In vitro Kulturtechniken für gartenbauliche Kulturen als ... · (Msc projectL. Subh) Solanum...
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In‐vitro‐Kulturtechniken für gartenbauliche Kulturen als Basis für Vermehrung, Züchtung und Biotechnologie
Traud Winkelmann
Leibniz Universität Hannover, Institut für Gartenbauliche Kultursysteme,
Abteilung Gehölz‐ und Vermehrungsphysiologie
TUM Hans Eisenmann Zentrum 18.05.2017
• Einführung in In‐vitro‐Kulturtechniken
• Anwendungsgebiete und wirtschaftliche Bedeutung
• Probleme und Limitierungen
• Somatische Embryogenese bei Cyclamen persicum
• Endophytische Bakterien in der pflanzlichen In‐vitro‐Kultur: Feind oder Freund?
• Zusammenfassung und Ausblick
Inhalte
218.05.2017 Traud Winkelmann
• Pflanzenzüchtung: genetische Weiterentwicklung von Pflanzen für menschliche Nutzung
– Kreuzungen, Selektion, Mutationszüchtung, Gentechnik, Genome editing
– In‐vitro‐Kulturtechniken unterstützen
• Pflanzenvermehrung: Basis für Pflanzenproduktion, Bereitstellung von gesundem Pflanzenmaterial
– Generative Vermehrung: Samen
– Vegetative Vermehrung:
• Teilung, Stecklinge, Abrisse, Zwiebeln, Knollen…
• Veredlungen
• In vitro‐Vermehrung
In-vitro-Kulturtechniken
318.05.2017 Traud Winkelmann
Etablierung von Dionaea muscipula
418.05.2017 Traud Winkelmann
1. Explant donor plant
2. Explant type: leaf explant
3. Medium: ½ MS + 4.6 µM kinetin
4. Surface disinfection
Sterilisationsmittel Konzentration Sterilisationsdauern
Genotyp ‘Grün‘
NaOCl
1 % 3 min 20 1 % 6 min 20 1 % 10 min 33 6 % 4 min 30
NaDCC 1 g/l 1 h 27 5 g/l 10 min 51 5 g/l 20 min 53
Mahnkopp (2013)
pH: ca. 12
pH: ca. 5,8
518.05.2017 Traud Winkelmann
Mahnkopp (2013)
Etablierung von Dionaea muscipula
Vermehrung von Dionaea muscipula
618.05.2017 Traud Winkelmann
Mahnkopp (2013)
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4
Prop
agation rate
Culture passage no.
n = 16 n = 10n = 20n = 6
I = s
a a
b
c
Culture passage: 8 weeks
Akklimatisierung von Dionaea muscipula
718.05.2017 Traud Winkelmann
Mahnkopp (2013)
01020304050607080
1 2 3 4 5 6 7
Akklimatisierung Weiterkultur
Substrate coverage (%
)
12
Weeks after transferto the greenhouse
I = s
Repetition
n = 97
n = 80
acclimatization acclimatization
In-vitro-Vermehrungswege
826.04.2016 Traud Winkelmann
George et al. (2008)
90-95 %
8
Kultursysteme
18.05.2017 Traud Winkelmann
• Kultur auf Festmedium+ Hohe Pflanzenqualität‐ Verfestigungsmittel: teuer‐ Begrenzte Anzahl von Pflanzen/Gefäß, Kulturregal…
10
• Kultur in Flüssigmedium+ Einfache Handhabung+ Schnelles Wachstum und Vermehrung+Möglichkeit des „Upscaling“ und der
Automatisierung‐ Physiologische Störungen‐ Hohes Kontaminationsrisiko
Foto: S. Richartz
• TIS = Temporäre Immersionssysteme+ Hohe Pflanzenqualität+ Schnelles Wachstum und Vermehrung+Möglichkeit des „Upscaling“ und der
Automatisierung‐ Hohes Kontaminationsrisiko‐ Technische Ausstattung notwendig
Different plant species tested in the Plantform TIS
1118.05.2017 Traud Winkelmann
Courtesy Margareta Welander
Echinacea Raspberry
RhubarbBirch
Blue‐berry
Foto: Lukas Rollwage
(Winkelmann et al. 2006, PCTOC 86: 319-327)
4,575
2,5643,441
33,543
3,605
48,901
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Prod
uctio
n [m
illio
n pl
ants
]
Year
Small fruits
Woody plants
Perennials incl. aquatic plants
Orchids
Other ornamental plants
Total
Kommerzielle In-vitro-Produktion in Deutschland
1218.05.2017 Traud Winkelmann
• Vermehrung hochpreisiger Pflanzen
• Gewinnung krankheitsfreier Pflanzen durch Meristemkultur
• Unterstützung der Pflanzenzüchtung
– Doppelhaploide
– Regeneration als Basis für Mutationszüchtungund genetische Transformation
– Embryo rescue Techniken nach Artkreuzungen
– Lagerung von genetischen Ressourcen
– Protoplastentechniken
Anwendungsgebiete
1318.05.2017 Traud Winkelmann
meristematic dome
meristem tip
Jansen et al. (1984)
www.hark‐orchideen.de
• Genotypische Unterschiede
• „Abbau“ von Kulturen
• Hyperhydrizität/Glasigkeit
• Endophyten
• Kontaminationen
• Phenole
• Somaklonale Variation
• Hoher Bedarf an Handarbeit (50‐80 % der Kosten)
18.05.2017 Traud Winkelmann
Probleme und Limitierungen
17
Olmos, et al. (1998), ScientiaHorticulturae 75, 91‐101
Zygotische Embryogenese
1518.05.2017 Traud Winkelmann
1. Asymmetric division of the zygote
2. Pattern formation in the globular embryo
3. Transition to cotyledonary stage with root and shoot primordia
4. Maturation (storage protein incorporation)
Embr
yoge
nesi
s se
nsu
stric
tu
Lau and Jürgens,MPI Tübingen
Xiang et al. (2011)
Zygotische versus somatische Embryogenese
1618.05.2017 Traud Winkelmann
Dodeman et al. (1997)
Induction(auxin/stress)Asymmetricdivision
Competent cells + dedifferentiation
Endosperm
Suspensor
Dormancy,timing and extentof storage proteinsynthesis
Cyclamen (Cyclamen persicum)
1718.05.2017 Traud Winkelmann
• Wichtige blühende Zierpflanze
• Produktion– Deutschland: 25 Mio. Pfl./a– Weltweit: ca. 200 Mio. Pfl./a
• Samenvermehrt• Hohe Saatgutpreise
(0,05‐0,20 € pro Samen)• Interesse an vegetativer
Vermehrung• In vitro über somatische
Embryogenese
www.goldsmithseeds.com
www.schoneveld.nl
Somatische Embryogenese bei Cyclamen persicum
1818.05.2017 Traud Winkelmann
bar = 0.5 cm
Induction of embryogenic cells/cultures
Conversion
Differentiation (A) and germination (B) of somatic embryos
A B
A
Cell growth(solid or liquid culture)
embryogenic
non ‐embryogenic
Schwenkel and Winkelmann (1998) Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 4 (1): 28 ‐ 34
½ MS-medium 2.0 mg/l 2,4-D; 0.8 mg/l 2iP
½ MS-medium 2.0 mg/l 2,4-D; 0.8 mg/l 2iP
hormone-free½ MS-medium
Anwendungen - Vermehrung
1918.05.2017 Traud Winkelmann
1. Propagation of parental lines of F1 hybrids(numbers needed: ~ 1,000)
2. Propagation of sterile interspecifichybrids (‘Odorella‘)(numbers needed: ~ 500,000)
3. Mass propagation of single elitegenotypes, artificial seed
Winkelmann et al. (2004b) HortScience 39 (5): 1093‐1097
Anwendungen - Züchtung
2018.05.2017 Traud Winkelmann
1. Long‐term storage of germplasm:
cryopreservation of embryogenic culturespre‐culture (2‐4 d 0.6 M sucrose)pre‐treatment (1 h 0.6 M sucrose+10 % DMSO
2. Protoplast technology:
Somatic hybridisation with wild Cyclamen species: embryogenic cultures asstarting material for protoplast isolation
Regeneration protocols available forC. persicumC. coumC. graecumC. alpinum
Winkelmann et al. (2004a) Plant Cell Rep. 23 (1‐2): 1‐8
Foto: V. Mussmann
Winkelmann et al. (2006) PCTOC 86: 337‐347Prange et al. (2010) PCTOC 101:171–182
Anwendung: Genetische Transformation
2118.05.2017 Traud Winkelmann
• Agrobacterium tumefaciens‐mediatedtransformation of embryogenic callus
• Auxin‐reporter construct DR5::GUS• First transgenic somatic embryos
– Comparison of auxin content and distribution in somatic andzygotic embryos
Samuel Breselge BSc thesis (2013)
Arabidopsis thalianazygotic embryos somatic embryos
Cyclamen persicum somatic embryos
Bassuner et al. (2007)
Begrenzungen
2218.05.2017 Traud Winkelmann
• Genotypic differences in regenerationability and regeneration efficiency
• Asynchronous formation anddevelopment of somatic embryos
• Malformations/ fused somatic embryos• Precocious germination• Loss of embryogenic competence• Secondary somatic embryos
Insights in physiology ofembryogenesis(transcriptomics/proteomics) needed
Model = zygotic embryo
Photos by S. Ratjens and fromHoenemann et al. (2010)
Proteomischer Vergleich
2318.05.2017 Traud Winkelmann
1mm
1cm
1cm1mm
Zygotic embryos Somatic embryos
240 embryos in torpedostage (80 mg)
PhD project Christina Rode
2418.05.2017 Traud Winkelmann
zygotic embryo somatic embryo
>1.5 in SE
>1.5 in ZE1,013 spots in total
137 spots higher abundant in zygotic embryos
109 spots higher abundant in somatic embryos
300 eluted spotssubmitted to MS, 261 with > 1 identifiedprotein (= 87 %)
Differentiell abundante Proteine
2518.05.2017 Traud Winkelmann
somatic embryo
Rode et al. 2011aPlant Mol Biol 75: 305‐319
Enolasen
2618.05.2017 Traud Winkelmann
• Functional enzyme for glycolysis/gluconeogenesis and fatty acid biosynthesis• „Small“ Enolases highly abundant in zygotic embryos
(MW 1/2‐1/3 of functional protein)• Novel seed storage proteins?• Recycling of amino acids? Rode et al. 2011a
Plant Mol Biol 75: 305‐319
Behandlung mit Abscisinsäure (ABA)
2718.05.2017 Traud Winkelmann
Rode et al. (2012) Planta 235: 995‐1011
‐ ABA: proteins of primary metabolism and stress response higherabundant
+ ABA: storage proteins, HSP 70
Metabolitprofile
2818.05.2017 Traud Winkelmann
In colaboration with K. Niehaus, University Bielefeld; GC‐MS
• Extraction from 10 to 20 mg tissue (80% methanol, ribitol as internal standard)• Metabolites derivatized with 75 µL of methoxylamine hydrochloride in pyridine • GC‐MS analysis: TraceGC gas chromatograph coupled to a PolarisQ ion trap MS • Identification by comparison to standards and the NIST 2005 database • Relative levels of selected metabolites determined by Xcalibur 1.4 software
Testa Endosperm Zygotic embryo Somatic embryo
Winkelmann et al. 2015Front. Plant Sci. 6:597
Metabolitprofile
2918.05.2017 Traud Winkelmann
ZE: Proline Serine Sucrose
SE: Asparagine Galactose Myo‐Inositol
Winkelmann et al. 2015Front. Plant Sci. 6:597
Forschungsarbeiten
3018.05.2017 Traud Winkelmann
Zygotic embryogenesisSomatic embryogenesis
• Proline?
• Oxygen
• ROS?
• PCD?
• Overexpression/silencing of keygenes
• ROS?
• PCD?
• Metabolites, phytohormones andnutrients
Scheme by S. RatjensPhotos from Hoenemann et al. (2010)
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Blick auf Endophyten
Positive impact on plants in vivo Synthesis of phytohormones Increase of nutrient availability Induced resistance to pathogens
But: Endophytes frequently turn detrimental in in vitro cultures growth inhibition, loss of viability
Phalaenopsis(Msc project L. Subh)
Solanum Helleborus
18.05.2017 Traud Winkelmann
PhD project Mona Quambusch
“All organisms inhabiting plant organs that at some time in their life, can colonize internal plant tissues without causing apparent harm to the host”(Petrini, 1991)
Fast growing hardwood for the production of high quality furniture.
Breeding goals: straight stem, good wood quality, fast growth.
Single trees with a good habitus were selected and propagated in vitro (trademark: silvaSelect®).
Genetic diversity in the forest achieved by using a mixture of 18 Prunus avium genotypes.
Genotypes propagated by the IFP (Institut für Pflanzenkultur), cooperation partner of this project.
32
Forschungsobjekt: Prunus avium
18.05.2017 Traud Winkelmann
PhD project Mona Quambusch
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Pflanzenmaterial
18.05.2017 Traud Winkelmann
Prunus avium genotype Propagation success in vitro Pictogram
Fama, Achilleus poor −
Asteria, Apollo variable/ fluctuating ±
Neptun, Demeter good +
Losses depending on genotypes:20‐70 % 30‐60 %
PhD project Mona QuambuschRole of endophytic bacteria?
Identifizierung von Bakterien
Culture‐dependent approach
Culture‐independent approach
DNA extracted from plant material DNA from bacterial isolates
3418.05.2017 Traud Winkelmann
PhD project Mona Quambusch
35
DNA extracted from in vitro plant material of propagationphase
Primers used: 799f and 1492r. (Chelius and Triplett, 2001)
PCR on 16S rDNA
Identifizierung von Bakterien
bacterial amplicon, mitochondrial amplicon* Indicates amplicons used for cloning and ARDRA
±± + +‐‐
18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch
36
Identification of bacteriaAmplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)
Restriction patterns of 95 bacterial 16S rDNA fragments of a plant sample of Neptun (+).
18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch
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Identifizierung von BakterienResults of culture‐independent analysis
Endophytic population of four Prunus avium genopytes
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Fama ‐ Achilleus ‐ Neptun + Demeter +Relativ
e prop
ortio
n of clone
s
Prunus genotype
Rhodopseudomonas spp.
other α‐Proteobacteria
Microbacterium spp.
Mycobacterium spp.
uncultured bacterial clone
18.05.2017 Traud Winkelmann
Quambusch et al. (2014) Tree Physiol. 34: 524–533
Identifizierung von Bakterien
38
Growth media: nutrient agar and medium #523 (Viss et al, 1991) Cultivation at RT for 5 weeks
Isolation of bacterial endophytesPlant material Pure culture
Nep
tun +
Asteria
±De
meter +
Gen
otypes no
bacteria
18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch
Identifizierung von Bakterien
39
Classification of bacterial isolates by 16S rDNA sequences
Isolate Isolated from Identified as* Length[bp] % Identity* # of isolates
F‐I‐3 Fama (‐) Acinetobacter junii 1441 100 1
301‐3 Fama (‐) Bacillus sp. 1452 100 1
E 78‐1 Fama (‐) Kocuria palustris 1398 100 1
E 74‐1 Achilleus (‐) Pseudomonas sp. 1441 99 1
A 1‐4 Achilleus (‐) Bacillus sp. 1453 100 29
C 43‐4 Apollo (±) Variovorax sp. 1440 99 1
210‐1 Asteria (±) Micrococcus sp. 1402 100 1
N‐I‐1 Neptun (+) Mycobacterium sp. 705 99 1
N‐I‐2 Neptun (+) Rhodopseudomonas sp. 1391 99 3
D‐I‐3 Demeter (+) Bacillus licheniformis 1449 100 1
D‐I‐1 Demeter (+) Microbacterium testaceum 1398 99 2
18.05.2017 Traud Winkelmann PhD project Mona Quambusch
40
Inokulationsexperiment
Effect on rooting three weeks post inoculation
Experimental design Two genotypes: Fama(–) and Achilleus (–) Inoculation with N‐I‐2 (Rhodopseudomonas) and D‐I‐1 (Microbacterium) 5 min treatment with bacterial suspension in 10mM MgSO4
Evaluation of rooting after two and three weeks
0
20
40
60
80
100
Fama Ach
Rooting [%
]
Control
N‐I‐2
D‐I‐1
***
0
2
4
6
8
10
12
Fama Ach
Num
ber of ro
ots
Control
N‐I‐2
D‐I‐1
**
**
*
n = 8 vessels with 5 plants each; asterisks indicate significant differences to control treatment (Dunnett Test) (p ≤ 0.05*, 0.01 ** und 0.001 *** )
18.05.2017 Traud WinkelmannQuambusch et al. (2014) Tree Physiol. 34: 524–533
41
Quantifizierung von EndophytenqPCR on 16S rDNA ofMycobacterium spp. with genus specific primers
18.05.2017 Traud Winkelmann Quambusch et al. (2016), PCTOC
Detection sensitivity: Mycobacterium spp.: 0.1 fg in 10 ng DNA (30 plasmid copies)Microbacterium spp.: 100 fg in 10 ng DNARhodopseudomonas spp: 1 fg in 10 ng DNA
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Offene Fragen
1. Welche Effekte haben Endophyten in vitro (Nährstoffverfügbarkeit,Phytohormone, indirekte Effekte)?
2. Welchen Ursprung haben die Endophyten in In‐vitro‐Kulturen?
3. Welche Faktoren bestimmen die Endophytengemeinschaften in In‐vitro‐Pflanzen und wie lassen sie sich steuern?
18.05.2017 Traud Winkelmann
• Das enorme Potential pflanzlicher In‐vitro‐Kulturtechniken ist bei weitem nicht ausgeschöpft.
• Abbildung „natürlicher“ Bedingungen könnte helfen, die Limitierungen der somatischen Embryogenese zu überwinden.
• Endophytische Bakterien in pflanzlichen In‐vitro‐Kulturen sollten im Detail untersucht werden auch unter Anwendung neuer Sequenzierungsmethoden, um stabile, dem Vermehrungsziel dienliche bakterielle Gemeinschaften zu erreichen.
• Ein besseres Verständnis der genetischen Basis des Regenerationsvermögens ist notwendig.
• Forschungsbedarf zur Automatisierung
• Revival der Bedeutung von In‐vitro‐Kulturtechniken als Basis für die Anwendung von Genome Editing (CRISPR/Cas9).
Zusammenfassung und Ausblick
4318.05.2017 Traud Winkelmann
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AcknowledgementsMona QuambuschMelanie BartschKristin HallerJane Brümmer
Institut für Pflanzenkultur (IFP)Carolin SchneiderMatthias Döring
University of Oulu, FinnlandAnna Maria Pirttilä
18.05.2017 Traud Winkelmann
Christina RodeMelanie BartschSvenja RatjensJenniffer MwangiSamuel BreselgeCathleen Neitsch
Hans‐Peter Braun (LUH)
Hardy Rolletschek (IPK Gatersleben)Henning Tschiersch (IPK Gatersleben)Karsten Niehaus (Universität Bielefeld)