IL Laboratorio di Microbiologia e le infezioni da KPC ... · BATTERI DI GRANDE IMPATTO...
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IL Laboratorio di Microbiologia e le infezioni da KPCScreening ,fenotipizzazione e genotipizzazione
ANNUNZIATA TAMBURRO UOC MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA ASL ROMA 1 OSPEDALE SAN FILIPPO NERI
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La resistenza ai carbapenemi è legata a meccanismi di resistenza combinati :sovraespressione di ß-lattamasi a largo spettro,pompe ad efflusso,impermeabilità e all’espressione di carbapenemasi in grado di idrolizzare i carbapenemi
Non trasferibile, costo di fitness
Bassa capacità
di diffondersi
Produzione di carbapenemasi(KPC, VIM, NDM,
OXA-48)
Perdita di porine+
produzione di ESBL/AmpC
Trasferibile, associazione con cloni ad alto rischioAlta capacità di diffondersi
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Enterobacteriaceae (the family)
BATTERI DI GRANDE IMPATTO EPIDEMIOLOGICO• Tra i Gram negativi, i batteri della
famiglia Enterobacteriaceae costituiscono la quota più frequentemente rilevata dal laboratorio.
• Fanno parte della normale flora gastrointestinale umana, ma sono anche comunemente isolati da pazienti con infezioni del tratto urinario, sia in comunità che in diversi settingassistenziali.
• Nei pazienti ospedalizzati, risultano anche agenti di batteriemie, infezioni delle basse vie respiratorie e infezioni del sito chirurgico (chirurgia addominale).
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Munoz-Price LS, Lancet Infect Dis, 2013
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Test di screening per la rilevazione dei soggetti colonizzati
A)Semina diretta su terreni cromogeniVantaggi •Lettura dopo 18-21 h•Facile riconoscimento delle colonie sospette (verde )•Identificazione presuntiva di specie Limiti•Costi, sensibilità e specificità da valutarsi in relazione al terreno utilizzato chromID CARBA SMART
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Test di screening per la rilevazione
dei soggetti colonizzati
C) Arricchimento in terreno liquido addizzionato di carbapenemico e semina su McConkey
• Semina tampone rettale in 5 ml Tryptic Soy Broth contenente discetto di ertapenem o meropenem da 10 µg/ml
• Incubazione a 35° TA per 18 h
• Sottocoltura su Agar McConkey
• Incubazione 35° TA per 24-48 h
Vantaggi
• Facile riconoscimento delle colonie
• Costi irrisori
Limiti
Tempi operativi molto lunghi
Falsi negativi
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ALGORITMO PER IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA DEGLI ISOLATI SOSPETTI• Le colonie evidenziatesi come “sospette”utilizzando una delle tre metodiche descritte
dovranno essere caratterizzate con:• Identificazione
• Antibiogramma
• Test fenotipici e/o genotipici
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Selezione dei ceppi da testare MIC ≥0.25 μg/ml per meropenem
Conferma fenotipicaTest di sinergia -disco diffusione (I scelta)- Test colorimetrico (II scelta)- Test di Hodge modificato (III scelta)
Refertazione- Produzione dicarbapenemasi definita in base al risultato del test di conferma fenotipica- Nota per il clinico qualora il ceppo testato risulti produttore di carbapenemasi ma sensibile ai carbapenemi in riferimento alla MIC
Algoritmo per l’identificazione fenotipica e la refertazione degli enterobatteri produttori di carbapenemasi
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Identificazione delle carbapenemasi inmicrorganismi isolati da campioni
clinici
Sia CLSI che EUCAST raccomandadi effettuare test fenotipici per la conferma della produzione di carbapenemasi solo per scopi epidemiologici o di controllo delleInfezioni.In molte aree la rilevazione e la caratterizzazione delle carbapenemasiè raccomandata o obbligatoria allo scopo di un controllo delle infezioni
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Qui cominciano i problemi ……• La conferma fenotipica della produzione nelle
Enterobacteriaceae rappresenta uno dei maggiori problemi interpretativi dell’ ATB
• La MIC ai Carbapenemi in CRE è molto variabile e dipende dal tipo di carbapenemasi ,dalla presenza di altri meccanismi di resistenza (ESBL e aMPc),dalla ridotta permeabilità e/o dalla presenza di pompe ad eflusso
• Ad oggi non esiste un unico test fenotipico risolutivo per tutti i casi possibili
• L’utilizzo combinato di più test permette di riconoscere questo meccanismo di resistenza con buona sensibilità e specificità
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Sistema automatici……in laboratorio
• i sistemi automatizzati per la determinazione delle MIC non consentono attualmente di misurare le MIC dei carbapenemi nel range degli ECOFF
•Nella pratica di laboratorio è consigliabile (CoSA)sospettare sottoporre a conferma fenotipica i ceppi di enterobatteri che abbiano una
MIC≥0,25 µg/ml per meropenemdiametro dell’alone di inibizione <25 mm
Quindi……………breakpoint clinicoper lo screening
Comitato di Studio AMCLI per gli Antimicrobici (CoSA)
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Perché il Meropenem ?
• MEROPENEM maggiore specificità rispetto ad altri carbapenemici
• MEROPENEM non saggiato ,può essere considerato indicativo lo stesso valore di MIC per IMIPENEM
( tranne che per Proteus spp, Morganella morganii, Providencia spp: queste hanno MIC molto elevate per imipenem)
• ERTAPENEM aumenta la sensibilità ma riduce la specificità (eccessivo ricorso ai test di conferma)
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Negli enterobatteri KPC-positivi, la MIC per i carbapenemi varia
da 0.25 mg/L a valori superiori a 32 mg/L
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Hodge test modificato(individua carbapenemasi
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Test di inibizione ( distingue le diverse classi
di carbapenemasi A e B)
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TEST DI SINERGIA O “DI COMBINAZIONE” SU DISCHETTO
• Posizionare i dischetti su piastra di Mueller-Hinton agar seminata con il ceppo da testare (sospensione 0.5 McFarland)
q Meropenem 10µgq Meropenem 10µg +acido boronicoq Meropenem 10µg + EDTAq Meropenem 10µg + CloxacillinaVantaggiFacile esecuzioneRilevazione fenotipica delle carbapenmasi di tipo KPC-MBLLimitiNon consente il riconoscimento delle 0XA
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Tabella per l’interpretazione delle carbapenamasi
Meropenem +Phenylboronic
Meropenem +EDTA
Meropenem +Cloxacillina
Temocillina
B-lactamasesMR+BO MR+ED MR+CL TMO
≥ 4 mm < 5mm < 5 mm - KPC< 4mm ≥ 5mm < 5 mm - MBL
≥ 4 mm AND < 5mm ≥ 5mm - Ampc+pori loss or efflux
< 4mm < 5mm < 5mm < 11 Oxa-48-like
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Test di inibizione dell’attivitàcarbapenemasica
• Questo test è basato sull�inibizione in vitro dell�attività delle carbapenemasi dovuta all�aggiunta di un inibitore specifico per classe
Sinergia con acido boronico
(BOR)Indicativa per la produzione
KPCK.pneumoniae KPC+
Sinergia con acido Dipicolinico o EDTA
(DPA) Indicativa per la produzione
MBLK.pneumoniae MBL+
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Meropenem MIC! 0.25 mg/L
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Ac. -%."/0('(."1(
1. EDTA1. Ac.dipicolini
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Distorsione Carbapenemasi non specificata
Diametro ! 5mm KPC
possibile falsa positività dovuta alla presenza di
AmpC
Diametro ! 5mm Metallo
beta-lattamasi
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Hodge testPOSITIVO NEGATIVO
ATCC E.coliColonia KLEB spp
MER
IIDENTIZIONE
Inoculo ATCC E. coli(0.5 MAC ). SEMINARE MH Agar.dischetto di meropenemal centro della piastra.deporre un’ansata dello stipite da testare in prossimità dal dischetto di carbapenemicostrisciare da 10 mcl verso la periferia della piastra sino a raggiungere il bordo della medesima.. Incubare la piastra in aria ambiente a 35 ± 2°C per 18 ore.
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Antibiotico MIC mg/L (S/I/R)
Ampicillina > 16 (R)Amoxi-Clav > 16 (R)Piperacillina > 16 (R)Pip-Tazo > 64 (R)Cefotaxime > 32 (R)Ceftazidime > 32 (R)Cefepime > 32 (R)Imipenem 1 (S)Meropenem 2 (S)Ertapenem > 4 (R)
Antibiotico MIC mg/L(S/I/R)
Ampicillina > 16 (R)Amoxi-Clav > 16 (R)Piperacillina > 16 (R)Pip-Tazo > 64 (R)Cefotaxime > 32 (R)Ceftazidime > 32 (R)Cefepime > 32 (R)Imipenem 1 (S)Meropenem 1 (S)Ertapenem 2 (R)
* Produzione di ESBL associata
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-sospette condizioni epidemiche, permettono di identificare i determinanti di resistenza in gioco:IPM, VIM, GIM, SIM, KHM, AIM, NDM, DIM,KPC e OXA-urgenze
QUANDO ….Utilizzare testdi biologia molecolare
Nota: i geni che codificano per le carbapenemasi sono spesso in associazionecon altri che determinano multiresistenza, quali determinanti di resistenza agliaminoglicosidi, ai fluorochinoloni o che codificano per ESBL
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Simple software for results interpretation
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