In Vitro Razmnozavanje

Materijali I metode: Prunus dulcis je izabran kao referentna vrsta (Rugini and Verma, 1983)I odnos mineralnog materijala oraha izmedju dve vrste koristen je kao murashigov I skugov posrednik (MS) korektivni factor mineralnog sastava (Murashige and Skoog, 1962). Ovaj je pristup uzeo u obzir znacaj sastava semena kao polazne tacke za formulisanje kulture posrednika, ali je predlozio orudje za balansiranje sastava posrednika sto je bolje moguce sa zahtevima somatskog rasta tkiva. Mineralni sastav (mikro I makroelemenata) procenjen je sa induktivno spojenom plazma-atomskom spektrometrijom emisije VARIAN S.p.A.(VISTA MPXnasilna konfiguracija) primenjenom na sveze lisce I sirovo seme uzoraka badema (Prunus dulcis) I oraha (Corylus avellana) prikupljenih u vocnjacima Virtebra (Centralna Italija). Procedura za razvoj novih posrednika bila je kao sto sledi: odredjivanje anjona I katjona MS slanog posrednika; procena odnosa koncentracija mineralnih elemenata iz orahovih I bademovih semena (Faktor korekcije); Koriscenje faktora korekcije za proracunavanje kolicine anjona I katjona I za procenu novih koncentracija soli; kolicina KI (kalijum jod) je bila nepromenjena, dok je kolicina kalijuma u KH2PO4 izracunata nakon fosforastosti.Nova formulacija bila je modifikovani MS posrednik, koji nazivamo HM indukcijom, dopunjenom vitaminima MS, 200 mgL1mio-inozitola as kao sto su prodloziliNas and Read (2004), giberelinske A3(GA3) 0.4 mgL1, indol-3-buterna kiselina (IBA) 0.05 mgL1, 3% saharoze, I BA (0.5 mgL1).Eksplant izvor: Kultura tkiva pokrenuta je koriscenjem uninodalnih izdanaka eksplanata (1cm duzine) prikupljenih od biljaka iz saksije. Biljke su bile dve godine stare I dobijene su od ukorenjenih mladica 6 italijanskih sorti (Tonda Romana, iz Latiuma; Tonda Giffoni, Avellana Speciale, i Mortarella iz Kampani; Napoletanedda and Ghirara iz Sicilije) u ex situ kolekciju lesnika lociranoj u Viko Matrinu (Viterbo, Centralna Italija). Mladice su posadjene u februaru 2003. godine I rasle su u plasticnim posudama precnika 30cm koje su sadrzale glinu, pesak I treset u razmerama 1:1:1. Posadjene biljke, koristene kao "majke", odrzavane su u zdravom stanju pod prirodnim svetlom I periodicno su djubrene, orezivane, I tretirane fungicidima.

Procedura sterilizacije: Primarni eksplanti oprani su vodi iz cesme (1h), dezinficirani antibakterijskim sapunom I isprani vodom. Sterilizacija je vrsena potapanjem u 70% etanol na 5 sekundi. Posle isecanja bazalnih krajeva, eksplanti su povrsinski sterilisani sa 0.05% Natrijum mertiolatom (CgHgHgNaO2S Carlo Erba) 10 minuta, dodato je nekoliko kapi Tween-20 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Njemacka), a onda su eksplanti isprani u sterilnoj, destilovanoj vodi tri puta ( 5 sekundi svaki put). Natrijum hipohlorit (1/5 v/v) na 10 minuta I par kapi Tween-20 koristeni su samo za eksplante prikupljene preko zime. Pre kalemljenja na kulturnog posrednika, bazalni krajevi svakog eksplanta su obnovljeni zarad apsorbcije hranljivih materija.Osnivanje in vitro kulture I oziljavanje: Uninodalni eksplanti su sakupljani u dve razlicite fizioloske faze biljke; rapidnog rasta I u fazi mirovanja ( prolece I leto) I kalemljeni na HM pocetnog posrednika. U drugoj subkulturi, BA (1.5 mgL1) ili zeatin (1 mgL1) je dodat posle autoklavacije na HM da se podstakne proliferacija. Ziljenje je stimulisano sa: 1) potapanjem krajeva bazalnih izdanaka u IBA rastvor (1 mgL1) u trajanju od 20 sekundi I 20-d kulture na HM posredniku bez hormona ili 2) Jednomesecna kultura na 1/3 HM suplementu mineralnog sadrzaja sa IBA (2 mgL1). Kao sto su predlozili razliciti autori, redukcija koncentracije minerala posrednika moze povecati procenat ziljenja. Posrednici su prilagodjeni na pH 5.7 pre dodavanja 0.7% agra I autoklavacije na 121 u trajanju od 20 minuta. Biljke su uzgajane u komorama za uslovljeni rast na 25 1 C sa sesnaestocasovnim fotoperiodom (32 molm2s1 hladno bela fluorescentna osvetljenost) I 70-80% relativne vlaznosti. Trideset mililitara posrednika je distribuisano u staklene test tube (12cm duzine I precnika 3cm) sa plasticnim poklopcima.Eksperimentalni dizajn: Sto pomocnih uninodalnih pupoljaka svake sorte lesnika su uzgajani u zasebnim staklenim test tubama koje su sadrzale 30 ml posrednika. Na deset replikacija (test tuba) svake sorte je nasumice primenjen svaki od tretmana. Na kraju subkulture (30 d) izmereni su: duzina izdanaka, broj pomocnih pupoljaka I tezina svezih I suvih izdanaka. Izgled biljaka je odokativno ocenjen. Eksperiment je ponovljen jednom. Podaci za eksplante u kulturnim posudama su podeljeni sa brojem eksplanata, I podrazumevana duzina izdanaka I broj pomocnih pupoljaka su korisceni za statisticku analizu. Statisticka analiza je dovrsena koriscenjem SPSS (13.0; SPSS, Chicago): deskriptivna analiza I opsti linearni model multivarira na P 0.05.

Rezultati I diskusije:Pregled posrednika lesnikaTabela 1 sadrzi koncentracije makro I mikroelemenata u lesniku I bademu I u liscu. Razlike su pronadjene za koncentracije B, Ba, Mn, Cu, Si, i Sr, sto ukazuje na vece vrednosti u lesniku nego u bademu. Sa druge strane Fe I Zn su pokazali manje koncentracije u lesniku. Mobdilen nije pronadjen jezgru I liscu niti lesnika, niti badema. Medju makroelementima Ca I Mg bili su konstantno nizi u Corylus avellana nego u Prunus dulci. Novi posrednik HM, razvijen na bazi ovih razlika, pokazan je u tabeli 2. U odnosu na MS, HM pokazuje nize koncentracije CaCl2, MgSO4, KH2PO4I ukljucuje K2SO4, koji izostaje iz MS I NMR. Medju mikroelementima, B je povecan u formi H3BO3i Mn u formi MnSO4. Sa druge strane koncentracije Zn u HM su se smanjila na 1:4 u odnosu na MS I NMR posrednike. Saharoza je izabrana kao izvor ugljenika, iako su prethodni eksperimenti pokazali pozitivne efekte na elongaciju izdanaka lesnika glukoze I fruktoze; izdanci sa dobrim opstim izgledom I rastom su takodje posmatrani u dodatku posrednika sa laktozom. Slicne rezultate su prijavili I Yu i Reed (1993) kod lesnika ali je alternativni izvor ugljenika u saharozu je poboljsao rast I stopu umnozavanja u ovoj I tri druge vrste.Faza kalemljenja: Trenutna ogranicenja mikropropagacije lesnika pridaju se ne samo smanjenom morfogenetickom kapacitetu eksplanata, vec I kontaminaciji pronadjenoj u biljnom materijalu. Damiano et al. (2005) prijavio je da 95% eksplanata mogu biti inficirani, sto ogranicava prednosti in vitro kulture. Prednost biljaka "majki" gajenih u saksijama je olaskana sterilizacija zbog smanjene endokontaminacije u pocetnom biljnom materijalu. Koriscenje ovih biljaka kao pocetnih eksplanata, procenat kontaminacije je smanjen za priblizno 20-30% u poredjenju sa materijalom prikupljenim direktno sa polja. Pupoljci su se cinili izuzetno osetljivim na preparate za sterilizaciju I pokazali su nekrozu tkiva. Fenomen je ocigledan u biljkama koje aktivno rastu. U ovom slucaju, natrijum-mertiolat se pokazao kao efektivniju nego natrijum-hipohlorit, zato sto je u mogucnosti da prodre u celiju bez izazivanja nekroze. Stavise, prema nasim rezultatima, izolovani pupoljci su pogodniji za uspostavljane in vitro vrsta lesnika koje miruju; procenat zdravih eksplanata je bio visi u pojedinacnim pupoljcima nego u uninodalnim eksplantima. Isto glediste su prijavili Messeguer i Mele (1987) za in vitro uspostavljanje spanskog cv. Negreta. Uklanjanje spoljasnjih listica pre kalemljenja olaksava razvoj eksplanata tako sto smanjuje nekrozu tkiva posle sterilizacije( cak I do 25% u odnosu na cele pupoljke). Damiano et al. (2005) je prijavio da je jedna od najvecih poteskoca kod in vitro kulture lesnika nekroza pupoljaka posle kalemljenja. Sa druge strane, tretman sa niskim temperaturama poboljsao je in vitro morfogeneticke kapacitete "uspavanih" materijala. Cuvanje lesnikovih grancica na 5 C u periodu od skoro tri nedelje, pre sterilizacije, prouzrokovao je 50% sterilnih izdanaka umesto 30% za netretirane materijale, duzno efektu hladnoce na kontaminaciju endogenim patogenima.Uspostavljanje kulture: Odgovor na nove posrednike sest vrsta lesnika pokazan je u tabeli 4. Eksplanti gajeni na HM pokazali su zeleno obojeno lisce I relativno malo kvrga na njihovim bazalnim krajevima. Eksplanti gajeni na MS su obicno hloroticni I skoro da nisu proizveli kvrge na bazalnim krajevima. Uopsteno, sve sorte su slicno rangirane po pitanju duzine izdanaka I broju pomocnih pupoljaka po izdanku na dva posrednika. Ipak, znacaja interakcija srestva x genotipa( ovaj deo uopste ne znam sta znaci) pokazala je da kada je posrednik pogodan, duzina I broj pupoljaka po izdanku su povecani. Stavise, kvalitet biljaka se povecao zbog pozitivnog efekta posrednika na tezinu svezih I suvih izdanaka. Proliferacija izdanaka je odsutna na oba posrednika, kao sto su prijavili Nas i Read (2004). Ipak, kulturni posrednik je uticao na ratu potencijalnog razmnozavanja; duzi izdanci su pogodniji za sledece kalemljenje. Fizioloska faza eksplanata uticala je na duzinu izdanaka cvs. Tonda Giffoni i Tonda Romana, koji su pokazali razlike u rastu izmedju eksplanata sakupljenih u prolece I zimu I koji su kalemljeni na HM pocetnog posrednika. Sa druge strane cvs. Mortarella, Ghirara, Avellana Speciale, and Napoletanedda su pokazali slicno izduzivanje izdanaka koristeci dve vrste eksplanata. U osnovi sve sorte diferencirale su najveci broj pomocnih pupoljaka kada je kultura pocinjala od eksplanata prikupljenih u prolece. Razlike medju regulatorima biljnog rasta u tkivima C. avellana prikupljenih u razlicitim periodima godine, prijavili su razliciti autori (Rodriguez et al., 1991;Rodriguez i Sanchez-Tams, 1986). Tkiva lesnika u periodu aktivnog rasta pokazala su velike kolicine indol-3-sircetne kiseline I totalne citokinine, koja poboljsava I olaksava in vitro organogenezu. Znacajne razlike su pronadjene za interakciju sezonskih x genotipa u pomocnom broju izdanaka.