biologisk perspektiv 4
1.2 Glycosylering med GlcNAc som donor 5 1.2.1 Beskyttelse af kvælstof 5 1.2.2 Den anomere leaving-gruppe 7
1.3 Reaktivitet og stereokemi 8
1.4 Oxazoliner som glycosyl-donorer 9
1.5 Katalysator 10
1.6 Projektidé 11
2. RESULTATER OG DISKUSSION 12
2.1 Fremstilling af donor 12
2.2 Glycosyleringsreaktionerne 14
2.3 Potentielle acceptorer 17
3. KONKLUSION 20
4. EXPERIMENTAL SECTION 22
4.1 General methods 22
4.2 Preparation of glycosyl donor 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose [3] 22
4.3 Preparation of allyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside [5] 23
4.4 Preparation of benzyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside [6] under various conditions
24
4.5 α/β-mixture as glycosyl donor resulting in benzyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside
[6] and 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranose [7] 26
4.6 Preparation of potential acceptor N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-serine methyl ester (Fmoc-L-serine
methyl ester) [8] 27
4.7 Preparation of potential acceptor methyl 2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranoside [10] 27
2
Forkortelser
aa aksiel-aksiel
Ac acetyl
ae aksiel-ækvatoriel
br bred
Bn benzyl
d dublet
DCE 1,2-dichloroethan
DCM dichloromethan
dd dobbel dublet
ddd dobbel dobbel dublet
dt dobbel triplet
eq ækvivalent
Et3N triethylamin
Et2O diethylether
EtOAc ethylacetat
EtOH ethanol
h time
J koblingskonstant
M molær
m multiplet
Me methyl
mp melting point
MS massespektroskopi
NMR nuclear magnetic resonance
OTf triflat
ppm parts per million
RE rare earth metal
Rf retentionsfaktor
rt stuetemperatur
s singlet
t triplet
t-Bu tert-butyl
TfOH triflinsyre
THF tetrahydrofuran
TLC thin layer chromatography
TMSOTf trimethylsilyl triflat
3
Abstract
The focus of the project was on β-glycosides with N-acetylglucosamine
(GlcNAc) as the donor. A stereoselective reaction, like this, demands neighbouring-group
participation from the C-2 substituent. This gives various possibilities, but the 2-acetamido-
group was used directly, and so no use of any special nitrogen-protecting group was made
here. 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose, that can form an
oxazoline by means of activation, was used as donor in the glycosylation reactions. The
purpose was to optimize the reaction conditions, with regard to catalyst and solvent, in
order to speed the glycosylations up and to get high yields. Furthermore the use of different
acceptors was to be exploited, with the synthesis of the important disaccharide as the final
goal. Benzyl alcohol proved to be an excellent acceptor for the many test experiments,
which were carried out. Sc(OTf)3 as catalyst and DCM or DCE as solvent proved to give
the best results.
Resumé
Projektets fokus var på β-glycosider med N-acetylglucosamin (GlcNAc) som
donor. En sådan stereoselektiv reaktion kræver nabo-gruppe deltagelse fra C-2
substituenten. Dette giver forskellige valgmuligheder, men her blev 2-acetamido-gruppen
anvendt direkte, og der blev altså her ikke gjort brug af særlig kvælstof-beskyttelse. 2-
acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose, der ved hjælp af aktivering
kan danne en oxazolin, blev benyttet som donor i glycosyleringsreaktionerne. Formålet var
at optimere reaktionsbetingelserne mht. katalysator og solvent, således at reaktionstiden for
glycosylering blev lav og udbyttet højt. Ydermere skulle anvendelsen af forskellige
acceptorer udforskes med det endelige mål at syntetisere det vigtige disaccharid chitobiose.
Benzyl alkohol viste sig at være en udmærket acceptor til de mange testforsøg, der blev
udført. Sc(OTf)3 som katalysator og DCM eller DCE som solvent viste sig at give de bedste
resultater.
4
1. Indledning
1.1 GlcNAc i et biologisk perspektiv
N-acetylglucosamin (GlcNAc) (Figur 1), er et monosaccharid med stor
biologisk betydning, idet denne sukker-forbindelse er en vigtig komponent i eksempelvis
mange glycoproteiner, glycolipider og glycosaminoglycaner.
O
OH
HOHO
NHAc
OH
Figur 1 N-acetyl-β-D-glucosamin
Bl.a. har -formen en stor rolle i den kemiske postmodificering af proteiner, hvor
denne sukker-forbindelse bindes kovalent til ilt i threonin og serin sidekæder (O-GlcNAc
glycosylering) samt til kvælstof i asparagin sidekæder (N-GlcNAc glycosylering). Der er
foretaget studier, som taler for, at O-GlcNAc glycosyleringen har lignende egenskaber med
phosphoryleringen – altså at en dynamisk påsætning og fjernelse af β-O-GlcNAc, til
specifikke steder i proteinet, har indflydelse på den cellulære regulering af protein-aktivitet1.
En anden vigtig egenskab ved GlcNAc, er dets rolle i ABO-blodtype-systemet, hvor dette
monosaccharid indgår i alle de tre forskellige oligosaccharid-kæder, der kan sidde på
overfladen af de røde blodlegemer, og som definerer blodtypen2.
Polysaccharidet chitin består udelukkende af GlcNAc-enheder, sammensat i en lang
uforgrenet kæde med β-1,4-bindinger, i analogi med cellulose. Chitin, som er et elastisk og
forholdsvist stærkt materiale, er hovedkomponent i svampes cellevægge, indgår i
exoskelettet i mange leddyr (bl.a. insekter) og kan kirurgisk benyttes som bionedbrydelig
tråd3. Chitobiose (GlcNAcβ-4GlcNAc), et disaccharid, som udskilles af edderkopper og af
nogle planter, er den mindste ”repeating unit” i chitin. Netop to β-1,4-bundne GlcNAc
molekyler er de første to enheder i den kerne af monosaccharider, der er bundet til peptid-
kæden ved N-GlcNAc glycosylering. Dette er en af grundene til at, chitobiose kan være
interessant at kunne syntetisere.
1 Zachara, N, E.; Hart, G. W., Chem. Rev., 2002, 102, 431-438
2 Berg, J. M.; Tymoczko, J. L.; Stryer, L., Biochemistry, W. H. Freeman and Company, 2002, 305
3 http://en.wikipedia.org/wiki/Chitin
5
1.2 Glycosylering med GlcNAc som donor
Som beskrevet ovenfor, har glycosider indeholdende GlcNAc en stor biologisk
betydning, og syntesen af sådanne forskellige glycosider har derfor været – og er stadig – et
område, der forskes meget indenfor. Der findes adskillige metoder til at danne β-glycosider
af GlcNAc. Den umiddelbart mest oplagte måde, ville være at benytte en donor, der
allerede har acetamido-funktionaliteten på C-2, men dette kan volde problemer. Med en 2-
acetamido-2-deoxy-glycosyl donor, ses – ved hjælp fra en aktivator – nabo-gruppe
deltagelse, hvilket medfører dannelsen af først et oxazolinium-intermediat og dernæst en
oxazolin (Skema 1)4,5
. En indlysende fordel ved anvendelse disse oxazoliner som donorer,
er at den ønskede stereoselektivitet (1,2-trans) opnås, idet nukleofilt angreb fra acceptoren
(R’OH) kun kan ske ”ovenfra”, resulterende i ækvatoriel position. En ulempe, er derimod at
de kan være ustabile overfor hydrolyse, hvilket især er problematisk ved kromatografi.
Ydermere udviser disse oxazoliner forholdsvis lav reaktivitet, hvorfor der kræves relativt
hårde reaktionsbetingelser, i form af stærk syre og høje temperaturer, når glycosyleringen
udføres med dem som donor. Dette kan føre til nedbrydning af både oxazolin og glycosid5,
hvilket selvsagt ikke er hensigtsmæssigt.
O
OR
RORO
ONH
O
OR
RORO
ON
O
OR
RORO
HNX
O
Aktivator
Oxazolinium Oxazolin
O
OR
RORO
NHAc
OR'
R'OH
Skema 1 Omdannelsen af O-beskyttet GlcNAc til oxazolin og i sidste ende glycosid
1.2.1 Beskyttelse af kvælstof
Der er derfor udviklet en række metoder, hvor kvælstof beskyttes før
glycosyleringen udføres, så oxazolin-dannelsen undgås. En af de meget benyttede
beskyttelsesgrupper, er phtalimido-gruppen (Figur 2).
4 Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 123 5 Wittmann, V.; Lennartz, D., Eur. J. Org. Chem, 2002, 1363-1367
6
N OO
Figur 2 Phtalimido-gruppen
Ligeledes her, er en af fordelene, at det udelukkende er den ønskede diastereomer,
β-glycosidet, der dannes. Denne stereoselektivitet skyldes til dels sterik, da gruppen har en
betragtelig volumen. Forklaringen er dog i højere grad den anchimeriske assistance til det
anomere kulstof, der udføres fra en af carbonyl-grupperne4, hvilket øger hastigheden af
leaving gruppens udtrædelse. Ulempen ved denne beskyttelsesgruppe, er besværligheder
omkring afbeskyttelsen. Idet phtalimido-gruppen kløves med overskud af base, kan dens
afbeskyttelse nemt påvirke andre base-følsomme funktionelle grupper.
Carbamater (-NHCOOR) er en anden klasse af N-beskyttelsesgrupper, der er nabo-
gruppe deltagende, og som derfor skaber preference for 1,2-trans glycosider. Troc (R =
trichloroethyl), Boc (R = t-Bu) og Cbz (R = benzyl) er nogen af de jævnligt anvendte
carbamater4. Deres afbeskyttelse sker under relativt sure betingelser. En anden mulighed,
som Yeung og co-workers har benyttet sig af, er at anvende methyl carbamat (R = Me), der
kan afbeskyttes under væsentligt mildere betingelser (MeSiCl3), hvilket betyder at
eventuelle andre beskyttelsesgrupper ikke påvirkes af dette6.
En alternativ metode, til dannelsen af rene β-glycosider, er enzymatisk
glycosylering. F.eks. har Kobayashi og co-workers7 fået koblet to GlcNAc enheder sammen
vha. enzymet chitinase, som er det fordøjelsesenzym, der bryder glycosidbindingerne i
chitin. Oxazolinet af GlcNAc benyttes her som donor, GlcNAc benyttes som acceptor, og
herudfra dannes chitobiose enzymatisk ved svagt basisk pH. En bemærkelsesværdig
kvalitet ved denne fremgangsmåde er muligheden for ubeskyttede hydroxylgrupper i de
anvendte saccharider. I de andre beskrevne metoder anvendes beskyttelsegrupper på ilt,
men med den enzymatisk katalyserede proces, er dette overflødigt, og eventuelle problemer
med senere afbeskyttelse kan herved undgås.
6 Yeung, B. K. S. et al., Org. Lett., 2000, vol. 2, 3135-3138
7 Kobayashi, S.; Kiyosada, T.; Shoda, S., Tetrahedron Letters, 1997, vol. 38, 2111-2112
7
De ovennævnte metoder har alle været stereoselektive overfor β-anomeren.
Når der benyttes en ikke-deltagende nabo-gruppe, vil α-glycosidet typisk også dannes.
Azido-gruppen (-N3) er en af disse beskyttelses-grupper, der er meget anvendt. Fordele er,
at den er nem at introducere i molekylet, nem at afbeskytte vha. reduktion og er stabil
overfor både ret sure og ret basiske betingelser. Den indlysende ulempe, når det er β-
glycosidet, vi er interesserede i, er naturligvis den manglende stereoselektivitet. Ofte
dominerer dannelsen af α-anomeren pga. anomer-effekten (omtales senere), selvom
selektiviteten afhænger meget af andre forhold, såsom den anvendte aktivator, den anomere
leaving-gruppe osv8.
1.2.2 Den anomere leaving-gruppe
Valget af leaving-gruppe (X) på det anomere kulstof (Skema 1) er en faktor,
der har stor indflydelse på reaktiviteten og stabiliteten af donoren. Koenigs og Knorr er
blevet kendt for deres anvendelse af glycosyl halider (X = Br-/Cl
-), typisk med aktivering
fra et sølv-salt, hvor kompleks-dannelse mellem halid og sølv forbedrer leaving-gruppe-
udtrædelsen8,9
. Haliderne følger den normale trend for leaving-gruppe-evne, og bromiderne
er altså mest reaktive, men derfor også ustabile. Chloriderne er derimod mere stabile, men
udviser til gengæld lavere reaktivitet. Den generelle reaktivitet af glycosyl haliderne
afhænger i høj grad af valget af beskyttelsesgrupper på sukkerens hydroxyl-grupper, hvilket
også påvirker stabiliteten. Et peracetyleret glycosyl-bromid er et udmærket valg, da det er
ret stabilt og samtidig udviser god reaktivitet ved tilstedeværelsen af en aktivator.
Thioglycosider (X = -S-R, R = alkyl/aryl) er en gruppe af donorer, der bruges
meget, da de har en række fordele8,10
. Deres aktivering kan ske med mange forskellige
promotorer, eksempelvis MeOTf, men et fællestræk for disse er, at den aktive del er en
kation af den ene eller anden art, eksempelvis Me+ i fald MeOTf anvendes. På denne måde
dannes en sulfonium-ion (+SR3), således at den anomere leaving gruppe (SR2) udtræder
som et neutralt molekyle. Thioglycosider udviser en høj stabilitet, og kan derfor tåle mange
forskellige reaktionsbetingelser, hvilket er en stor fordel.
8 Banoub, J. et al., Chem. Rev., 1992, 92, 1167-1195
9 Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 105 10
Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 109
8
Trichloroacetamidater (X = -OC(NH)CCl3) er endnu en leaving-gruppe, der
har fundet bred anvendelse i glycosyleringsreaktioner. Deres aktivering sker typisk med
BF3 • Et2O eller TMSOTf8,11
, idet disse Lewis syrer kobler til kvælstof, hvorved en bedre
leaving gruppe dannes. Trichloroacetamidater har derudover en rimelig stabilitet.
En knap så anvendt anomer leaving-gruppe er acetat-gruppen (X = -OCOCH3),
pga. den relativt lave reaktivitet sådanne glycosyl-donorer udviser. Ikke desto mindre
benyttes acetat ofte som beskyttelses-gruppe på sukkerens hydroxyl-grupper, idet det
syntese-mæssigt er nemt og selv meget sterisk hindrede hydroxyl-grupper kan acetyleres12
.
Når dette udføres på en ubeskyttet sukker, bliver også den anomere hydroxyl-gruppe
acetyleret. Det er derfor en fordel at kunne anvende acetat som leaving gruppe, da der i så
fald ikke er behov for efterfølgende selektiv reaktion på det anomere kulstof, ved
fremstillingen af glycosyl-donoren. Ved aktivering fra en Lewis syre, f.eks. SnCl4 eller BF3
• Et2O8, kan acetat udmærket benyttes som leaving-gruppe.
1.3 Reaktivitet og stereokemi
I forhold til elektronegative substituenter på det anomere kulstof, er der en
generel regel, som siger at aksielle anomerer er mere stabile end ækvatorielle anomerer,
hvilket er i modstrid med den normale trend, hvor ækvatorielle substituenter generelt er
mest stabile. Dette fænomen inden for sukker-kemien skyldes den såkaldte anomer-effekt,
der kan forklares ud fra et kig på orbitaler13
. Kort fortalt skyldes anomer-effekten den
stabiliserende effekt en elektronegativ substituent (X) har, når den er placeret aksielt, som
følge af positiv orbital-interaktion mellem en lonepair-orbital (n) fra det endocykliske ilt og
en anti-bindende orbital (σ*) fra C1-X-bindingen (Figur 3). Denne hyperkonjugation sker
ikke i β-anomeren, hvor substituenten sidder ækvatorielt. Ydermere gælder det at jo mere
elektronegativ substituenten er, jo mere udpræget er præferencen for den aksielle
konfiguration.
11
Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 107 12
Davis, B. G.; Fairbanks, A. J., Carbohydrate Chemistry, Oxford University Press, 2002, 21 13
Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 11-13
9
Figur 3 Anomer-effekten
En anden væsentlig effekt, der påvirker reaktiviteten af glycosyl-donoren, er
konfigurationen af de andre substituenter i sukkeren. Jensen og Bols har forsket indenfor
dette felt, hvor det har vist sig at donorer med aksielle elektron-tiltrækkende grupper er
mere reaktive end med ækvatorielle14
.
1.4 Oxazoliner som glycosyl-donorer
Oxazoliner har som nævnt behov for aktivering, i form af syre-katalyse fra enten en
Brønsted syre eller en Lewis syre, for at glycosyleringen finder sted. I nogle af de første
forsøg udført med oxazolin-donorer, blev forholdsvist skrappe betingelser anvendt,
eksempelvis p-toluensulfonsyre i nitrometan og toluen under refluks8. Forbedringer af
reaktionsbetingelser; herunder valg af katalysator; førte til brugen af Lewis syrer som FeCl3
eller TMSOTf som aktivatorer med DCE som solvent. Som Banoub konstaterer, har det
netop været de barske reaktionsbetingelser (stærk syre, høje temperaturer), der har været
den primære begrænsende faktor i forhold til glycosylering med disse donorer8.
I forsøg udført af Wittmann og Lennartz5, er der fundet mildere og stadigt effektive
betingelser, der tillader at benytte oxazoliner som donorer. Denne mildere aktiverings-
metode, omfatter brugen af Cu(II) salte (CuBr2, CuCl2), da oxazoliner er kendt som gode
ligander i Cu(II)-komplekser. Der rapporteres dog om ineffektivitet ved brugen af andre
Cu(II) salte, eksempelvis Cu(OTf)2. Katalysator-mængden er i de beskrevne forsøg
forholdsvist høj, da der tilsættes 1 eq. i forhold til mængden af donor. Mht. solventer, blev
THF, MeCN, DCE og CHCl3 screenet, hvor sidstnævnte viste sig at give de bedste
resultater.
I en anden metode, beskrevet af Crasto og Jones15
, bruges ligeledes oxazoliner som
donorer, men i stedet for Cu(II) salte benyttes her lanthanid triflater som katalysator – af
14
Jensen, H. H.; Bols, M., Acc. Chem. Res, 2006, 39, 259-265 15
Crasto, C. F.; Jones, G. B., Tetrahedron Letters, 2004, 4891-4894
10
økonomiske årsager vælges Yb(OTf)3. En umiddelbar fordel i forhold til Wittmann og
Lennartz er mængden af anvendt katalysator, idet der her opnås gode resultater ved brug af
30 mol%. Ved tilsætning af Et3N ophører glycosyleringen, hvilket afspejler vigtigheden af
tilstedeværelsen af TfOH i den katalytiske cyklus, som de formoder forløber som vist i
Skema 2. TfOH har altså rollen som proton-donor, for at opnå acetamido-funktionalitet og
OTf- er med til gendannelsen af katalysatoren.
Skema 2 Katalytisk cyklus ved brugen af Yb(OTf)3 foreslået af Crasto og Jones15
1.5 Katalysator
Brugen af forskellige RE triflater, heriblandt lanthanoid triflater, som aktivatorer i
glycosyleringsreaktioner er ikke noget fuldstændigt nyt fænomen, og udover den
ovennævnte metode fra Crasto og Jones, er der opnået flere gode resultater. Bl.a. har
Adinolfi og co-workers udført forsøg med Yb(OTf)3 som aktivator16
. Glycosyl
trichloroacetamidater og trifluoroacetamidater er her anvendt som donorer og forskellige
beskyttede glycosider er anvendt som acceptorer. På denne måde har de fået dannet både
di- og tri-saccharider, hvor sidstnævnte blev fremstillet fra tre monosaccharider i ”one-pot”
syntese. Yb(OTf)3 er anvendt i meget små mængder (3 mol% i tilfældet med
trichloroacetamidater), men der er her anvendt et co-solvent i form af pivalonitril (t-BuCN),
som synes at have positiv effekt på både reaktionshastighed og β-stereoselektivitet.
16
Adinolfi, M. et al., Synlett, 2006, no. 4, 583-586
11
Også Yamanoi og co-workers har haft succes med brugen af RE triflater som
promoter, i deres tilfælde primært Sc(OTf)317
. Glycosyldonorerne er her 1-C-alkyl-α-D-
glucopyranoser, hvor den anomere leaving gruppe er acetat, som altså her sidder på et
tertiært kulstof. Som acceptor anvendes enten en simpel primær alkohol eller galactose med
en fri 6-OH. Ligeledes her anvendes katalysatoren i små mængder (5-7.5 mol% afhængig af
acceptor). De resulterende glycosider fås med fine udbytter og med α-stereoselektivitet.
Reaktionerne er udført ved lav temperatur (0 °C) og reaktionstiderne er korte (1-3 h).
Et stort stykke arbejde, der afdækker brugen af RE triflater indenfor organisk
syntese, er udført af Kobayashi og co-workers18
. Med udgangspunkt i et udpluk af de
adskillige organiske reaktioner, der er Lewis syre katalyserede, har de undersøgt brugen af
RE(OTf)3 som nye katalysatorer. Fordelen ved disse, frem for de traditionelt anvendte
Lewis syrer, såsom AlCl3, BF3 og SnCl4, er bl.a. deres stabilitet ved tilstedeværelsen af
vand. I langt de fleste tilfælde er en katalytisk mængde nok til at reaktionerne forløber til
ende og disse katalysatorer kan nemt genvindes efter brug og genbruges. Dette gør alt i alt
disse RE triflater til betydeligt mere gunstige katalysatorer end de hidtil anvendte.
Mht. katalyse af glycosylering, har de undersøgt effektiviteten af primært Sc(OTf)3
og Yb(OTf)3 som aktivatorer i en række reaktioner. Selv med meget små mængder (ned til
0.5 mol%), opnås gode udbytter med kort reaktionstid ved lave temperaturer (højst 53 °C)
og udmærket stereoselektivitet, hvor β-anomeren i de fleste tilfælde dannes i stort overskud,
med mindre LiClO4 er tilsat.
1.6 Projektidé
I stedet for at beskytte kvælstof i GlcNAc, for efterfølgende at afbeskytte, udnyttes
den nabo-gruppe deltagelse 2-acetamido funktionaliteten kan udføre via oxazolin-formen.
Dog vil oxazolinen ikke blive isoleret og anvendt som donor, men derimod vil peracetyleret
GlcNAc blive anvendt direkte som glycosyl-donor. Ved tilsætning af en aktivator, vil
oxazolin-formen dannes og selv samme aktivator skal så katalysere
glycosyleringsreaktionen mellem den dannede oxazolin-donor og den tilsatte acceptor, som
pga. anchimerisk assistance vil være 100 % stereoselektiv overfor β-glycosidet. Aguilera og
co-workers har udført samme forsøg, netop med peracetyleret GlcNAc og med benzyl
17
Yamanoi, T. et al., Letters in Organic Chemistry, 2005, 2, 242-246 18
Kobayashi, S. et al., Chem Rev., 2002, 102, 2227-2302
12
alkohol som acceptor, men ved anvendelsen af FeCl3, ZnCl2 eller kamfersulfonsyre som
syre-promoterer19
.
Fordele ved denne metode er, at man undgår N-beskyttelse med eksempelvis
phtalimido-gruppen, som kan give problemer mht. afbeskyttelse og derudover undgås
isolering af ustabilt oxazolin. I projektet skal effektiviteten af forskellige katalysatorer –
primært RE triflater, der ikke er så vandfølsomme – og solventer undersøges med henblik
på øget udbytte og nedsat reaktionstid. Formålet er ligeledes at udforske anvendelsen af
forskellige alkoholer – herunder andre sukre – med det endelige mål at syntetisere
disaccharidet chitobiose.
2. Resultater og diskussion
2.1 Fremstilling af donor
O
OH
HOHO
NH2
OH
O
OAc
AcOAcO
NH2
OAc
O
OH
HOHO
N
OH
O
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
O
O
OAc
AcOAcO
NHAc
OAc
HCl
HCl
1 2
3
a b
c d
a. 1 M aq NaOH, p-anisaldehyd; b. pyridin, eddikesyre-anhydrid;
c. varm acetone, HCl; d. Et3N, eddikesyre-anhydrid
Skema 3
Fremstilling af donor 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose
2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranose [3] blev
anvendt som glycosyl-donor i den række af forsøg, der blev udført. Første trin i
fremstillingen, er imin-beskyttelse af den primære amin i D-glucosamin hydrochlorid [1]
(Skema 3). Imin-dannelsen udføres med p-anisaldehyd i en vandig opløsning af NaOH, for
at neutralisere overskydende syre. Den nødvendige syre-katalyse udføres af det HCl der
19
Aguilera, B., Jiménez-Barbero, J., Fernández-Majoralas, A.; Carbohydrate Research, 1998, 308,
19-27
13
frigives ved opløsning af sukker-forbindelsen, idet der ikke tilsættes yderligere syre.
Mekanismen for den syre-katalyserede imin-dannelse fra en primær amin og et aldehyd ses
i Skema 4.
O
NH2
OHHO
O
H Ar
O
NH2
OHHO
Ar
O
O
NH
OHHO
Ar
HO
+/- H H
O
NH
OHHO
Ar
H2O
O
NH
OHHO
Ar
-H O
N
OHHO
Ar
Skema 4 Mekanisme for imin-dannelsen. (Ar = p-methoxyphenyl)
Beskyttelsen medvirker først og fremmest, at aminen ikke påvirkes af acetyleringen
af ilt, og når det udføres med p-anisaldehyd, resulterer volumenet af beskyttelsesgruppen i,
at kun β-formen dannes når ilt beskyttes. Dette er favorabelt, idet anomer-effekten
indebærer at β-anomeren, er mere reaktiv end α-anomeren, som forklaret ovenfor. En anden
fordel ved en imin med en aromatisk substituent på dobbeltbindingen, er at disse er
betydeligt mere stabile end andre iminer20
.
Acetylering af de frie hydroxyl-grupper foretages med eddikesyre-anhydrid og
pyridin. Sidstnævnte har først og fremmest den opgave at ”fange” den ækvivalente mængde
eddikesyre, der dannes under reaktionen. Derudover kan pyridin katalysere reaktionen ved
enten generel base-katalyse eller nukleofil katalyse12
. Efter O-acetyleringen skal iminen
afbeskyttes med syre i form af HCl med varm acetone som solvent, for at få saltet af O-
acetyleret glucosamin. 2-acetamido funktionaliteten kan fremstilles med eddikesyre-
anhydrid og Et3N som base21
.
Da dette blev forsøgt udført i praksis, opstod et problem, idet N-beskyttelsesgruppen
faldt af ved acetyleringen af ilt. Iminer er syre-labile, og hydrolyseres let ved
tilstedeværelsen af syre og vand, hvilket må være hvad der er sket. Det faktum at
opløsningen var sur efter reaktionsforløbet, tyder ligeledes på at neutraliseringen af
20
Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic chemistry, Oxford University Press,
2001, 350 21
Kiso, M.; Anderson, L, Carbohydrate Research, 1985, 136, 309-323 brugt som inspiration
14
overskydende syre ikke har været tilstrækkelig. En mulig løsning på dette problem, kunne
være tilsætning af et større overskud af base (pyridin).
Udover at beskyttelsesgruppen var mistet, viste NMR, at kvælstof var blevet
acetyleret i samme ombæring og tilmed at ren β-form var dannet, hvilket tyder på at det
anomere kulstof blev acetyleret mens iminen stadig var intakt. At det var ren β-anomer, der
var dannet, kunne ses fra NMR, idet signalet fra H-1 for det første lå ved 5.69 ppm, hvilket
er lavere end for den tilsvarende α-anomer og for det andet havde en koblingskonstant til
det aksielle hydrogen-atom på C-2 på 8.8 Hz, som svarer til en aa-kobling og ikke en ae-
kobling. Det ønskede produkt blev altså dannet, trods problemer med den syre-labile imin,
hvilket var et overraskende resultat.
2.2 Glycosyleringsreaktionerne
2-acetamido funktionaliteten blev anvendt på glycosyl-donoren, pga. den
anchimeriske assistance der udføres, hvilket som nævnt danner oxazolin-formen og hermed
styrer stereoselektiviteten. Oxazolin-dannelsen starter med udtrædelse af leaving-gruppen,
der her er acetat, hvilket lettes ved hjælp fra en aktivator. Aktivatoren er her den samme
Lewis syre, som katalyserer selve glycosyleringen, muligvis med en positiv ladning. Ved
leaving-gruppe-udtrædelsen dannes en oxocarbenium-ion som intermediat. Det anomere
kulstof angribes af carbonylen i amidet, hvilket forårsager dannelsen af et nyt intermediat;
en oxazolinium-ion. Efter deprotonering fås oxazolinen [4] (Skema 5).
OAcOAcO
HN
OAc
O
Yb(OTf)2AcOOAcO
AcO
AcO
OAcOAcO
AcO
HN O
OTf
OAcOAcO
AcO
N OHN
O3 4
Skema 5 Dannelsen af oxazolin, her med +Yb(OTf)2 som aktivator
Det er oxazolinen [4], der indtræder som donor i den katalytiske cyklus, som vist i
Skema 2. Katalysatoren, i sin kationiske form (her +Yb(OTf)2), koordinerer til kvælstof, og
der dannes et kontakt-ionpar mellem dette kompleks og katalysatorens modion (her -OTf). I
et sådant kontakt-ionpar, er der intet solvent mellem de to modioner. Man siger at ionerne
15
er fanget i et ”solvent-bur”22
. Når en glycocyl-acceptor i form af en alkohol (ROH) angriber
det reaktive ion-par, er den aksielle side af det anomere kulstof blokeret, således at kun det
ønskede β-glycosid dannes. Udover den fordel nabo-gruppe-deltagelsen giver mht.
stereoselektivitet, har donoren den kvalitet, at den anomere leaving-gruppe sidder
ækvatorielt, hvilket øger reaktiviteten pga. anomer-effekten.
Alle glycosyleringsreaktionerne blev udført i tørt solvent under nitrogen-atmosfære
for at undgå angreb fra vand på det anomere kulstof. Der blev benyttet 3 eq. acceptor og
~16 mol% katalysator i reaktionerne.
Første test-forsøg med den fremstillede donor blev udført med allyl alkohol som
acceptor, Yb(OTf)3 som katalysator og DCM som solvent ved 45 °C, således at refluks blev
opnået. Valget af donor viste sig at være mindre hensigtsmæssigt, idet der ved kromatografi
på silica kun var ringe adskillelse af glycosidet og alkoholen. Bortset fra det, forløb
reaktionen som forventet med nogenlunde godt udbytte (80 %) og 100 % stereoselektivitet.
Det varede dog 30 h, før reaktionen var forløbet til ende, hvilket er lang tid. Flere forsøg
blev derfor udført for at finde reaktionsbetingelser, der kunne reducere reaktionstiden.
O
OAc
AcOAcO
NHAc
OAcO
OAc
AcOAcO
NHAc
OR5 R = Allyl6 R = Benzyl3
Katalysator
3 eq. alkohol
Skema 6 Den katalyserede glycosyleringsreaktion
I den næste række af forsøg blev benzyl alkohol anvendt som acceptor (Tabel
1), idet der pga. dennes apolære karakter, var fin adskillelse fra glycosidet med TLC og
søjle kromatografi. I første omgang blev en række RE triflater testet som aktivatorer i DCM
ved 45 °C. La(OTf)3, Sc(OTf)3, Sm(OTf)3 og Yb(OTf)3 (indgang a, b, c og d) gav
nogenlunde ens udbytter (75-84 %), men hvad der var værd at bemærke, var varigheden af
forsøget med Sc(OTf)3, da reaktionstiden her var helt nede på 4 h, i modsætning til
forsøgene med de andre tre katalysatorer, som alle var ~22 h om at få reaktionen til at løbe
til ende.
22
Anslyn, E. V.; Dougherty, D. A., Modern Physical Organic Chemistry, University Science Books,
2006, 640
16
I de næste fire forsøg, anvendtes Sc(OTf)3 derfor som katalysator, men med
solventet som variationsparameter. Temperaturen blev holdt ved 45 °C, for at de opnåede
resultater kunne sammenlignes. DCE, THF, toluen og MeCN blev screenet som solventer
(indgang e, f, g og h), hvor DCE gav det bedste resultat med en reaktionstid på 6 h, hvilket
dog stadig ikke var bedre end med DCM. Alle fire reaktioner gav noget lavere udbytter (48-
69 %) end de foregående forsøg med DCM, hvilket eventuelt kan skyldes at ingen af de fire
solventer havde kogepunkter lave nok til at refluks blev opnået ved 45 °C.
Da DCM tilsyneladende var det bedste af de afprøvede solventer, blev de næste fire
forsøg med nye katalysatorer udført i DCM og stadig ved samme temperatur. De fire
katalysatorer, der blev testet for at runde katalysator-delen af, var CuBr2, Cu(OTf)2,
Dy(OTf)3 og Nd(OTf)3 (indgang i, j, k og l), altså to RE triflater mere samt to kobber-salte.
Dy(OTf)3 og Nd(OTf)3 udviste omtrent samme effektivitet, som de tidligere afprøvede
lanthanid triflater (La, Sm og Yb) med udbytter på hhv. 83 % og 88 % og en reaktionstid på
20 h. CuBr2 katalyserede reaktionen udmærket, hvilket også var forventet på baggrund af
resultaterne fra Wittmann og Lennartz5, dog var udbyttet betydeligt lavere end for RE
triflaterne (57 %) og varigheden af reaktionen var på > 24 h. Det lave udbytte, kan muligvis
forklares med den vandfølsomhed CuBr2 udviser. Reaktionsblandingen var, f.eks. ved
udtag til TLC, i kontakt med atmosfærisk luft, hvilket kan have haft betydning for
stabiliteten af CuBr2. Cu(OTf)2 var ligeledes en succesfuld katalysator, hvilket umiddelbart
er i modstrid med resultater fra nævnte artikel, idet Wittmann og Lennartz betegner
Cu(OTf)2 som ”essentially ineffective”. Denne aktivator gav bestemt udmærkede resultater
med en lav reaktionstid (8 h) og et acceptabelt udbytte på 69 %. De nævner da også selv
oxazoliners glimrende evne til at danne komplekser til Cu(II)-salte5.
Hernæst udførtes et forsøg med DCE under refluks (indgang m). Ved at hæve
temperaturen til 90 °C blev reaktionstiden betydeligt sænket (1½ h). En forøget temperatur,
havde altså en positiv effekt på både udbytte og reaktionstid, hvilket også var forventeligt.
Til sidst blev et kontrolforsøg udført (indgang n), for at bekræfte at reaktionen ikke ville
forløbe uden tilsætning aktivator. Selv ved høj temperatur (90 °C) skete ingen
glycosylering, heller ikke efter 30 h. Anvendelsen af katalysator var altså nødvendig for
glycosyleringen.
Der blev ydermere udført to forsøg hvor donoren var en blanding af diastereomere i
forholdet α/β ≈ 13:1, for at undersøge om den mindre reaktive α-anomer ville undergå
glycosylering ved de anvendte reaktionsbetingelser (Skema 7). Benzyl alkohol blev også
17
her anvendt som acceptor og Sc(OTf)3 hhv. Yb(OTf)3 blev anvendt som katalysator i de to
forsøg. TLC viste at kun en lille del af donoren reagerede, hvilket må anses som en klar
indikation af, at kun β-anomeren reagerede. Efter søjle-kromatografi blev kun én organisk
fraktion opsamlet, og dette blev identificeret som uomdannet α-anomer af udgangsstoffet.
Der har tilsyneladende været så lidt dannet β-glycosid, at dette er forsvundet ved
oparbejdning og oprensning. Kun 35 % ureageret α-anomer blev opsamlet efter
kromatografi ifølge beregninger. Der var dog stadig en del solvent i α/β-blandingen, da det
blev afvejet inden starten på reaktionerne, hvilket naturligvis gjorde det beregnede udbytte
lavere end det faktiske. Tilstedeværelsen af solvent ved afvejning, reducerede ydermere den
mængde β-glycosid, der potentielt kunne dannes, hvilket gør det mere rimeligt at det ikke
var at finde efter oprensning. Ikke desto mindre må det konkluderes, at det kun var β-
anomeren af donor, der blev koblet med acceptoren og at reaktionsbetingelserne altså ikke
var kraftige nok til at lade α-anomeren reagere.
O
OAc
AcOAcO
NHAc
Katalysator
O
OAc
AcOAcO
NHAc
OBnOAc 3 eq. benzyl alkohol
= 13:1
O
OAc
AcOAcO
AcHNOAc
+
Major Minor7 6
Skema 7 Forsøg på glycosylering af α/β-blanding
Uanset valget af solvent og katalysator, var reaktionerne 100 % stereoselektive og
det var således kun β-glycosidet, der blev dannet.
2.3 Potentielle acceptorer
Idet de optimale reaktionsbetingelser var fundet, kunne der i højere grad
fokuseres på anvendelse af forskellige acceptorer i glycosyleringen. Allyl alkohol og benzyl
alkohol er ”almindelige” primære alkoholer og blev anvendt blot for at teste metoden. Som
beskrevet i indledningen, er GlcNAc et monosaccharid, der forekommer mange steder i
naturen, og det ville derfor være interessant at udforske muligheden for at anvende
eksempelvis aminosyrer og andre sukre som acceptorer.
Aminosyren serin, er et potentielt site for O-glycosylering i peptider og
proteiner, og koblingen af GlcNac til serin-sidekæden, er derfor ikke uvæsentlig at kunne
18
udføre syntetisk. Da serin i sin naturlige form (L-serin), har en fri amin, som også kan være
et potentielt acceptor-site, er det nødvendigt med en N-beskyttelsesgruppe når denne skal
benyttes som acceptor. Her valgtes den meget anvendte fluorenylmethyloxycarbonyl
(Fmoc), der beskytter mod elektrofiler, og som ikke kan tabes ved substitution som Cbz og
t-Boc kan23
, idet fluorenylmethyl-delen er en dårlig leaving-gruppe. L-serin blev anvendt i
methyl-ester formen. Mekanismen bag beskyttelsen er nukleofil substitution på carbonyl-
kulstof, med et tetraedrisk intermediat, som vist i Skema 8.
H2NO
OH
O
O Cl
O
FmocNH
O
OH
O
- HCl
8
O NH2
O ClOH
O
O
O N
OH
O
O
O
Cl
H H
Skema 8 Dannelsen af Fmoc-L-serin methyl ester
Beskyttelsen blev udført med 9-Fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl),
som Fmoc-donor og med L-serin methyl ester hydrochlorid i 1,4-dioxan. Der blev tilsat
vandig Na2CO3 for at neutralisere overskydende syre. Efterfølgende afbeskyttelse af Fmoc
skal ske med base, f.eks en amin, idet den alifatiske proton i fluorenyl-delen, er sur (pKa≈
25). Efter deprotonering fås et 14-elektron aromatisk system, hvorpå der sker elimination,
således at et fulven-derivat dannes. Efter decarboxylering fås den frie afbeskyttede amin23
(Skema 9).
O NH
O
R
HO N
H
O
R
BaseO N
H
O
R
+
Base-HCO2
+ NH2-R
Skema 9 Afbeskyttelse af Fmoc
23
Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P., Organic chemistry, Oxford University Press,
2001, 656-657
19
At Fmoc-L-serin methyl ester [8] kan anvendes som acceptor, understøttes af forsøg
udført af Wittmann og Lennartz5, hvor allyl esteren af Fmoc-L-serin anvendes som
acceptor. Dette forløber med fint udbytte, men reaktionstiden er temmelig lang i
sammenligning med alkoholer som 2-propanol og cyklohexanol. Også pentafluorophenyl
(Pfp) esteren af serin med Fmoc-beskyttelse kan udmærket anvendes i glycosylering24
.
En potentiel sukker-acceptor, skal optimalt være et saccharid med kun en fri
hydroxyl-gruppe og beskyttelsesgrupper på de resterende. En sådan kunne være methyl
2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-glucopyranosid [10], som kan fremstilles ved ringåbning af den
tilsvarende benzyliden-beskyttede sukker [9], således at 4-OH-gruppen blottes. Dette blev
gjort ved selektiv reduktion med NaCNBH3 som hydrid-donor og med HCl i Et2O som
Lewis syre. CNBH3- er mindre voluminøs end eksempelvis AlH4
- og regioselektiviteten
styres derfor af elektroniske faktorer. På denne måde vil Lewis syren (her H+) koordinere til
det mere basiske ilt (O-4), resulterende i en fri hydroxyl-grupe på C-4 og O-benzyl på C-625
.
Mekanismen er angivet i Skema 10.
OOBnO
BnOOMe
OPhO
O
HOBnO
BnOOMe
Ph
H
H
BC H
H H
N
O
OBn
HOBnO
BnOOMe9 10
Skema 10 Regioselektiv ringåbning af 4,6-benzyliden acetal
Desværre var omdannelsen langt fra fuldstændig. Der blev ikke tilsat nok syre i
første omgang og heller ikke tilstrækkeligt NaCNBH3, så begge dele skulle tilsættes igen i
løbet af reaktionsforløbet. Reaktionen blev stoppet efter to dage og efter oparbejdning og
søjlekromatografi blev der opsamlet to faser. Disse blev som forventet identificeret som
hhv. uomdannet udgangsstof [9] og produkt [10]. Dog var der kun genvundet 11 % af
udgangsstoffet og udbyttet blev kun 13 %, hvilket må siges at være et skuffende resultat.
24
Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 162 25
Boons G.; Hale, K. J., Organic Synthesis with Carbohydrates, Sheffield Academic Press og
Blackwell Science, 2000, 43
20
Den dannede sukker-forbindelse er en potentiel acceptor, hvor den frie 4-OH-
gruppe er det ”reaktive site”. Denne hydroxyl-gruppe er ofte den mindst reaktive i
glycosyleringsreaktioner, men ikke desto mindre, kan den anvendes som ”koblings-site” til
en glycosyldonor. Eksempelvis anvender Yeung og co-workers en acceptor med en fri 4-
OH-gruppe, hvor donoren er et trichloroacetamidat6. Også Dasgupta og Anderson benytter
flere forskellige acceptorer med en fri hydroxyl-gruppe på C-4 i både aksiel og ækvatoriel
position26
. Deres erfaring var, at udbyttet blev højest når acceptorerne blev tilsat som det
sidste til reaktionsblandingen.
Tiden tillod desværre ikke forsøg på kobling mellem de to fremstillede acceptorer
og donoren. Andre udførte forsøg giver dog et fingerpeg om at det bør kunne lade sig gøre,
selvom det muligvis giver knap så høje udbytter og kræver betydeligt længere
reaktionstider. Forhåbentlig og formodentlig kan de optimerede betingelser også anvendes
med acceptorer, som de to omtalte og lignende, således at det vil være muligt at koble en
sukkerforbindelse til et peptid, eller i det mindste en aminosyre, samt at fremstille
disaccharider med denne metode.
3. Konklusion
26
Dasgupta, F.; Anderson, L., Carbohydrate Research, 1990, 202, 239-255
21
Peracetyleret GlcNAc blev med succes anvendt som donor i en række
glycosyleringsreaktioner, der må formodes at gå gennem en oxazolin, som dernæst indgår i
en katalytisk cyklus, hvorved det ønskede β-glycosid dannes. Både allyl alkohol og benzyl
alkohol var udmærkede acceptorer, men benzyl alkohol blev foretrukket af praktiske
årsager. Alle de afprøvede katalysatorer var i en vis udstrækning effektive, dog var RE (La,
Sc, Sm, Yb, Dy, Nd) triflaterne, de aktivatorer, der gav de højeste udbytter. DCM, som er
det lavest kogende af de screenede solventer, gav gode resultater ved refluks (45 °C). Da
DCE blev anvendt ved dobbelt så høj temperatur (90 °C), blev reaktionstiden mere end
halveret. De optimale rektionsbetingelser må konkluderes at være Sc(OTf)3 som katalysator
med enten DCM eller DCE som solvent. Dette giver højt udbytte og lav reaktionstid, hvor
en høj temperatur er en forbedrende faktor.
Der er dog også et økonomisk aspekt at overveje. Mht. prisen på de forskellige
katalysatorer (se Tabel 1), er Sc(OTf)3 nemlig klart den dyreste (1671.12 DKK/5g), hvilket
gør det økonomiske aspekt værd at anskue. Til langt færre penge, fås Nd(III)(OTf)3 (294.48
DKK/5g), Sm(III)(OTf)3 (333.36 DKK/5g) eller Dy(III)(OTf)3 (455.76 DKK/5g), som alle
gav lignende udbytter under de samme forhold og med meget ens reaktionstider (20-22 h).
Tiden for at få reaktionerne til at løbe til ende er altså væsentligt længere, men til gengæld
er udgiften betragteligt mindre. I forhold til hvilken katalysator, der bør anvendes, skal der
altså træffes et valg mellem tid og penge. På baggrund af andre publicerede resultater, kan
de udviklede reaktionsbetingelser formodentlig anvendes til koblingen af GlcNAc med en
aminosyre eller et andet monosaccharid.
22
4. Experimental section
4.1 General methods
When needed, solvents were distilled and equipment was dried before use. Reactions were
followed using TLC. The TLC plates were developed using a suitable staining system
followed by heating. Columns for flash chromatography were packed with silica gel (60 Å)
and an appropriate proportion between EtOAc and pentane was used as eluent.
1H and
13C NMR experiments were recorded in deuterated chloroform, CDCl3 (signals at
7.26 and 77.16 in 1H and
13C NMR respectively), on a Varian Mercury 400 NMR
instrument. 1H NMR was recorded at 400 MHz and
13C NMR at 100 MHz. The spectra
were analyzed partly by means of comparison with data from the literature on equivalent or
similar compounds. Low-resolution mass spectral analyses were made on a Micromass LC-
TOF instrument. Optical rotation was measured on a PE-314 polarimeter. Melting points
were measured on a Büchi B-540.
4.2 Preparation of glycosyl donor 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-
deoxy-β-D-glucopyranose [3]27
O
OAc
AcOAcO
NHAc
OAc
D-glucosamine hydrochloride [1] (25 g, 116 mmol) was dissolved in a freshly prepared aq.
solution of 1 M NaOH (120 mL). p-anisaldehyde (17 mL, 140 mmol) was added while
stirring. After ~1 h crystallization began. The mixture was cooled. The precipitation was
filtered and washed with cold water and subsequently with a 1:1 mixture of EtOH/Et2O.
The product (2-deoxy-2-[p-methoxybenzylidene(amino)]-D-glucopyranoside [2]) was
evaporated. (Crude yield: 42.1 g, 122 %). This intermediate product was dissolved in
pyridine (135 mL), the solution was cooled (ice bath) and Ac2O (75 mL, 793 mmol) was
added successively. The mixture was left overnight. The yellow solution was poured into
500 mL of ice-water and another 1000 mL was added. No precipitation observed.
Neutralization with NaHCO3. The mixture was extracted 3 times with DCM. 10 % of the
organic extract was evaporated with toluene and allowed to stand at rt. After several
27
procedure inspired by: Myszka, H. et al., Carbohydrate research, 2003, 338, 133-141
23
minutes precipitation could be observed. The precipitated product was washed with a 2:1
mixture of pentane/EtOAc and filtered. Subsequently the remaining organic extract was
evaporated with toluene, precipitation by addition of Et2O. Filtration of the product. This
product was surprisingly identified as the per-acetylated GlcNAc (with impurities). It was
washed with DCM and purified by flash column chromatography, resulting in [3]. (11.56 g,
26 %)
Rf: 0.34; mp: 186-189 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 5.69 (d, J1,2 = 8.8 Hz, 1H, H-1), 5.44 (br d,
JNH,2 = 10.0 Hz, 1H, NH), 5.17-5.09 (m, 2H, H-3+H-4), 4.33-4.24 (m, 2H, H-2+H-6a), 4.13
(dd, J5,6b = 2.4 Hz, J6b,6a = 6.2 Hz, H-6b), 3.79 (ddd, J5,6b = 2.4 Hz, J5,6a = 4.8 Hz, J4,5 = 9.6
Hz, 1H, H-5), 2.11 (s, 3H, CH3), 2.08 (s, 3H, CH3), 2.04 (s, 3H, CH3), 2.03 (s, 3H, CH3),
1.92 (s, 3H, CH3); 13
C-NMR: δ (ppm) 171.44 (CO), 170.89 (CO), 170.31 (CO), 169.79
(CO), 169.46 (CO), 92.86 (C-1), 73.18, 72.83, 67.93, 61.87, 53.27, 23.41 (CH3), 21.11
(CH3), 20.94 (CH3), 20.85 (CH3), 20.79 (CH3); MS: 412.1 ([3]+Na+ = 412.34) (data in
accordance with references28,29
)
4.3 Preparation of allyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-
glucopyranoside [5]
O
OAc
AcOAcO
NHAc
O
Per-acetylated GlcNAc [3] (212 mg, 0.54 mmol) and Yb(III)(OTf)3 (50 mg, 0.08 mmol)
were dissolved in dry DCM (2.5 mL) and allyl alcohol (0.11 mL, 1.6 mmol) was added.
Reflux (45°C) under nitrogen for ~30 h. The mixture was diluted with DCM, washed with
water, extracted 2 times with DCM and dried over anhydrous MgSO4. Purification by flash
column chromatography with EtOAc gave white crystals (168 mg, 80 % yield) identified as
the desired product [5].
28
mp from: Horton, D.; J. Org. Chem, 1964, 1776-1782 29
SDBS used as reference for NMR-spectra: http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-
bin/direct_frame_top.cgi
24
Rf (EtOAc): 0.46 ; mp: 160-162 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 5.90-5.81 (m, 1H, CH=CH2), 5.55
(br s, 1H, NH), 5.31-5.18 (m, 3H, H-3+CH=CH2), 5.07 (t, J3,4 ≈ J4,5 = 9.2 Hz, 1H, H-4),
4.71 (d, J1,2 = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.33 (dd, JO-CH2,HC=C = 4.4 Hz, Jgem,O-CH2 = 12.8 Hz, 1H, O-
CH2), 4.25 (dd, J5,6a = 4.8 Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6a), 4.13 (d, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-
6b), 4.08 (dd, JO-CH2,HC=C = 6.2 Hz, Jgem,O-CH2 = 12.8 Hz, 1H, O-CH2) 3.87 (k, JNH,2 ≈ J1,2 ≈
J3,4 = 9.2 Hz, 1H, H-2), 3.70-3.68 (m, 1H, H-5), 2.08 (s, 3H, CH3), 2.03 (s, 3H, CH3), 2.02
(s, 3H, CH3), 1.95 (s, 3H, CH3); 13
C-NMR: δ (ppm) 171.10 (CO), 170.93 (CO), 170.45
(CO), 169.62 (CO), 133.77 (CH=CH2), 118.00 (CH=CH2) 99.87 (C-1), 72.60, 72.01, 70.16,
68.92, 62.39, 54.96 (C-2), 23.54 (CH3), 20.96 (CH3), 20.91 (CH3), 20.85 (CH3); MS: 410.1
([5]+Na+ = 410.37) (data in accordance with reference
30)
4.4 Preparation of benzyl 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-
glucopyranoside [6] under various conditions
O
OAc
AcOAcO
NHAc
OBn
General procedure: Per-acetylated GlcNAc [3] (200 mg, 0.51 mmol) and catalyst (0.081
mmol) were dissolved in dry solvent (2.5 mL) and benzyl alcohol (0.17 mL, 1.6 mmol) was
added. The mixture was heated with condenser under nitrogen, until complete conversion
or until no more possible conversion. Reaction work-up was made by dilution with DCM
and wash with water, followed by extraction with DCM. The mixture was then dried over
anhydrous MgSO4 and purified by flash column chromatography with gradient, starting at a
1:1 mixture of pentane/EtOAc as eluent.
30
Aguilera, B., Jiménez-Barbero, J., Fernández-Majoralas, A.; Carbohydrate Research, 1998, 308,
19-27
25
Reaction Temp
[°C] Solvent
Bp
[°C] Catalyst
m
[mg]
Priceb
[DKK/5g] Duration Yield
a 45 DCM 39.8 La(OTf)3 47.5 1026.00 22 h 81 %
b 45 DCM 39.8 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 4 h 78 %
c 45 DCM 39.8 Sm(III)(OTf)3 48.4 333.36 22 h 84 %
d 45 DCM 39.8 Yb(III)(OTf)3
50.2 602.64c
22 h 75 %
e 45 DCE 83.5 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 6 h 69 %
fa
45 THF 67.0 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 >28 h 48 %
g 45 Toluene 110.6 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 11½ h 54 %
ha
45 MeCN 81.6 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 7½ h 62 %
i 45 DCM 39.8 CuBr2 18.1 144.72 >24 h 57 %
j 45 DCM 39.8 Cu(II)(OTf)2 29.3 578.16 8 h 69 %
k 45 DCM 39.8 Dy(III)(OTf)3 49.4 455.76 20 h 83 %
l 45 DCM 39.8 Nd(III)(OTf)3 47.9 294.48 20 h 88 %
m 90 DCE 83.5 Sc(OTf)3 39.9 1671.12 1½ h 82 %
n 90 DCM 39.8 NONE!! - - >30 h 0 %
Tabel 1 The reactions performed with [3] as donor and benzyl alcohol as acceptor resulting
in [6]. aIn the case of the solvents THF and MeCN, the organic extracts were washed with a
saturated aq. solution of NaCl. bPrices were found on www.sigmaaldrich.com 7/8 2007.
cThe price for
Yb(III)(OTf)3 was only found for the hydrate (• xH2O)
Rf (EtOAc): 0.58; mp: 165-167 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 7.35-7.26 (m, 5H, 5 Ar-H), 5.55 (br
s, 1H, NH), 5.20 (t, J2,3 ≈ J3,4 = 9.6 Hz, 1H, H-3), 5.07 (t, J3,4 ≈ J4,5 = 9.6 Hz, 1H, H-4), 4.88
(d, Jgem,CH2Ph = 12 Hz, 1H, CH2Ph), 4.64 (d, J1,2 = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.59 (d, Jgem,CH2Ph = 12
Hz, 1H, CH2Ph), 4.26 (dd, J5,6a = 4.8 Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6a), 4.15 (dd, J5,6b = 2.4
Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6b), 3.96 (k, J1,2 ≈ J2,3 ≈ JNH,2 = 8.4 Hz, 1H, H-2), 3.67 (ddd, 1H,
H-5), 2.10 (s, 3H, CH3), 2.01 (s, 6H, 2 CH3), 1.90 (s, 3H, CH3); 13
C-NMR: δ (ppm) 171.15
(CO), 170.96 (CO), 170.34 (CO), 169.60 (CO), 137.11 (C-ipso), 128.72 (Ar-C), 128.31
(Ar-C), 128.27 (Ar-C), 99.66 (C-1), 72.66, 72.10, 70.89, 68.84, 62.37, 54.75 (C-2), 23.51
26
(CH3), 20.99 (CH3), 20.90 (CH3), 20.84 (CH3); ( MS: 460.2 ([6]+Na+ = 460.43) (data in
accordance with reference31
)
4.5 α/β-mixture as glycosyl donor resulting in benzyl 2-acetamido-3,4,6-
tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glucopyranoside [6] and 2-acetamido-1,3,4,6-
tetra-O-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranose [7]
O
OAc
AcOAcO
NHAc
OBn
O
OAc
AcOAcO
AcHNOAc
Before synthesis, the α/β-mixture was purified by flash column chromatography with
EtOAc as eluent. Identified as a ~13:1 α/β-mixture. 1H-NMR: δ (ppm) 6.08 (d, J1,2 = 3.6 Hz,
1H, H-1α) (integral = 3.36), 5.64 (d, J1,2 = 8.8 Hz, 1H, H-1β) (integral = 0.25), 3.36/0.25 =
13.4.
The product was placed in two flasks (o: 162.9 mg, 0.42 mmol (0.39 mmol α-anomer); p:
171.2 mg, 0.44 mmol (0.41 mmol α-anomer)), catalyst was added (o: Sc(OTf)3, 30.9 mg,
0.063 mmol; p: Yb(III)(OTf)3, 40.9 mg, 0.066 mmol) and dry DCM (2.5 mL for each) was
added for dissolution. Addition of benzyl alcohol (0.14 mL, 1.3 mmol for each) and the
reactions were set to reflux (45°C) under nitrogen. Reactions stopped after 48 h. Work-up
as described above. Flash column chromatography of “o” in a 3:1 mixture of
pentane/EtOAc, resulting in only one organic fraction. This was identified as the α-anomer
of starting material [7] (52.8 mg, 35 % recovered).
Rf (EtOAc): 0.45; mp: 136-138 °C; 1H-NMR: δ (ppm) 6.14 (d, J1,2 = 3.6 Hz, 1H, H-1), 5.70
(br d, JNH,2 = 9.2 Hz, 1H, NH), 5.24-5.15 (m, 2H, H-3 + H-4), 4.45 (dt, J1,2 = 3.6 Hz, J2,3 ≈
JNH,2 ≈ 9.2, 1H, H-2), 4.22 (dd, J5,6a = 4.4 Hz, J6a,6b = 12.8 Hz, 1H, H-6a), 4.04 (dd, J5,6b =
2.4 Hz, J6a,6b = 12.4 Hz, 1H, H-6b), 3.97 (m, 1H, H-5), 2.16 (s, 3H, CH3), 2.14 (s, 3H, CH3),
2.06 (s, 3H, CH3), 2.02 (s, 3H, CH3), 1.91 (s, 3H, CH3) (data in accordance with reference31
)
31
Aguilera, B., Fernández-Mayoralas, A., Jaramillo, C.; Tetrahedron, 1997, vol. 53, 5863-5876
27
4.6 Preparation of potential acceptor N-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-
L-serine methyl ester (Fmoc-L-serine methyl ester) [8]32
FmocNH
O
OH
O
9-Fluorenylmethyl chloroformate (Fmoc-Cl) (1.1058 g, 4.27 mmol) was dissolved in 1,4-
dioxane (10 mL) and 10 % aq Na2CO3 (10 mL) and the mixture was placed on ice bath. L-
serine methyl ester hydrochloride (600 mg, 3.86 mmol) was added while stirring. The
reaction mixture was left at rt for 2¼ h, then diluted with water and extracted 2 times with
DCM. The extract was dried with anhydrous MgSO4 and purified with flash column
chromatography in a 1:1 mixture of pentane/EtOAc to give the protected amino acid [8]
(907.2 mg, 69 %).
Rf (EtOAc): 0.46; mp: 128-130 ˚C; [α]D295K
: + 6.9 ° (c 1, CHCl3); 1H-NMR: δ (ppm) 7.77
(d, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-H (ortho)), 7.60 (br s, 2H, Ar-H (ortho)) 7.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-
H (meta/para), 7.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H, Ar-H (meta/para), 5.73 (br s, 1H), 4.44 (m, 3H),
4.23 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.96 (br d, 2H), 3.79 (s, 3H, CH3), 2.20 (br s, 1H); 13
C-NMR: δ
(ppm) 171.15 (CO), 143.90 (ipso), 141.54 (ipso), 127.99 (Ar-C), 127.32 (Ar-C), 125.29
(Ar-C), 120.24 (Ar-C), 67.43, 63.53, 56.24, 53.02, 47.39 (one signal missing from a C=O);
MS: (____) (data in accordance with references33,34
)
4.7 Preparation of potential acceptor methyl 2,3,6-tri-O-benzyl-α-D-
glucopyranoside [10]35
O
OBn
HOBnO
BnOOMe
32
Procedure inspired by: Hale, K. J. et al., Tetrahedron Letters, 1996, vol. 37, 9345-9348 33
mp from: Lapatsanis, L. et al.; Synthesis, 1983, 8, 671-673 34
NMR of Fmoc-D-Ser methyl ester from: Rush, J; Bertozzi, C. R., Org. Lett., 2006, vol 8, 131-134
(found in supporting information) 35
Procedure from: Garerr, P. J.; Hultberg, H., Carbohydrate Research, 1981, 93, C10-C11
28
Methyl 2,3-di-O-benzyl-4,6-O-benzylidene-α-D-glucopyranoside [9] (2.3445 g, 5.1 mmol)
was dissolved in dry THF with activated 3 Å molecular sieves. Sodium cyanoborohydride
(2.9290 g, 46.6 mmol) was added and the mixture was cooled to 0°C (ice bath). HCl (1 M
in Et2O) (~8 mL) was added drop wise to the reaction. After ~1 h, more NaCNBH3 (0.4071
g, 6.5 mmol) and more acid (~25 mL) was added. The reaction was stopped after 2 days
(incomplete conversion). Mol. sieves and some precipitation were filtered out and washed
with DCM. The filtrate was poured into ice-water and allowed to stand at rt. Extraction 2
times with DCM. The organic extract and the DCM-fase from washing were collected.
Flash column chromatography resulting in two organic fractions. One identified as
unconverted starting material [9] (248.0 mg, 11 % recovered). The other identified as the
opened benzylidene [10] (296.8 mg, 13 % yield)
DATA [9]: Rf (EtOAc/pentane 1:2): 0.80; 1H-NMR: δ (ppm) 7.43 (m, 15H, Ar-H), 5.48 (s,
1H, CH-Ph), 4.86-4.75 (m, 3H, 3 CH2-Ph), 4.63 (d, J = 12.4 Hz, 1H, 1 CH2-Ph), 4.53 (d,
J1,2 = 3.6, 1H, H-1), 4.20 (dd, J4,5 = 4.4 Hz, J3,4 = 10 Hz, 1H, H-4), 3.98 (t, J2,3 ≈ J3,4 ≈ 9.2
Hz, 1H, H-3), 3.76 (dt, J4,5 = 4.4 Hz, J5,6a ≈ J5,6a ≈ 10.4 Hz, 1H, H-5), 3.64 (t, J5,6a = 10.4
Hz, 1H, H-6a), 3.53 (t, J5,6b = 9.6 Hz, 1H, H-6b), 3.49 (dd, J1,2 = 3.6 Hz, J2,3 = 9.2 Hz, 1H,
H-2), 3.33 (s, 3H, O-CH3); 13
C-NMR: δ (ppm) 138.96 (ipso), 138.39 (ipso), 137.64 (ipso),
129.14-126.26 (Ar-C), 101.50, 99.48, 82.37, 79.42, 78.83, 75.57, 74.02, 69.30, 62.56, 55.58;
MS: (___) (data in accordance with reference36
)
DATA [10]: Rf (EtOAc/pentane 1:2): 0.54; 1H-NMR: δ (ppm) 7.40-7.31 (m, 15H, 15 Ar-H),
5.03 (d, J = 11.6 Hz, 1H, CH2-Ph), 4.81-4.55 (m, 6H, 5 CH2-Ph + H-1), 3.83 (t, J2,3 ≈ J3,4 ≈
9.2 Hz, 1H, H-3), 3.76-3.71 (m, 3H, H-5 + H-6a + H-6b), 3.63 (t, J3,4 ≈ J4,5 ≈ 9.2 Hz, 1H,
H-4), 3.57 (dd, J1,2 = 3.2 Hz, J2,3 = 9.6 Hz, 1H, H-2), 3.42 (s, 3H, OCH3), 2.51 (br s, 1H, 4-
OH); 13
C-NMR: δ (ppm) 139.14 (ipso), 138.38 (ipso), 138.34 (ipso), 128.84-127.90 (Ar-C),
98.45 (C-1), 81.78, 79.93, 75.68, 73.85, 73.41, 71.00, 70.30, 69.80, 55.52; MS: (___) (data
in accordance with reference37
)
36
1H-NMR from: Elhalabi, J.; Rice, K. G., Carbohydrate Research, 2001, 335, 159-165
37 NMR from Elhalabi, J.; Rice, K. G., Carbohydrate Research, 2001, 335, 159-165