Implementacion y Estandarizacion de Diversas Tecnicas as Para Su Aplicacion en Estudios Experiment...
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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICA ESCUELA DE BIOLOGÍA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
INFORME DE TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAR POR EL GRADO DE BACHILLER EN BIOTECNOLOGÍA
IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVERSAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN EN
ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE RATA.
ADRIANA J. SABORÍO ARCE
PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN EN NEUROCIENCIAS
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
CARTAGO, 2008
INSTITUTO TECNOLÓGIC
INGENIERÍA EN BIOTEC
INFORME DE TRABAJOPOR EL GRADO DE BACH
IMPLEMENTACIÓN Y ESTTÉCNICAS HISTOLÓGICA
ESTUDIOS EXPERIMENTA
ADRIANA
PROGRAMA DE UNIVERSIDAD DE COSTA
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICAESCUELA DE BIOLOGÍA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAPOR EL GRADO DE BACHILLER EN BIOTECNOLOG
IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVETÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN
ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE
ADRIANA J. SABORÍO ARCE
PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN EN NEUROCIENCIAS
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
CARTAGO, 2008
O DE COSTA RICA
GRADUACIÓN PARA OPTAR ILLER EN BIOTECNOLOGÍA
ANDARIZACIÓN DE DIVERSAS S PARA SU APLICACIÓN EN LES CON CEREBRO DE RATA.
ROCIENCIAS
IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVERSAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN EN ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE RATA
Informe presentado a la Escuela de Biología del
Instituto Tecnológico de Costa Rica como requisito parcial
para optar por el título de Bachiller en Ingeniería en Biotecnología.
Miembros del Tribunal
______________________________ Jaime Fornaguera Trías, Ph.D.
Profesor asesor
______________________________ Maritza Guerrero Barrantes, MSc.
Profesora asesora
______________________________ Giovanni Garro Monge, MSc.
Lector
“Toda obra grande es el resultado de una gran pasión
puesta al servicio de una idea”
- Santiago Ramón y Cajal
i
IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVERSAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN EN ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE RATA
Adriana J. Saborío Arce 1
En el Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica se realizan estudios conductuales y neuroquímicos sobre ciertas enfermedades neurodegenerativas que involucran ratas albinas como animales de experimentación. La introducción de protocolos estandarizados de corte y tinción de tejidos por medio de métodos y sistemas biotecnológicos específicos, resulta fundamental para el estudio, la investigación y el análisis cuidadoso del cerebro de estos roedores. Esto permitiría entender los cambios funcionales y estructurales ocurridos en ellos bajo ciertas condiciones y al mismo tiempo permite la comparación entre diferentes grupos experimentales sometidos a condiciones diversas. El objetivo de esta investigación fue implementar varias técnicas de corte y tinción de cerebros de rata para el reconocimiento de regiones tanto sanas como disfuncionales. Para ello, se estandarizó un protocolo para el corte de las muestras utilizando el criostato Leica CM3050 S, y se definieron varios criterios: los cerebros de rata deben trabajarse a una temperatura de -26ºC, cortarse a una velocidad de 42 mm/s y deben tener un grosor mínimo de 25µm. Además, se desarrollaron protocolos de tinción de estos cortes utilizando los colorantes Azul de Metileno, Cresyl Fast Violet, Hematoxilina y Eosina, y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet, los cuales permitieron la visualización microscópica de algunas estructuras presentes en los cortes cerebrales. Se logró además identificar diferentes tipos de células nerviosas y de la neuroglia en regiones de interés (hipocampo, sustancia nigra, etc.). Por último, y para resaltar una de las aplicaciones de los protocolos desarrollados, se realizó una evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de Parkinson y se logró determinar el punto exacto de llegada de una cánula, introducida unilateralmente en el cerebro de ratas macho de la cepa Sprague Dawley.
Palabras clave: Criostato, Azul de Metileno, Cresyl Fast Violet, Hematoxilina, Eosina, Luxol Fast Blue, Sprague Dawley
1 INFORME DE TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAR POR EL GRADO DE BACHILLER EN BIOTECNOLOGÍA, Escuela de Biología, Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica. 2008.
ii
Dedicatoria
A mis queridos padres por su apoyo y confianza en mis años de estudio,
A mi hermano, por siempre estar ahí para mi y alentarme en todo momento,
A mi abuela Anita, por sus consejos durante toda su vida.
iii
Agradecimientos
La autora desea expresar su agradecimiento a las siguientes personas y/o instituciones
por sus valiosos aportes en el desarrollo de esta investigación:
A Dios, por darme la vida, por brindarme salud y fortaleza en cada momento, y por
las personas que puso en mi camino.
A mis padres, Licda. Virginia Arce Cortés y Lic. Arturo Saborío Alfaro; por su mejor
herencia: mis estudios.
Al Dr. Jaime Fornaguera Trías, director del Programa de Investigación en
Neurociencias (PIN) de la Universidad de Costa Rica; por brindarme la oportunidad
de realizar la práctica en el PIN y por su orientación, paciencia y labor de dirección
que emprendió con sabiduría en este proceso.
A la MSc. Maritza Guerrero Barrantes, profesora de la Escuela de Biología del
Instituto Tecnológico de Costa Rica; por su apoyo incondicional, su dirección y
asesoría técnica durante este trabajo.
Al Técnico Médico Juan José Ramírez Aguilar; por consejos y ayuda incondicional
que hicieron posible la presente investigación.
A todas las personas que trabajan en el PIN; por su compañerismo y amabilidad.
A los profesores, amigos y colegas del ITCR; por sus enseñanzas y todos los
momentos inolvidables que hemos vivido.
Finalmente, a todas las personas que se cruzaron en mi camino y que me dieron
palabras de aliento y apoyo para lograr mis objetivos.
iv
Índice General
Resumen ..................................................................................................................................... i
Dedicatoria ................................................................................................................................ ii
Agradecimientos ....................................................................................................................... iii
Índice General .......................................................................................................................... iv
Índice de Figuras ....................................................................................................................... v
Índice de Cuadros ................................................................................................................... viii
Índice de Anexos ...................................................................................................................... ix
Índice de Apéndices .................................................................................................................. x
Introducción .............................................................................................................................. 1
Revisión de Literatura ............................................................................................................... 3
Generalidades del Sistema Nervioso ............................................................................ 3
El cerebro de la rata ...................................................................................................... 6
Las técnicas histológicas .............................................................................................. 8
Colorantes para tejido nervioso .................................................................................. 12
Estudio experimental con cerebro de rata ................................................................... 14
Objetivos: General y Específicos ............................................................................................ 15
Materiales y Métodos .............................................................................................................. 16
Localización del estudio ............................................................................................. 16
Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y grosor en los cortes de cerebros de rata en el criostato .................................................................... 16
Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata ........... 21
Evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de Parkinson .... 24
Resultados ............................................................................................................................... 26
Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y grosor en los cortes de cerebros de rata en el criostato .................................................................... 26
Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata ........... 29
Evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de Parkinson .... 43
Discusión ................................................................................................................................. 49
Conclusiones ........................................................................................................................... 57
Recomendaciones .................................................................................................................... 58
Bibliografía.............................................................................................................................. 60
Anexos ..................................................................................................................................... 64
Apéndices ................................................................................................................................ 67
v
Índice de Figuras Número Título Página
1 Esquema de una neurona y sus partes (Geneser, 2000). 4
2 Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).
6
3 Planos de corte de un cerebro de rata utilizados en estudios histológicos (Paxinos y Watson, 1998).
7
4 Corte coronal de cerebro de rata que muestra la región del hipocampo, en color verde, y de la sustancia nigra, en color morado (Wei, 2007).
8
5 Diferentes tipos de micrótomos utilizados para obtener cortes histológicos (Instrumental Parteur, 2008; Labequim, 2004; Labequim, 2005; Leica, 1996; Leica, 2000).
10
6
Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso (García, 1993).
13
7 Fotografías de cerebros de ratas albinas utilizados durante el trabajo experimental. A) muestra almacenada a temperatura ambiente en una solución fijadora. B) muestra almacenada a -30°C sin solución fijadora.
16
8 Fotografía del criostato Leica CM3050 S utilizado para el corte de los cerebros de rata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.
17
9
Fotografía de una muestra de cerebro de rata albina dentro de la cámara del criostato Leica, modelo CM3050 S. A) muestra montada en la “platina porta-muestras”. B) “bloque de congelación rápida”. C) “termobloque”.
18
10 Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloque” del criostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del tejido en su plano horizontal.
19
11
Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o cubeta con cestillo de vidrio. B) cubeta tipo Coplin.
24
12
Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio histológico de un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se señala con una flecha la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.
25
13 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).
31
vi
Número Título Página
14
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).
31
15 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).
32
16 Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 400X).
32
17 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
34
18
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
34
19 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
35
20
Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).
35
21 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
37
22
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
37
23 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
38
24
Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 400X).
38
vii
Número Título Página
25
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
41
26
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).
41
27
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
42
28
Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).
42
29 Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
44
30 Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la figura 29 (100X).
44
31 Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
45
32 Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la figura 29 (400X).
46
33
Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).
47
34
Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.
48
35
Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.
48
viii
Índice de Cuadros Número Título Página
1
Resultados de la evaluación de la temperatura más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.
26
2
Resultados de la evaluación de la velocidad más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.
27
3
Resultados de la evaluación del espesor más apto para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.
28
ix
Índice de Anexos Número Título Página
1 Panel de mandos del Criostato Leica CM3050 S (Leica, 2000). 60
2 Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con (3-Aminopropyl)- triethoxysilane (Sigma, A3648).
61
3 Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con gelatina (Food Grade-Merck, #1.04078.0500).
62
x
Índice de Apéndices Número Título Página
1 Protocolo para el corte de los cerebros de rata utilizando el criostato Leica CM3050 S.
63
2 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Azul de Metileno (Modificado a partir del protocolo de Rüdeberg (1967)).
64
3 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo de Aldana et al. (1996)).
65
4 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Hematoxilina y Eosina (Modificado a partir del protocolo de Bush (1877)).
66
5 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo de Klüver y Barrera (1954)).
67
6 Resultados y características del tratamiento histológico realizado a los cuarenta cerebros de rata en el estudio de la enfermedad de Parkinson.
68
1
Introducción
La histología es una disciplina morfológica, que se fundamenta en la
observación e identificación de las células y su entorno, el material extracelular, y
sienta las bases estructurales para entender posteriormente las transformaciones que
tienen lugar en condiciones normales y en condiciones patológicas en el organismo
(Geneser, 2000). Existen varios instrumentos, como el microscopio, y otras ramas de
la ciencia, como la bioquímica, la fisiología, la inmunología y la patología, que han
contribuido a ampliar el campo de estudio de la histología, logrando que en la
actualidad se estudie en el contexto de la histoquímica, la histofisiología, la
inmunohistoquímica y la histopatología (Junqueira y Carneiro, 1996). Con la
neurohistología, por tanto, se fusionan todas estas áreas con el fin de permitir el
estudio de los componentes estructurales del sistema nervioso.
La ciencia contemporánea se diferencia de la antigua en la investigación y
elaboración de técnicas con tecnologías cada vez más automatizadas, y en este
aspecto, la biotecnología se visualiza como una expresión conceptual de la ciencia y
la técnica y sus consecuencias en la medicina moderna (Santi, 2006). El curso actual
de la biotecnología pretende dar un panorama general de las técnicas vigentes más
utilizadas, los productos y equipos más precisos, y proporciona un enfoque del
conocimiento y suministro de herramientas que facilitan un mejor estudio, control y
pronóstico en la medicina predictiva y preventiva, y finalmente en el diagnóstico de
enfermedades, junto a la patología (Carson, 1997). Asimismo, los métodos
histológicos son importantes para el estudio de los tejidos y sus componentes
celulares con fines diagnósticos, de enseñanza e investigación (UMSNH, 2007).
En el Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa
Rica se realizan proyectos de investigación conductuales y neuroquímicos, enfocados
en enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson, y que involucran a ratas
albinas como animales de experimentación. Resulta fundamental, por tanto, el
2
desarrollo de técnicas histológicas de corte y tinción con el fin de estudiar lo que
sucede anatómicamente en el cerebro de estos roedores de forma macro y
microscópicamente.
Por lo tanto, el desarrollo de protocolos estandarizados de corte y tinción de
tejidos, en instituciones como la Universidad de Costa Rica, por medio de métodos y
sistemas biotecnológicos específicos, se perfila como una necesidad para el estudio,
la investigación y el análisis cuidadoso de los componentes de las muestras
histológicas, con el fin de obtener un alto porcentaje de éxito, con resultados
replicables, en estudios experimentales que beneficien a la sociedad. Con la presente
investigación se pretenden implementar diversas técnicas de corte y tinción para el
reconocimiento de regiones cerebrales de ratas en el Laboratorio de Histología del
Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.
3
Revisión de Literatura
• Generalidades del Sistema Nervioso
En este estudio es fundamental describir y ubicar los componentes
estructurales más importantes del sistema nervioso; por tanto, seguidamente se
puntualizan algunos aspectos generales al respecto.
En los mamíferos, el sistema nervioso comprende el tejido que recibe
estímulos del medio ambiente, los transforma en impulsos nerviosos, y los envía a
zonas de recepción, donde son interpretados y devueltos a los órganos efectores para
integrar respuestas adecuadas. Estas funciones son llevadas a cabo por las neuronas
que, junto con células de sostén y material extracelular, forman el sistema nervioso
(Leeson y Leeson, 1983).
El sistema nervioso se divide anatómicamente en: a) sistema nervioso central
(SNC), compuesto por el encéfalo y la médula espinal, que están protegidos por
envolturas óseas, que son el cráneo y la columna vertebral respectivamente, y b)
sistema nervioso periférico (SNP), formado por los nervios y los ganglios nerviosos,
que son pequeños agregados de células nerviosas (Junqueira y Carneiro, 1996). La
mayoría de las neuronas de los mamíferos se encuentran en el SNC y, desde el punto
de vista histológico, se caracterizan como un epitelio (tejido formado por una o varias
capas de células yuxtapuestas) muy especializado, dado que las células están
densamente empaquetadas y unidas por contactos celulares frecuentes (sinapsis)
(Geneser, 2000; Leeson y Leeson, 1983).
El tejido nervioso está constituido por dos elementos principales: las neuronas
y la neuroglia. La neurona es la unidad estructural y funcional del sistema nervioso y
consiste en el cuerpo de la célula nerviosa con todas sus prolongaciones (Fig. 1).
Posee características morfológicas típicas que sustenta sus funciones: un cuerpo
celular o soma, que generalmente
prolongaciones citoplasmáticas
relación con el tamaño celular
dendritas (gr. dendrites, á
celular; y la prolongación larga, en forma de cono,
conduce los impulsos desde el soma hacia otra neurona u órgano diana
2000).
Figura 1. Esquema de una neurona
La mayoría de las neuronas tiene un solo axón y suelen tener muchas
dendritas; por lo que las neuronas se pueden clasificar según las cantidad de
prolongaciones que se extienden desde el cuerpo neuronal: la neurona multipolar
tienen un axón y dos dendri
dendrita, y la neurona unipolar o pseudounipolar tiene el axón que se divide cerca del
soma neuronal en dos largas prolongación (Ross
4
generalmente es de forma poligonal, esférico o angular, emite
prolongaciones citoplasmáticas y comprende al núcleo, que es redondo y grande en
relación con el tamaño celular; las prolongaciones cortas ramificadas se denominan
, árboles) y generalmente transmiten impulsos hacia el soma
; y la prolongación larga, en forma de cono, se designa axón (gr.
conduce los impulsos desde el soma hacia otra neurona u órgano diana
Esquema de una neurona y sus partes (Geneser, 2000)
La mayoría de las neuronas tiene un solo axón y suelen tener muchas
dendritas; por lo que las neuronas se pueden clasificar según las cantidad de
prolongaciones que se extienden desde el cuerpo neuronal: la neurona multipolar
tienen un axón y dos dendritas o más, la neurona bipolar posee un axón y una
dendrita, y la neurona unipolar o pseudounipolar tiene el axón que se divide cerca del
soma neuronal en dos largas prolongación (Ross et al., 2005).
o angular, emite
l núcleo, que es redondo y grande en
; las prolongaciones cortas ramificadas se denominan
lsos hacia el soma
(gr. axon, eje) y
conduce los impulsos desde el soma hacia otra neurona u órgano diana (Geneser,
).
La mayoría de las neuronas tiene un solo axón y suelen tener muchas
dendritas; por lo que las neuronas se pueden clasificar según las cantidad de
prolongaciones que se extienden desde el cuerpo neuronal: la neurona multipolar
tas o más, la neurona bipolar posee un axón y una
dendrita, y la neurona unipolar o pseudounipolar tiene el axón que se divide cerca del
5
La neuroglia (gr. glía, pegamento), son células especiales que además de darle
sostén a las neuronas, participan en la actividad neural, en la nutrición de las neuronas
y en los procesos de defensa del tejido nervioso (Junqueira y Carneiro, 1996). En los
cortes histológicos habituales del SNC, las células nerviosas y sus prolongaciones
siempre están rodeadas por pequeños núcleos dispersos pertenecientes a las células de
la glía, de las cuales se establece que en proporción hay, aproximadamente, y
dependiendo de la región, de diez a cincuenta células neuróglicas por cada neurona
(Leeson y Leeson, 1983). De este tipo celular se diferencian los astrocitos (gr. astron,
estrella) que son células con forma de estrella y numerosas prolongaciones
citoplasmáticas, los oligodendrocitos (gr. oligos, pocos) que producen la vaina de
mielina, y la microglia, que son células macrofágicas y forman parte del sistema
mononuclear fagocítico (Geneser, 2000; Leeson y Leeson, 1983).
En el SNC hay cierta separación entre los somas celulares de las neuronas y
sus prolongaciones, lo que hace que se identifiquen en el encéfalo y en la médula
espinal dos partes distintas, la sustancia blanca y la sustancia gris (Geneser, 2000). La
sustancia gris, que se denomina así porque muestra esta coloración cuando se observa
macroscópicamente, está formada por los cuerpos celulares de las neuronas, fibras
amielínicas, y algunas fibras mielínicas, astrocitos protoplasmáticos, oligodendrocitos
y células de la microglia. La sustancia blanca no contiene somas celulares de
neuronas y está constituida por fibras mielínicas, oligodendrocitos, astrocitos fibrosos
y células de la microglia. Su nombre se debe a la presencia de gran cantidad de un
material blanquecino, denominado mielina, que envuelve los axones de las neuronas
(Geneser, 2000; Junqueira y Carneiro, 1996).
• El cerebro de la rata
La experimentación animal
y aclarar fenómenos biológicos sobre
animal de experimentación es una de las piezas
tanto en los proyectos de investigación
controles de los productos farmacológicos
Existen varias razones por las que la rata es el sujeto más selecciona
investigación en neurociencias; entres estas se puede citar que: 1) son individuos con
un tamaño adecuado, es decir, son lo suficientemente pequeños
fácil manipulación en el laboratorio y poseen un cerebro lo suficientemente gr
(Fig. 2) lo que facilita su localización estereotáxica de ciertas áreas cerebrales; 2) son
individuos muy resistentes a las infecciones; y 3)
anatómicas y bioquímicas, similares a las del ser humano, se constituyen
modelos experimentales
Figura 2. Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).
En estudios histológicos, el cerebro de la rata suele cortarse en tres planos
anatómicos principales, a saber: plano coronal, plano sagital y plano horizontal (Fig.
6
El cerebro de la rata
La experimentación animal es una actividad que tiene como misión evidenciar
y aclarar fenómenos biológicos sobre individuos determinados (UMSNH, 2007)
animal de experimentación es una de las piezas fundamentales en la biomedicina,
tanto en los proyectos de investigación, como en las pruebas diagnósticas y en los
controles de los productos farmacológicos (Paxinos y Watson, 1998).
Existen varias razones por las que la rata es el sujeto más selecciona
investigación en neurociencias; entres estas se puede citar que: 1) son individuos con
un tamaño adecuado, es decir, son lo suficientemente pequeños lo que permite su
fácil manipulación en el laboratorio y poseen un cerebro lo suficientemente gr
que facilita su localización estereotáxica de ciertas áreas cerebrales; 2) son
individuos muy resistentes a las infecciones; y 3) por sus características cerebrales,
anatómicas y bioquímicas, similares a las del ser humano, se constituyen
elos experimentales (Paxinos y Watson, 1998).
Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).
estudios histológicos, el cerebro de la rata suele cortarse en tres planos
principales, a saber: plano coronal, plano sagital y plano horizontal (Fig.
una actividad que tiene como misión evidenciar
(UMSNH, 2007). El
fundamentales en la biomedicina,
sticas y en los
Existen varias razones por las que la rata es el sujeto más seleccionado para la
investigación en neurociencias; entres estas se puede citar que: 1) son individuos con
que permite su
fácil manipulación en el laboratorio y poseen un cerebro lo suficientemente grande
que facilita su localización estereotáxica de ciertas áreas cerebrales; 2) son
por sus características cerebrales,
anatómicas y bioquímicas, similares a las del ser humano, se constituyen en buenos
Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).
estudios histológicos, el cerebro de la rata suele cortarse en tres planos
principales, a saber: plano coronal, plano sagital y plano horizontal (Fig.
3), y dependiendo del estudio histológico por realizar así se
corte se debe ejecutar (
coordenadas de cada plano de corte, se hace referencia a las suturas craneales
Bregma, Lambda e Interaural
esta especie de animales
Plano coronal
Figura 3. Planos de corte de y Watson, 1998).
El cerebro de la rata, al igual que el del resto de mamíf
secciones, hemisferios, lóbulos, córtex, áreas,
de interés dos zonas importantes: la región h
(Fig. 4), puesto que en el PIN se realizan investigaciones
asociadas a estos sectores cerebrales
estructura comprendida entre la corteza cerebral y el tálamo,
algunos neurotransmisores importantes, entre estos serotonina y acetil
un papel importante en la memoria, el aprendizaje y la
2007). La sustancia nigra
importante del sistema de ganglios basales
control motor, por lo que se estudia mucho en modelos de la enfermedad de
Parkinson; además, muestra dos principales divisiones que son fácilmente
7
dependiendo del estudio histológico por realizar así se determina cuál plano
(Beresford, 2000; Paxinos y Watson, 1998). Para definir las
s de cada plano de corte, se hace referencia a las suturas craneales
Bregma, Lambda e Interaural, que se obtienen del Atlas estereotáxico específico para
esta especie de animales (Paxinos y Watson, 1998).
Plano sagital Plano horizontal
Planos de corte de un cerebro de rata utilizados en estudios histológicosy Watson, 1998).
El cerebro de la rata, al igual que el del resto de mamíferos, se divide en
secciones, hemisferios, lóbulos, córtex, áreas, etc. (Walter, 1963). En este estudio son
erés dos zonas importantes: la región hipocampal y la zona de la sustancia nigra
, puesto que en el PIN se realizan investigaciones que involucran las funciones
asociadas a estos sectores cerebrales. El hipocampo o cuerno de Amón
estructura comprendida entre la corteza cerebral y el tálamo, donde se localizan
algunos neurotransmisores importantes, entre estos serotonina y acetilcolina,
un papel importante en la memoria, el aprendizaje y la orientación espacial
gra es una porción heterogénea del mesencéfalo y un elemento
importante del sistema de ganglios basales, es la zona que lleva a cabo
por lo que se estudia mucho en modelos de la enfermedad de
muestra dos principales divisiones que son fácilmente
determina cuál plano de
ara definir las
s de cada plano de corte, se hace referencia a las suturas craneales
, que se obtienen del Atlas estereotáxico específico para
lano horizontal
utilizados en estudios histológicos (Paxinos
eros, se divide en
este estudio son
ipocampal y la zona de la sustancia nigra
que involucran las funciones
o cuerno de Amón es una
donde se localizan
colina, y juega
orientación espacial (Escobar,
es una porción heterogénea del mesencéfalo y un elemento
, es la zona que lleva a cabo la función de
por lo que se estudia mucho en modelos de la enfermedad de
muestra dos principales divisiones que son fácilmente
diferenciadas por sus neurotransmisores: la sustancia nigra reticulada (SNR) que es la
región más voluminosa y sus neuronas contienen GABA; y la sustancia nigra
compacta (SNC) que contiene altas concentraciones de dopamina (Abdala, 1998).
Figura 4. Corte coronal de cerebro de rata que muestra la verde, y de la sustancia
• Las técnicas histológicas
Las técnicas histológicas han sido mejoradas con el pasar del tiempo
al avance tecnológico, lo cual ha permitido optimizar el quehacer científico en esta
área (Junqueira, 1988). S
de la muestra, de: fijación, deshidratación
conocer el propósito de cada paso de esta técnica, con el fin de entender la evolución
de las posteriores (Alzola, 2001).
La fijación permite
cuales tienen como fin mantener las estructuras al generar la formación de enlaces
entre las proteínas constituyentes del tejido, logrando una conservación
aumentando su dureza, destruyendo bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en
8
diferenciadas por sus neurotransmisores: la sustancia nigra reticulada (SNR) que es la
más voluminosa y sus neuronas contienen GABA; y la sustancia nigra
compacta (SNC) que contiene altas concentraciones de dopamina (Abdala, 1998).
Corte coronal de cerebro de rata que muestra la región del hipocampo, en color ustancia nigra, en color morado (Wei, 2007).
Las técnicas histológicas
Las técnicas histológicas han sido mejoradas con el pasar del tiempo
lo cual ha permitido optimizar el quehacer científico en esta
Se trata de una técnica que incluye los pasos previos al corte
de: fijación, deshidratación, aclaramiento e inclusión; es importante
conocer el propósito de cada paso de esta técnica, con el fin de entender la evolución
es (Alzola, 2001).
permite dar tratamiento a los tejidos con sustancias químicas, las
cuales tienen como fin mantener las estructuras al generar la formación de enlaces
entre las proteínas constituyentes del tejido, logrando una conservación
aumentando su dureza, destruyendo bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en
diferenciadas por sus neurotransmisores: la sustancia nigra reticulada (SNR) que es la
más voluminosa y sus neuronas contienen GABA; y la sustancia nigra
compacta (SNC) que contiene altas concentraciones de dopamina (Abdala, 1998).
ipocampo, en color
Las técnicas histológicas han sido mejoradas con el pasar del tiempo, gracias
lo cual ha permitido optimizar el quehacer científico en esta
previos al corte
e inclusión; es importante
conocer el propósito de cada paso de esta técnica, con el fin de entender la evolución
tratamiento a los tejidos con sustancias químicas, las
cuales tienen como fin mantener las estructuras al generar la formación de enlaces
entre las proteínas constituyentes del tejido, logrando una conservación de los tejidos,
aumentando su dureza, destruyendo bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en
9
estos e interrumpiendo los procesos celulares dinámicos que ocurren con la muerte
celular (Alzola, 2001; Beresford, 2000). Después de que la muestra ha sido fijada, se
elimina el fijador, por lavado en agua o en alcohol, y se deshidratan los tejidos, en
forma progresiva, con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos hidratados (70°,
80°, 90°, 96°, 100°) (Beresford, 2000). El aclaramiento permite que el alcohol de los
tejidos sea reemplazado por un líquido (solvente) que disuelva el medio de inclusión
con el cual el tejido va a ser impregnado (Alzola, 2001). En la inclusión o
impregnación los tejidos se envuelven en una sustancia de consistencia firme, que
permite obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio; las
sustancias usadas para este fin en microscopía óptica son la gelatina, la celoidina, el
polietilenglicol y la parafina (Alzola, 2001; Geneser, 2000).
El paso a seguir en el procesamiento histológico es el corte o sección de la
muestra, con el cual se corta el tejido en láminas lo suficientemente delgadas (0,5 -
20µm) como para permitir, en el microscopio, el paso de la luz a través de él; las
secciones finas y parejas se obtienen con el micrótomo (Alzola, 2001; Beresford,
2000).
El micrótomo es un instrumento de gran precisión que proporciona cortes
delgados, lisos y de espesor graduable (UAB, 2005). Se han desarrollado cinco tipos
de micrótomos (Fig. 5), y seguidamente se da una breve descripción de cada uno
(Aimale y Gatti, 2008). En el micrótomo de deslizamiento el tejido queda fijo
mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales. En el tipo Minot o de
rotación la cuchilla queda fija y el tejido se desliza sujeto a una platina. El micrótomo
de congelación es semejante al micrótomo de deslizamiento, pero la cuchilla no se
desliza, sino que gira sobre un eje, y utiliza gas carbónico para el congelamiento de la
muestra. El criostato consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de
congelación, normalmente a -20º C, que utiliza gas freon para este fin. Finalmente, el
ultramicrótomo que se distingue de los anteriores en que secciona los tejidos con una
hoja de vidrio o diamante (Aimale y Gatti, 2008; UAB, 2005).
10
Micrótomo de deslizamiento Micrótomo de rotación
Leica SM 2000R Leica RM 2155
Micrótomo de Congelación Criostato Leitz 1213 Leica CM3050 S
Ultramicrótomo
Leica Ultracut UCT
Figura 5. Diferentes tipos de micrótomos utilizados para obtener cortes histológicos (Instrumental Parteur, 2008; Labequim, 2004; Labequim, 2005; Leica, 1996; Leica, 2000).
Una modificación de la metodología anterior de preparación de la muestra,
que incluía los pasos de fijación, deshidratación, aclaramiento e inclusión, surgió al
utilizar la técnica de congelación de tejidos, sumergiendo la muestra de tejido en
11
nitrógeno líquido para obtener una congelación rápida, y luego se corta con un
micrótomo de congelación (Aimale y Gatti, 2008).
En la actualidad, el criostato es un aparato más elaborado y eficiente para los
cortes de congelación, ya que permite la obtención de cortes mucho más delgados y
sin pasar por todas las etapas descritas antes, es decir, no se requiere un tratamiento
previo de la muestra (Aimale y Gatti, 2008). En un criostato, el volante de inercia que
controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el
mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (Leica, 2000). Pese a la
disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible
gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a
deslizarse sobre la superficie de la cuchilla (Aimale y Gatti, 2008). En los modelos
más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar
rápidamente la muestra a -60º C debido a la existencia de una placa de congelación
instantánea (Leica, 2000). Si se requieren cortes más delgados (ultrafinos), de
aproximadamente 25 a 100 nm de espesor, se utiliza el ultramicrótomo, que se
emplea principalmente en microscopía electrónica y para cortes extremadamente
duros y compactos, por ejemplo, huesos, dientes, especímenes minerales, fibra de
vidrio, cerámica, porcelana, entre otros (UAB, 2005).
Finalmente, la última etapa del proceso histológico consiste en la tinción de
los cortes, y este paso es fundamental, ya que permite la visualización de los tejidos y
sus componentes al microscopio. Existen colorantes generales y otros específicos, y
permiten poner de manifiesto tanto la topografía tisular, como tipos celulares
concretos, determinados orgánulos, estructuras intracelulares, celulares y
extracelulares (Junqueira y Carneiro, 1996). Las tinciones histológicas utilizan
colorantes que se eligen en función de su capacidad de interactuar con los diferentes
constituyentes de los tejidos (Leeson y Leeson, 1983). Todos los métodos de tinción
requieren siempre una adaptación o modificación para ser utilizados correctamente;
aunque conviene tener presente que la técnica de tinción en sí misma no es una
12
técnica aislada, sino que forma parte integral de todo el proceso histológico (Geneser,
2000).
En un corte de tejido, el esqueleto proteico y muchas otras macromoléculas
contienen grupos ionizables, capaces de formar uniones salinas con los colorantes; y
de acuerdo con este principio, los colorantes pueden clasificarse en iónicos y no-
iónicos, y a su vez, los colorantes iónicos se clasifican en ácidos, básicos y neutros
(Geneser, 2000). Un colorante iónico ácido (aniónico) tiñe grupos tisulares con carga
positiva (estructura tisular acidófila); por el contrario, un colorante iónico básico
(catiónico) tiñe grupos tisulares con carga negativa (estructura tisular basófila); y un
colorante iónico neutro es aquel que tiene un principio colorante aniónico y otro
principio colorante catiónico (UAB, 2005).
• Colorantes para tejido nervioso
Ciertos colorantes permiten la tinción de cortes de tejido nervioso, entre éstos
se pueden citar: El Azul de Metileno, que es un colorante catiónico, el cual tiñe, de
color azul-violeta, unos grumos muy basófilos en el citoplasma de las células
neuronales, denominados corpúsculos de Nissl (Beresford, 2000; Geneser, 2000). El
Cresyl Fast Violet tiñe de color azul oscuro-violeta los corpúsculos de Nissl y de
color morado/azul las neuronas y núcleos celulares (Aldana et al., 1996; Beresford,
2000). El Luxol Fast Blue tiñe la mielina de color azul y las neuronas color celeste
debido a su alta afinidad por los lípidos y bases de colina, y por tanto, de la mielina
(IHC World, 2007b). La Hematoxilina y Eosina, que son colorantes catiónico y
aniónico, respectivamente, y permiten observar los núcleos neuronales de color
morado, el citoplasma en color rosado y los glóbulos rojos en color naranja o rojo
(UAM, 2007). De estos colorantes, la Hematoxilina es el único de origen natural,
extraído de la madera del árbol Haematoxylon campechianum; y con el fin de
emplearse como colorante debe oxidarse a hemateína, mediante oxidación espontánea
con el oxígeno atmosférico (García, 1993). Además, entre estos, la Eosina y el Cresyl
Fast Violet son dos colorantes muy utilizados como contratinciones, es decir, que
debido a sus colores contrastantes se usan para teñir ciertos componentes tisulares
que no son visibles con el colorante principal; por ejemplo, cuando se util
conjunto la Hematoxilina y Eosina o el Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet
1993; Leeson y Leeson, 1983
El soporte químico de la mayor parte de los colorantes son
presentes entre los átomos de carbono de
benceno, los cuales no son fijos y, por tanto, pueden ser reordenados y causar los
derivados del benceno, y en consecuencia, los diversos colorantes
benceno es originariamente una sustancia incolora, aunque suscep
radiación dentro del espectro de la luz ultravioleta, pero si en un momento
determinado se produce la fijación de los dobles enlaces, dentro del anillo, por ocurrir
alguna reacción química sobre éste
absorber radiación luminosa dentro del espectro visible y mostrar color (Fig. 6)
(García, 1993).
Azul de Metileno
Eosina Y
Figura 6. Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso (García, 1993).
13
Fast Violet son dos colorantes muy utilizados como contratinciones, es decir, que
a sus colores contrastantes se usan para teñir ciertos componentes tisulares
que no son visibles con el colorante principal; por ejemplo, cuando se util
conjunto la Hematoxilina y Eosina o el Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet
Leeson y Leeson, 1983).
El soporte químico de la mayor parte de los colorantes son los dobles enlaces
entre los átomos de carbono de los anillos aromáticos derivados del
no son fijos y, por tanto, pueden ser reordenados y causar los
derivados del benceno, y en consecuencia, los diversos colorantes (García, 1993)
benceno es originariamente una sustancia incolora, aunque susceptible de absorber
radiación dentro del espectro de la luz ultravioleta, pero si en un momento
determinado se produce la fijación de los dobles enlaces, dentro del anillo, por ocurrir
alguna reacción química sobre éste y el derivado bencénico que se obtiene
absorber radiación luminosa dentro del espectro visible y mostrar color (Fig. 6)
Cresyl Fast Violet Hemateína
Eosina Y Luxol Fast Blue
Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso (García, 1993).
Fast Violet son dos colorantes muy utilizados como contratinciones, es decir, que
a sus colores contrastantes se usan para teñir ciertos componentes tisulares
que no son visibles con el colorante principal; por ejemplo, cuando se utiliza en
conjunto la Hematoxilina y Eosina o el Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (García,
os dobles enlaces
romáticos derivados del
no son fijos y, por tanto, pueden ser reordenados y causar los
(García, 1993). El
tible de absorber
radiación dentro del espectro de la luz ultravioleta, pero si en un momento
determinado se produce la fijación de los dobles enlaces, dentro del anillo, por ocurrir
el derivado bencénico que se obtiene puede
absorber radiación luminosa dentro del espectro visible y mostrar color (Fig. 6)
Hemateína
Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de
14
• Estudio experimental con cerebro de rata
Con el fin de aplicar las técnicas histológicas en tejido cerebral de rata, en este
trabajo se evalúa un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Los modelos
animales son una herramienta vital para estudiar el origen y la evolución de las
enfermedades neurodegenerativas. Uno de los modelos más utilizados en el estudio
de la enfermedad de Parkinson es el modelo de lesión unilateral de la vía
nigroestriatal con neurotoxinas, debido a que la evidencia neuropatológica más
consistente en los pacientes con Parkinson es la pérdida de las neuronas pigmentadas
de la sustancia nigra (Martin, 1999). En este modelo se inyecta una toxina
unilateralmente en la zona de la sustancia nigra compacta (SNC) y después de un
periodo determinado se analiza la conducta de los animales, que es muy
característica. Este modelo ha sido y es uno de los más utilizados en el estudio de los
procesos subyacentes a la enfermedad de Parkinson (Woodruff y Nonneman, 1994).
Por tanto, en el modelo a evaluar se utilizó una de las cuatro miotoxinas que
se han aislado y purificado del veneno de la serpiente Terciopelo (Bothrops asper), la
miotoxina III (MT-III). La MT-III estructuralmente se caracteriza como una
fosfolipasa A2 (PLA2) de la clase IIA, un tipo de enzima hidrolítica presente en el
desarrollo de muchos procesos celulares (Kaiser et al., 1990). Se espera que la MT-III
presente una actividad fisiopatológica, de tipo neurotóxica, y que produzca una lesión
neuronal; es por ello que se compara la acción de esta miotoxina, contra sí misma,
bloqueando su sitio catalítico por alquilación de los grupos hidroxilo de los
aminoácidos serina y tirosina de su secuencia.
15
Objetivos
• Objetivo General
Implementar diversas técnicas de corte y tinción de cerebro de rata para el
reconocimiento de regiones tanto sanas como disfuncionales.
• Objetivos Específicos
Los objetivos específicos de esta investigación son los siguientes:
− Estandarizar los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y grosor para
el corte de cerebros de rata en el criostato.
− Estandarizar los protocolos de tinción con los colorantes Azul de Metileno,
Cresyl Fast Violet, Hematoxilina y Eosina, y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast
Violet, en los cortes de cerebro de rata.
− Reconocer y caracterizar al microscopio, mediante diferentes tinciones, tejido
cerebral sano y disfuncional.
− Determinar el punto exacto de llegada de una cánula, introducida
unilateralmente en el cerebro de ratas macho de la cepa Sprague Dawley, con
el fin de utilizarlo como control en el modelo conductual de la enfermedad de
Parkinson.
Materiales y métodos
• Localización del estudio
El estudio se realizó en el laboratorio de Histología del Programa de
Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica,
Campus Universitario Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa
Rica.
• Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y
grosor en los cortes
Es importante resaltar que en este trabajo se experimentó con
diferentes de “tratamiento previo” de las muestras de cerebro de rata. Unas muestras
se encontraban almacenadas
Eppendorf con una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, cuyo
fin era deshidratar y conservar a los tejidos
de la extracción cuidadosa de
un beaker con una solución salina al
de tal forma que permitiera deshidratar la
almacenaron a -30°C por un periodo de día y medio (Fig. 7).
Figura 7. Fotografías de cerebros de ratas albinas utilizados A) muestra almacenamuestra almacena
A
16
estudio
El estudio se realizó en el laboratorio de Histología del Programa de
Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica, ubicado en el
Campus Universitario Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa
Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y
s de cerebros de rata en el criostato
Es importante resaltar que en este trabajo se experimentó con
diferentes de “tratamiento previo” de las muestras de cerebro de rata. Unas muestras
se encontraban almacenadas a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos
solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, cuyo
fin era deshidratar y conservar a los tejidos. Las otras muestras se obtuvieron a partir
la extracción cuidadosa de los cerebros de ratas albinas, y éstas se deposit
solución salina al 0.9%, refrigerada, por un periodo de 5 minutos,
de tal forma que permitiera deshidratar las muestras; se secaron lo suficiente y se
30°C por un periodo de día y medio (Fig. 7).
Fotografías de cerebros de ratas albinas utilizados durante el trabajo experimentalalmacenada a temperatura ambiente en una solución
muestra almacenada a -30°C sin solución fijadora.
B
El estudio se realizó en el laboratorio de Histología del Programa de
ubicado en el
Campus Universitario Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa
Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y
Es importante resaltar que en este trabajo se experimentó con dos tipos
diferentes de “tratamiento previo” de las muestras de cerebro de rata. Unas muestras
a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos
solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, cuyo
. Las otras muestras se obtuvieron a partir
se depositaron en
por un periodo de 5 minutos,
lo suficiente y se
durante el trabajo experimental. a temperatura ambiente en una solución fijadora. B)
Los cerebros de rata en estudio,
se cortaron en los planos
Leica, modelo CM3050 S
seguidamente.
Figura 8. Fotografía del crata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.
Se aplicó una cantidad suficiente de
Cryocompound) sobre una “platina porta
Seguidamente, se montó una muestra de cerebro, y se orientó
cuidado de posicionar la parte superior del cerebro en donde se señala en la “platina
porta-muestras”. A continuación, se recubrió el tejido superficialmente con el medio
de montaje mencionado anteriormente. Finalmente, se colocó la platina con la
muestra en uno de los diez orificios del “bloque de congelación rápida” del criostato
y se dejó reposar diez minutos, aproximadamente, con el fin de que la temperatura de
la muestra alcanzara la temperatura
17
Los cerebros de rata en estudio, independientemente de su tratamiento previo,
en los planos coronal, sagital y horizontal, utilizando un criostato marca
Leica, modelo CM3050 S (Fig. 8), y de acuerdo con el procedimiento que se describe
el criostato Leica CM3050 S utilizado para el corte de los cerebros de rata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.
Se aplicó una cantidad suficiente de “medio de montaje
sobre una “platina porta-muestras”, a temperatura ambiente.
montó una muestra de cerebro, y se orientó esta muestra t
de posicionar la parte superior del cerebro en donde se señala en la “platina
ras”. A continuación, se recubrió el tejido superficialmente con el medio
de montaje mencionado anteriormente. Finalmente, se colocó la platina con la
muestra en uno de los diez orificios del “bloque de congelación rápida” del criostato
iez minutos, aproximadamente, con el fin de que la temperatura de
la muestra alcanzara la temperatura prefijada de la cámara (Fig. 9).
independientemente de su tratamiento previo,
un criostato marca
(Fig. 8), y de acuerdo con el procedimiento que se describe
CM3050 S utilizado para el corte de los cerebros de rata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en
de montaje” (Leica
, a temperatura ambiente.
esta muestra teniendo el
de posicionar la parte superior del cerebro en donde se señala en la “platina
ras”. A continuación, se recubrió el tejido superficialmente con el medio
de montaje mencionado anteriormente. Finalmente, se colocó la platina con la
muestra en uno de los diez orificios del “bloque de congelación rápida” del criostato
iez minutos, aproximadamente, con el fin de que la temperatura de
Figura 9. Fotografía de una muestra de cerebro de rata albinacriostato Leica, modelo CM3050 Smuestras”. B) “
Seguidamente, se montó la platina con la muestra en el “termobloque” y
utilizando el “panel de mandos” del criostato (
cuchilla, mediante los comandos de “avance macro rápido hacia adelante”
(1000µm/s) y “avance macro lento hacia adelante” (500 µm/s), se ajust
de corte” y se procedió a desbastar la muestra (5
la cuchilla la capa de medio de montaje que envolvía la muestra, hasta que se
obtuvieron secciones completas de la superficie total de esta
2000). Seguidamente, y con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic
Coordinates” (Paxinos y Watson, 1998)
orientándola en sus ejes
observados en el Atlas. Para definir aproximadamente las coordenadas de cada plano,
se hizo referencia a las suturas craneales Bregma, Lambda e Interaural
A
18
Fotografía de una muestra de cerebro de rata albina dentro de la cámara del Leica, modelo CM3050 S. A) muestra montada en la “
“bloque de congelación rápida”. C) “termobloque”.
Seguidamente, se montó la platina con la muestra en el “termobloque” y
l de mandos” del criostato (Anexo 1) se acercó la muestra a la
cuchilla, mediante los comandos de “avance macro rápido hacia adelante”
(1000µm/s) y “avance macro lento hacia adelante” (500 µm/s), se ajust
de corte” y se procedió a desbastar la muestra (5-150 µm/s), es decir, a di
la cuchilla la capa de medio de montaje que envolvía la muestra, hasta que se
obtuvieron secciones completas de la superficie total de esta muestra (Fig.
2000). Seguidamente, y con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic
(Paxinos y Watson, 1998), se ajustó el ángulo de corte de la muestra,
en sus ejes x-, y-, z- hasta obtener secciones paralelas a los planos
Para definir aproximadamente las coordenadas de cada plano,
erencia a las suturas craneales Bregma, Lambda e Interaural.
B C
dentro de la cámara del montada en la “platina porta-
Seguidamente, se montó la platina con la muestra en el “termobloque” y
se acercó la muestra a la
cuchilla, mediante los comandos de “avance macro rápido hacia adelante”
(1000µm/s) y “avance macro lento hacia adelante” (500 µm/s), se ajustó la “ventana
150 µm/s), es decir, a disminuir con
la cuchilla la capa de medio de montaje que envolvía la muestra, hasta que se
muestra (Fig. 10) (Leica,
2000). Seguidamente, y con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic
, se ajustó el ángulo de corte de la muestra,
hasta obtener secciones paralelas a los planos
Para definir aproximadamente las coordenadas de cada plano,
Figura 10. Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloquecriostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del tejido en su plano horizontal.
Posteriormente, se estandarizaron los parámetros de
grosor de los cortes, en
aquellas muestras almacenadas a temperatura ambiente, con una solución tamponada
de formalina 10%, sacarosa y fosfatos
almacenamiento a -30°C y sin solución fijadora
19
Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloquecriostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del tejido en su plano horizontal.
, se estandarizaron los parámetros de temperatura, velocidad y
las muestras de cerebro de rata. Inicialmente se trabajó con
almacenadas a temperatura ambiente, con una solución tamponada
de formalina 10%, sacarosa y fosfatos; luego, con aquellas correspondientes a un
30°C y sin solución fijadora.
Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloque” del criostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del
temperatura, velocidad y
se trabajó con
almacenadas a temperatura ambiente, con una solución tamponada
aquellas correspondientes a un
20
− Evaluación de la temperatura más apta para el corte de cerebros de rata
Se trabajó con un rango de temperatura entre -15°C y -25°C, de acuerdo con
lo recomendado por la compañía Leica para el criostato Leica CM3050 S, al usar un
tipo de tejido como lo es el cerebro (Leica, 2000). Se empezó por la temperatura más
alta del rango (-15°C) y hasta los -25°C.
− Evaluación de la velocidad más apta para el corte de cerebros de rata
Para definir la velocidad de los cortes se utilizó la opción “potenciómetro de
deslizamiento” localizado en el “panel de mandos” (Anexo 1); se midió un rango de
velocidad desde el 0% (0 mm/s) y hasta el 100% (210 mm/s) que es la velocidad
máxima permitida por el criostato Leica CM3050 S en su modo automático (Leica,
2000).
− Evaluación del espesor más apto para el corte de cerebros de rata
Para definir el grosor de los cortes se usaron las teclas localizadas en
el “panel de mandos” (Anexo 1); se midió un valor de espesor de corte de 0.5 µm (lo
mínimo permisible por el criostato Leica CM3050 S) a 30 µm, considerándose este
último valor como “grueso” para su observación posterior al microscopio (Leica,
2000).
Al principio del estudio, los cortes del tejido se recogieron en portaobjetos
recubiertos con una solución de 3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma, #A3648)
(Anexo 2); posteriormente, se cambió a un revestimiento con gelatina (Food Grade-
Merck, #1.04078.0500), siguiendo el protocolo adaptado de Fornaguera y
colaboradores (Anexo 3) (Comunicación oral, 2005).
21
• Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata
Los procedimientos utilizados para la coloración de secciones de tejido
nervioso se adaptaron y optimizaron a partir de las metodologías descritas por Carl
Rüdeberg (1967), en la tinción con Azul de Metileno; Aldana et al. (1996) para teñir
con Cresyl Fast Violet; Carl Busch (1877), en la tinción con Hematoxilina y Eosina, y
finalmente, Heinrich Klüver y Elizabeth Barrera (1954) para teñir con Luxol Fast
Blue.
− Azul de Metileno
Es importante rescatar que esta tinción, modificada a partir de la de Carl
Rüdeberg (1967), se utilizó para una localización rápida de la zona de interés y
decidir así si se toman esos cortes o si se tiene que seguir desbastando la muestra. Se
preparó una Solución de Trabajo de Azul de Metileno al 0.25% de la siguiente forma:
se añadió 0.5g de Azul de Metileno (Biolab - BDH Chemicals, #VW6276-2) a 200ml
de agua destilada; se disolvió el polvo mediante agitación y se añadieron diez gotas
de alcohol 95%. Esta Solución de Trabajo se añadió, con un gotero, a un portaobjetos
con un corte de tejido de cerebro de rata, y se dejó reposando por un tiempo de 30
segundos. Finalmente, se lavó el portaobjetos tres veces en agua destilada y se
observó la muestra al microscopio.
− Cresyl Fast Violet
Se preparó una Solución de Trabajo de Cresyl Fast Violet al 0.1% de la
siguiente forma: se añadieron 0.2g de Cresyl Fast Violet (Gurr’s, #340244K) a 200ml
de agua destilada; se disolvió el polvo agitando la solución con un agitador magnético
a una temperatura entre 50-60 °C durante 30 minutos e inmediatamente se filtró la
solución con un papel filtro y un embudo (Aldana et al., 1996). Esta Solución de
Trabajo se aplicó con un gotero a un portaobjetos con el corte de tejido de cerebro de
22
rata y se dejó reposando por un tiempo de 5 minutos. Se lavó dos veces en agua
destilada y se dejó reposando 30 segundos en alcohol 70%. Luego de decantar el
líquido, se dejó 30 segundos en alcohol 95%, y luego 30 segundos en alcohol
absoluto. Por último, en una campana de extracción de aire, se aplicó, con un gotero,
xileno (J. T. Baker, #3410) a la muestra y se añadió el medio de montaje Shandon
Xylene Substitute Mountant (Thermo Scientific, #9999122) al cubreobjetos para
fijarlo al portaobjetos. Se dejó reposando el portaobjetos, mínimo una hora, y
finalmente se observó la muestra al microscopio (Aldana et al., 1996).
− Hematoxilina y Eosina
Se preparó una Solución de Trabajo de Eosina al 30% de la siguiente forma:
se añadieron 50mL de Eosina Y (Fisher Scientific, #E-511) a 150ml de alcohol 95% y
se removió. Además, se preparó una solución al 1% de Bicarbonato de Sodio, de la
siguiente manera: se añadió 1g de Bicarbonato de Sodio (Laboratorios Quiflo, #03-
0327) a 100mL de agua destilada y se disolvió el polvo mediante agitación. En la
tinción, se sumergió un portaobjetos, con muestra de tejido de cerebro de rata, en una
batería o cubeta para tinción con cestillo de vidrio (Fig. 11) con la solución lista para
usar de Hematoxilina 1% (Science Products Division, #E-106), se dejó reposando en
la solución por un tiempo de 3 minutos y se lavó dos veces en agua destilada. Luego,
se aplicaron unas gotas de HCl 1N, de tal forma que cubrieran la muestra y se
decolorara el tejido (aproximadamente 4 segundos); se decantó la solución y se
aplicó, seguidamente, la solución de Bicarbonato de Sodio 1% hasta que se
oscureciera el tejido (tornándose nuevamente color morado-azul); por último, se lavó
el portaobjetos en agua destilada. Seguidamente, se sumergió el portaobjetos en la
Solución de Trabajo de Eosina al 30%, se dejó reposando en esta por un tiempo de 3
minutos y en seguida se lavó dos veces en agua destilada. Se dejó reposando 30
segundos en alcohol 70%; luego de decantar el líquido, se dejó 30 segundos en
alcohol 95%, y luego 30 segundos en alcohol absoluto. Por último, en una campana
de extracción de aire, se aplicó xileno a la muestra y se añadió el medio de montaje
23
Shandon Xylene Substitute Mountant (Thermo Scientific, #9999122) al cubreobjetos
para fijarlo al portaobjetos. Se dejó reposando el portaobjetos, mínimo una hora, y
finalmente se observó la muestra al microscopio (Busch, 1877; IHC World, 2007a).
− Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet
Se preparó una Solución de Trabajo de Luxol Fast Blue 0.1% de la siguiente
forma: se añadieron 0.2g de Luxol Fast Blue (Fisher Scientific, #201238) a 200ml de
alcohol 95%; se disolvió el polvo mediante agitación y seguidamente se añadieron
0.5mL de Ácido Acético 10%. Además, se preparó una solución de Carbonato de
Litio 0.05% de la siguiente forma: se añadieron 0.05g de Carbonato de Litio (Baker
Analyzed, #0155) a 100ml de agua destilada y se agitó la solución hasta disolver
(Sheehan y Hrapchak, 1980). En la tinción, se sumergió un portaobjetos, con muestra
de tejido de cerebro de rata, en una cubeta tipo Coplin (Fig. 11) con la solución de
Luxol Fast Blue 0.1%, durante la noche (aproximadamente 12 horas), a 60°C. Se lavó
el exceso de colorante en alcohol 95% y luego en agua destilada, contando 5
segundos en cada líquido. Seguidamente, se sumergió el portaobjetos en la solución
de Carbonato de Litio 0.05%, agitándolo levemente durante 5 segundos; luego, se
sumergió el portaobjetos, por un tiempo de 30 segundos, en alcohol 70%; finalmente,
se lavó en agua destilada. En el proceso de la contratinción, se siguió el protocolo con
Cresyl Fast Violet al 0.1%, anteriormente mencionado (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Figura 11. Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o cubeta con cestillo de vidrio. B) cubeta tipo Coplin.
• Evaluación histológica de
Parkinson
Se evaluó histológicamente un
enfermedad de Parkinson, el cual consistió en observar y determinar
microscopio óptico, el punto exacto de llegada de una
previamente introducida
adultas de la cepa Sprague Dawley
animales se habían dividido en tres grupos y por medio de estas cánulas
administrado un tratamiento diferente a cada uno: solución salina al 1% al
control, miotoxina III (MT
alquilada en su sitio activo catalítico
Es importante destacar que las cánulas
cerebral denominada sustancia nigra
Interaural 3.40 mm, según el
(Paxinos y Watson, 1998)
A
24
Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o cubeta con cestillo de vidrio. B) cubeta tipo Coplin.
ción histológica de un modelo conductual de la enfermedad de
Se evaluó histológicamente un estudio sobre un modelo animal de la
enfermedad de Parkinson, el cual consistió en observar y determinar
el punto exacto de llegada de una cánula, que había sido
previamente introducida estereotáxicamente en el cerebro de cuarenta
Sprague Dawley, con un rango de peso entre 218
animales se habían dividido en tres grupos y por medio de estas cánulas
administrado un tratamiento diferente a cada uno: solución salina al 1% al
III (MT-III) de Bothrops asper a otro grupo, y la
en su sitio activo catalítico.
Es importante destacar que las cánulas habían sido dirigidas hacia la zona
cerebral denominada sustancia nigra (en las coordenadas Bregma
según el Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”
(Paxinos y Watson, 1998)), y que la totalidad de las muestras se enc
B
Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o
al de la enfermedad de
modelo animal de la
enfermedad de Parkinson, el cual consistió en observar y determinar, con el
cánula, que había sido
uarenta ratas macho
, con un rango de peso entre 218-332 g. Los
animales se habían dividido en tres grupos y por medio de estas cánulas se les había
administrado un tratamiento diferente a cada uno: solución salina al 1% al grupo
, y la misma toxina
habían sido dirigidas hacia la zona
(en las coordenadas Bregma -5.60 mm e
Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”
y que la totalidad de las muestras se encontraban
almacenadas a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos Eppendorf con
una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos.
Cada muestra cerebral se preparó para su segmentación del modo como se
describió previamente en este es
porta-muestras” de tal forma que los cortes obtenidos fueran de su plano coronal; y
con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”
1998), se ajustó el ángulo de corte de
a los planos observados en el Atlas
partir de la aparición de la cicatriz de la cánula en cada muestra (Fig. 12). Se
colocaron seis cortes por portaobjeto y estos se tiñeron con los colorantes
Hematoxilina y Eosina, Cresyl Fast Violet y Lu
obtenidos se observaron al microscopio.
Figura 12. Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio de un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se flecha la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.
25
almacenadas a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos Eppendorf con
una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos.
Cada muestra cerebral se preparó para su segmentación del modo como se
describió previamente en este estudio. Además, cada tejido se montó en la “platina
muestras” de tal forma que los cortes obtenidos fueran de su plano coronal; y
con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” (Paxinos y Watson,
, se ajustó el ángulo de corte de cada muestra hasta obtener secciones paral
observados en el Atlas. Asimismo, se inició la recolección de los cortes a
partir de la aparición de la cicatriz de la cánula en cada muestra (Fig. 12). Se
colocaron seis cortes por portaobjeto y estos se tiñeron con los colorantes
Hematoxilina y Eosina, Cresyl Fast Violet y Luxol Fast Blue. Finalmente,
observaron al microscopio.
Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se
la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.
almacenadas a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos Eppendorf con
Cada muestra cerebral se preparó para su segmentación del modo como se
tudio. Además, cada tejido se montó en la “platina
muestras” de tal forma que los cortes obtenidos fueran de su plano coronal; y
(Paxinos y Watson,
hasta obtener secciones paralelas
. Asimismo, se inició la recolección de los cortes a
partir de la aparición de la cicatriz de la cánula en cada muestra (Fig. 12). Se
colocaron seis cortes por portaobjeto y estos se tiñeron con los colorantes
xol Fast Blue. Finalmente, los cortes
Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio histológico un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se señala con una
la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.
26
Resultados
• Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y
grosor en los cortes de cerebros de rata en el criostato
La temperatura más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a
temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos está en un rango comprendido entre -24°C y -26°C; y para aquellos cerebros
de rata sin fijador está entre -23°C y -26°C (Las flechas señalan estos resultados)
(Cuadro 1).
Cuadro 1. Resultados de la evaluación de la temperatura más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C. (*)
Valores de temperatura (°C) del
criostato Leica SM3050 S
Observaciones de cerebros de rata albina
A temperatura ambiente, con solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos
A -30°C, sin fijador
De -15 a -18 Muestra no estaba
suficientemente sólida. Cortes de consistencia pegajosa
Muestra no estaba suficientemente sólida. Corte de
consistencia pegajosa
-19 Cortes de consistencia pegajosa Cortes rotos o divididos en dos
-20 Cortes rotos o divididos en dos Los cortes no se estiraron bien en
la placa anti-roll
-21 Cortes rotos o divididos en dos Cortes bien estirados se
enrollaron al quitar la placa anti-roll
-22 Los cortes no se estiraron bien en
la placa anti-roll
Cortes bien estirados se enrollaron al quitar la placa anti-
roll
-23 Cortes bien estirados se
enrollaron al quitar la placa anti-roll
La muestra se congeló lo suficiente y por tanto se cortó sin
problemas.
-24 y -26 La muestra se congeló lo
suficiente y por tanto se cortó sin problemas.
La muestra se congeló lo suficiente y por tanto se cortó sin
problemas.
(*) Nota: El grosor de corte utilizado en esta evaluación fue de 20 µm.
27
La velocidad más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a
temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos está en un rango comprendido entre 20% (42 mm/s) y 10% (21 mm/s); y para
aquellos cerebros de rata sin fijador está entre 40% (84 mm/s) y 10% (21 mm/s) (Las
flechas señalan estos resultados) (Cuadro 2).
Cuadro 2. Resultados de la evaluación de la velocidad más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C. (*)
Valores de velocidad de corte del criostato Leica
SM3050 S en modo automático
Observaciones de cerebros de rata albina
A temperatura ambiente, con solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos
A -30°C, sin fijador
De 100% (210 mm/s) a 50% (105 mm/s)
Cortes estirados se enrollaron al quitar la placa anti-roll
Cortes estirados se enrollaron al quitar la placa anti-roll y no fue posible acomodar los cortes con el pincel ya que se adhirieron a
este
40% (84 mm/s)
No fue posible acomodar los cortes con el pincel ya que se
adhirieron a este
Cortes estirados no se adhirieron al pincel
30% (63 mm/s) No fue posible acomodar los cortes con el pincel ya que se
adhirieron a este
Cortes estirados no se adhirieron al pincel
20% (42 mm/s) Cortes estirados no se adhirieron al pincel
Cortes estirados no se adhirieron al pincel
10% (21 mm/s) Cortes estirados no se adhirieron al pincel
Cortes estirados no se adhirieron al pincel
(*) Nota: El grosor de corte utilizado en esta evaluación fue de 20 µm.
28
El espesor de corte más apto para los cerebros de rata almacenados a
temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos es de 25 µm y para aquellos cerebros de rata sin fijar está en un rango
comprendido entre 10 µm y 25 µm (Las flechas señalan estos resultados) (Cuadro 3).
Cuadro 3. Resultados de la evaluación del espesor más apto para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.
Valores de espesor de corte en el criostato Leica SM3050 S (µm)
Observaciones de cerebros de rata albina
A temperatura ambiente, con solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos
A -30°C, sin fijador
De 0.5 a 9 Los cortes se arrugaron y se enrollaron y fue difícil su
recolección
Al observar los cortes con el microscopio, estos se visualizan
arrugados
De 10 a 20 Al observar los cortes con el
microscopio, estos se visualizan arrugados
Al observar los cortes con el microscopio, estos se visualizan
lisos y sin arrugas
25 Al observar los cortes con el
microscopio, estos se visualizan lisos y sin arrugas
Al observar los cortes con el microscopio, estos se visualizan
lisos y sin arrugas
30
Al observar los cortes con el microscopio, estos se visualizan
muy gruesos
Al observar los cortes con el microscopio, estos se visualizan
muy gruesos
Con los resultados obtenidos de las evaluaciones realizadas, se estableció un
protocolo para el corte de de los cortes de cerebros de rata utilizando el criostato
Leica CM3050 S (Apéndice 1).
29
• Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata
- Azul de Metileno
El Azul de Metileno es un colorante catiónico, por lo que se resaltan de color
azul las estructuras ácidas de los núcleos celulares de las células presentes en el corte;
a su vez, en color celeste se evidencia el citoplasma celular (Fig. 13, 14, 15 y 16)
(Beresford, 2000; Ham, 1975).
En la parte superior izquierda, se muestra el plano de corte (coronal, sagital u
horizontal) de las coordenadas correspondientes a cada fotografía (Fig. 13, 14 y 15).
Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta
(SNC), sustancia nigra lateral (SNL), sustancia nigra medial (SNM) y sustancia nigra
reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml: lemnisco medial (Paxinos y Watson,
1998) (Fig. 13) (Paxinos y Watson, 1998). Además, se muestran las zonas CA1, CA2
y CA3 del hipocampo, la fisura hipocampal (hf), el hilo del giro dentado (Hil), el giro
dentado (DG), y la capa polimórfica de éste (PoDG); alv: alveo del hipocampo; cc:
cuerpo calloso; fi: fimbria del hipocampo; S: subículo (Fig. 14 y 15) (Paxinos y
Watson, 1998).
Las flechas color negro señalan “artefactos” o alteraciones en el corte,
producto del procesamiento histológico de la muestra (Fig. 14).
Se observan núcleos de células neuronales encerrados en círculos y núcleos de
células de neuroglia encerrados en cuadrados (Fig. 16). En el SNC estas últimas
difieren de las primeras en que son de menor tamaño y de diferente morfología; las
células de la neuroglia sí presentan prolongaciones, aunque no se asemejan al axón y
a las dendritas de la neurona (Leeson y Leeson, 1983). Nótese además, que la
30
proporción de células de neuroglia es mayor en comparación con las neuronas (Fig.
16).
Los resultados obtenidos con la tinción con Azul de Metileno permitieron
establecer un protocolo con este colorante para la tinción de los cortes de cerebros de
rata de 25 µm de grosor (Apéndice 2).
Figura 13. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenaMetileno (Aumento 40X).
Figura 14. Fotografía tomada al un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).
PP
DD
Lateral: 3.40 mm
Interaural: 3.20 mm Bregma: -5.80 mm
31
. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de
(Aumento 40X).
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de
(Aumento 40X).
CCAA11 CCAA22
CCAA33 hhff
HHiill
PPooDDGG
DDGG
ff
aallvv
SSNNRR
SSNNCC
mmll
ccpp SSNNMM
SSNNLL
. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
, y teñido con Azul de
, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de
ffii
cccc
32
Figura 15. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).
Figura 16. Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 400X).
CCAA33
CCAA22
CCAA11
SS DDGG
CCAA11
Interaural: 6.90 mm Bregma: -3.10 mm
33
- Cresyl Fast Violet
El Cresyl Fast Violet es un colorante catiónico, el cual tiñe de color morado
oscuro los corpúsculos de Nissl presentes en el soma neuronal y las estructuras ácidas
de los núcleos celulares de las células presentes en el corte; en color lila se evidencia
el citoplasma celular (Fig. 17, 18, 19 y 20) (Aldana et al., 1996; Beresford, 2000).
En la parte superior izquierda, se muestra el plano de corte (coronal, sagital u
horizontal) de las coordenadas correspondientes a cada fotografía (Fig. 17, 18 y 19).
Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta porción
dorsal (SNCD) y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml:
lemnisco medial; Aq: acueducto de Silvio; PAG: sustancia gris periacueductal (Fig.
17). Asimismo, se muestran las zonas CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, la fisura
hipocampal (hf), el hilo del giro dentado (Hil), el giro dentado (DG), y la capa
polimórfica de éste (PoDG); alv: alveo del hipocampo; cc: cuerpo calloso; fi: fimbria
del hipocampo; S: subículo (Fig. 18 y 19) (Paxinos y Watson, 1998).
Independientemente del plano de corte de la muestra cerebral, la tinción con
Cresyl Fast Violet permite diferenciar las zonas cerebrales del hipocampo. La
evidente distribución en capas se debe al agrupamiento que realizan las células de una
misma morfología con el fin de desempeñar una función determinada (Fig. 18 y 19).
(Junqueira, 1988).
Se observan núcleos de células neuronales encerrados en círculos, éstas son de
tipo multipolar, ya que se observan más de dos prolongaciones celulares desde el
soma de cada una (Milikowski y Berman, 2001); además, se visualizan núcleos
esféricos de astrocitos encerrados en cuadrados, y núcleos alargados encerrados en el
triángulo, denominados microglia (Fig. 20) (Junqueira y Carneiro, 1996)
Los resultados obtenidos con la tinción con Cresyl Fast Violet permitieron
establecer un protocolo con este colorante para la tinción de los cortes de cerebros de
rata, de 25 µm de grosor (Apéndice 3).
34
Figura 17. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
Figura 18. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
CCAA11 CCAA22
CCAA33 hhff
HHiill
PPooDDGG
DDGG
ffii
cccc
aallvv
Lateral: 3.40 mm
ccpp
SSNNRR SSNNCCDD
DDGG
mmll
PPAAGG
AAqq
Interaural: 4.20 mm Bregma: -4.80 mm
35
Figura 19. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
Figura 20. Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular
presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).
SS
CCAA22
CCAA33
DDGG
CCAA11
PPooDDGG ffii
Interaural: 4.68 mm Bregma: -5.32 mm
36
- Hematoxilina/Eosina
La Hematoxilina es un colorante catiónico y la Eosina es aniónico, por lo que
se observan de color rosado oscuro las estructuras ácidas (basófilas) de los núcleos de
las células presentes en el corte; a su vez, en color rosado claro se evidencia el
citoplasma celular, que es acidófilo (Fig. 21, 22, 23 y 24) (Beresford, 2000; UAM,
2007).
En la parte superior izquierda, se muestra el plano de corte (coronal, sagital u
horizontal) de las coordenadas correspondientes a cada fotografía (Fig. 21, 22 y 23).
Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta
porción dorsal (SNCD) y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral;
ml: lemnisco medial; DG: giro dentado (Fig. 21). Asimismo, se muestran las zonas
CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, la fisura hipocampal (hf), el hilo del giro dentado
(Hil), el giro dentado (DG), y la capa polimórfica de éste (PoDG); cc: cuerpo calloso;
S: subículo (Fig. 22 y 23) (Paxinos y Watson, 1998).
Las flechas color negro señalan “artefactos” o alteraciones en los cortes,
producto del procesamiento histológico de la muestra (Fig. 22 y 24).
Se observan núcleos de células neuronales encerrados en círculos, éstas son de
tipo multipolar, ya que se observan más de dos prolongaciones celulares desde el
soma de cada una (Milikowski y Berman, 2001); además, se visualizan núcleos
esféricos de astrocitos encerrados en cuadrados y núcleos alargados encerrados en el
triángulo, denominados microglia (Fig. 24) (Junqueira y Carneiro, 1996)
Los resultados obtenidos con la tinción con Cresyl Fast Violet permitieron
establecer un protocolo con este colorante para la tinción de los cortes de cerebros de
rata de 25 µm de grosor (Apéndice 4).
37
Figura 21. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
Figura 22. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
CCAA11
CCAA22
CCAA33 hhff
HHiill
PPooDDGG
DDGG
SS
cccc
Lateral: 2.90 mm
ccpp
SSNNRR SSNNCCDD
DDGG
mmll
Interaural: 4.20 mm Bregma: -4.80 mm
Figura 23. Fotografía tomada al un corte horizonHematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
Figura 24. Microfotografía tomada al presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, con Hematoxilina y Eosina (Aumento 400X).
Interaural: 6.62 mm Bregma: -3.38 mm
38
Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en zontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C
Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a con Hematoxilina y Eosina (Aumento 400X).
DDGG
CCAA22
CCAA33 HHiill
PPooDDGG
CCAA11
CCAA11
CC
, que muestra diferentes zonas presentes en
30°C, y teñido con
que muestra la diversidad celular
a -30°C, y teñido
CCAA33
39
- Luxol Fast Blue/Cresyl Fast Violet
El colorante Luxol Fast Blue, al tener una alta afinidad por los lípidos y bases
de colina, presentes en la mielina, tiñe esta sustancia de color azul (Beresford, 2000;
Sheehan y Hrapchak, 1980). La mielina se presenta en los axones de las neuronas y
en los oligodendrocitos, que son células de la glia con varias ramificaciones o
dendritas y que se enrollan alrededor de los axones de varias neuronas (Fig. 25, 26,
27 y 28) (Ross et al., 2005).
Además, se resaltan de color morado las estructuras ácidas de los núcleos de
las células presentes en los cortes, y en color lila se evidencia el citoplasma celular; y
esto se debe a que el Cresyl Fast Violet, utilizado para la contratinción, es un
colorante catiónico que tiñe de color morado oscuro los corpúsculos de Nissl
presentes en el soma neuronal (Fig. 25, 26, 27 y 28) (Aldana et al., 1996; Beresford,
2000).
En la parte superior izquierda, se muestra el plano de corte (coronal, sagital u
horizontal) de las coordenadas correspondientes a cada fotografía (Fig. 25, 26 y 27).
Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta
porción dorsal (SNCD) y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral;
ml: lemnisco medial; mp: pedúnculo mamilar; MT: núcleo terminal medial del
sistema óptico accesorio; IPF: fosa interpeduncular; MM: núcleo mamilar medial,
Aq: acueducto de Silvio (Fig. 25) (Paxinos y Watson, 1998).
Asimismo, se muestran las zonas CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, la fisura
hipocampal (hf), el hilo del giro dentado (Hil), el giro dentado (DG) y la capa
polimórfica de éste (PoDG); alv: alveo del hipocampo; bsc: brazo del colículo
superior; cc: cuerpo calloso; dcw: materia blanca cerebral profunda; DLG: núcleo
40
genicular lateral dorsal ; LV: ventrículo lateral ; S: subículo (Fig. 26 y 27) (Paxinos y
Watson, 1998).
Las flechas color negro señalan “artefactos” o alteraciones en los cortes (Fig.
26 y 27).
Se observan núcleos de células neuronales encerrados en círculos, éstas son de
tipo multipolar, ya que se observan más de dos prolongaciones celulares desde el
soma de cada una (Milikowski y Berman, 2001); además, se visualizan núcleos
esféricos encerrados en cuadrados, que corresponden a astrocitos; núcleos alargados
encerrados en el triángulo, denominados microglia; y oligodendrocitos dentro del
rombo, que pueden ser observados solamente con este colorante (Fig. 28) (Junqueira
y Carneiro, 1996; Ross et al., 2005).
Los resultados obtenidos con la tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast
Violet permitieron establecer un protocolo con estos colorantes para la tinción de los
cortes de cerebros de rata de 25 µm de grosor (Apéndice 5).
Es importante resaltar las grandes diferencias presentes entre aquellos tejidos
almacenados en una solución fijadora y aquellos que no, independientemente del tipo
de colorante utilizado para su tinción. En los cortes procedentes de un
almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos se
observan tejidos con mayor cantidad de artefactos, retracciones y anomalías; y lo
contrario ocurre con aquellos cortes que no provienen de un almacenamiento a -30°C,
los cuales sí presentan artefactos, pero en una menor cantidad.
41
Figura 25. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
Figura 26. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).
DDGG
HHiill
CCAA33
CCAA22
CCAA11 hhff
bbsscc
cccc
SS
IIPPFF ccpp MMTT
AAqq
MMMM
SSNNRR
SSNNCCDD
mmll
mmpp
Lateral: 1.90mm
Interaural: 4.84 mm Bregma: -4.16 mm
42
Figura 27. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en
un corte horizontal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
Figura 28. Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular
presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).
PPooDDGG
DDGG
DDLLGG
CCAA33
LLVV
CCAA22
CCAA11
SS
aallvv ddccww
hhff
Interaural: 5.90 mm Bregma: -4.10 mm
43
• Evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de
Parkinson
A continuación se muestran los resultados referentes a la aplicación de las
técnicas histológicas, que consistió en observar y determinar, el punto exacto de
llegada de una cánula, que había sido previamente introducida estereotáxicamente en
el cerebro de cuarenta ratas macho adultas de la cepa Sprague Dawley.
Aplicando el protocolo de tinción con Cresyl Fast Violet (Apéndice 3) se
logra observar claramente la cicatriz de la cánula introducida en una de las muestras
del estudio (flecha roja) (Fig. 29).
Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta
porción dorsal (SNCD), sustancia nigra lateral (SNL), sustancia nigra medial (SNM)
y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml: lemnisco medial; Aq:
acueducto de Silvio; CL: núcleo talámico centrolateral; DpMe: núcleo mesencefálico
profundo; LPAG: sustancia gris periacueductal; RMC: núcleo rojo (Fig. 29) (Paxinos
y Watson, 1998).
Con un lente objetivo de mayor aumento se logran observar núcleos de células
neuronales (encerrados en círculos), núcleos de neuroglia (encerrados en cuadrados) y
núcleos de microglia y astrocitos (dentro del triángulo), que se originaron como
consecuencia de la lesión (Fig. 30) (Milikowski y Berman, 2001). Esta lesión es
evidente en los cortes cerebrales puesto que, al ser una lesión unilateral, se comparan
ambos hemisferios cerebrales y, por tanto, se determina el daño provocado por la
introducción de la cánula y las sustancias en las muestras.
44
Figura 29. Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue
utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).
Figura 30. Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la
figura 29 (100X).
ccpp
SSNNRR
SSNNCCDD
SSNNMM
SSNNLL
mmll
AAqq LLPPAAGG
RRMMCC CCLL
DDppMMee
Interaural: 2.96 mm Bregma: -6.04 mm
45
Igualmente, al aplicar el protocolo de tinción con Hematoxilina y Eosina
(Apéndice 4) se logra observar claramente la cicatriz de la cánula introducida en las
muestras (flecha roja) (Fig. 31).
Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta
porción dorsal (SNCD), sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml:
lemnisco medial; DG: giro dentado; LM: Núcleo mamilar lateral; mfb: fascículo
medial del prosencéfalo; mp: pedúnculo mamilar; ns: fascículo nigroestriado (Fig. 31)
(Paxinos y Watson, 1998).
Figura 31. Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue
utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).
mmffbb ccpp
DDGG mmpp
LLMM
SSNNRR SSNNCCDD
mmll
nnss
Interaural: 3.40 mm Bregma: -5.60 mm
46
Con un lente objetivo de mayor aumento se observa un soma neuronal
(encerrado en un círculo), núcleos de astrocitos (encerrados en cuadrados) y células
de microglia y astrocitos (encerrados en el triángulo), que se originaron como
consecuencia de la lesión de la cánula. La flecha roja señala depósitos de
hemosiderina (Fig. 32) (Milikowski y Berman, 2001).
Figura 32. Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la figura 29 (400X).
47
El protocolo de tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Apéndice 5)
permitió mostrar la cicatriz de la cánula introducida en la muestra, núcleos neuronales
encerrados en círculos y núcleos de microglia y astrocitos encerrados en el triángulo
(Fig. 33) (Milikowski y Berman, 2001).
Figura 33. Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue
utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).
Seguidamente, se muestra el resultado de la llegada de la totalidad de las
cánulas del estudio (Fig. 34 y 35; apéndice 6). Los puntos color rojo, verde y azul
corresponden, respectivamente, al punto de llegada de las cánulas de los tratamientos
control (solución salina al 1%), miotoxina III (MT-III) de Bothrops asper, y la misma
toxina alquilada en su sitio activo catalítico.
48
Figura 34. Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 3.40mm y
Bregma -5.60mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.
Figura 35. Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.
49
Discusión
Para garantizar el proceso histotecnológico de corte de las muestras de cerebro
de rata fue necesario definir los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y
grosor para el corte de estas muestras en el criostato. Los resultados obtenidos
permitieron la estandarización de estos parámetros y el desarrollo del protocolo para
el corte de de los cortes de cerebros de rata utilizando el criostato Leica CM3050 S
(Apéndice 1).
De acuerdo con los resultados obtenidos, se determinó que la temperatura del
criostato para el corte de cerebros de rata está en un rango comprendido entre -24°C y
-26°C, ya que en este rango la muestra se congeló lo suficiente y por tanto se cortó
sin problemas; sin embargo, en el protocolo se establece una temperatura estándar de
-26ºC para el trabajo con estos tejidos en el criostato, debido a que, por trabajar con la
ventana deslizante del equipo abierta, aumenta la temperatura (1ºC) por corrientes de
aire que pueden entrar en la cámara.
La temperatura fue el primer factor a considerar al trabajar con este equipo, ya
que es la principal característica que lo diferencia de los demás modelos de
micrótomos existentes (García, 1993). La compañía Leica recomienda dos aspectos
importantes en relación con la temperatura a utilizar en el criostato: (1) trabajar a un
rango de -15°C y -25°C para/con tejido cerebral y (2) utilizar un medio líquido,
sintético, de montaje e imbibición hidrosoluble para cortes por congelación (Leica,
2000). El medio líquido utilizado fue el “Leica Cryocompound”, el cual facilitó el
enfriamiento del tejido, lo fijó a “la platina portamuestras”, le confirió a la muestra
una dureza que impidió su fragmentación durante el corte, y aseguró la obtención de
cortes finos y lo suficientemente delgados, regulares y homogéneos.
También, con los resultados obtenidos, se determinó que la velocidad de corte
del criostato para el corte de cerebros de rata resultó ser óptima en un rango
50
comprendido entre el 20% (42 mm/s) y el 10% (21 mm/s), ya que se obtuvieron
cortes estirados, que no se enrollaron al quitar la placa anti-roll, ni se adhirieron al
pincel, porque entre menor sea la velocidad del corte, menor serán las fuerzas
presentes entre las superficies. Sin embargo, en el protocolo se establece una
velocidad estándar de 20% (42 mm/s) para el corte de cerebros de rata en estas
condiciones.
Este resultado se refuerza con lo estipulado por Kiernan (1999), quien
establece que la velocidad del corte se ve influenciada, principalmente, por las
fuerzas no iónicas, de van der Waals y puente de hidrógeno, que aunque son fuerzas
débiles, permiten la atracción entre el tejido, el vidrio y el portacuchillas (donde se
colecta la muestra); por lo que si se trabaja con una alta velocidad de corte (mayor a
42mm/s), se provoca el roce entre las superficies y su posterior adherencia; por tanto,
entre menor sea la velocidad del corte, menor serán las fuerzas presentes entre las
superficies.
El tercer parámetro a evaluar fue el grosor del corte y con los resultados
obtenidos, se determinó que el espesor óptimo fue aquel con el cual los cortes al
microscopio se visualizaron lisos, sin arrugas y no muy gruesos.
El grosor del corte se relaciona con su observación directa al microscopio. Los
cortes demasiado gruesos permiten observar más estructuras, pero con menos
definición, ya que se superponen unas a otras (UAB, 2005). Raimundo García (1993),
en su libro “Anatomía Patológica”, establece que para el estudio del tejido nervioso
central se emplean secciones de tejido entre 10 y 30 micras. Es la densidad óptica de
cada estructura atravesada por la luz la que disminuye la amplitud de luz que la
atraviesa. Si la muestra rebasa cierto espesor, la luz, simplemente, no es capaz de
atravesarla (Ham, 1975). No obstante, lo ideal es observar con el microscopio cortes
lisos y sin arrugas, y para esto también se recomienda el uso de un revestimiento con
una solución de gelatina al 0.5% para los portaobjetos con que se recolectan los
51
cortes. Este revestimiento no solo ayuda a evitar arrugas al recolectar los cortes, sino
que permite la adherencia adecuada de la totalidad del corte, y se mantiene aún
durante el proceso de tinción. Kiernan (1999) menciona que esta adherencia se debe a
la formación de enlaces covalentes entre las proteínas del corte y los átomos de
nitrógeno de la gelatina, que son más fuertes que las fuerzas no iónicas, como las de
van der Waals y los puentes de hidrógeno, formados entre el corte y el vidrio.
Los resultados muestran diferencias entre los rangos de temperatura,
velocidad y espesor en los cortes de cerebros de rata almacenados a temperatura
ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos y aquellos
cerebros de rata no fijados, y se deben principalmente, al agente fijador presente en
unas muestras y ausente en las otras.
La fijación es una operación destinada a conservar las células, cuanto sea
posible, en el estado final en que estuvieron durante la vida; permite producir una
coagulación o una precipitación lo más completa posible de todas las sustancias
celulares, conservando la configuración correspondiente a su naturaleza amorfa
(citoplasma), granulosa (gránulos de secreción), filamentosa (condrioma), etc. Por
tanto, Alzola (2001) explica que si las células no son congeladas o fijadas, las
sustancias celulares pueden perderse por solución simple, por diálisis o por
ingurgitación osmótica de las células en el proceso que debe preceder al corte y a la
tinción.
Ahora bien, el formaldehído es el fijador más utilizado, debido a su alto poder
de penetración en el tejido, su bajo costo y facilidad de empleo. Cuando se utiliza
puro es un mal fijador, produce hinchamiento de los tejidos y vacuoliza las células,
por lo que generalmente se usa en mezclas fijadoras y es uno de los mejores fijadores
para el sistema nervioso (Alzola, 2001; Beresford, 2000). En el caso del criostato
CM3050 S, la compañía Leica recomienda trabajar con tejidos sin fijar; no obstante,
dado que las cuarenta muestras de cerebro se encontraban, previo al desarrollo de este
52
trabajo práctico, embebidas en una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y
fosfatos, se tuvo que realizar la estandarización del protocolo tanto en muestras
fijadas, como en muestras sin fijador.
En relación con la interpretación de los cortes histológicos obtenidos, Geneser
(2000) destaca que la imagen microscópica, su intensidad y grado de color, dependen
de la calidad de la coloración empleada, de la solución de trabajo (pH, concentración,
estabilidad, etc.) y del procedimiento técnico utilizado. Los colorantes son
fundamentales para permitir la visualización de los tejidos y sus componentes al
microscopio y deben cumplir con una condición esencial en este proceso y es su
constancia en todas las preparaciones histológicas obtenidas de distintos individuos
de una misma especie animal (Geneser, 2000). El fundamento de cualquier método de
tinción radica en la propiedad que poseen todos los tejidos para incorporar y fijar de
modo variable los colorantes (García, 1993).
Los resultados obtenidos con los colorantes Azul de Metileno, Cresyl Fast
Violet, Hematoxilina y Eosina, y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet, se
correlacionan con los obtenidos por Carl Rüdeberg (1967), Aldana et al. (1996), Carl
Busch (1877), y Heinrich Klüver y Elizabeth Barrera (1954), respectivamente. La
escogencia de los colorantes utilizados en este estudio radica en la especificidad de
cada uno para teñir elementos presentes en el tejido nervioso.
El Azul de Metileno es un colorante catiónico, es decir, tiñe grupos tisulares
con carga negativa (basófilos); por tanto, lo que tiñó de color azul fueron núcleos
celulares y en celeste el citoplasma celular (Beresford, 2000; Ham, 1975). Esta
tinción se utilizó con éxito para una localización rápida (se dejó reposando por un
tiempo de 30 segundos en el corte), y observar al microscopio la región en la que se
estaba y determinar si se tomaban esos cortes o si se seguía desbastando la muestra.
En este estudio se determinó que, por cada neurona hay entre diez a cincuenta células
de la glía, y Junqueira y Carneiro (1996) refuerzan esta idea y estipulan además que,
53
en virtud del menor tamaño de las células de la neuroglia, éstas ocupan
aproximadamente la mitad del volumen del tejido.
El Cresyl Fast Violet es un colorante básico, es decir, que al igual que el Azul
de Metileno tiñe grupos tisulares ácidos (basófilos); por tanto, tiñó de color violeta
los núcleos celulares y los corpúsculos de Nissl presentes en el soma neuronal, y en
lila el citoplasma celular. Entre las tinciones utilizadas en este estudio, ésta presenta
la ventaja que permite definir mejor los elementos del sistema nervioso. Ham (1975)
menciona al respecto que, al tratar el corte con un solo colorante, aumenta el
contraste entre los componentes celulares y extracelulares, ya que captan de manera
diferencial el colorante.
La Hematoxilina es un colorante catiónico y la Eosina es aniónico, por lo que
permiten observar los núcleos neuronales de color rosado oscuro – morado y el
citoplasma celular en color rosado claro (Beresford, 2000; UAM, 2007). La Eosina es
un colorante muy utilizado como contratinción para la Hematoxilina; se usa para teñir
ciertos componentes tisulares que no son visibles con el colorante principal. Estas
tinciones presentan un mecanismo físicoquímico de coloración tisular, que está
vinculado a la formación de uniones intermoleculares por atracción electrostática; es
decir, que se basan en la propiedad de ligarse entre sí, que poseen las moléculas de
carga eléctrica contraria, de manera que la Hematoxilina, al ser un colorante básico
tiñe las estructuras ácidas, y viceversa en el caso de la Eosina (García, 1993). En el
proceso de coloración con estas tinciones hay un paso que se denomina
“azulamiento” y consiste en el uso de un ácido (HCl) seguido de una base
(Bicarbonato de Sodio) con el fin de reforzar la tinción de la Hematoxilina y
prepararla para la contratinción con la Eosina (IHC World, 2007a).
La tinción con Luxol Fast Blue tiñe la mielina de color azul y las neuronas
color violeta-azul, debido a que el colorante tiene una alta afinidad por los lípidos y
bases de colina, presentes en la mielina; por tanto, se establece que este colorante es
54
selectivo para estos componentes celulares. La mielina rodea al axón de las neuronas
y lo aísla con el fin de que se lleve a cabo la conducción del impulso nervioso y que
no se pierda corriente eléctrica (Alberts et al., 2004). La técnica de coloración se
fundamenta en una reacción ácido-base con formación de sal; el Luxol Fast Blue
forma precipitados insolubles con las lipoproteínas presentes en la mielina, por lo que
queda retenido tras la diferenciación (García, 1993; Sheehan y Hrapchak, 1980).
Se pueden apreciar con detalle ciertas estructuras celulares del tejido nervioso
al utilizar los lentes objetivos cuyo aumento microscópico permite observar los cortes
a 400X. Se observa que de los elementos de la glía solo se visualizan con claridad sus
núcleos, esparcidos entre los núcleos de las neuronas, que son de dimensiones
mayores. Además, el citoplasma y las prolongaciones de las células de la neuroglia no
son visibles, ya que se confunden con las prolongaciones de las células nerviosas.
Junqueira y Carneiro (1996) mencionan que la forma del núcleo, denso y alargado, de
las células de la microglia facilita su identificación, pues el núcleo de las otras células
de la neuroglia es esférico.
Con el fin de realizar los cortes coronales del cerebro de las cuarenta muestras
almacenadas en una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos era
necesario ubicar la zona específica de la sustancia nigra para poder determinar el
punto exacto de llegada de las cánulas en los cerebros; para ello se usó el Atlas “The
Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”, que permitió el ajuste del ángulo de corte de
las muestras en sus ejes x-, y-, z- hasta obtener secciones paralelas a los planos
observados en el Atlas.
En relación con los cortes histológicos del estudio del modelo animal de la
enfermedad de Parkinson, en los que se aprecia la cicatriz dejada por las cánulas
introducidas a los cerebros de rata, se puede establecer que debido a la destrucción
celular provocada por la cánula, se observa un aumento de las células de la neuroglia,
que funcionan como un sistema de reparación. Junqueira y Carneiro (1996)
55
establecen que, como las neuronas no se dividen, su destrucción representa una
pérdida permanente, y que en contraste, las células de la neuroglia están dotadas de
gran capacidad de reproducción. Su número y su fisiología dependen de los diversos
estados del desarrollo y de las condiciones fisiológicas, por lo que las células gliales
aumentan en número e incrementan su actividad metabólica ante una reacción a la
degeneración neuronal, ó también, ante una reacción secundaria a los procesos
patológicos que producen la degeneración neuronal (Junqueira y Carneiro, 1996).
Los astrocitos participan con la microglia en actividades fagocíticas,
eliminando restos de tejido nervioso (Spranger y Fontana, 1996). Luego de la muerte
neuronal por procesos patológicos, los astrocitos proliferan y llenan los espacios
previamente ocupados por las neuronas, fenómeno conocido como gliosis de
reemplazo (Junqueira y Carneiro, 1996). Las células de la microglia, actúan como
macrófagos, es decir, células representantes del sistema inmunológico en el SNC.
Estas células pueden permanecer en estado quiescente durante largos periodos de
tiempo y pueden modificar su comportamiento en respuesta a diversas señales
provenientes del entorno celular y llegar a actuar como macrófagos fagocíticos
cerebrales (Junqueira y Carneiro, 1996; Spranger y Fontana, 1996).
En uno de los cortes obtenidos del estudio del modelo animal de la
enfermedad de Parkinson se observaron restos de hemosiderina, debido a una
hemorragia provocada por la cánula. Walter (1963) menciona que la hemosiderina es
un pigmento de color amarillo y aspecto cristalino que deriva de la hemoglobina
cuando hay más hierro del necesario en el cuerpo. Su depósito patológico en las
células se denomina hemosiderosis y se forma por descomposición del grupo hemo
de la hemoglobina (UMSNH, 2007). Los restos de hemosiderina se evidencian y
distinguen de los demás componentes tisulares puesto que la hemoglobina se tiñe de
color rojo con el colorante Eosina Y (García, 1993).
56
Es importante recordar que al ser un modelo de lesión unilateral se pueden
comparar ambos hemisferios cerebrales en un mismo animal; por tanto, en cada corte
obtenido, al estar solamente un hemisferio lesionado, se tiene un control del daño
provocado por la introducción de la cánula y las sustancias y se puede entonces
relacionar el daño observado con los resultados obtenidos con los estudios en
neuroquímica y en conducta.
Conviene apreciar también que lo que se desea es llevar al microscopio una
preparación en la cual los tejidos estén perfectamente conservados, presentando la
misma estructura y composición química. Sin embargo, por las técnicas que se
emplean en la preparación, los cortes pueden no ser representaciones exactas, y
surgen alteraciones conocidas como artefactos, producto del procesamiento y la
manipulación humana. Según Ham (1975), en la preparación de un corte, en cualquier
etapa puede ocurrir algo que haga menos perfecto el producto final. Con base en ese
principio, los artefactos señalados en los cortes, en este estudio, pueden derivar de las
sustancias químicas empleadas en la técnica histológica, como el xileno, que provoca
retracción del tejido; o por errores de corte causados por una cuchilla imperfecta; o
que ocurra un plegamiento del corte al recolectarlo; o por el fijador, en este caso la
formalina, que puede causar precipitaciones de cristales; o bien, una manipulación
poco cuidadosa del tejido fresco, cuando se extrajo del animal.
Finalmente, se puede manifestar que la presente investigación permitió, de
una forma exitosa, la implementación y estandarización de las técnicas propuestas, de
corte y tinción, para el reconocimiento de regiones cerebrales de rata, para así poder
utilizarse en diferentes proyectos involucrados con el estudio del sistema nervioso.
57
Conclusiones
De la presente investigación se concluye que:
− Es necesario reducir las piezas a delgadas secciones histológicas y
posteriormente teñirlas con colorantes afines para visualizar las características
microscópicas de los tejidos cerebrales de rata.
− Los cerebros de rata se deben trabajar a una temperatura de -26ºC, una
velocidad de corte de 20% (42 mm/s) y un grosor de 25 µm, en el criostato
Leica CM3050 S.
− Los colorantes Azul de Metileno, Cresyl Fast Violet, Hematoxilina y Eosina,
y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet, permiten la visualización
microscópica de las estructuras presentes en los cortes de cerebro de rata.
− Los colorantes permiten una identificación de tejido cerebral sano y
disfuncional en los cortes cerebrales de rata.
− La evaluación histológica del modelo conductual de la enfermedad de
Parkinson logró determinar el punto exacto de llegada de la cánula,
introducida unilateralmente en el cerebro de ratas macho de la cepa Sprague
Dawley.
− La Histología es una herramienta que permite entender los cambios
funcionales ocurridos en el individuo y relacionarlos con aquellos
estructurales.
58
Recomendaciones
Se recomienda hacer uso de mascarilla (tapa boca) durante el trabajo en el criostato y
mantener cerrada la ventana deslizante del mismo cuando no se esté trabajando
dentro de la cámara, esto con el fin de evitar la formación de escarcha en las paredes
de la cámara y en el micrótomo, y la contaminación de los cortes cerebrales.
Se recomienda guardar piezas importantes, como los pinceles, dentro de la cámara,
con el fin de facilitar el trabajo con los cortes cerebrales.
Se recomienda realizar el proceso de desbaste de la muestra en los extremos de la
cuchilla y el proceso de corte de la muestra, propiamente, en el centro de la misma.
Utilizar guantes en todo momento y especialmente durante el desarrollo del protocolo
de revestimiento de los portaobjetos con gelatina, con el fin de evitar contaminar y
manchar la superficie de estos. Se recomienda el uso de guantes de nitrilo para
trabajar con sustancias químico-tóxicas, como el xileno y las soluciones de tinción.
Además, utilizar el equipo de protección adecuado al manipular sustancias irritantes,
como la formalina y el xileno.
La Solución de Trabajo de Azul de Metileno al 0.25% puede conservarse en un
gotero, a temperatura ambiente, ya que basta una gota para teñir el corte; y el
excedente del uso de esta solución puede decantarse en una cubeta para reciclar.
Los excedentes de los demás colorantes se pueden recolectar en un frasco ámbar y
llevarlo a la Facultad de Química de la Universidad de Costa Rica, donde se le da un
tratamiento adecuado a este tipo de desechos.
En cuanto a la visualización de las láminas ya listas de los cortes de cerebro de rata,
se recomienda limpiar tanto los oculares como la muestra con el papel adecuado o
59
con algún tejido suave, tipo franela, ya que pueden observarse manchas irregulares y
que no corresponden a artefactos del corte per sé.
Se recomienda la búsqueda de otra solución fijadora, diferente a la formalina, para los
cerebros de rata. Esto debido a que los trabajos experimentales en el Programa de
Investigación en Neurociencias involucran una numerosa cantidad de muestras
cerebrales, y estas deben ser extraídas de las ratas el mismo día, y por tanto
almacenarse en una solución adecuada que preserve las muestras.
60
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64
Anexo 1. Panel de mandos del Criostato Leica CM3050 S (Leica, 2000).
65
Anexo 2. Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con (3-Aminopropyl)-
triethoxysilane (Sigma, A3648)
Previo al revestimiento, se realizó un proceso de lavado de los portaobjetos; se
embebieron las láminas en HCl 2M durante cinco minutos, luego se le dieron dos
baños en alcohol 95%, de cinco minutos cada uno, y se dejaron secando por diez
minutos a 40°C en un horno DELTA A Series.
Seguidamente, se procedió a sumergir los portaobjetos en una solución al 4% de (3-
Aminopropyl)triethoxysilane en acetona, y se mantuvieron por un periodo de dos
minutos. Se lavaron tres veces en agua destilada y se dejaron secando una hora a
40°C en el horno DELTA A Series. Por último, se almacenaron en cajas, a
temperatura ambiente.
Nota importante: Utilizar guantes durante el desarrollo del protocolo y para la
manipulación de los portaobjetos, y sobretodo no tocar con los dedos la superficie de
estos.
66
Anexo 3. Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con gelatina (Food Grade-
Merck, #1.04078.0500)
Previo al revestimiento, se realizó un proceso de lavado de los portaobjetos, con el fin
de eliminar sustancias oleicas y otras que pudieran interferir en el proceso de tinción
posterior; se embebieron las láminas en HCl 2M durante cinco minutos,
seguidamente se le dieron dos baños en alcohol 95%, de cinco minutos cada uno, y se
dejaron secando por diez minutos a 40°C en un horno DELTA A Series.
Posteriormente, se sumergieron tres veces en una solución de gelatina al 0.5%,
previamente filtrada, y se dejaron secando a 40°C en el horno DELTA A Series,
durante 48 horas. Finalmente, se almacenaron en cajas, a temperatura ambiente, hasta
su utilización.
Nota importante: Utilizar guantes durante el desarrollo del protocolo y para la
manipulación de los portaobjetos, y sobretodo no tocar con los dedos la superficie de
estos.
67
Apéndice 1. Protocolo para el corte de los cerebros de rata utilizando el criostato
Leica CM3050 S.
1. Ajustar la temperatura del criostato a –26°C, y esperar a que el equipo se
estabilice a dicha temperatura antes de iniciar el trabajo.
2. Aplicar una cantidad suficiente de “medio de montaje” (Leica
Cryocompound) sobre una “platina porta-muestras”, a temperatura ambiente.
3. Montar la muestra de cerebro, sobre la “platina porta-muestras” y orientar el
tejido teniendo el cuidado de posicionar la parte superior del cerebro en donde
se señala en la platina.
4. Recubrir el tejido superficialmente con el “medio de montaje” (Leica
Cryocompound) e inmediatamente colocar la platina con la muestra en uno de
los diez orificios del “bloque de congelación rápida” del criostato. Dejar
reposando diez minutos con el fin de que disminuya la temperatura de la
muestra y alcance la temperatura de la cámara.
5. Montar la platina con la muestra en el “termobloque” del criostato, acercar la
muestra a la cuchilla y ajustar la “ventana de corte” de la muestra.
6. Desbastar la muestra hasta obtener secciones completas de la superficie total
del tejido.
7. Ajustar el ángulo de corte de la muestra, orientándola en sus ejes x-, y-, z-.
8. Ajustar el grosor del corte a 25µm y utilizar una velocidad de corte del 20%
(42mm/s).
68
Apéndice 2. Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de
grosor, con Azul de Metileno (Modificado a partir del protocolo de Rüdeberg
(1967)).
1. Preparar una Solución de Trabajo de Azul de Metileno al 0.25%, en agua
destilada, y añadir diez gotas de alcohol 95%.
2. Añadir la Solución de Trabajo, con un gotero, sobre un portaobjetos con un
corte de tejido de cerebro de rata.
3. Esperar 30 segundos y lavar tres veces en agua destilada.
69
Apéndice 3. Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de
grosor, con Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo de Aldana et al.
(1996)).
1. Preparar una Solución de Trabajo de Cresyl Fast Violet al 0.1%, en agua
destilada; disolver el colorante removiendo la solución con un agitador
magnético a una temperatura entre 50-60 °C durante 30 minutos e
inmediatamente filtrar la solución para evitar grumos.
2. Añadir la Solución de Trabajo, con un gotero, sobre un portaobjetos con
muestra de tejido de cerebro de rata.
3. Esperar 5 minutos y lavar dos veces en agua destilada.
4. Añadir alcohol 70%, durante 30 segundos, sobre el portaobjetos con la
muestra de tejido, y decantar el líquido. Repetir este paso con alcohol 95% y
luego con alcohol absoluto.
5. Aplicar una gota de xileno, a cada corte de cerebro de rata del portaobjetos, y
añadir el medio de montaje al cubreobjetos para fijarlo al portaobjetos.
6. Reposar el portaobjetos, mínimo una hora, antes de observar la muestra al
microscopio.
70
Apéndice 4. Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de
grosor, con Hematoxilina y Eosina (Modificado a partir del protocolo de Bush
(1877)).
1. Preparar una Solución de Trabajo de Eosina al 30%, en alcohol 95%; y una
solución de Bicarbonato de Sodio al 1%, en agua destilada.
2. Sumergir un portaobjetos, con muestra de tejido de cerebro de rata, en una
batería con la solución lista para usar de Hematoxilina al 1%.
3. Esperar 3 minutos y lavar dos veces en agua destilada.
4. Cubrir la muestra con unas gotas de HCl 1N, hasta decolorar el tejido
(aproximadamente 4 segundos), decantar la solución y aplicar, seguidamente,
la solución de Bicarbonato de Sodio al 1% hasta oscurecer el tejido
(tornándose nuevamente color morado-azul); por último, lavar la muestra en
agua destilada.
5. Sumergir la muestra en una batería con la Solución de Trabajo de Eosina al
30%.
6. Esperar 3 minutos y lavar dos veces en agua destilada.
7. Añadir alcohol 70%, durante 30 segundos, sobre el portaobjetos con la
muestra de tejido, y decantar el líquido. Repetir este paso con alcohol 95% y
luego con alcohol absoluto.
8. Aplicar una gota de xileno, a cada corte de cerebro de rata del portaobjetos, y
añadir el medio de montaje al cubreobjetos para fijarlo al portaobjetos.
9. Reposar el portaobjetos, mínimo una hora, antes de observar la muestra al
microscopio.
71
Apéndice 5. Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de
grosor, con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo
de Klüver y Barrera (1954)).
1. Preparar una Solución de Trabajo de Luxol Fast Blue 0.1%, en agua destilada,
y añadir 0.5mL de Ácido Acético 10%. Preparar, además, una solución de
Carbonato de Litio 0.05%, en agua destilada.
2. Sumergir un portaobjetos, con muestra de tejido de cerebro de rata, en una
cubeta tipo Coplin con la solución de Luxol Fast Blue 0.1%, durante la noche
(aproximadamente 12 horas), a 60°C.
3. Lavar el exceso de colorante en alcohol 95% y luego en agua destilada,
contando 5 segundos en cada líquido.
4. Sumergir el portaobjetos en la solución de Carbonato de Litio 0.05%, durante
5 segundos.
5. Seguidamente, sumergir el portaobjetos, por un tiempo de 30 segundos, en
alcohol 70% y luego lavar en agua destilada.
6. Realizar un contratinción con la Solución de Trabajo de Cresyl Fast Violet al
0.1%, siguiendo el protocolo anteriormente mencionado.
72
Apéndice 6. Resultados y características del tratamiento histológico realizado a los cuarenta cerebros de rata en el estudio de la enfermedad de Parkinson.
MUESTRA TRATAMIENTO OBSERVACIONES
MTE4R01 Control Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R02 Control Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R03 Control Total de portaobjetos: 6. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R04 Control Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R05 Miotoxina Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R06 Miotoxina Total de portaobjetos: 3. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R07 Miotoxina Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R08 Miotoxina Total de portaobjetos: 3. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R09 Miotoxina Total de portaobjetos: 6. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R10 Miotoxina Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R11 Miotoxina Total de portaobjetos: 7. Tinción con HyE realizada por
Juan José Ramírez Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R12 Miotoxina Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R13 Miotoxina Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R14 Miotoxina Total de portaobjetos: 8. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R15 Miotoxina Total de portaobjetos: 2. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R16 Miotoxina Total de portaobjetos: 3. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R17 Miotoxina Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
-continúa en la siguiente página-
73
Continuación del Apéndice 6
MUESTRA TRATAMIENTO OBSERVACIONES
MTE4R18 Miotoxina Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R19 Miotoxina Hematoma en el cerebro. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R20 Miotoxina Total de portaobj: 5. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R21 Control Total de portaobjetos: 5. Tinción con Cresyl Violeta
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R22 Control Total de portaobj: 6. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R23 Control Total de portaobjetos: 12. Tinción con HyE, Cresyl
Violeta y Luxol Fast Blue Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R24 Control Total de portaobjetos: 12. Tinción con HyE, Cresyl
Violeta y Luxol Fast Blue Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R25 Control Total de portaobjetos: 3. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm Se observaron restos de hemosiderina en la cicatriz
MTE4R26 Control Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R27 T+alquil Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R28 T+alquil Total de portaobjetos: 3. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R29 T+alquil Total de portaobjetos: 2. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R30 T+alquil Total de portaobjetos: 3. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R31 T+alquil Total de portaobjetos: 2. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R32 T+alquil
Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm El fin de la cánula se observó en la zona del pedúnculo
cerebral
-continúa en la siguiente página-
74
Continuación del Apéndice 6
MUESTRA TRATAMIENTO OBSERVACIONES
MTE4R33 T+alquil Total de portaobjetos: 2. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R34 T+alquil Individuo murió antes de terminar experimento
MTE4R35 T+alquil Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE
Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R36 T+alquil Total de portaobj: 12. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R37 T+alquil Total de portaobj: 8. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R38 T+alquil Total de portaobj: 6. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm
MTE4R39 T+alquil Total de portaobj: 8. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm
MTE4R40 T+alquil Total de portaobj: 6. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm