Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken...
Transcript of Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken...
Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken met als toepassing de
detectie van waterstofperoxide
Hans Buschop Scriptie voorgelegd tot het behalen van de graad van licentiaat in de scheikunde
Academiejaar 2005-2006
Promotor: prof. dr. A. Adriaens Copromotor: dr. K. De Wael
FACULTEIT WETENSCHAPPEN
Vakgroep Analytische Chemie
Aan iedereen die op één of andere manier bijgedragen heeft tot dit werk:
Bedankt!
Inhoudstabel Inleiding 1 Hoofdstuk 1 Biochemie en Eiwitelektrochemie 3 1.1 Eiwitten 3 1.2 Enzymen 5 1.3 Eiwitelektrochemie 13 Hoofdstuk 2 Experimentele technieken 16 2.1 Cyclische voltammetrie 16 2.2 Ramanspectroscopie 25 Hoofdstuk 3 Experimentele opstelling 27 3.1 Drie-elektrodensysteem 27 3.1.1 De elektrochemische cel 27 3.1.2 Elektroden 29 3.2 Reagentia 32 3.2.1 Bufferoplossingen 32 3.2.2 Linkers 34 3.2.3 HCC en CCP 35 3.2.4 Doelmolecule 35 3.3 Meetapparatuur 35 Hoofdstuk 4 Elektrochemisch onderzoek naar een geschikte bufferoplossing 37 4.1 Voltammetrisch gedrag van een Tris bufferoplossing 37 4.1.1 Goud als werkelektrode 38 4.2.1 Glasachtig koolstof als werkelektrode 40 4.2 Voltammetrisch gedrag van een Mes bufferoplossing 42 4.2.1 Goud als werkelektrode 42 4.2.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode 43 4.3 Voltammetrisch gedrag van een HEPES bufferoplossing 44 4.3.1 Goud als werkelektrode 45 4.3.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode 46
4.4 Welke buffer verder gebruiken? 48 Hoofdstuk 5 Elektrochemisch gedrag van HCC 50 5.1 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een glasachtig koolstofelektrode 50 5.2 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een goudelektrode 52 5.2.1 4,4’-bipyridyl als linker 52 5.2.2 6-mercaptohexanol als linker 54 5.2.3 5-carboxy-1-pentaanthiol als linker 56 5.2.4 7-carboxy-1-heptaanthiol als linker 58 5.2.5 Overige linkers 59 Hoofdstuk 6 Elektrochemisch gedrag van CCP 61 6.1 Linkers 61 6.2 HCC als mediator voor CCP 63 Hoofdstuk 7 Detectie van waterstofperoxide aan een HCC/CCP gemodificeerde goudelektrode 67 7.1 4,4’-bipyridyl als linker 67 7.2 6-mercaptohexanol als linker 71 Samenvatting en besluit 75 Literatuurlijst 77
1
Inleiding
In 1792 publiceerde Luigi Galvani (1737-1798) zijn beroemde experimenten waarbij hij
stroom zette op de kikkerpoten van dode kikkers (zie figuur 1). Door deze stroom maakten de
kikkerpoten schokbewegingen. Dit experiment kan men beschouwen als het eerste
rudimentair ‘bioelektrochemisch’ experiment.
Figuur 1 Het labo van Luigi Galvani.
Het eerste van de bio-elektrochemische experimenten, zoals ze de dag van vandaag gekend
zijn, was de immobilisatie van paardenhart cytochroom c aan een elektrode. Dit experiment
werd onafhankelijk van elkaar en gelijktijdig uitgevoerd in 1977 door Hill [1] en door
Kuwana [2], respectievelijk aan een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode en een
indiumoxide elektrode. Sindsdien zijn verschillende eiwitten en enzymen geïmmobiliseerd
aan een elektrode om zo de kinetische parameters van deze eiwitten en enzymen te
bestuderen.
Meer recent wordt vooral onderzoek verricht naar de ontwikkeling van biosensoren en wordt
getracht om één enkel eiwit of enzym te immobiliseren om zo een beter beeld te krijgen van
de kinetiek van het eiwit of enzym [3,4].
2
In dit werk is het de bedoeling fundamenteel onderzoek te verrichten naar de immobilisatie
van redoxenzymen aan een elektrodeoppervlak. Als toepassing wordt in dit werk gebruik
gemaakt van een geïmmobiliseerd redoxenzym om waterstofperoxide te detecteren. Het
voordeel om waterstofperoxide te detecteren met behulp van een biosensor is de lage
concentraties waterstofperoxide die gemeten kunnen worden en de snelle detectie. Dit is
vooral van belang voor de klinische diagnose, de chemische en farmaceutische industrie en de
biologische en medische wetenschappen.
Eerst wordt gezocht naar een geschikte bufferoplossing waarin de elektrochemische
experimenten kunnen plaatsvinden. Deze bufferoplossing moet stabiel zijn en moet
elektrochemisch inert zijn in het potentiaalgebied waarin respons van de eiwitten en enzymen
verwacht wordt.
Na dit vooronderzoek wordt de afzetting van het eiwit paardenhart cytochroom c (HCC) en
het enzym Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP) bestudeerd. De gebruikte
elektroden worden al dan niet gemodificeerd met een linker om de immobilisatie van het eiwit
of enzym mogelijk te maken.
Tenslotte wordt waterstofperoxide gedetecteerd door gebruik te maken van het
geïmmobiliseerde CCP.
3
Hoofdstuk 1 Biochemie en eiwitelektrochemie
In dit hoofdstuk worden de biochemische aspecten van het in dit werk gebruikte eiwit
paardenhart cytochroom c (HCC) en het enzym Rhodobacter capsulatus cytochroom c
peroxidase (CCP) toegelicht. Tevens wordt een korte inleiding tot eiwitelektrochemie
gegeven.
1.1 Eiwitten [5,6]
Een eiwit of een proteïne is een biopolymeer dat bestaat uit één of meerdere ketens van
aminozuren verbonden door peptidebindingen. Deze verbindingen zijn essentieel voor
levende organismen. De functies die eiwitten uitvoeren zijn vaak van structurele of metabole
aard. Zo zorgen ze bijvoorbeeld voor de celstructuur (bv. collageen het hoofdbestanddeel van
pezen en ander bindweefsel). Tevens verzorgen ze vele levensfuncties, zoals transport van
voedingsstoffen, aanmaak van lichaamseigen stoffen en vertering. Dergelijke proteïnen die
reacties katalyseren worden enzymen genoemd (zie paragraaf 1.2).
Een eiwit vouwt zich op tot een unieke drie-dimensionale vorm die wordt bepaald door de
onderlinge aantrekking en afstoting van de samenstellende aminozuren. De vorm waarin een
proteïne zich onder normale omstandigheden vouwt noemt men de natieve conformatie van
het eiwit. In de structurele organisatie van eiwitten onderscheidt men 4 niveaus:
- primaire structuur: de aminozuursequentie, de keten wordt bij elkaar gehouden door
covalente bindingen. De lineaire, ééndimensionale structuur komt overeen met de
lineaire informatie in DNA die afgelezen en vertaald wordt door de cellulaire
machinerie voor de eiwitsynthese.
- secundaire structuur: het eiwit stabiliseert en vouwt lokaal op. De eerste structurele
elementen, zoals α-helix en β-plaat ontstaan. Deze structuurelementen worden vooral
gestabiliseerd door middel van waterstofbruggen.
- tertiaire structuur: het eiwit vouwt zich op tot zijn compacte, natuurlijke vorm.
Verdere stabilisatie treedt op door aantrekkingskrachten tussen de verschillende delen
4
van de eiwitketen, zoals hydrofobe interacties, ioneninteracties en disulfidebruggen.
Vooral niet-covalente interacties tussen de zijketens spelen een rol. Voor eiwitten die
uit één keten bestaan is dit de biologisch actieve vorm.
- quaternaire structuur: de vorm die voortkomt uit de associatie van meerdere
eiwitketens, die op zichzelf reeds een tertiaire structuur bezitten, ook het eiwitcomplex
genoemd.
Paardenhart cytochroom c (HCC)
Eén van de eiwitten die in dit onderzoek gebruikt wordt, is paardenhart cytochroom c (HCC).
Cytochromen zijn redox-actieve proteïnen die in alle organismen, behalve in enkele obligaat
anaeroben, voorkomen. Ze bevinden zich in het binnenste membraan of in de
intermembranaire ruimte van de mitochondriën en zijn wateroplosbare, mobiele
elektrondragers. Deze proteïnen binden haemgroepen waarin zich een ijzeratoom bevindt dat
kan variëren tussen de Fe2+ en de Fe3+ valentietoestand tijdens het elektrontransport. Onder de
term ‘haem’ wordt elk ijzerchelaat van een tetrapyrrool verstaan.
Figuur 1.1 Structuur van Paardenhart cytochroom c [7].
5
Paardenhart cytochroom c, waarvan de structuur getoond wordt in figuur 1.1, staat in voor de
elektronenoverdracht naar enzymen die reducties of oxidaties uitvoeren. Deze enzymen
moeten na de elektronenoverdracht terug gereduceerd worden.
1.2 Enzymen [5,6]
Een enzym is een eiwit dat een bepaalde reactie versnelt, ook katalysator genoemd. Het maakt
een biologische reactie in een cel mogelijk of versnelt deze reactie. Het enzym verandert
hierbij niet van samenstelling en wordt niet verbruikt. Het bindt zich tijdens de reactie met het
substraat, met vorming van een enzym-substraat-complex. Dit complex zorgt ervoor dat de
reactie en omzetting van het substraat doorgaan. Na de reactie valt het enzym-substraat-
complex uit elkaar tot product en enzym.
enzym + substraat → enzym-substraat-complex → enzym + product
De binding van het substraat met elk enzym gebeurt op een verschillende manier. Enzymen
worden na de reactie direct omgezet tot hun oorspronkelijke actieve toestand zodat het enzym
opnieuw substraat kan binden en de reactie opnieuw kan katalyseren. Het lichaam maakt
enzymen zelf aan.
De reactiesnelheid van een enzym is afhankelijk van de temperatuur, de zuurtegraad en de
concentratie van enzym en substraat:
- temperatuur: de ruimtelijke structuur van enzymen en eiwitten wijzigt met de
temperatuur. Zo zijn de meeste enzymen inactief bij lage temperatuur en wordt de
werking van het eiwit ook geblokkeerd door denaturatie. Ieder enzym heeft bij een
bepaalde temperatuur een optimale activiteit. Bij zoogdieren is deze temperatuur
meestal de lichaamstemperatuur.
- zuurtegraad: ieder enzym heeft ook een bepaalde pH-waarde waarbij de
enzymactiviteit een maximum bereikt.
6
Veel enzymen zijn efficiënter dan tot nu toe door de mens ontworpen katalysatoren. Daarom
worden enzymen dikwijls gebruikt in industriële processen, bijvoorbeeld in de
voedselbereiding. Zonder enzymen zouden stofwisselingsprocessen in de organismen zeer
traag verlopen.
Enzymen worden benoemd naar het proces dat zij katalyseren, gevolgd door de uitgang –ase:
- oxidoreductasen: katalyseren oxidatie- en reductiereacties. Hieronder vallen de
enzymen hydrogenase, oxidasen, peroxidasen, reductasen, transhydrogenasen en
hydroxylasen.
- transferasen: katalyseren groepsoverdrachtsreacties zoals methyl-, carboxyl-, acyl-,
glycosyl-, amino- of fosfaatgroepoverdracht. Hiertoe behoren onder andere
transfosfatasen (kinasen) en de transaminasen.
- hydrolasen: katalyseren hydrolyses. Enzymen uit deze groep zijn onder andere
peptidasen, esterasen, glycosidasen en fosfatasen.
- lyasen: katalyseren splitsing van C-C, C-O en C-N bindingen door middel van
eliminatiereacties. Enzymen uit deze groep zijn decarboxylasen en dehydratasen.
- isomerasen: katalyseren isomerisatiereacties. Hieronder vallen racemasen en
epimerasen.
- ligasen: katalyseren de koppeling van twee substraten waarbij een binding van een
koolstofatoom met een ander atoom gevormd wordt (meestal zuurstof, stikstof of
zwavel). Tot deze groep behoren onder andere synthetasen en carboxylasen.
Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP)
Cytochroom c peroxidasen komen voor in gist en bacteriën en beschermen het organisme
tegen toxische peroxiden. Het enzym dat in dit werk gebruikt wordt is het Rhodobacter
capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP). Cytochroom c peroxidase van Rhodobacter
7
capsulatus is een bacterieel enzym gelegen in het periplasma. Dit enzym behoort tot de
oxidoreductasen en staat in voor de detoxificatie van het organisme door de reductie van
waterstofperoxide te katalyseren. Bacterieel CCP is een enzym dat twee haemgroepen bevat
waarin zich telkens één ijzeratoom bevindt. De reductie van waterstofperoxide gebeurt
volgens volgende reactie [8]:
2 Cyt c (Fe2+) + H2O2 + 2 H+ → 2 cyt c (Fe3+) + 2 H2O
Het cytochroom c (cyt c), aanwezig in de cellen, fungeert als initiële elektrondonor. CCP
komt niet voor in de reactievergelijking aangezien CCP als katalysator voor deze reactie
optreedt.
C
Q107
H74
M118
W97
M278
LP
HP
Ca2+
N
Figuur 1.2 Structuur van Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase [8].
Figuur 1.2 toont de driedimensionale structuur van het CCP enzym. Het waterstofperoxide
bindt aan de laagpotentiaal haemgroep (LP) en de elektronen voor de reductie komen binnen
via de hoogpotentiaal haemgroep (HP). De hoogpotentiaal haemgroep heeft een potentiaal
van +29 mV ten opzichte van de verzadigde kalomelelektrode (VKE), de laagpotentiaal
haemgroep varieert tussen -431 tot -500 mV ten opzichte van de VKE. In het midden van het
eiwit bevindt zich een calciumion. Dit calciumion is van belang voor de werking van het
enzym. Dit wordt verduidelijkt in figuur 1.3 [8].
8
Figuur 1.3 Schematische voorstelling van de werking van CCP [8].
Figuur 1.3 toont de ijzerionen van de haemgroepen en hun directe omringing. Het
overgeproduceerde enzym bevindt zich in zijn inactieve, geoxideerde vorm, namelijk 3 3( ) ( )LP HPFe Fe+ +− . Een elektrondonor (cytochroom c in levende organismen, elektrode in
elektrochemische toepassingen) brengt het enzym in zijn gemengde valentie vorm, namelijk 3 2( ) ( )LP HPFe Fe+ +− . Deze vorm is nog steeds inactief. Door tussenkomst van het calciumion, dat
zich in het CCP bevindt, ontstaat de door calcium geactiveerde gemengde valentievorm.
Hierbij wordt de binding tussen histidine 74 en het 3( )LPFe + -ion verbroken. Op deze lege plaats
kan het waterstofperoxide binden. Vervolgens wordt het gereduceerd waarbij elk ijzeratoom
een elektron overdraagt naar het waterstofperoxide. Door deze elektronenoverdracht komt het
enzym in de 4 3( ) ( )( )HP LPFe oxyferryl Fe+ +− toestand. Nu moet het enzym terug gereduceerd
worden naar de calcium geactiveerde gemengde valentievorm. Dit gebeurt in twee stappen
waarbij tijdens elke stap een elektron wordt overgedragen aan een ijzerion uit de haemgroep.
In dit onderzoek zorgt de elektrode voor de elektronenoverdracht [8].
Om denaturatie van het eiwit tegen te gaan wordt CCP gestockeerd bij -20 °C. Zoals reeds
vermeld is de activeit van een enzym pH afhankelijk. Figuur 1.4 toont de afhankelijkheid van
de activiteit van CCP in functie van de pH van de gebruikte bufferoplossing.
9
Figuur 1.4 De pH afhankelijkheid van de enzymactiviteit van CCP [9].
CCP toont een belvormige afhankelijkheid van de activiteit in functie van de pH en heeft een
pK1 van 6,1 en een pK2 van 7,9 met een maximale activiteit bij pH 7. Het is dus van belang
dat de elektrochemische metingen gebeuren bij pH 7 waarbij CCP een maximale activiteit
vertoont [9].
In tegenstelling tot HCC dat bij de firma Sigma-Aldrich werd aangekocht, werd CCP in het
Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering aan de UGent geproduceerd. Het is
bij de productie van CCP de bedoeling om dit enzym in zo groot mogelijke concentraties in
de groeicellen te krijgen. De cel die hiervoor gebruikt wordt, is Escherichia coli (E. coli). In
deze cel worden vectoren ingebracht die de cel aanzetten tot CCP-productie [10]. Het DNA
dat gekloneerd wordt in de vectoren bekomt men door PCR (polymerase chain reaction), een
techniek die als doel het amplificeren van DNA heeft.
Vaak bevatten monsters te kleine hoeveelheden DNA om direct mee te werken. Dankzij de
PCR-techniek kan het DNA in een monster vermenigvuldigd worden. Het PCR apparaat is
een heel nauwkeurig verwarmings- en koelapparaat met daarin de buisjes met het DNA-
monster en andere componenten die noodzakelijk zijn voor de reactie.
10
Deze componenten zijn:
- deoxynucleotiden (deoxyadeninetrifosfaat (dATP), deoxythyminetrifosfaat
(dTTP), deoxycytosinetrifosfaat (dCTP) en deoxyguaninetrifosfaat (dGTP)).
- korte, enkelstrengige DNA moleculen, de zogenaamde primers.
- het enzym Thermus aquaticus polymerase (Taq polymerase). Taq polymerase is
afkomstig van bacteriën die leven in de nabijheid van hete bronnen en in het bezit
zijn van enzymen die bij zeer hoge temperaturen werkzaam zijn.
- templaat DNA: genomisch DNA of plasmide DNA.
- buffer.
Het proces, voorgesteld in figuur 1.5 begint met het verwarmen van het monster tot een
temperatuur van circa 90-95ºC, waardoor het dubbelstrengig DNA zich splitst in twee enkele
strengen. De oorzaak hiervan is dat de waterstofbruggen die de complementaire strengen "bij
elkaar houden" veel zwakker zijn dan de covalente bindingen tussen de nucleotides binnen
een keten. Het verhitten verbreekt de waterstofbinding waardoor de dubbele streng uit elkaar
gaat terwijl de covalente (keten)bindingen onaangetast blijven. Vervolgens wordt de
temperatuur iets verlaagd, wat de DNA-primers in staat stelt zich aan de gescheiden ketens te
binden. De primers binden zich omdat ze complementair zijn aan bepaalde (specifieke)
sequenties van elke streng die naast het DNA-stuk ligt dat moet worden geamplificeerd.
Zodra de primer zich gehecht heeft, gaat het Taq polymerase het DNA verlengen waarbij de
losse nucleotides gebruikt worden. Het uiteindelijke resultaat is een complementaire keten op
elke oorspronkelijke keten. In deze eerste cyclus is het oorspronkelijk aanwezige DNA
verdubbeld. In de volgende cyclus wordt opnieuw verhit en afgekoeld waardoor de nieuwe
dubbele strengen gescheiden worden en elk afzonderlijk gekopiëerd door het Taq polymerase.
In elke stap, cyclus, wordt het aantal strengen van het gewenste stuk DNA verdubbeld. Na
ongeveer 30 cycli (wat enkele uren duurt), zijn er genoeg DNA kopieën voor verder
onderzoek aanwezig [6].
11
Figuur 1.5 Het principe van PCR [11].
De productie van CCP kan in anaerobe of aerobe condities gebeuren. Voor de productie onder
anaerobe condities wordt gebruik gemaakt van cytochroom c maturatiegenen (ccm) in het
genoom. Deze zorgen voor de aanhechting van de haemgroepen. Het nadeel is een lage
celopbrengst. Een voordeel is dan weer de hoge CCP productie. Men kan CCP ook
produceren onder aerobe condities, maar hier moeten wel de ccm genen gecoëxpresseerd
worden. Hier heeft men een zeer grote celproductie maar de CCP productie ligt lager. In dit
werk wordt gebruik gemaakt van CCP dat geproduceerd werd onder anaerobe condities [10].
12
Vervolgens moet het CCP uit de cel geëxtraheerd worden. Het voordeel van CCP is dat het
een periplasmatisch eiwit is (zie figuur 1.6). Dit wil zeggen dat het enzym zich in het
periplasma van de cel bevindt. Dit is een voordeel omdat het de latere opzuivering
vereenvoudigt aangezien 90% van de eiwitten zich in het cytoplasma bevinden en maar 10%
in het periplasma. Het enzym kan bekomen worden door het buitenste membraan te breken.
Dit kan gebeuren door osmotische shock of door een lysozymebehandeling. Bij osmotische
shock gaat men een hoge concentratie zout toevoegen en nadien water zodanig dat het
buitenste membraan openbreekt. Bij een lysozymebehandeling wordt lysozyme toegevoegd
dat inwerkt op het buitenste membraan zodat het openbreekt [10].
Figuur 1.6 Een schematische voorstelling van de gebruikte cel waarbij CCP zich in het periplasma van de cel
bevindt.
De laatste stap is het opzuiveren van het enzym. Dit gebeurt door standaard
chromatografische technieken en dit onder niet denaturerende omstandigheden (dus geen
HPLC). Dit om ervoor te zorgen dat het enzym zijn opvouwing behoudt. De
chromatografische technieken die vooral gebruikt worden, zijn
ionenuitwisselingschromatografie, gelfiltratie en hydrofobe interactie [10]. Het CCP heeft een
rode kleur. Dit maakt de opzuivering eenvoudiger omdat de andere eiwitten meestal kleurloos
zijn. De fractie met een rode kleur bevat CCP. Indien de kleur van het enzym tijdens de latere
elektrochemische metingen zou veranderen dan weten we dat het CCP gedenatureerd is.
13
1.3 Eiwitelektrochemie
Dankzij het pionierswerk in de jaren 1970-1980 van Bowden E.F., Niki K., Hill H.A.O. en
later ook Armstrong F.A. en Canters G.W. zijn voltammetrische methoden routine geworden
in de bepaling van formele potentialen van redoxcentra in eiwitten [4,12-22]. Het is bekend
dat met behulp van geschikte elektroden bepaalde redoxcomponenten, waaronder
cytochromen, azurines en ferredoxines, een reversibel elektrochemisch gedrag vertonen zelfs
in afwezigheid van een mediator.
Spontane of elektrochemisch opgewekte adsorptie van eiwitten aan elektroden is de meest
recente ontwikkeling binnen de bio-elektrochemie. Het elektrisch contact tussen de
biokatalysator en de elektrode is van fundamenteel belang voor de ontwikkeling van
biosensoren en bio-elektronische koppelingen. Het is vanzelfsprekend dat het behoud van de
oorspronkelijke eigenschappen van de eiwitten centraal staat en dat geen denaturatie mag
optreden. Dit wordt ook wel ‘The art of persuasion’ genoemd.
De interacties tussen het eiwit en de elektrode kunnen zwak of sterk zijn; zwakke interacties
geven in ideale omstandigheden aanleiding tot diffusiegecontroleerde processen van de
eiwitspecies uit oplossing, terwijl bij sterke interacties de eiwitfilm zich gedraagt als een
monolaag. De koppeling tussen het eiwit en de elektrode kan van directe aard zijn of tot stand
komen door tussenkomst van een mediator. Deze mediator kan een eiwit zijn of een linker
waarmee we het elektrodeoppervlak modificeren. Een zeer efficiënte en gemakkelijke
modificatie is het vervaardigen van self-assembled monolayers (SAM) [21,23].
14
Au-oppervlak
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
enzyme enzyme
Au-oppervlak
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
S
HO
enzyme enzyme
Figuur 1.7 Een schematische voorstelling van een self-assembled monolayer (SAM) met als linker 1,3-
mercaptopropanol.
Figuur 1.7 toont een SAM. Een SAM kan verkregen worden door het elektrodeoppervlak
gedurende een bepaalde tijd in een oplossing met linker te hangen. Voor een SAM, met als
elektrodemateriaal goud, zijn linkers met een eindstandige thiol groep uitermate geschikt.
Deze linkers kunnen namelijk spontaan een covalente goud-thiol binding vormen met het
elektrodeoppervlak. Door de interacties tussen de koolstofketens van de verschillende linkers
ontstaat een mooie geordende structuur op het elektrodeoppervlak wat er voor zorgt dat een
reproduceerbare monolaag gevormd wordt. De lengte van de koolstofketen kan men variëren
net als de eindgroep zodat men verschillende monolagen met variërende eigenschappen kan
vervaardigen. De lengte van de koolstofketen mag niet kleiner zijn dan drie koolstofatomen
omdat anders de interacties tussen de verschillende koolstofketens niet groot genoeg zijn om
een geordende monolaag te verkrijgen. De elektronenoverdracht tussen het redoxenzym en
het elektrodeoppervlak gebeurt via het tunneling effect [23].
De voltammetrische studie aan een eiwitgemodificeerde elektrode is een uitstekend middel
om oxidatie- en reductiereacties van redoxenzymes te bestuderen. De activiteit van het enzym
kan, bij aanleggen of variëren van een potentiaal, bepaald worden door meting van de met de
doelmolecule geassocieerde stroom. Een elektrochemische studie van het redoxproces kan
gedetailleerde informatie betreffende de reactiekinetiek opleveren.
15
Het toepassingsgebied van eiwitelektrochemie bevindt zich vooral in het ontwikkelen van
biosensoren [3]. Deze sensoren hebben een elektrokatalytische werking. Deze werking wordt
schematisch voorgesteld in figuur 1.8.
e-
Mred
Mox
Dox
Dred
elektrode mediator oplossing
e-
Figuur 1.8 Schematische voorstelling van een heterogeen elektrokatalytisch oxidatieproces (M staat voor
mediator en D voor doelmolecule).
Mox staat voor de geoxideerde vorm van de mediator die in het geval van een biosensor het
enzym is. Deze mediator gaat bij het aanleggen van een gepaste potentiaal naar de
gereduceerde toestand (Mred) door opname van een elektron afkomstig van de elektrode.
Wanneer de mediator in de gereduceerde toestand is kan deze een doelmolecule van de
geoxideerde (Dox) naar de gereduceerde (Dred) toestand brengen waarbij de mediator zelf terug
naar de geoxideerde vorm gaat. Hierna kan het proces opnieuw van voor af aan beginnen. Een
mediator is dus een molecule die de elektronenoverdracht tussen doelmolecule en elektrode
medieert [24].
16
Hoofdstuk 2 Experimentele technieken
2.1 Cyclische voltammetrie [24]
Bij cyclische voltammetrie wordt gebruik gemaakt van lineaire potentiaalvariatie [25-27]. De
overeenkomstige formule wordt getoond in vergelijking 2.1. Bij de eindpotentiaal wordt de
zin van de potentiaalvariatie omgekeerd. Deze potentiaal wordt de omkeerpotentiaal Er
genoemd. Het aangelegde excitatiesignaal wordt voorgesteld in figuur 2.1.
E = Ee + vt (2.1)
met Ee = beginpotentiaal in V, meestal zodanig gekozen dat aanvankelijk geen reactie
optreedt, v = snelheid van potentiaalvariatie of polarisatiesnelheid in Vs-1, t = tijd in s.
Figuur 2.1 Triangulaire potentiaalvariatie kenmerkend voor cyclische voltammetrie [24].
Het cyclisch voltammogram bekomen voor een reversibel systeem aan een stationaire
elektrodeconfiguratie met semi-oneindige lineaire diffusie wordt in figuur 2.2 schematisch
weergegeven. Stel dat een oplossing wordt beschouwd die enkel reductans bevat dan kan de
bekomen piekstroom verklaard worden als het gevolg van de competitie tussen twee effecten.
In eerste instantie zal bij een positievere potentiaal de oxidatiesnelheid van het reductans R
continu gaan toenemen met een stroomstijging tot gevolg. Terzelfdertijd treedt een verarming
op van bestanddeel R in de buurt van het elektrodeoppervlak, wat de stroomstijging afremt en
17
uiteindelijk de bovenhand zal nemen met een daling van de stroom tot gevolg. Na het
bereiken van de omkeerpotentiaal Er zal de oxidatie van R nog doorgaan, totdat een
voldoende negatieve potentiaal bereikt wordt om de reductie van het in de buurt van het
elektrodeoppervlak geaccumuleerde oxidans O te bewerkstelligen. Dit resulteert in een
toename van de kathodische stroom en verandering in polariteit van de totale stroom. De
verarming van bestanddeel O zal uiteindelijk zorgen voor het optreden van een kathodische
piek. Cyclische voltammetrie wordt vaak als eerste techniek in een onderzoek toegepast daar
het meestal een aantal kwalitatieve aspecten van het elektrodeproces onthult, waaronder de
afhankelijkheid van de concentratie, de polarisatiesnelheid,....
Figuur 2.2 Verband tussen de stroom I en de potentiaal E voor een reversibel systeem [24].
2.1.1 Reversibiliteit of irreversibiliteit van een reactie van een deeltje in oplossing
Voor een reversibele elektrochemische reactie geldt dat bij iedere potentiaal in het
voltammogram de potentiaalbetrekking van Nernst, voorgesteld in vergelijking 2.2, geldig is
[28].
0 0lnr
aRTE EnF a
⎛ ⎞= + ⎜ ⎟
⎝ ⎠ (2.2)
waarin E de potentiaal (V), E0 de standaardpotentiaal (V), n het aantal uitgewisselde
elektronen in de reactie, F de constante van Faraday (96485 C mol-1), T de temperatuur (K), R
de universele gasconstante (8,314 J K-1 mol-1), a0 de activiteit van het oxidans en ar de
activiteit van het reductans aan het elektrodeoppervlak is.
18
Dit houdt in dat de elektrontransfer voldoende snel moet verlopen, zodat bij elke aangelegde
potentiaal de concentratie van het oxidans en reductans aan het elektrodeoppervlak
overeenkomen met de verhouding uit de vergelijking van Nernst. Het massatransport, met
andere woorden de aanvoer van elektroactief bestanddeel naar het elektrodeopervlak, is voor
een reversibele reactie snelheidsbepalend bij alle potentialen of in ieder geval trager dan de
snelheid van de elektrontransfer. Het stroompotentiaalgedrag van een reversibel systeem werd
reeds voorgesteld in figuur 2.2.
Het verband tussen de piekstroom en de polarisatiesnelheid voor een reversibel systeem bij
298 K wordt weergegeven in vergelijking 2.3, volgens Sevcik-Randles [29,30]. Een lineair
verband tussen de piekstroom en de wortel van de polarisatiesnelheid is eigen aan de reactie
van een deeltje in oplossing. Voor de afleiding van deze vergelijking wordt verwezen naar de
literatuur [25,31]. 3 1 1
5 2 2 22,69.10 vp i iI n AD c= (2.3)
waarin Ip de piekstroom (A), n het aantal uitgewisselde elektronen in de reactie, A de
elektrodeoppervlakte (cm2), Di de diffusiecoëfficient van het elektroactief bestanddeel O of R
(cm2 s-1), ci de concentratie van het elektroactief bestanddeel O of R (mol cm-3) en v de
polarisatiesnelheid (V s-1) is.
Wanneer de snelheid van de elektrontransfer snelheidsbepalend wordt, zal de vergelijking van
Nernst niet meer geldig zijn en spreekt men van een irreversibele reactie. Voor een volledige
theoretische behandeling wordt verwezen naar meer gespecialiseerde literatuur [25,31]. Het
karakteristieke verloop van een volledig irreversibele oxidatiereactie (A → B) wordt
voorgesteld in figuur 2.3. De terugkerende piek, die bij een reversibele reactie zichtbaar is
(B → A), wordt niet meer geobserveerd. Enkel het oxidatieproces zal bijgevolg zichtbaar zijn
in de stroompotentiaalcurve.
19
Figuur 2.3 Verband tussen de stroom I en de potentiaal E voor een volledig irreversibel systeem [24].
Voor een irreversibele reactie bij 298 K wordt het verband tussen de piekstroom en de
polarisatiesnelheid weergegeven door vergelijking 2.4 [32].
1 1 1
5 2 2 22,99.10 ( ') vp i iI n n AD cα= (2.4)
waarin Ip de piekstroom (A), n het aantal uitgewisselde elektronen in de reactie, α de
transfercoëfficiënt, n’ het aantal elektronen uitgewisseld tot en met de snelheidsbepalende
stap, A de elektrodeoppervlakte (cm2), Di de diffusiecoëfficiënt van het elektroactief
bestanddeel O of R (cm2 s-1), ci de concentratie van het elektroactief bestanddeel O of R (mol
cm-3) en v de polarisatiesnelheid (V s-1) is.
Een quasi-reversibel systeem situeert zich tussen het reversibele en irreversibele en kan
slechts optreden in een bepaald polarisatiesnelheidsgebied. De stroom wordt zowel bepaald
door de reactiesnelheid van de elektrontransfer als door het massatransport. Voor een quasi-
reversibel systeem zijn de vergelijkingen ingewikkeld. Daar deze vergelijkingen niet relevant
zijn voor dit onderzoek wordt hiervoor verwezen naar de literatuur [25,27,31]. Het algemene
verband tussen piekstroom en polarisatiesnelheid voor de reacties van deeltjes uit oplossing
wordt schematisch voorgesteld in figuur 2.4.
20
Figuur 2.4 Schematische voorstelling van de overgang van een reversibel naar een irreversibel systeem bij
vergroten van de polarisatiesnelheid [24].
Hierin is duidelijk dat de polarisatiesnelheid een invloed kan hebben op het al dan niet
reversibel gedrag van een elektrochemische reactie. Het is bijgevolg mogelijk dat een
bepaalde elektrochemische reactie zich reversibel gedraagt bij een lagere polarisatiesnelheid,
terwijl bij hogere polarisatiesnelheden de reactie een quasi-reversibel of irreversibel gedrag
vertoont.
2.1.2 Reversibiliteit of irreversibiliteit van een reactie van een deeltje geadsorbeerd aan
de elektrode
Wanneer het reagens en/of het product van de elektrodereactie geadsorbeerd wordt aan het
elektrodeoppervlak, kan dit het voltammetrisch signaal beïnvloeden. Drie situaties kunnen
zich voordoen:
- de reactiesnelheid van de geadsorbeerde deeltjes is veel groter dan de
reactiesnelheid van de deeltjes in oplossing.
- zowel de reactie van de geadsorbeerde deeltjes als de reactie van de deeltjes in
oplossing moeten in rekening gebracht worden.
- de reactiesnelheid van de geadsorbeerde deeltjes is het kleinst en bijgevolg
snelheidsbepalend.
21
De interpretatie van de voltammogrammen is niet evident wanneer adsorptieprocessen
aanwezig zijn. Adsorptie is dan ook een fenomeen dat in het doorsnee elektrochemisch
onderzoek eerder dient vermeden te worden door bijvoorbeeld het solvent of de concentraties
te wijzigen. Toch is de adsorptie van een component aan het elektrodeoppervlak in sommige
situaties net wel gewenst om bijvoorbeeld, zoals in dit werk, tot een biosensor te komen.
Daarom wordt de theorie van deze adsorptieprocessen hier kort toegelicht. Er dient echter
opgemerkt dat de werkelijk opgenomen stroompotentiaalcurven afwijken van de theoretisch
beschreven situatie. Tevens wordt de theoretische behandeling complex wanneer het gaat om
de vorming van een multilaag in plaats van een monolaag: in het geval van een dunne film
zijn de eigenschappen analoog aan die van een monolaag. Factoren zoals inhomogeniteit van
de film, beperkte ladingstransfer door de film, structurele veranderingen in de multilaag
gedurende de oxidatie en/of reductie,... kunnen een rol spelen in het elektrochemisch gedrag
en zich uiten in een verandering van de opgenomen stroompotentiaalcurven.
Omwille van de hierboven beschreven complexiteit van adsorptieprocessen wordt voor een
volledige theoretische behandeling verwezen naar de literatuur [33-35]. Enkel het meest
eenvoudige en ideale geval wordt hier besproken, namelijk datgene waarbij enkel
geadsorbeerd oxidans O elektroactief is (O in oplossing is niet elektroactief) en reversibel
reageert. Er wordt in dit geval tevens aangenomen dat gevormd reductans R geadsorbeerd is
aan het oppervlak en dat geen laterale interacties optreden (Langmuir isotherm). Een
voorbeeld is de situatie waarbij, eens het adsorptie-evenwicht is ingesteld, de adsorptie zo
sterk is dat de geadsorbeerde laag O gevormd wordt zelfs waneer de concentratie in oplossing
zo klein is dat de stroombijdrage van opgelost O te verwaarlozen is. De stroompotentiaalcurve
horende bij deze situatie wordt in figuur 2.5 voorgesteld.
22
Figuur 2.5 Voorstelling van een cyclisch voltammogram voor een reversibel adsorptieproces met oxidatie en
reductie [25].
Een belangrijke karakteristiek van de vergelijkingen die het verband tussen de stroom en de
potentiaal beschrijven is de afwezigheid van transportparameters vermits de reagerende
bestanddelen O en R geïmmobiliseerd zijn op het elektrodeoppervlak. Vergelijking 2.5 geeft
het verband weer tussen de piekstroom en de polarisatiesnelheid.
2 2 *
0 v4p
n F AIRT
Γ= (2.5)
waarin Ip de piekstroom (A), n het aantal uitgewisselde elektronen in de reactie, F de
constante van Faraday (96485 C mol-1), R de universele gasconstante (8,314 J K-1 mol-1), T de
temperatuur (K), v de polarisatiesnelheid (V s-1), A de elektrodeoppervlakte (cm2) en *0Γ de
totale oppervlakconcentratie van de geadsorbeerde deeltjes (mol cm-2) is.
2 2 *0( / )
pin F RT vAΓ
2 2 *0( / )
in F RT vAΓ
23
Uit vergelijking 2.5 kan worden afgeleid dat de piekstroom in functie van de
polarisatiesnelheid een lineair verband vertoont, in tegenstelling tot de situatie voor een
deeltje in oplossing waarbij een lineair verband tussen de piekstroom en de wortel van de
polarisatiesnelheid waargenomen wordt (zie vergelijking 2.3).
Bij adsorptie-evenwicht is een welbepaalde hoeveelheid van reagens aanwezig op het
elektrodeoppervlak. Vandaar dat de stroom eerst zal toenemen, vervolgens een maximum
bereiken om uiteindelijk opnieuw de reststroomwaarde te bereiken. De lading die hierbij
verbruikt wordt is constant, vandaar dat bij verhogen van de polarisatiesnelheid de stroom op
een analoge manier moet toenemen om de lading constant te houden.
Het oppervlak onder de reductiegolf, na correctie voor een eventuele reststroom, komt
overeen met de lading Q nodig om de laag volledig te reduceren (Q = nF *0Γ ). De anodische
golf is het spiegelbeeld van de kathodische ten opzichte van de potentiaalas. Afwijkingen op
deze theoretische situatie komen frequent voor, wanneer bijvoorbeeld de ene component
sterker geadsorbeerd wordt dan de andere of wanneer laterale interacties tussen O en R in de
film opduiken. Een perfect symmetrische stroompotentiaalcurve, zoals voorgesteld in figuur
2.5, is dan ook een theoretisch gegeven en zal in de praktijk zelden voorkomen. Ondanks het
afwijkend gedrag van de stoompotentiaalcurve in de reële situaties, blijft het verband tussen
de piekstroom en de polarisatiesnelheid lineair.
Ook voor adsorptieprocessen kan een irreversibele situatie beschouwd worden, namelijk
diegene waarbij enkel geadsorbeerd O elektroactief is en gereduceerd wordt in een
irreversibele, éénstaps- en éénelektronreactie. De schematische voorstelling van de
stroompotentiaalcurve is weergegeven in figuur 2.6.
24
Figuur 2.6 Voorstelling van een irreversibel adsorptieproces [25].
Zoals figuur 2.6 aantoont treedt geen terugkeerpiek op en is de stroompotentiaalcurve
asymmetrisch. Een volledige theoretische behandeling is terug te vinden in gespecialiseerde
literatuur [25].
Het verband tussen de piekstroom en de polarisatiesnelheid voor een irreversibele situatie is,
analoog aan het reversibele gedrag, lineair en wordt in vergelijking 2.6 weergegeven.
2 *
0 v2,718.p
F AIRT
α Γ= (2.6)
waarin Ip de piekstroom (A), α de transfercoëfficiënt, F de constante van Faraday (96485 C
mol-1), A de elektrodeopervlakte (cm2), v de polarisatiesnelheid (V s-1), *0Γ de totale
oppervlakconcentratie van de geadsorbeerde deeltjes (mol cm-2), R de universele gasconstante
(8,314 J K-1 mol-1) en T de temperatuur (K) is.
2 *0( / )
iF RT Avα Γ
25
Voor de quasi-reversibele situatie is er wel een terugkeerpiek, maar beide pieken zijn sterk
asymmetrisch. Een meer gedetailleerde beschrijving is terug te vinden in de literatuur daar de
vergelijkingen horende bij deze situatie niet relevant zijn voor deze studie [36-38].
Nogmaals wordt benadrukt dat de hierboven beschreven situaties de meest ideale zijn. De
Langmuir isotherm die de basis vormt voor de afgeleide formules houdt echter geen rekening
met enerzijds laterale interacties en anderzijds het feit dat de verschillende sites van het
elektrodeoppervlak gekenmerkt worden door een verschillende vrije energie. Indien men één
van deze aspecten in rekening brengt, zullen andere vergelijkingen het
stroompotentiaalgedrag beschrijven. De basis voor de afgeleide formules zijn dan Frumkin en
Temkin isothermen. Hiervoor wordt verwezen naar de literatuur [25,35,39].
2.2 Ramanspectroscopie [24]
Het Ramaneffect kan opgevat worden als een inelastische verstrooiing van licht door materie
[40]. Een foton met een energie die onvoldoende is om een elektronische transitie te
bewerkstelligen, kan interageren met een molecule en verstrooid worden. De molecule gaat
hierbij over van een stationaire naar een virtuele toestand, die een distortie van de
elektronendistributie van een covalente binding inhoudt. Deze toestand is echter niet stabiel
en de molecule relaxeert naar een stationaire energietoestand. Deze relaxatie kan op drie
verschillende manieren gebeuren en wordt voorgesteld in figuur 2.7.
Figuur 2.7 Energieniveaus en voorstelling van ontstaan van Rayleigh (a), Stokes (b) en anti-Stokes (c)
verstrooiing [24].
26
Wanneer de molecule relaxeert en terugkeert naar de vibrationele grondtoestand, dan heeft het
verstrooide foton eenzelfde energie en golflengte als het initiërende foton. Dit is beter gekend
als Rayleigh verstrooiing (figuur 2.7a). Als de molecule relaxeert en terugvalt naar de eerste
geëxciteerde toestand (figuur 2.7b) zal het verstrooide foton minder energie bezitten en
bijgevolg een langere golflengte hebben dan het initiële foton. De vibratie-energie van de
molecule is toegenomen. Dit proces wordt Stokes (Raman) verstrooiing genoemd. Wanneer
de molecule zich bevindt in de eerste geëxciteerde toestand en een foton met energie E
absorbeert, dan wordt de molecule geëxciteerd naar een virtueel energieniveau met een iets
hogere energie dan in het geval van Rayleigh en Stokes verstrooiing. De molecule relaxeert en
kan terugkeren naar de vibrationele grondtoestand. Het verstrooide foton zal meer energie
bezitten dan het initiële foton en bijgevolg een kortere golflengte hebben. Dit fenomeen wordt
anti-Stokes Raman verstrooiing genoemd (figuur 2.7c).
De energie wordt in Ramanspectroscopie uitgedrukt als het Ramangolfgetal of Ramanshift, de
verschuiving ten opzichte van de Rayleigh verstrooiing (cm-1). Voor analytische doeleinden
wordt hoofdzakelijk Stokes verstrooiing gebruikt daar de Stokes Ramanintensiteit groter is
dan de anti-Stokes Ramanintensiteit. Het is namelijk zo dat de intentsiteit van het Stokes
Ramanverstrooid licht proportioneel is met het aantal moleculen in de initiële grondtoestand,
terwijl de intensiteit van het anti-Stokes Ramanverstrooid licht proportioneel is met het aantal
moleculen in de eerste aangeslagen vibratietoestand. Volgens Boltzmann is het zo dat het
aantal moleculen in een hogere vibratietoestand steeds kleiner is dan het aantal bij een lagere
vibratietoestand, vandaar dat het Stokes Ramanverstrooid licht gekenmerkt wordt door een
grotere intensiteit.
In realiteit is een Ramanspectrum meestal gesuperponeerd op een continuüm aan
fluorescentie. Wanneer fotonen met voldoende energie invallen op een molecule, kan deze
molecule overgaan naar geëxciteerde elektronische toestanden. De toestand heeft een beperkte
levensduur met een terugval naaar lager gelegen toestanden en uitzenden van licht (E = hv)
als gevolg. Dit proces wordt fluorescentie genoemd. Als de energie van het geëmitteerde
foton dezelfde waarde heeft als de energie van het geabsorbeerde foton, dan is er sprake van
resonantiefluorescentie.
Met Ramanspectroscopie kan informatie bekomen worden of het eiwit of enzym
geïmmobiliseerd is aan het elektrodeoppervlak of niet.
27
Hoofdstuk 3 Experimentele opstelling
In dit werk worden de elektrochemische reacties van eiwitten en enzymen bestudeerd. Door
de hoge kostprijs van deze bestanddelen is het ongepast gebruik te maken van een standaard
elektrochemische cel die 10 of 100 mL van een oplossing vereist. Om deze reden werd een cel
ontwikkeld die toelaat aan elektrochemie te doen in één druppel (20 µL). De configuratie van
de cel, het drie-elektrodensysteem, de gebruikte reagentia en de meetapparatuur komen in dit
hoofdstuk aan bod.
3.1 Drie-elektrodensysteem
Voor sommige elektrochemische metingen, zoals evenwichtspotentiaalbepaling en
potentiometrische experimenten, volstaan twee elektroden. Wanneer men de potentiaal doet
veranderen van zijn openklemwaarde dan zal, in het geval van een twee-elektrodensysteem,
de overpotentiaal zich verdelen over de twee elektroden. Het is echter voor elektrochemische
metingen belangrijk om de overpotentiaal aan de werkelektrode te kennen. Daarom wordt bij
metingen onder stroomdoorgang een drie-elektrodensysteem gehanteerd [41].
Bij een drie-elektrodensysteem wordt er tussen de werkelektrode en de tegenelektrode een
variabel potentiaalverschil aangelegd en de stroom die tussen deze twee elektroden vloeit,
wordt gemeten. Tussen de referentie- en de werkelektrode bevindt zich een hoogohmige
voltmeter waardoor de potentiaal van de werkelektrode ten opzichte van de referentie-
elektrode gemeten wordt in een circuit waardoor nagenoeg geen stroom vloeit. Hierdoor is de
gemeten potentiaal, op een constante na, deze van de werkelektrode. In dit werk wordt
gebruik gemaakt van een platinadraadje als tegenelektrode, een goudelektrode of glasachtig
koolstofelektrode als werkelektrode en een verzadigde kalomelelektrode als referentie-
elektrode.
3.1.1 De elektrochemische cel
Zoals reeds vermeld werd, wordt wegens de hoge kostprijs van het enzym gebruik gemaakt
van een celconfiguratie waarvoor maar één druppel van 20 µL als celoplossing vereist is.
Deze configuratie wordt getoond in figuur 3.1.
28
Figuur 3.1 Elektrochemische cel met aanduiding van de werkelektrode (1), referentie-elektrode (2),
tegenelektrode (3) en invoer (4).
De in dit werk gebruikte meetcel bestaat uit glas en is goed afsluibaar. Dit laatste is belangrijk
om in een zuurstofvrije omgeving te kunnen werken (zie later). In de bovenste opening
bevindt zich de referentie-elektrode (2), onderaan in een teflonbuis de werkelektrode (1), links
bevindt zich de tegenelektrode (3) en rechts bevindt zich het septum (4) langswaar met behulp
van een microliterspuit de eiwitten kunnen toegevoegd worden aan de druppel. Achteraan,
niet zichtbaar op figuur 3.1, bevindt zich nog een ingang voor de stikstoftoevoer. Met een
kraantje kan de stikstoftoevoer geregeld worden. Via het septum langswaar de reagentia
1
2
3 4
29
worden toegevoegd wordt de stikstofflow nagegaan via een druppelteller. Aangezien de
stikstof uit de fles zeer droog is wordt deze eerst door twee wasflessen (5) gestuurd. De
volledige opstelling wordt getoond in figuur 3.2. Om interferentiestromen van buitenaf te
weren staat de volledige opstelling in een Faraday-kooi. Alle metingen worden uitgevoerd bij
kamertemperatuur.
Figuur 3.2 De volledige proefopstelling.
3.1.2 Elektroden
-De referentie-elektrode
Een goede referentie-elektrode is van cruciaal belang voor elektrochemische metingen. De
referentie-elektrode wordt gekenmerkt door een vaste potentiaal die niet verandert gedurende
het experiment en zorgt voor het vervolledigen van het circuit voor de potentiaalmeting.
In dit werk wordt gebruik gemaakt van een verzadigde kalomelelektrode (Hg/Hg2Cl2,
verzadigd KCl). Deze elektrode heeft een referentiepotentiaal van 0,241 V versus de
standaard waterstofelektrode [41]. De elektrode bestaat uit een kwikmetaalfase, waarop een
55
30
pasta van het weinig oplosbare zout Hg2Cl2 (kalomel) gemengd met kwik zit, in contact met
een chloridebevattende oplossing (doorgaans waterig KCl). Deze elektrode is commercieel
verkrijgbaar bij verschillende firma’s. De in dit onderzoek gebruikte referentie-elektrode heeft
als referentie REF 401 en werd aangekocht bij het bedrijf Radiometer (Frankrijk).
Iedere gemeten en aangelegde potentiaal wordt weergegeven ten opzichte van deze
verzadigde kalomelelektrode. De elektrode wordt verder aangeduid als VKE
Figuur 3.3 De gehanteerde referentie-elektrode [42].
-De tegenelektrode
Tussen de tegenelektrode en de werkelektrode wordt de stroom gemeten. De stroom die in de
oplossing komt via de werkelektrode verlaat de oplossing via de tegenelektrode. De
tegenelektrode is een geleider. In dit werk werd gebruik gemaakt van een platinadraadje
ingesmolten in een plastiek tip.
31
-De werkelektrode
Als werkelektrode werd gebruik gemaakt van een goudelektrode en van een glasachtig
koolstofelektrode beide van BasInstruments (USA).
Figuur 3.4 Werkelektrode met CTFE omhulsel (1), metaal voor elektrische geleiding (2) en goud of glasachtig
koolstof (3) [43].
Figuur 3.4 toont de schematische voorstelling van de gebruikte werkelektroden. Deze
werkelektroden zijn opgebouwd uit een chloro-trifluorethyleen (CTFE) polymeer omhulsel
waarvan de lengte 7,5 cm is en de dikte 6 mm. In dit omhulsel is het elektrodemateriaal
(polykristallijn goud of glasachtig koolstof) ingebed. De diameter van de schijfelektrode is 1,6
mm voor de goudelektrode en 3,0 mm voor de glasachtig koolstofelektrode. Een metalen pin
is in het omhulsel geïncorporeerd om voor het elektrisch contact tussen de kabels van de
potentiostaat en het elektrodemateriaal te zorgen.
Om resten van vorige metingen te verwijderen en om een reproduceerbaar elektrodeoppervlak
te bekomen wordt de werkelektrode eerst voorbehandeld. De voorbehandeling bestond uit een
vijftal minuten polijsten op 1 en 0,05 µm Al2O3, dat werd aangebracht op verschillende
polijstdoeken. De resten Al2O3 werden verwijderd door spoelen met gedeïoniseerd water en
via ultrasone trillingen in een ultrasoonbad (Branson 3210) gedurende één minuut.
1
2
3
32
3.2 Reagentia
3.2.1 Bufferoplossingen
Hoe werkt een buffer? Een bufferoplossing omvat doorgaans een mengsel van een zwak zuur
HA en zijn geconjugeerde base A-. Wanneer hydroxide ionen worden toegevoegd treedt de
volgende reactie op met het zwakke zuur.
OH- + HA → A- + H2O (3.1)
Het netto resultaat is dat de hydroxide ionen worden vervangen door de geconjugeerde base
van het zwakke zuur. De stabiliteit van de pH onder deze omstandigheiden kan verklaard
worden door het evenwicht van de dissociatiereactie te onderzoeken.
[ ][ ][ ]a
H AKHA
+ −
= of na herschikken, [ ][ ][ ]aHAH KA
+−= (3.2)
Hieruit volgt dat de evenwichtsconcentratie van H+ en dus de pH bepaald wordt door de
verhouding [HA]/[A-]. Wanneer hydroxide ionen worden toegevoegd dan wordt het zwakke
zuur omgezet in zijn geconjugeerde base en daalt de verhouding [HA]/[A-]. Wanneer nu de
initieel aanwezige hoeveelheid zwak zuur en geconjugeerde base veel groter is dan de
hoeveelheid toegevoegde hydroxide ionen dan is de wijziging in de verhouding [HA]/[A-]
zeer klein. Dezelfde redenering kan nu ook gemaakt worden wanneer protonen toegevoegd
worden. Een andere nuttige en veel gebruikte formule in verband met buffers wordt bekomen
door het negatieve logaritme van vergelijking 3.2 te nemen:
[ ]log[ ] log( ) log[ ]aHAH KA
+−
⎛ ⎞− = − − ⎜ ⎟⎝ ⎠
of herschreven naar pH en rekening houdend met de tekens:
[ ] [ ]log log[ ] [ ]a a
A basepH pK pKHA zuur
−⎛ ⎞ ⎛ ⎞= + = +⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠⎝ ⎠
(3.3)
33
Deze formule wordt de Henderson-Hasselbalch vergelijking genoemd en is zeer nuttig om de
pH te berekenen van oplossingen waarvoor de verhouding [A-]/[HA] gekend is. Om een
goede buffer te bekomen bij een welbepaalde pH is het zeer belangrijk dat de pKa van de
gekozen bufferoplossing zo dicht mogelijk bij de gewenste pH ligt. Omdat hoe verder de
verhouding [A-]/[HA] van 1 ligt hoe slechter de buffercapaciteit en dus hoe slechter de
resistentie van de oplossing tegen wijzigingen van de pH wanneer protonen of hydroxide
ionen worden toegevoegd [44].
Tijdens het onderzoek naar een geschikte bufferoplossing voor de elektrochemische metingen
van dit werk werden drie buffers getest, namelijk tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris), 2-
morfolinoethaansulfonzuur (Mes) en N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (HEPES).
NH2
OH
HO OH
O N
S
O
O
O-
. H2O
N
N OH
S
OO
-O
Tris Mes
HEPES
NH2
OH
HO OH
O N
S
O
O
O-
. H2O
N
N OH
S
OO
-O
Tris Mes
HEPES Figuur 3.5 Structuur van Tris, Mes en HEPES.
De eerste buffer is tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris). Deze biochemische buffer heeft
een pKa waarde van 8,1 en een bruikbaar gebied van 7,0 tot 9,01. Tris is een buffer met zeer
hoge stabiliteit. Daarom is tris één van de meest gebruikte biochemische buffers bij pH 7. De
structuur van Tris wordt weergegeven in figuur 3.5.
De tweede buffer is 2-morfolinoethaansulfonzuur (Mes). Deze biochemische buffer vertoont
een veel mindere stabiliteit. Na enkele weken treedt schimmelvorming op in de
34
bufferoplossing en is de oplossing niet meer bruikbaar. De pKa van Mes bedraag 6,2. Mes
heeft een bruikbaar gebied van 5,5 tot 6,7. Het bruikbare gebied van Mes is lager dan 7 wat de
Mes bufferoplossing minder geschikt maakt om te bufferen voor CCP. De structuur van Mes
wordt getoond in figuur 3.5.
De derde en laatste buffer die in dit onderzoek gebruikt werd is een HEPES bufferoplossing.
Een HEPES bufferoplossing bevindt zich qua stabiliteit tussen de Tris bufferoplossing en de
Mes bufferoplossing en is ongeveer een maand stabiel. HEPES heeft een pKa van 7,5 en een
bruikbaar gebied van 6,8 tot 8,2. De structuur van HEPES wordt voorgesteld in figuur 3.5.
Alle bufferoplossingen werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (USA) net als NaOH (99,998%
zuiver) dat gebruikt werd om de bufferoplossingen op pH 7 te brengen.
3.2.2 Linkers
Een linker wordt in dit werk gebruikt om het elektrodeoppervlak te modificeren zodat het
eiwit of enzym ten eerste gemakkelijker bindt en ten tweede omdat het eiwit of enzym minder
makkelijk zou denatureren (cf. the art of persuasion). De verschillende linkers en de firma
waar ze werden aangekocht worden getoond in tabel 3.1.
Tabel 3.1 De gebruikte linkers met de firma van aankoop.
Linker Firma 4,4'-bipyridyl Sigma-Aldrich polymixine Sigma-Aldrich 6-mercapto-1-hexanol Fluka Cysteamine hydrochloride Fluka Neomycine Riedel-DeHaën Spermidine Sigma-Aldrich CuTSPc Sigma-Aldrich poly-L-lysine Sigma-Aldrich 5-carboxy-1-pentaanthiol Dojindo 7-carboxy-1-heptaanthiol Dojindo 5-carboxypenthyl disulfide Dojindo 6-amino-1-hexaanthiol Dojindo 6-ferrocenyl-1-hexaanthiol Dojindo mercaptopropionzuur Sigma-Aldrich
35
3.2.3 Paardenhart cytochroom c (HCC) en Rhodobacter capsulatus cytochroom c
peroxidase (CCP)
Paardenhart cytochroom c (HCC) werd aangekocht bij Sigma-Aldrich en heeft een zuiverheid
van 97 %. Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP) werd aangemaakt door
het Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering aan de UGent. HCC en CCP
werden bewaard bij -20°C.
3.2.4 Doelmolecule
Als doelmolecule werd waterstofperoxide gebruikt omdat CCP de reductie van
waterstofperoxide katalyseert. Waterstofperoxide heeft een molaire massa van 40 g mol-1. Het
waterstofperoxide, dat in dit onderzoek gebruikt werd, werd aangekocht bij de firma Sigma-
Aldrich en was een 35 gewichtsprocent oplossing in water. De oplossing werd bewaard bij
+4°C.
3.3 Meetapparatuur
Een volledig geautomatiseerde potentiostaat met softwarebediening werd aangewend voor het
aanleggen van een gecontroleerd, al dan niet variërend, potentiaalverschil en het meten van de
stroom tussen werk- en tegenelektrode. In dit werk werd een Autolab potentiostaat van Eco
Chemie B.V. (Nederland) gehanteerd, meer bepaald het type PGSTAT 10. Voor dit systeem
verloopt de besturing via het softwarepakket GPES (General Purpose Electrochemical
System), versie 4.9.005 [45].
Meting van de pH van de bufferoplossing gebeurde met een Orion (USA) Benchtop pH-
meter, model 420A.
Het in dit werk gebruikte Ramantoestel is het Renishaw System 1000 (Renishaw, Wotton
Under Edge, UK) met als monochromatische lichtbron een diode laser met een vermogen van
50 mW en een golflengte van 785 nm. Het laserlicht werd rechtstreeks gefocusseerd op het
elektrodeoppervlak door middel van een Olympus 50X objectief, waardoor deeltjes met een
36
diameter van ongeveer 2 µm diameter bestudeerd konden worden. De detector was een Peltier
CCD (charge coupled device), bestaande uit lichtgevoelige cellen.
37
Hoofdstuk 4 Elektrochemisch onderzoek naar een
geschikte bufferoplossing In dit hoofdstuk wordt het elektrochemisch gedrag van drie biochemische buffers beschreven,
zowel aan een goud- als een glasachtig koolstofelektrode. De geselecteerde buffers zijn:
- tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris) zie figuur 3.5
- 2-morfolinoethaansulfonzuur (Mes) zie figuur 3.5
- N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (HEPES) zie figuur 3.5
Zoals reeds eerder vermeld, worden deze bufferoplossingen gekozen omdat ze een pKa
waarde hebben die zeer dicht bij 7 ligt (zie paragraaf 3.2.1). Dit maakt ze uitermate geschikt
om te bufferen bij pH 7. Bij deze pH vertoont het gebruikte enzym zijn maximale activiteit.
Alle stroompotentiaalcurven worden verkregen door een druppel van de bufferoplossing (18
µL) in contact te brengen met de drie elektroden (werkelektrode, referentie-elektrode en
tegenelektrode). Als werkelektrode wordt gebruik gemaakt van ofwel een goudelektrode
ofwel een glasachtig koolstofelektrode. Eerst wordt een stroompotentiaalcurve opgenomen
waarbij het systeem vrij aan de lucht is waardoor er reactie met zuurstof kan optreden.
Vervolgens wordt een stroompotentiaalcurve opgenomen waarbij de cel met stikstof
verzadigd is. Daarna wordt telkens het, voor dit werk, bruikbare potentiaalgebied van elke
bufferoplossing bepaald.
Een geschikte bufferoplossing mag geen elektrochemische reacties vertonen in het
potentiaalgebied van -0,2 V tot 0,2 V omdat in dit gebied de oxidatie en reductiepieken van
het eiwit en het enzym worden verwacht.
4.1 Voltammetrisch gedrag van een Tris bufferoplossing
Een Tris bufferoplossing wordt gekenmerkt door een hoge stabiliteit, ze blijft ongeveer een
jaar stabiel bij kamertemperatuur. Tris heeft een pKa van 8,1 en heeft een bruikbaar pH
gebied van 7,0 tot 9,01. In dit pH-gebied zijn de geselecteerde eiwitten en enzymen stabiel.
38
4.1.1 Goud als werkelektrode
Figuur 4.1 toont het elektrochemisch gedrag van een 10 mmol L-1 Tris bufferoplossing aan
een goudelektrode. De parameterinstellingen voor deze meting worden getoond in tabel 4.1.
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
Figuur 4.1 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Tris
bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof,
telkens aan een andere Tris buffer druppel. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.
Curve 1 uit figuur 4.1 toont het stroompotentiaalgedrag in afwezigheid van zuurstof; curve 2
in aanwezigheid van zuurstof. De zuurstofreductiepiek treedt duidelijk op bij een potentiaal
van -0,16 V. Omdat deze zuurstofreductiepiek verschijnt in het potentiaalgebied waar een
respons van het enzym verwacht wordt, wordt verkozen te werken in afwezigheid van
zuurstof. Een zuurstofvrije atmosfeer werd bereikt door continu stikstof door de opstelling te
sturen. Het oxidatieproces bij 0,35 V is zowel zichtbaar in curve 1 als in curve 2 en kan
verklaard worden als de oxidatie van goud met vorming van goudoxiden en –hydroxiden [46-
48]. In aanwezigheid van zuurstof treedt bij 0,16 V en 0,1 V respectievelijk een oxidatie- en
reductieproces op. Deze elektrochemische reacties treden vermoedelijk op door reactie met
zuurstofradicalen.
39
Tabel 4.1 Parameterinstellingen bij figuur 4.1, figuur 4.2, figuur 4.3, figuur 4.5, figuur 4.6, figuur 4.7 en
figuur 4.9.
startpotentiaal 0 V eerste omkeerpotentiaal 0,5 V tweede omkeerpotentiaal -0,5 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
De twee stroompotentiaalcurven, getoond in figuur 4.1, werden telkens opgenomen aan een
andere Tris buffer druppel. Wanneer deze meting op een zelfde druppel werd uitgevoerd,
werd een ander elektrochemisch gedrag waargenomen. Dit elektrochemisch gedrag wordt
voorgesteld in figuur 4.2.
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
Figuur 4.2 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Tris
bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in afwezigheid van zuurstof na
cyclische voltammogrammen te hebben opgenomen in aanwezigheid van zuurstof. Parameterinstellingen: zie
tabel 4.1.
Curve 1 uit figuur 4.2 is identiek aan curve 1 van figuur 4.1, namelijk de
stroompotentiaalcurve waarbij rechtstreeks in afwezigheid van zuurstof het elektrochemisch
gedrag werd nagegaan. Curve 2 stelt het elektrochemisch gedrag van een Tris bufferdruppel
voor, eveneens in afwezigheid van zuurstof, maar waarbij eerst op dezelfde druppel het
elektrochemisch gedrag in aanwezigheid van zuurstof getest werd. In vergelijking met curve 1
wordt er een extra oxidatie- en reductiepiek waargenomen. De extra oxidatiepiek is gelegen
bij 0,16 V. De reductiepiek bevindt zich bij 0,095 V. Het zijn precies deze processen die reeds
40
gedetecteerd werden in curve 2 van figuur 4.1 (in aanwezigheid van zuurstof). Ook hier is een
mogelijke verklaring voor deze extra pieken dat er tijdens de meting in aanwezigheid met
zuurstof een reactie optreedt tussen de buffermoleculen en de aanwezige zuurstofradicalen.
Zelfs na zuurstofvrij maken van de oplossing blijven deze vermoedelijk geadsorbeerde
bestanddelen elektrochemisch zichtbaar. Dit fenomeen wordt verder in dit werk het
zuurstofeffect genoemd. Omdat deze pieken voor interferentie kunnen zorgen met de respons
van het enzym wordt steeds van bij de aanvang van het experiment gemeten in afwezigheid
van zuurstof. Het bruikbaar potentiaalgebied voor een Tris bufferoplossing aan een
goudelektrode gaat van -0,5 V tot 0,25 V.
4.1.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode
Bij een glasachtig koolstofelektrode wordt het eerder beschreven zuurstofeffect, vastgesteld
bij een goudelektrode (zie figuur 4.2), niet waargenomen. Toch zijn er ook hier interfererende
processen in aanwezigheid van zuurstof. Figuur 4.3 toont de stroompotentiaalcurven van een
10 mmol L-1 Tris bufferoplossing aan een glasachtig koolstofelektrode.
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
-0.50 -0.30 -0.10 0.10 0.30 0.50
E (V vs VKE)
I (µA)2
2
1 1
Figuur 4.3 Cyclische voltammogrammen van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1
Tris bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof.
Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.
41
Curve 1 uit figuur 4.3 stelt het elektrochemische gedrag voor in afwezigheid van zuurstof,
curve 2 in aanwezigheid van zuurstof. De piek gelegen bij een potentiaal van 0,14 V is de
koolstofoxidatiepiek [49]. Deze piek heeft een verschillende respons voor beide curven. Een
mogelijke verklaring hiervoor is dat door het polijsten het kristallijne oppervlak van de
elektrode telkens verschilt [50]. Iedere voorbehandeling is anders en geeft aanleiding tot licht
verschillende oppervlakken.
Op basis van figuur 4.3 kan vervolgens het bruikbare potentiaalgebied van een glasachtig
koolstofelektrode in een 10 mmol L-1 Tris bufferoplossing bepaald worden. Figuur 4.4 is de
voorstelling van dit bruikbare potentiaalgebied. Het zuurstofreductie proces wordt niet
waargenomen. De aanzet van de koolstofoxidatiepiek, bij een potentiaal van 0,025 V, vormt
de oxidatieve begrenzing. Er worden nog twee kleine oxidatieprocessen waargenomen bij
-0,31 V en -0,55 V. Deze processen zijn toe te kennen aan quinone dat zich op het
elektrodeoppervlak van een glasachtig koolstofelektrode bevindt. Voor meer informatie wordt
verwezen naar de literatuur [49,51]. Tabel 4.2 toont de parameterinstellingen voor deze
meting.
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0
E (V vs VKE)
I (µA)
Figuur 4.4 Cyclisch voltammogram van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Tris
bufferoplossing in afwezigheid van zuurstof. Parameterinstellingen: zie tabel 4.2.
42
Tabel 4.2 Parameterinstellingen bij de figuur 4.4.
startpotentiaal 0 V eerste omkeerpotentiaal 0,05 V tweede omkeerpotentiaal -1,0 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
4.2 Voltammetrisch gedrag van een Mes bufferoplossing
Door mogelijke schimmelvorming in de oplossing blijft een Mes bufferoplossing maar een
paar weken stabiel. Qua stabiliteit heeft het bijgevolg niet de voordelen van een Tris
bufferoplossing. Mes heeft een pKa van 6,2 en is stabiel in een pH gebied van 5,5 tot 6,7. In
dit hoofdstukonderdeel wordt het elektrochemisch gedrag van een Mes bufferoplossing aan
een goud- en glasachtig koolstofelektrode onderzocht.
4.2.1 Goud als werkelektrode
Analoog aan de experimenten beschreven in 4.1.1 wordt het elektrochemisch gedrag van de
Mes bufferoplossing vooreerst aan een goudelektrode bestudeerd. De cyclische
voltammogrammen van een gepolijste, niet roterende goudelektrode opgenomen in een 10
mmol L-1 Mes bufferoplosing worden voorgesteld in figuur 4.5. De parameterinstellingen van
deze meting worden weergegeven in tabel 4.1.
43
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5
E (V vs VKE)
I (µA)
2
1
12
12
Figuur 4.5 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Mes
bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof,
telkens aan een andere Mes buffer druppel. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.
Curve 1 in figuur 4.5 stelt de stroompotentiaalcurve voor in afwezigheid van zuurstof, curve 2
in aanwezigheid van zuurstof. Beide scans zijn opgenomen in een andere druppel Mes buffer
om het eventuele zuurstofeffect te vermijden. De zuurstofreductiepiek heeft een
piekpotentiaal van -0,13 V. Deze piek verdwijnt volledig wanneer gemeten wordt in
afwezigheid van zuurstof. Zowel in curve 1 als 2 worden twee oxidatieprocessen
waargenomen bij een potentiaal van ongeveer 0,24 V en 0,38 V en een reductieproces bij
ongeveer 0,24 V. Deze processen kunnen wellicht verklaard worden als de oxidatie van het
goud met vorming van goudoxiden en –hydroxiden en de reductie van deze componenten [46-
48]. Het bruikbare potentiaalgebied voor een Mes bufferoplossing aan een goudelektrode gaat
van -0,5 V tot 0,1 V.
4.2.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode
Figuur 4.6 toont twee stroompotentiaalcurven, opgenomen aan een glasachtig
koolstofelektode in een Mes bufferoplossing.De parameterinstellingen bij de opname van
deze cyclische voltammogrammen worden weergegeven in tabel 4.1.
44
-4.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5
E (V vs VKE)
I (µA)
2
1
2
1
Figuur 4.6 Cyclische voltammogrammen van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1
Mes bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof.
Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.
Curve 1 toont een stroompotentiaalcurve in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in
aanwezigheid van zuurstof. Er wordt een verschuiving van de koolstofoxidatiepiek
opgemerkt. Bij curve 1 bevindt de koolstofoxidatiepiek zich bij een potentiaal van 0,13 V en
bij curve 2 bij 0,16 V. Bij ongeveer -0,3 V wordt in aanwezigheid van zuurstof een
reductieproces waargenomen. Dit proces kan verklaard worden als de reductie van de
aanwezige hoeveelheid zuurstof in de oplossing. Daar dit proces kan interfereren met andere
wordt verkozen om te werken in een stikstofatmosfeer. Het bruikbare potentiaalgebied ligt
tussen -0,8 V en 0,1 V.
4.3 Voltammetrisch gedrag van een HEPES bufferoplossing
HEPES is een buffer die qua stabiliteit tussen de twee voorgaande ligt. Een HEPES
bufferoplossing blijft gedurende enkele maanden stabiel. HEPES heeft een pKa van 7,5 en
zijn bruikbaar pH-gebied ligt tussen 6,8 en 8,2. In dit pH gebied zijn de bestudeerde eiwitten
en enzymen stabiel en vertonen ze een hoge activiteit.
45
4.3.1 Goud als werkelektrode
De cyclische voltammogrammen van een gepolijste, niet roterende goudelektrode opgenomen
in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing worden voorgesteld in figuur 4.7. De
parameterinstellingen van deze meting worden weergegeven in tabel 4.1.
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5
E (V vs VKE)
I (µA)
2
1
2
1
Figuur 4.7 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES
bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof,
telkens aan een andere HEPES buffer druppel. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.
Curve 2 uit figuur 4.7 werd opgenomen in aanwezigheid van zuurstof, curve 1 in afwezigheid
van zuurstof. De zuurstofreductiepiek heeft een potentiaal van -0,16 V. Deze piek is niet
aanwezig in curve 1. In curve 2 worden twee oxidatieprocessen bij 0,20 V en bij 0,38 V
waargenomen. Het oxidatieproces bij 0,38 V is eveneens zichtbaar in curve 1 en kan
verklaard worden als de oxidatie van het goudoppervlak met vorming van goudoxiden en
goudhydroxiden [46-48]. Het proces bij 0,20 V is echter enkel waarneembaar in aanwezigheid
van zuurstof. Er treedt ook een reductieproces op bij 0,13 V. Een mogelijke verklaring voor
deze oxidatie- en reductiepiek is, zoals bij Tris, dat er tijdens de meting in aanwezigheid van
zuurstof mogelijk een reactie optreedt met de aanwezige zuurstofradicalen. Figuur 4.8 toont
het bruikbare potentiaalgebied van een goudelektrode in een 10 mmol L-1 HEPES
bufferoplossing in afwezigheid van zuurstof. Het bruikbare potentiaalgebied voor een
46
goudelektrode in een HEPES bufferoplossing gaat van -0,65 V tot 0,20 V. Tabel 4.3 toont de
parameterinstellingen die voor deze meting gebruikt werden.
-20
-10
0
10
20
-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19
E (V vs VKE)
I (nA)
Figuur 4.8 Cyclisch voltammogram van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES
bufferoplossing. Parameterinstellingen: zie tabel 4.3.
Tabel 4.3 Parameterinstellingen bij figuur 4.8.
startpotentiaal 0 V eerste omkeerpotentiaal 0,20 V tweede omkeerpotentiaal -0,65 V polarisatiesnelheid 10 mVs-1
4.3.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode
Figuur 4.9 toont het elektrochemisch gedrag van een glasachtig koolstofelektrode in
aanwezigheid van zuurstof (curve 2) en in afwezigheid van zuurstof (curve 1). De
parameterinstellingen bij de opname van deze cyclische voltammogrammen worden
weergegeven in tabel 4.1.
47
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
2
Figuur 4.9 Cyclische voltammogrammen van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1
HEPES bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van
zuurstof. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.
Het zuurstofreductieproces begint bij een potentiaal van ongeveer -0,13 V. De
koolstofoxidatiepiek wordt waargenomen bij een potentiaal van 0,17 V in afwezigheid van
zuurstof en bij 0,16 V in aanwezigheid van zuurstof. Ook bij HEPES is er dus een
verschuiving van de koolstofreductiepiek.
Figuur 4.10 toont het voor dit werk geselecteerde potentiaalgebied voor een glasachtig
koolstofelektrode in contact met een HEPES bufferoplossing onder stikstofatmosfeer. Het
bruikbare potentiaalgebied voor een glasachtig koolstofelektrode in een HEPES
bufferoplossing gaat van -0,8 V tot 0,1 V. Tabel 4.4 toont de parameterinstellingen die voor
deze meting gebruikt werden.
48
-80
-40
0
40
80
-0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1
E (V vs VKE)
I (nA)
Figuur 4.10 Cyclisch voltammogram van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1
HEPES bufferoplossing. Parameterinstellingen: zie tabel 4.4.
Tabel 4.4 Parameterinstellingen bij figuur 4.10.
startpotentiaal 0 V eerste omkeerpotentiaal 0,1 V tweede omkeerpotentiaal -0,8 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
4.4 Welke buffer verder gebruiken?
Op basis van de beschreven experimenten en resultaten wordt één van de bufferoplossingen
geselecteerd. In volgende hoofdstukken zal het eiwit en enzym elektrochemisch bestudeerd
worden in deze bufferoplossing.
Een Tris bufferoplossing wordt verder niet gebruikt vanwege het zuurstofeffect. Een Mes
bufferoplossing vertoont dit zuurstofeffect niet maar heeft een geringe stabiliteit. Een HEPES
bufferoplossing vertoont geen zuurstofeffect en is zeer stabiel. Tevens is er een relatief groot
potentiaalgebied waarin geen oxidatie- of reductieproces van de HEPES bufferoplossing of
van de elektrode optreedt. Dit zowel voor de goudelektrode als voor de glasachtig
koolstofelektrode. Hieruit kan besloten worden dat de HEPES bufferoplossing de voor dit
werk meest geschikte bufferoplossing is. Alle experimenten beschreven in volgende
hoofdstukken worden bijgevolg uitgevoerd in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing bij pH
49
7 en bij kamertemperatuur gebruik makende van ofwel een goudelektrode of een glasachtig
koolstofelektrode.
50
Hoofdstuk 5 Elektrochemisch gedrag van HCC Dit hoofdstuk omvat de studie van het elektrochemisch gedrag van HCC aan een glasachtig
koolstof- en een goudelektrode, al dan niet gemodificeerd met een linker, in een 10 mmol L-1
HEPES buffer oplossing van pH 7. Vóór iedere elektrochemische meting wordt 18 µL van
een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing aan de referentie-elektrode gehangen en wordt, om
alle zuurstof uit de cel te verwijderen, stikstof door de cel gestuurd. Na vijftien tot twintig
minuten wordt contact gemaakt tussen de drie elektroden. Vervolgens worden een drietal
cyclische voltammogrammen opgenomen waarna een linker wordt toegevoegd, opnieuw
gevolgd door opname van een drietal scans. In een volgende stap wordt het eiwit toegevoegd
en wordt het elektrochemisch gedrag ervan bestudeerd. In sommige gevallen wordt de stap
van het toevoegen van de linker overgeslaan omdat het elektrodeoppervlak reeds op voorhand
gemodificeerd werd. Dit wordt gedaan door het elektrodeoppervlak een twintigtal minuten in
contact te brengen met een oplossing van de linker waarmee men het oppervlak wil
modificeren. Het eiwit dat in dit hoofdstuk gebruikt wordt is HCC en bevat één haemgroep.
Het is de oxidatie en reductie van het ijzerion in deze haemgroep dat elektrochemisch
gedetecteerd kan worden.
5.1 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een glasachtig koolstofelektrode
Omdat HCC aan de buitenkant een globale positieve lading heeft en het glasachtig
koolstofoppervlak negatieve groepen bevat, wordt verwacht dat door de aantrekking van
tegengestelde ladingen HCC elektrochemisch detecteerbaar is aan een glasachtig
koolstofelektrode. Om dit na te gaan werden achtereenvolgende cyclische voltammogrammen
continu opgenomen onder een stikstofatmosfeer aan een glasachtig koolstofelektrode in een
26,3 µmol L-1 HCC bevattende 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Figuur 5.1 stelt de
eerste vier scans van dit experiment voor alsook de stroompotentiaalcurve opgenomen aan
een blanco glasachtig koolstofelektrode in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing zonder
HCC (curve 1). In dit experiment werd HCC gedetecteerd zonder gebruik te maken van een
linker. De parameterinstellingen voor dit experiment worden voorgesteld in tabel 5.1.
51
-0.5
-0.3
0.0
0.3
0.5
-0.33 -0.28 -0.23 -0.18 -0.13 -0.08 -0.03 0.02 0.07
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
5
2
5
Figuur 5.1 Cyclische voltammogrammen van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1
HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 26,3 µmol L-1 HCC (2-5). Parameterinstellingen: zie tabel 5.1.
Wat opvalt in figuur 5.1 is dat in het potentiaalgebied van 0 V tot -0,33 V na toevoegen van
HCC de reductiestromen afnemen met het scannummer. De pijlen verduidelijken de zin van
de optredende stroomvariaties met toenemend scannummer. Dit is te verklaren door het
volgende effect. Wanneer HCC wordt toegevoegd, wordt een kleine hoeveelheid zuurstof in
de cel gebracht dat gereduceerd kan worden in het getoonde potentiaalgebied. Deze kleine
hoeveelheid zuurstof en de daarbij horende reductiestroom verdwijnen wanneer continu
stikstofgas door de cel wordt gestuurd. Een ander redoxproces dat optreedt, is dat van HCC.
De piekpotentiaal van het oxidatieproces van HCC bedraagt 0,07 V. Er wordt slechts tot 0,07
V gescand omdat bij een hogere potentiaal de koolstofoxidatiepiek van de glasachtig
koolstofelektrode zichtbaar wordt en deze zou interfereren met de oxidatiepiek van HCC. Er
is reeds een kleine interferentie zichtbaar in figuur 5.1 waardoor het oxidatieproces en de
bijhorende potentiaal moeilijk te bepalen is. De piekpotentiaal van het reductieproces van
HCC bedraagt -0,024 V. Verder ziet men ook dat bij toenemend aantal scans de oxidatiepiek
van het eiwit afneemt. Dit is te verklaren door het optreden van denaturatie van het eiwit aan
het koolstofoppervlak. Deze twee effecten, zuurstofreductie bij toevoegen en denaturatie van
het eiwit bij herhaaldelijk cycliseren, treden bij ieder experiment op en worden daarom niet
meer expliciet vermeld. De besproken reacties zijn afkomstig van de oxidatie en reductie van
het ijzerion dat zich in de haemgroep van HCC bevindt en dit volgens de volgende reacties:
52
Oxidatie: Fe2+ → Fe3+ + 1 e- Reductie: Fe3+ + 1 e- → Fe2+
Tabel 5.1 Parameterinstellingen bij figuur 5.1.
startpotentiaal -0,31 V eerste omkeerpotentiaal 0,07 V tweede omkeerpotentiaal -0,31 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
5.2 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een goudelektrode
Daar goud een hydrofoob karakter heeft, wordt verwacht dat een hydrofiel enzym, zoals
HCC, denatureert in contact met een goudoppervlak. Elektrochemisch wordt dan ook vaak
geen signaal waargenomen omdat de elektronenoverdracht in het eiwit niet meer optimaal
verloopt. Om HCC elektrochemisch wel te kunnen detecteren aan een goudelektrode moet
gebruik gemaakt worden van een linker. De linker kan door spontane adsorptie tijdens de
voorbehandeling of elektrochemisch aangebracht worden. Omdat HCC globaal positief
geladen is, maakt men het best gebruik van linkers die een negatieve eindgroep bevatten zoals
6-mercaptohexanol, 5-carboxy-1-pentaanthiol,… In de literatuur werd tevens beschreven dat
4,4’-bipyridyl vaak als een geschikte linker kan fungeren [1,46].
5.2.1 4,4’-bipyridyl als linker
De eerste linker die getest werd, is 4,4’-bipyridyl (figuur 5.2). De modificatie van het
goudoppervlak werd bereikt door drie achtereenvolgende cyclische voltammogrammen op te
nemen van een goudelektrode in contact met 20 µL 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing die
5 mmol L-1 4,4’-bipyridyl bevat. De laatste van deze drie scans worden in figuur 5.3
voorgesteld (curve 1).
HN NH
Figuur 5.2 Structuur van 4,4’-bipyridyl.
In figuur 5.3 wordt tevens het elektrochemisch gedrag van HCC aan een met 4,4’-bipyridyl
gemodificeerde goudelektrode in 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing voorgesteld. Curve 1
53
stelt een cyclisch voltammogram voor van de met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde
goudelektrode. Na stabilisatie van het signaal werd 1 µL 500 µmol L-1 HCC toegevoegd (23,8
µmol L-1 HCC in druppel) (curve 2).
-0.20
-0.15
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
-0.42 -0.32 -0.22 -0.12 -0.02 0.08 0.18
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
Figuur 5.3 Cyclisch voltammogram van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode opgenomen in een
10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 23,8 µmol L-1 HCC (2). Parameterinstellingen zie
tabel 5.2.
Figuur 5.3 geeft duidelijk weer dat in aanwezigheid van 23,8 µmol L-1 HCC een oxidatie- en
reductieproces optreedt. Op basis van literatuurgegevens [1] kunnen deze processen worden
toegeschreven aan de oxidatie en reductie van de haemgroep in het eiwit. De piekpotentiaal
van het oxidatieproces bedraagt 0,087 V en van het reductieproces 0,002 V. Het
oxidatieproces stelt de oxidatie van Fe2+ voor met vorming van Fe3+. Bij 0,002 V treedt het
daarbijhorende reductieproces op. In de literatuur werden analoge piekpotentialen gevonden
[1]. De parameterinstellingen voor deze meting worden getoond in tabel 5.2.
54
Tabel 5.2 Parameterinstellingen bij figuur 5.3, figuur 5.5 en figuur 5.10.
startpotentiaal -0,4 V eerste omkeerpotentiaal 0,2 V tweede omkeerpotentiaal -0,4 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
Nu blijft natuurlijk de vraag of het eiwit geadsorbeerd is aan het goudoppervlak of niet. Dit
werd onderzocht door de polarisatiesnelheid te variëren. Wanneer de stroom wordt uitgezet in
functie van de polarisatiesnelheid zou men een lineair verband moeten vinden als het deeltje
geadsorbeerd wordt (vergelijking 2.5). Indien het eiwit vanuit de oplossing reageert dan vindt
men een lineair verband als de stroom wordt uitgezet in functie van de vierkantswortel van de
polarisatiesnelheid (vergelijking 2.4). Wanneer dit voor HCC aan een met 4,4’-bipyridyl
gemodificeerde goudelektrode werd uitgevoerd, werd noch voor adsorptie, noch voor reactie
vanuit de oplossing een lineair verband gevonden. Dit kan verklaard worden door denaturatie
van het eiwit. Gedenatureerd eiwit kan aan het elektrodeoppervlak binden waardoor het
oppervlak gedeeltelijk geblokkeerd wordt.
Vervolgens werden Raman metingen uitgevoerd om een passend antwoord op deze vraag te
vinden. Maar door de lage concentratie op de elektrode werden geen duidelijke Raman
banden waargenomen.
Gebaseerd op literatuurgegevens [1,46] wordt aangenomen dat HCC geadsorbeerd wordt aan
het gemodificeerde oppervlak. De piekseparatie die optreedt, duidt op een lichte afwijking
van het ideale reversibele systeem.
5.2.2 6-mercaptohexanol als linker
De volgende linker die getest werd om HCC elektrochemisch te detecteren aan een
goudelektrode is 6-mercaptohexanol (figuur 5.4).
HS
OH Figuur 5.4 Structuur van 6-mercaptohexanol.
55
Om het goudoppervlak te modificeren werd de goudelektrode twintig minuten in een
1 mmol L-1 6-mercaptohexanol oplossing gedompeld. Dit om de covalente goud-thiol
bindingen te vormen. De gemodificeerde goudelektrode werd vervolgens in de cel gebracht en
18 µL 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing werd aan de referentie-elektrode gehangen. De
volledige opstelling werd vijftien minuten doorborreld met stikstof om alle zuurstof uit de cel
te verwijderen. Na contact gemaakt te hebben tussen de druppel en de elektroden werden een
aantal voltammetrische curven opgenomen. Na stabilisatie van dit blanco signaal werd
vervolgens HCC toegevoegd aan de druppel. De cyclische voltammogrammen van de
gemodificeerde elektrode in af- en aanwezigheid van HCC worden voorgesteld in figuur 5.5.
-0.28
-0.23
-0.18
-0.13
-0.08
-0.03
0.02
0.07
0.12
0.17
-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
Figuur 5.5 Cyclisch voltammogram van een met 6-mercaptohexanol gemodificeerde goudelektrode opgenomen
in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 100 µmol L-1 HCC (2).
Parameterinstellingen zie tabel 5.2.
Curve 1 in figuur 5.5 toont het elektrochemisch gedrag van een met 6-mercaptohexanol
gemodificeerde goudoppervlak. Curve 2 toont het elektrochemisch gedrag na toevoegen van 2
µL van een 1 mmol L-1 HCC oplossing. Dit resulteert in een 100 µmol L-1 HCC oplossing in
de druppel.
Analoog aan figuur 5.3 worden een oxidatie- en reductieproces van HCC vastgesteld. De
piekpotentialen liggen wat verder uit elkaar wat duidt op een meer irreversibel proces en dus
op een minder goede linker. De piekpotentiaal van de oxidatie bevindt zich bij 0,116 V, die
56
van de reductie bij -0,059 V. Ook hier kunnen beide processen worden toegeschreven aan de
oxidatie en reductie van de haemgroep van het eiwit HCC.
5.2.3 5-carboxy-1-pentaanthiol als linker
Indien 5-carboxy-1-pentaanthiol (zie figuur 5.6) als linker wordt gebruikt dan ontstaan
covalente goud-thiol bindingen waarbij een negatief geladen oppervlak (carboxylgroepen)
gecreëerd wordt.
HS COOH
Figuur 5.6 De structuur van 5-carboxy-1-pentaanthiol.
Om een met 5-carboxy-1-pentaanthiol gemodificeerd goudoppervlak te bekomen, werd de
goudelektrode gedurende twintig minuten in een 5-carboxy-1-pentaanthiol oplossing
gehangen. Deze oplossing werd bereid door 1 µL 5-carboxy-1-pentaanthiol op te lossen in 1
mL ethanol. Deze modificatie gebeurde onder stikstofatmosfeer omdat 5-carboxy-1-
pentaanthiol reageert met zuurstof.
-40
-20
0
20
40
60
80
-0.47 -0.37 -0.27 -0.17 -0.07 0.03 0.13
E (V vs VKE)
I (nA)
1
2
Figuur 5.7 Cyclisch voltammogram van een met 5-carboxy-1-pentaanthiol gemodificeerde goudelektrode
opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 50 µmol L-1 HCC (2).
Parameterinstellingen: zie tabel 5.3.
57
Curve 1 in figuur 5.7 toont het cyclisch voltammogram van een met 5-carboxy-1-pentaanthiol
gemodificeerde goudoppervlak in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Er zijn
verschillende redoxprocessen van de linker zichtbaar. Curve 2 is de scan opgenomen in
aanwezigheid van 50 µmol L-1 HCC oplossing. De parameterinstellingen van deze meting
worden getoond in tabel 5.3.
Tabel 5.3 Parameterinstellingen bij figuur 5.7.
startpotentiaal -0,46 V eerste omkeerpotentiaal 0,2 V tweede omkeerpotentiaal -0,46 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
Om het netto elektrochemisch signaal van HCC waar te nemen, wordt curve 1 van curve 2
afgetrokken. De resulterende curve wordt voorgesteld in figuur 5.8.
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
-0.17 -0.12 -0.07 -0.02 0.03 0.08 0.13
E (V vs VKE)
I (nA)
AC
B
D
Figuur 5.8 Curve 2 – curve 1 van figuur 5.7.
De piekpotentialen liggen ook hier ver uit elkaar. De piekpotentiaal van de oxidatie van HCC
bevindt zich bij 0,124 V (A), deze van de reductie bij -0,031 V (B). De grote spreiding tussen
de piekpotentialen duidt er wederom op dat 5-carboxy-1-pentaanthiol een minder goede linker
is dan 4,4’-bipyridyl. Bij C en D treedt een tweede redoxkoppel op. Dit proces en een
mogelijke verklaring ervan werden niet bestudeerd.
58
5.2.4 7-carboxy-1-heptaanthiol als linker
Ook met 7-carboxy-1-heptaanthiol (figuur 5.9) worden covalente goud-thiol bindingen en een
negatief geladen goudoppervlak gevormd.
HS COOH
Figuur 5.9 Structuur van 7-carboxy-1-heptaanthiol.
Het gemodificeerde goudoppervlak werd bereid door de goudelektrode in een 7-carboxy-1-
heptaanthiol oplossing te hangen. Deze oplossing werd bekomen door 1 µL 7-carboxy-1-
heptaanthiol op te lossen in 1 mL water.
-50
-25
0
25
50
-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19
E (V vs VKE)
I (nA)
1
2
Figuur 5.10 Cyclisch voltammogram van een met 7-carboxy-1-heptaanthiol gemodificeerde goudelektrode
opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 13,5 µmol L-1 HCC (2).
Parameterinstellingen zie tabel 5.2.
Figuur 5.10 toont het elektrochemisch gedrag van een met 7-carboxy-1-heptaanthiol
gemodificeerd goudoppervlak in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Curve 1 toont het
stroompotentiaalgedrag van het gemodificeerde goudoppervlak. Curve 2 stelt het
stroompotentiaalgedrag voor van HCC aan dit gemodificeerde oppervlak. Aan de
bufferoplossing werd 0,5 µL 500 µmol L-1 HCC oplossing toegevoegd, resulterend in een
13,5 µmol L-1 concentratie HCC in de druppel. De reductiepiek van het eiwit bevindt zich bij
59
een potentiaal van 0,0 V, de oxidatiepiek bij een potentiaal van 0,12 V. Deze piek zijn
afkomstig van de oxidatie en de reductie van HCC. Deze linker blijkt dus geschikt te zijn voor
detectie van HCC. 7-carboxy-1-heptaanthiol als linker geeft wel een minder reversibel
systeem voor HCC dan 4,4’-bipyridyl.
5.2.5 Overige linkers
Bij het gebruik van sommige linkers verschijnen er in het gehanteerde potentiaalgebied geen
extra oxidatie- of reductieprocessen na toevoegen van het eiwit. Het eiwit HCC kan aldus met
deze linkers geïmmobiliseerd op de elektrode niet gedetecteerd worden.
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
-0.33 -0.28 -0.23 -0.18 -0.13 -0.08 -0.03 0.02 0.07
E (V vs VKE)
I (nA)
1
2
Figuur 5.11 Cyclisch voltammogram van een met een linker gemodificeerde goudelektrode opgenomen in een 10
mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van HCC(2).
Figuur 5.11 toont het elektrochemisch gedrag van een dergelijke linker. Curve 1 toont het
elektrochemisch gedrag van het gemodificeerde goudoppervlak. Curve 2, die de
stroompotentiaalcurve na toevoeging van het eiwit voorstelt, verschilt enkel in het
potentiaalgebied van -0,15 V tot -0,33 V van curve 1. Dit valt te verklaren door het
zuurstofeffect dat reeds besproken werd bij figuur 5.1. Een linker die een gelijkaardig
elektrochemisch gedrag heeft, zoals getoond wordt in figuur 5.11 is
koper(II)tetrasulfoftalocyanine tetrasodium zout (CuTSPc). Deze afzetting van CuTSPc werd
60
bekomen door eerst tien blanco scans op te nemen in een bufferoplossing met pH 12.
Vervolgens werd de elektrode in een 8 mmol L-1 CuTSPc oplossing gebracht en werden 50
scans opgenomen. Bij deze meting was de beginpotentiaal 0 V, de eerste omkeerpotentiaal
bedroeg 0,6 V en de tweede omkeerpotentiaal was -1,2 V. De polarisatiesnelheid was steeds
50 mV s-1. De blanco goudelektrode geeft zoals vermeld ook een gelijkaardige respons als
figuur 5.7.
Aangezien er reeds een aantal linkers (4,4’-bipyridyl, 6-mercaptohexanol, ...) een zeer goede
respons voor HCC vertonen en omdat het doelenzym CCP is, werden geen extra linkers
getest.
Het mag duidelijk zijn dat het dikwijls trial and error is om het eiwit HCC elektrochemisch te
kunnen detecteren. Zowel de hydrofobiciteit als de lading van zowel het oppervlak als het
eiwit spelen vaak een beperkende factor.
61
Hoofdstuk 6 Elektrochemisch gedrag van CCP
Zoals in hoofdstuk 1 reeds werd beschreven, wordt het enzym CCP gekenmerkt door een
negatieve lading langs de buitenzijde van de haemgroepen. Om CCP te kunnen detecteren aan
een door een linker gemodificeerde elektrode, is het een vereiste dat deze linker een positief
uiteinde bevat. Linkers die hiervoor in aanmerking komen zijn diegene met als eindstandige
groep bijvoorbeeld een amine (bv. cysteamine).
6.1 Linkers
De eerste linker die getest werd, was cysteamine (zie figuur 6.1). Het goudoppervlak werd
gemodificeerd door de elektrode in een 60 µmol L-1 cysteamine oplossing, met als solvent
water, te hangen gedurende een twintigtal minuten.
HSNH2
Figuur 6.1 Structuur van Cysteamine.
Curve 1 van figuur 6.2 toont de stroompotentiaalcurve voor een met cysteamine
gemodificeerde goudelektrode in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Curve 2 toont het
elektrochemisch gedrag van 50 µ mol L-1 CCP aan deze gemodificeerde elektrode. De
parameterinstellingen van dit experiment worden getoond in tabel 6.1.
Parameterinstellingen bij figuur 6.1.
startpotentiaal -0,4 V eerste omkeerpotentiaal 0,2 V tweede omkeerpotentiaal -0,4 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
62
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19
E (V vs VKE)
I (µA)
12
Figuur 6.2 Cyclisch voltammogram van een met cysteamine gemodificeerde goudelektrode opgenomen in een 10
mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 50 µmol L-1 CCP (2). Parameterinstellingen zie tabel
6.1.
In curve 1 van figuur 6.2 wordt een oxidatieproces waargenomen in het potentiaalgebied van
-0,04 V tot 0,2 V. Dit oxidatieproces heeft als mogelijke verklaring de oxidatie van de linker
cysteamine. Deze oxidatie wordt ook waargenomen in curve 2. In aanwezigheid van CCP is
de respons duidelijk verschillend van curve 1. Dit doet vermoeden dat er een ander proces
optreedt. Om het signaal van dit extra proces te bekomen wordt curve 2 van curve 1
afgetrokken. Dit nettosignaal geeft de bijdrage van CCP weer.
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
-0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14E (V vs VKE)
I (µA)
Figuur 6.3 Curve 2 – curve 1 van figuur 6.2.
63
Figuur 6.3 vertoont een duidelijke oxidatiepiek waarvan de piekpotentiaal zich bij 0,08 V
bevindt. Deze oxidatiepiek is afkomstig van het ijzerion uit de hoogpotentiaal haemgroep. Het
reductieproces is afwezig wat duidt op een irreversibel proces waarbij het ijzerion uit de
hoogpotentiaal haemgroep geoxideerd wordt.
2 3 -1HP HPFe Fe e+ +→ +
Vervolgens werden heel wat linkers getest waarbij het elektrochemisch gedrag gelijkaardig is
aan figuur 5.7. Deze linkers zijn niet geschikt voor de elektrochemische detectie van CCP.
Deze zijn voor de goudelektrode: neomycine, spermidine, 4,4’-bipyridyl, CuTSPc, poly-L-
lysine, 6-mercaptohexanol, 6-ferrocenyl-1-hexaanthiol, 5-carboxy-1-pentaanthiol, 5-
carboxypenthyl disulfide, mercaptopropionzuur en de blanco goudelektrode. Voor de
glasachtig koolstofelektrode werden poly-L-lysine, poly-L-lysine (10X verdund), neomycine,
6-amino-1-hexaanthiol en de blanco koolstofelektrode getest.
6.2 HCC als mediator voor CCP
Omdat de geteste linkers geen goede resultaten gaven, wordt getracht CCP elektrochemisch te
detecteren met HCC als mediator (zie paragraaf 1.3). Hiervoor wordt eerst HCC
geïmmobiliseerd aan de goudelektrode met behulp van 4,4’-bipyridyl volgens de procedure
die werd uitgelegd in paragraaf 5.2.1. Nadien wordt HCC toegevoegd zodat het
gemodificeerde goudoppervlak in contact staat met 11,9 µmol L-1 HCC. Daarna worden vijf
cyclische voltammogrammen opgenomen om HCC te laten stabiliseren. Vervolgens wordt
CCP toegevoegd en elektrochemisch gedetecteerd.
64
I (nA)
-30
-20
-10
0
10
20
-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19
E (V vs VKE)
Au/bipyAu/bipy/HCCAu/bipy/HCC/CCP
Figuur 6.4 Cyclisch voltammogram van een met 4,4’-bipyridyl (bipy) gemodificeerde goudelektrode opgenomen
in 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (blauw) in aanwezigheid van HCC (rood) en in aanwezigheid van HCC
en CCP (groen). Parameterinstellingen zie tabel 6.2.
Figuur 6.4 toont het elektrochemisch gedrag van door HCC gemedieerd CCP. De
parameterinstellingen van deze meting worden getoond in tabel 6.1. De blauwe curve toont
het elektrochemisch gedrag van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode. De
rode curve toont het elektrochemisch gedrag na toevoegen van HCC aan de druppel en de
groene curve toont het elektrochemisch gedrag na toevoegen van CCP aan diezelfde druppel.
Bij de rode curve worden opnieuw het oxidatie- en reductieproces van HCC waargenomen.
De piekpotentiaal van de oxidatie van HCC bevindt zich bij 0,08 V, deze van de reductie bij
0,02 V. Bij de groene curve, dit is de curve na toevoegen van 1 µL 500 µmol L-1 CCP
(resulterend in 26,3 µmol L-1 in de druppel), verschuift de piekpotentiaal van de oxidatie naar
0,06 V, deze van de reductie naar 0,0 V. Een mogelijke verklaring voor deze verschuiving is
de vorming van een complex tussen HCC en CCP. CCP is elektrochemisch niet actief maar
bindt zich aan HCC via complexvorming. Deze binding van CCP aan HCC zorgt voor de
verschuiving van de piekpotentiaal van HCC.
Een gelijkaardig systeem werd door het Laboratorium voor Eiwitbiochemie en
Eiwitengineering aan de UGent getest met het twee hybride systeem. De complexvorming
werd onderzocht met cytochroom c2 en CCP. Cytochroom c2 is net als HCC een monohaem
65
eiwit en een elektronendonor. Cytochroom c2 werd in frame gekloneerd met ∆α truncaties
van galactosidase en cytochroom c peroxidase met ∆ω truncaties van galactosidase. Deze
twee β galactosidase mutanten, ∆α (N-terminale deletie) en ∆ω (C-terminale truncatie)
hebben een lage bindingsaffiniteit en zijn niet in staat om een stabiel complex te vormen. Een
actief complex wordt gevormd wanneer de twee mutanten geëxpresseerd worden als fusies
waarvan de ‘target’ eiwitparen met elkaar interageren (in dit geval cytochroom c2 en CCP)
(zie figuur 6.5). Als gastheer voor dit systeem werd gebruik gemaakt van een E. Coli stam
waarvan het endogeen galactosidase geïnactiveerd is. Deze benadering heeft als voordeel dat
eiwitcomplexen kunnen bestudeerd worden in het periplasma en dat er geen interactie met het
DNA noodzakelijk is om een reporter gen aan te slaan. De activiteit wordt
spectrofotometrisch gevolgd bij 450 nm dat de vrijstelling van ortho-nitrofenol uit 2-
nitrofenyl-β D-galactopyranoside volgt indien een actief complex gevormd wordt [52].
Tabel 6.2 Parameterinstellingen bij figuur 6.4.
startpotentiaal -0,2 V eerste omkeerpotentiaal 0,2 V tweede omkeerpotentiaal -0,2 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
Figuur 6.5 Principe van het bacterieel twee hybride systeem.
In de literatuur vinden we ook nog andere systemen waarbij complexvorming optreedt tussen
HCC en een peroxidase [53,54]. Op basis van de bekomen resultaten, de vastgestelde
66
piekverschuiving en gelijkaardige systemen beschreven in de literatuur, stellen we dat HCC
en CCP een complex vormen.
67
Hoofdstuk 7 Detectie van waterstofperoxide aan een
HCC/CCP gemodificeerde goudelektrode
Als toepassing wordt getracht waterstofperoxide te detecteren met behulp van een
goudelektrode gemodificeerd met het HCC/CCP complex. De reductie van waterstofperoxide
gebeurt door het enzym CCP volgens de reactie:
H2O2 + 2 e- + 2 H+ → 2 H2O
In dit hoofdstuk wordt nagegaan of de detectie van waterstofperoxide aan deze
gemodificeerde goudelektrode mogelijk is. Het complex wordt geïmmobiliseerd met enerzijds
4,4’-bipyridyl als linker en anderzijds met 6-mercaptohexanol als linker.
7.1 4,4’-bipyridyl als linker
Om waterstofperoxide te detecteren wordt aan het in hoofdstukdeel 6.2 beschreven systeem
(met 4,4’bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact met HCC/CCP complex)
waterstofperoxide toegevoegd. Figuur 7.1 toont de katalyse in een 10 mmol L-1 HEPES
bufferoplossing. Curve 1 uit figuur 7.1 toont het elektrochemisch gedrag van CCP gemedieerd
door HCC aan een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerd goudoppervlak. Na toevoegen van het
waterstofperoxide (454 µmol L-1 in de druppel) wordt curve 2 bekomen. HCC en CCP
worden in de verhouding 1/1 (telkens 23,8 µmol L-1 in de druppel) aan de druppel
toegevoegd, zodat de complexvorming goed kan doorgaan. De elektrontransfer, van het
complex naar het waterstofperoxide, wordt gekatalyseerd via een redoxreactie met de
geadsorbeerde ijzerionen uit de haemgroepen. De elektrontransfer (reductie van
waterstofperoxide) is elektrochemisch detecteerbaar. Dit wordt duidelijk waargenomen in
curve 2 waar de elektrokatalyse zichtbaar is in de vorm van een sigmoïde.
68
-165
-115
-65
-15-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19
E (V vs VKE)
I (nA)
2
1
Figuur 7.1 Cyclisch voltammogrammen van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact met
23,8 µmol L-1 HCC en 23,8 µmol L-1 CCP (1) in contact met 454 µmol L-1 H2O2 (2). Parameterinstellingen zie
tabel 7.1.
Tabel 7.1 Parameterinstellingen bij figuur 7.1, figuur 7.3 en figuur 7.4.
startpotentiaal -0,2 V eerste omkeerpotentiaal 0,2 V tweede omkeerpotentiaal -0,2 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
Om te weten of de katalyse reversibel verloopt wordt de eerste afgeleide van de stroom naar
de tijd genomen en uitgezet in functie van de potentiaal. Dit wordt getoond in figuur 7.2.
69
-15
-10
-5
0
5
10
15
-0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19
E (V vs VKE)
di/dt (nA/s)
Figuur 7.2 De afgeleide van de stroom naar de tijd van curve 2 uit figuur 7.1 uitgezet in functie van de
potentiaal.
Op figuur 7.2 worden duidelijk pieken waargenomen op de plaats van de sigmoïden. De
oxidatie- en de reductiepiek bevinden zich bij dezelfde potentiaal wat duidt op een reversibele
katalytische reactie.
Om aan te tonen dat alle componenten die aanwezig zijn aan de goudelektrode nodig zijn om
katalyse elektrochemisch waar te nemen, werden een aantal experimenten uitgevoerd waarbij
telkens een component werd weggelaten.
In een eerste experiment werd CCP weggelaten. Het goudoppervlak werd gemodificeerd met
4,4’-bipyridyl. Vervolgens werd HCC aan de druppel toegevoegd. Dan werd de
gemodificeerde goudelektrode in contact gebracht met waterstofperoxide. Dit experiment test
in feite of HCC de reductie van waterstofperoxide kan katalyseren. Figuur 7.3 toont dit
experiment.
70
-30
-20
-10
0
10
20
30
-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19
E (V vs VKE)
I (µA)
1
2
Figuur 7.3 Cyclische voltammogrammen van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact
met 23,8 µmol L-1 HCC en 454 µmol L-1 H2O2. Parameterinstellingen zie tabel 6.1.
Curve 1 uit figuur 7.3 toont het elektrochemisch gedrag van 23,8 µmol L-1 HCC aan een met
4,4’-bipyridyl gemodificeerd goudoppervlak. De oxidatie- en reductiepieken die besproken
werden in hoofdstuk 5.2.1 komen ook hier tevoorschijn. Na toevoegen van 1 µl 10 mmol L-1
waterstofperoxide (454 µmol L-1 in de druppel) werd curve 2 bekomen. De respons van deze
curve is lager omdat HCC vrij gemakkelijk denatureert in contact met waterstofperoxide. Dit
proces wordt bleking genoemd. Er treedt geen katalyse op wat er op wijst dat CCP een
noodzakelijke component is voor het detecteren van waterstofperoxide aan de gemodificeerde
goudelektrode.
In een volgend experiment werd HCC weggelaten. Dat CCP niet elektrochemisch
detecteerbaar is aan 4,4’-bipyridyl werd reeds aangetoond in hoofdstuk 6.2. Maar dat de
katalyse elektrochemisch niet detecteerbaar is zonder HCC, werd nog niet aangetoond. Om dit
te onderzoeken werd de goudelektrode gemodificeerd met 4,4’-bipyridyl. Vervolgens werd
CCP aan de druppel toegevoegd. Daarna werd het gemodificeerde goudoppervlak in contact
gebracht met waterstofperoxide. Figuur 7.4 toont de resultaten van dit experiment.
71
-40
-30
-20
-10
0
10
20
-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19
E (V vs VKE)
I (nA)
1
2
Figuur 7.4 Cyclische voltammogrammen van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact
met 23,8 µmol L-1 CCP (1) en met 455 µmol L-1 H2O2 (2). Parameterinstellingen zie tabel 6.1.
Curve 1 uit figuur 7.4 toont het elektrochemisch gedrag van 23,8 µmol L-1 CCP aan een met
4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode. Na toevoegen van 1 µl 10 mmol L-1
waterstofperoxide (455 µmol L-1 in de druppel) werd curve 2 bekomen. Ook hier wordt geen
katalyse waargenomen. Dus HCC is wel degelijk nodig om katalyse elektrochemisch te
detecteren aan een goudelektrode. De complexvorming tussen HCC en CCP is nodig om de
reductie van waterstofperoxide elektrochemisch te detecteren.
7.2 6-mercaptohexanol als linker
Het bovenstaande systeem werd ook getest met een andere linker dan 4,4’-bipyridyl, namelijk
6-mercaptohexanol. Deze linker gaf ook een reversibele respons met HCC (zie paragraaf
5.2.2).
72
-150
-100
-50
0
50
-0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19E (V vs VKE)
I (nA)
1
2
Figuur 7.5 Cyclische voltamogrammen van een met 6-mercaptohexanol gemodificeerde goudelektrode in contact
met 23,8 µmol L-1 HCC en 23,8 µmol L-1 CCP (1) en in contact met 454 µmol L-1 H2O2 (2).
Parameterinstellingen zie tabel 7.1.
Figuur 7.5 maakt duidelijk dat de katalyse die we met 4,4’-bipyridyl elektrochemisch konden
detecteren ook mogelijk is met 6-mercaptohexanol. De parameterinstellingen van deze meting
worden getoond in tabel 7.1. Curve 1 toont hier CCP gemedieerd door HCC aan een met 6-
mercaptohexanol gemodificeerde goudelektrode. HCC en CCP worden telkens toegevoegd tot
een concentratie van 23,8 µmol L-1 in de druppel. Curve 2 toont het cyclisch voltammogram
na toevoegen van 1 µL 10 mmol L-1 waterstofperoxide (454 µmol L-1 in de druppel). De
sigmoïde vorm verschijnt duidelijk maar om iets te kunnen vertellen over de reversibiliteit
wordt de eerste afgeleide van de stroom naar de tijd uitgezet in functie van de potentiaal.
Tabel 7.2 Parameterinstellingen bij figuur 7.5.
startpotentiaal -0,3 V eerste omkeerpotentiaal 0,2 V tweede omkeerpotentiaal -0,3 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1
73
-15
-10
-5
0
5
10
15
-0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19
E (V vs VKE)
di/dt (nA/s)
Figuur 7.6 De afgeleide van de stroom naar de tijd van curve 2 uit figuur 7.5 uitgezet in functie van de
potentiaal.
Figuur 7.6 toont duidelijk pieken op de plaats waar in figuur 7.5 de sigmoïden zich bevinden.
Hieruit kan besloten worden dat ook hier de katalyse elektrochemisch detecteerbaar is. Dit
doet vermoeden dat voor elke linker die een goede reversibiliteit vertoont met HCC het
systeem in staat is om katalyse elektrochemisch te detecteren. Verder onderzoek zal dit echter
moeten uitwijzen.
Wat is er nu allemaal nodig om waterstofperoxide te kunnen detecteren? Dit wordt getoond in
figuur 7.7.
-linker
-HCC
-CCP
-H2O2
Indien één van deze componenten ontbreekt:
geen katalyse waarneembaar!!!!
Deze 4 componenten zijn nodig aan het Au-oppervlak
om katalyse waar te nemen
-linker
-HCC
-CCP
-H2O2
Indien één van deze componenten ontbreekt:
geen katalyse waarneembaar!!!!
Deze 4 componenten zijn nodig aan het Au-oppervlak
om katalyse waar te nemen
-linker
-HCC
-CCP
-H2O2
Indien één van deze componenten ontbreekt:
geen katalyse waarneembaar!!!!
Deze 4 componenten zijn nodig aan het Au-oppervlak
om katalyse waar te nemen
Figuur 7.7 schematische voorstelling van de componenten noodzakelijk om katalyse waar te nemen.
74
Eerst en vooral het elektrodeoppervlak. Dit elektrodeoppervlak wordt gemodificeerd met een
linker die een goede reversibiliteit vertoonde met HCC. Vervolgens HCC dat
geïmmobiliseerd wordt op deze linker. Dan CCP dat op HCC geïmmobiliseerd wordt waarbij
een complex tussen HCC en CCP wordt gevormd en tot slot moet dit systeem in contact
gebracht worden met waterstofperoxide.
Voor de eventuele toepassing in de klinische diagnose, de chemische en farmaceutische
industrie en de biologische en medische wetenschappen is het zoals vermeld in de inleiding
van belang dat zeer lage concentraties aan waterstofperoxide gedetecteerd kunnen worden. In
dit onderzoek werd nagegaan of waterstofperoxide gedetecteerd kan worden. Daarom werd
steeds gebruik gemaakt van ongeveer 454 µmol L-1 waterstofperoxide in de druppel. Wat de
laagste concentratie waterstofperoxide is die gemeten kan worden moet nog verder
onderzocht worden.
75
Samenvatting en besluit
In dit werk werd onderzoek verricht naar de immobilisatie van eiwitten en redoxenzymen aan
al dan niet gemodificeerde elektroden.
Eerst werd nagegaan welke bufferoplossing het meest geschikt is om elektrochemische
metingen in uit te voeren bij pH 7. Door middel van cyclische voltammetrie werd vastgesteld
dat een HEPES bufferoplossing bij pH 7 de meest stabiele bufferoplossing is en het minste
interferentiepieken heeft in een potentiaalgebied van -0,2 V tot 0,2 V. Dit is het
potentiaalgebied waarin respons van de eiwitten of enzymen verwacht wordt.
Na dit vooronderzoek werd onderzoek verricht naar de immobilisatie van paardenhart
cytochroom c (HCC) aan een al dan niet gemodificeerde goudelektrode en een glasachtig
koolstofelektrode. Dit werd onderzocht met behulp van cyclische voltammetrie. Hierbij werd
gevonden dat een goudelektrode gemodificeerd met 4,4’-bipyridyl een zeer goede respons
geeft die het meest de reversibiliteit benadert. Ook een goudelektrode gemodificeerd met 6-
mercaptohexanol geeft een goede respons. De voltammetrische respons die wordt bekomen is
afkomstig van de oxidatie en reductie van het ijzerion in de haemgroep van HCC.
Vervolgens werd gepoogd Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP) te
immobiliseren aan een al dan niet gemodificeerde goudelektrode of glasachtig
koolstofelektrode. Aanvankelijk kon CCP elektrochemisch niet gedetecteerd worden. Dus
werd CCP geïmmobiliseerd met HCC als mediator. Hierbij werd HCC eerst geïmmobiliseerd
aan een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode. Deze gemodificeerde
goudelektrode werd vervolgens in contact gebracht met CCP. Hierbij was CCP zelf niet
elektrochemisch actief maar kon de immobilisatie gevolgd worden door de verschuiving van
de piekpotentiaal van HCC. Deze verschuiving bracht aan het licht dat HCC en CCP een
complex vormen.
Tot slot werd getracht waterstofperoxide te detecteren met het gevormde complex. Dit is
mogelijk omdat CCP in staat is om de reductie van waterstofperoxide te katalyseren. Deze
detectie lukte zeer goed waarbij de katalyse werd waargenomen als een sigmoïde vorm in het
cyclisch voltammogram. Er werd bekomen dat waterstofperoxide kan gedetecteerd worden
76
aan een goudelektrode gemodificeerd met een linker die een goede reversibiliteit vertoond
met HCC. Op dit gemodificeerde oppervlak wordt HCC geïmmobiliseerd. Daarna wordt CCP
toegevoegd zodat er een complex wordt gevormd tussen HCC en CCP. Dit systeem is in staat
om waterstofperoxide elektrochemisch te detecteren als waterstofperoxide aan het systeem
wordt toegevoegd.
77
Literatuurlijst
[1] Eddowes M.J., Hill H.A.O., J.C.S. Chem. Comm. 21 (1977) 771.
[2] Yeh P., Kuwana T., Chemistry Letters 10 (1977) 1145.
[3] Kafi A.K.M., Yin F., Shin H., Kwon Y., Thin Solid Films 499 (2006) 420.
[4] Heering H.A., Wiertz F.G.M., Dekker C., de Vries S., J. AM. Chem. Soc. 126
(2004) 11103.
[5] http://nl.wikipedia.org (mei 2006).
[6] Voet D., Voet J.G., Biochemistry, Second Edition, Wiley-VCH, New York,
1995.
[7] http://www.aecom.yu.edu/home/biophysics/rousseau/ctc/ctcw.gif (mei 2006).
[8] De Smet L., Savvides S.N., Van Horen E., Pettigraw G., Van Beeumen J.J.,
Journal of Biological Chemistry 281 (2006) 4371.
[9] Koh M., Meyer T.E., De Smet L., Van Beeumen J.J., Cusanovich M.A.,
Archives of Biochemistry and Biophysics 410 (2003) 230.
[10] De Smet L., Pettigraw G.W., Van Beeumen J.J., Eur. J. Biochem. 268 (2001)
6559.
[11] http://dwp.fcroc.nl/microbiologie/images/Image13.gif (november 2005).
[12] Bowden E.F., Hawkridge F.M., Chlebowski J.F., Bancroft E.E., Thorp C.,
Blount H.N., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7641.
[13] Niki K., Yagi T., Inokuchi H., Kimura K., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 3335.
[14] Eddowes M.J., Hill H.A.O., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 4461.
[15] Guilbault G.G., Kauffmann J.-M., Patriarche G.J., Protein immobilization,
Taylor R.F. (Ed.), Marcel Dekker, New York, 1991.
[16] Bowden, E.F., Hawkridge, F.M., Blount H.N., J. Electroanal. Chem. 161
(1984) 355.
[17] Davis J.J., Hill H.A.O., Bond A.M., Coordination Chem. Reviews 200-202
(2000) 411-442.
[18] Hill H.A.O., Davis J.J., Biochem. Soc. Trans. 27 (1999) 331.
[19] Gilardi G., den Blaauwen T., Canters G. W., J. Controlled Release 29 (1994)
231.
[20] Armstrong F.A., Wilson G.S., Electrochim. Acta 45 (2000) 2623.
[21] Jeuken L.J.C., Biochimica et Biophysica Acta 1604 (2003) 67.
78
[22] Page C.C., Moser C.C., Chen X., Dutton P.L., Nature 402 (1999) 47.
[23] Bard A.J., Stratmann M., Encyclopedia of Electrochemistry volume 9:
Bioelectrochemistry, (Ed.) Wilson G.S., Wiley, Weinheim, 2002.
[24] De Wael K., Elektrochemische studie van een goudelektrodeoppervlak
gemodificeerd door het immobiliseren van transitiemetaalionftalocyanines en
–porfyrines, Scriptie, UGent, 2005.
[25] Bard J., Faulkner L.R., Electrochemical Methods Fundamentals and
Applications, Wiley, New York, 2001.
[26] Kissinger P.T., Heineman W.R., Laboratory Techniques in Electroanalytical
Chemistry, Marcel Dekker, New York, 1994.
[27] Oldham K.B., Myland J.C., Fundamentals of Electrochemical Science,
Academic Press, New York, 1994.
[28] Maloy J.T., J. Chem. Educ. 60 (1983) 285.
[29] Sevcik A., Collect. Czech. Chem. Commun. 13 (1948) 349.
[30] Randles J.E.B., Trans. Faraday Soc. 44 (1948) 327.
[31] Brett C.M.A., Brett A.M.O., Electrochemistry: Principles, Methods and
Applications, Oxford University Press, Oxford, 1993.
[32] Nicholson R.S., Shain I., Anal. Chem. 36 (1964) 706.
[33] Nicholson R.S., Anal. Chem. 37 (1965) 1351
[34] Perone S.P., Anal. Chem. 38 (1966) 1158.
[35] Noel M., Vasu K.I., Cyclic Voltammetry and the Frontiers of Electrochemistry,
Aspect Publications, London, 1990.
[36] Laviron E. J. Electroanal. Chem. 52 (1974) 355.
[37] Laviron E. J. Electroanal. Chem. 52 (1974) 395.
[38] Srinivasan S., Gileadi E., Electrochim. Acta 13 (1968) 721.
[39] Bockris J.O’M., Khan S.U.M., Surface Electrochemistry: A Molecular Level
Approach, Plenum Press, New York, 1993.
[40] Pelletier M.J., Arbor A., Analytical Applications of Raman Spectroscopy,
Blackwell Science, Oxford, 1999.
[41] Southampton Electrochemistry Group, Instrumental Methods in
Electrochemistry, 229, Horwood Publishing Ltd, 2001.
[42] http://www.radiometer-analytical.com (mei 2006)
[43] http://www.bioanalytical.com (mei 2006)
79
[44] Zumdahl S.S., Chemical Principles Second Edition, D.C. Heath and Company,
Lexington, 1995.
[45] Eco Chemie B.V., User Manual for General Purpose Electrochemical System
for Windows, Utrecht, 1996.
[46] Uosaki K., Hill H.A.O., J. Electroanal. Chem. 122 (1981) 321.
[47] Eddowes M.J., Hill H.A.O., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 7113.
[48] Bard A.J., Encyclopedia of Electrochemistry of the Elements Volume IV,
Marcel Dekker, New York, 1975.
[49] Bard A.J., Encyclopedia of Electrochemistry of the Elements Volume VII,
Marcel Dekker, New York, 1976.
[50] Chen P., McCreery R.L., Anal. Chem. 68 (1996) 3958.
[51] Yang Y., Lin Z., J. Elektroanal. Chem. 364 (1994) 23.
[52] Unpublished results, Borloo et al. 2006.
[53] Vitello L.B., Erman J.E., Archives of Biochemistry and Biophysics, 258 (1987)
621.
[54] Erman J.E., Kim, K.L., Vitello L.B., Moench S.J., Satterlee J.D., Biochimica
et Biophysica Acta 911 (1987) 1.