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기관고유연구사업 최종보고서

(과제번호 : 0910170 )

유방암에서 항암제 반응과 Jnk1 또는

Stat3 활성도와의 관련성 및 기작 규명

Identification of mechanism for Jnk1 and

Stat3 activation related to drug resistance in breast cancer

과제책임자 : 윤 성 필

국 립 암 센 터

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편집순서 1 : 겉표지 (측면, 뒷면)

(뒷면) (측면)

↑

5cm

↓

과

제

명

국

립

암

센

터

↑

3cm

↓

1. 이 보고서는 국립암센터 기관고유연구

사업 최종보고서입니다.

2. 이 보고서 내용을 인용할 때에는 반드시

국립암센터 연구사업 결과임을 밝혀야

합니다.

(14 pont, 고딕체)

↑

6cm↓

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제 출 문

국립암센터 원장 귀하

이 보고서를 기관고유연구사업 “유방암에서 항암제 반응과 Jnk1 또는 Stat3

활성도와의 관련성 및 기작 규명” 과제의 최종보고서로 제출합니다.

2012. 1 . 31

국 립 암 센 터

과 제 책 임 자 : 윤 성필

연 구 원 : 김 주화

〃 : 김 원기

〃 : 노 정실

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목 차

< 요 약 문 >

(한글) ------- 2

(영문) ------- 4

1. 연구의 최종목표 ------- 6

2. 연구의 내용 및 결과 ------- 6

3. 연구결과 고찰 및 결론 ------- 26

4. 연구성과 및 목표달성도 ------- 26

5. 연구결과의 활용계획 ------- 29

6. 참고문헌 ------- 29

7. 첨부서류 ------- 30

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< 요 약 문 >

연구분야(코드) T-3 과제번호 0910170

과 제 명유방암에서 항암제 반응과 Jnk1 또는 Stat3 활성도와의 관련성 및 기작

규명

연구기간/연구비(천원)

합계 2009년 1월 1일～2011년 12월 31일 273,000

1차년도 2009년 1월 1일～2009년 12월 31일 90,000

2차년도 2010년 1월 1일～2010년 12월 31일 91,500

3차년도 2011년 1월 1일～2011년 12월 31일 91,500

과제책임자성 명 윤 성필 소 속 유방내분비암연구과

전화번호 920-2361 전 자 우 편 yoons@ncc.re.kr

색인단어

국문항암제, Doxorubicin, Stat3, Jnk1, 유방암환자, 세포사멸, 세포성장, 전사인

자, 신호전달 경로, 내성, salinomycin

영문

Doxorubicin, Stat3, Jnk1, breast cancer patients, apoptosis, cellular

proliferation, transcription factors, signaling pathways,

combination-chemotherapy, salinomycin

◆ 연구목표<최종목표>

유방암 세포에서 항암제의 내성과 관련된 새로운 인자의 발굴과 더불어, 기작 발굴을 통하여 내성의

원리에 있어서 새로운 모델을 제시하여 암의 치료에 적용될 수 있는 토대를 제공 함.

<당해년도 목표>

(1) Doxorubicin 치료에서 재발한 환자에게서, 초기 암세포의 Jnk1의 활성과 Stat3의 활성이 어

떠한 지에 대한 탐색

(2) Doxorubicin에 의해 활성화된 Stat3와 Jnk1이 세포성장과 관계된 어떠한 유전자를 활성화

하는가에 대한 연구

(3) Salinomycin에 의한 Doxorubicin의 저항성을 극복하는 기작 연구

(4) Doxorubicin에 내성을 가지는 세포를 sensitize 하는 새로운 물질의 탐색

◆ 연구내용 및 방법

(1) Doxorubicin 치료에서 재발한 환자에게서, 초기 암세포의 Jnk1의 활성과 Stat3의 활성

이 어떠한 지에 대한 탐색

- 조직으로부터 immunohistochemistry 방법을 통해 Jnk1의 활성도와 Stat3의 활성도와의 관련성

을 탐색했지만 negative한 결과를 얻었음.

(2) Doxorubicin에 의해 활성화된 Stat3와 Jnk1이 세포성장과 관계된 어떠한 유전자를 활

성화 하는가에 대한 연구

- Doxorubicin에 의해서 활성화된 Stat3가 세포성장과 관계된 어떠한 target 유전자에 영향을 끼

치는 지를 연구함.

- Doxorubicin에 의해서 활성화된 Jnk1이 세포성장과 관계된 어떠한 downstream target 유전자

에 영향을 끼치는 지를 연구함.

- 이러한 결과는 doxorubicin에 의해 증가된 Jnk1이 Stat3를 어떻게 활성화할 수 있는지에 대한

mechanisms을 규명하는데 도움을 줄 것으로 예상되고 있음.

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(3) Salinomycin에 의한 Doxorubicin의 저항성을 극복하는 기작 연구

- Salinomycin가 doxorubicin의 효과를 sensitize 하는데 있어서, 어떠한 전사인자 (p53, Stat3,

AP1, NF-kB 등)와 signaling pathways의 활성이 관련성이 있는지를 관찰함.

- Salinomycin가 doxorubicin의 효과를 sensitize 하는데 있어서, 세포성장과 관련된 어떠한

signaling pathway와 전사인자, anti-apoptotic proteins, caspases. cell cycle proteins, tumor

suppressors를 조절 하는지를 보기 위하여 Western blot analysis를 통해 중요 단백질의 탐색을

연구함.

(4) Doxorubicin에 내성을 가지는 세포를 sensitize 하는 새로운 물질의 탐색

- 여러 가지 다양한 source (화학연구원 김성환 박사, 강원대 조재열 박사 등)에서 항암 성분을

가지는 물질들을 확보하고 있으며, doxorubicin, paclitaxcel, docetaxcel, 5-FU, etoposide 등과

이 물질의 co-treatment후에 세포 성장이 줄어드는지를 MTS assay를 통해 연구함.

- Co-treatment 후에 combination effect를 가지는 물질을 발견 할 시에 위와 같이 열거한 방법

으로 sensitize 하는 기작을 탐색함 (Combination index를 고려하여 분석함).

(5) 찾아낸 항암제를 sensitization 할 수 있는 약물의 임상적응용을 위해 유방암센터의 노정

실 선생님과 상의함.

(6) Doxorubicin외에 etoposide, paclitaxcel, docetaxcel을 sensitize 하는 새로운 물질의

탐색도 병행함.

◆ 연구성과

-정량적 성과

구분 달성치/목표치1)

달성도(%)

SCI 논문 편수 4/6 67

IF 합 14/22 64

기타 성과:

-정성적 성과: 이 결과는 유방암 환자에게서 doxorubicin에 대한 예후를 예측하게 하는 분자적 표지

marker로서 Jnk1과 Stat3의 활성도를 평가 하게 할 것임. 또한 Salinomycin의 항암제

combination-therapy로 사용에 대한 기초를 마련할 것임.

◆ 참여연구원

(최종연도 참여인원)성 명

윤성필, 김주화, 김원기, 노정실

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Project Summary-1

Title of ProjectIdentification of mechanism for Jnk1 and

Stat3 activation related to drug resistance in breast cancer

Key Words Doxorubicin, Stat3, Jnk1, combination-chemotherapy, salinomycin

Project Leader Sungpil Yoon

Associated Company National Cancer Center

Background and purpose: Both doxorubicin (DOX) and etoposide (ETO) are widely used for the

treatment of numerous types of cancers. They cause DNA damage through the inhibition of

topoisomerases, which cause apoptosis. Since patients develop resistance to these drugs, research

concerning DOX- and ETO-associated increased apoptosis has been aimed at providing better treatment

of patients.

Key results 1: We sought to identify altered transcription factors (Stat, AP1, and NF-kB) or signal

proteins (Erk1/2, p38, Akt, Jnk, Jak, and c-Src) in cancer cell lines whose growth was arrested by

doxorubicin (DOX) treatment. Jnk1 was the only signal protein to be activated. DOX increased Stat3

phosphorylation, nuclear localization, and transcriptional activity. Jnk1 activation appeared to be required

for Stat3 activity. Stat3 activity via the Jnk pathway was conserved in other cell lines originating from

other organs. Transcriptional activity of Stat3 was increased in cells surviving DOX treatment suggesting

that Stat3 activation contributed to the resistance to cytotoxicity. To better understand the role of Stat3

in Jnk1 activation, we investigated its effect on the viability of DOX-treated cells. Co-treatment with

DOX and Jnk inhibitor negatively correlated with viability of cancer cells and reduced Stat3 activity.

Taken together, these results indicate that Stat3 activation via the Jnk pathway promotes the resistance

of cancer cells to DOX.

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Project Summary-2

Title of ProjectIdentification of mechanism for Jnk1 and

Stat3 activation related to drug resistance in breast cancer

Key Words Doxorubicin, Stat3, Jnk1, combination-chemotherapy, salinomycin

Project Leader Sungpil Yoon

Associated Company National Cancer Center

Key results 2: We demonstrated that Sal increased DNA breakage and phosphorylated levels of p53 and

H2AX. We also observed that Sal could form DNA foci with pH2AX and 53BP1. This is the first

study to report that Sal increases DNA damage. Further, we demonstrated the association of Sal with

increased sensitivity of cancer cells to doxorubicin DOX or ETO. We found that pH2AX, pBRCA1,

p53BP1, and pChk1 levels greatly increased with co-treatment of Sal with DOX or ETO, suggesting that

increased DNA damage plays an important role in apoptosis increases caused by sensitization of Sal.

The level of anti-apoptotic p21 protein increased with either DOX or ETO treatment and decreased with

proteasome activity increases caused by Sal treatment, suggesting that down-regulation of p21 levels

might be pivotal in Sal-induced sensitization.

Key results 3: Sal sensitized radiation-treated cancer cells by inducing G2 arrest and causing DNA

damage. Sal treatment also reduced p21 levels in radiation-treated cells. Considering that Sal sensitizes

doxorubicin (DOX)- or etoposide (ETO)-treated cancer cells by causing DNA damage and reducing p21

expression, the results from our study suggest that the mechanism underlying Sal sensitization is

conserved in both chemo- and radiation-treated cells.

We also tested the ability of Sal to inhibit p-glycoprotein (P-gp), which plays a role in the efflux of

anti-cancer drugs to reduce cellular damage. In particular, we compared Sal to verapamil (Ver), a

well-known P-gp inhibitor. Sal inhibits P-gp with a different substrate distinct from that of Ver. In

addition, Sal sensitized Ver-resistant cells, indicating that this compound is more effective for sensitizing

than Ver. Taken together, the results from our study may contribute to the development of Sal-based

therapy for cancer patients treated with P-gp-inhibiting drugs or radiation therapy.

Conclusions and implications: Overall, we demonstrated that Sal correlates with DNA damage and p21

levels, increasing apoptosis of DOX- or ETO-treated cancer cells. These results may contribute to the

development of Sal-based chemotherapy for cancer patients receiving DOX or ETO treatment.

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1. 연구의 최종목표

(1) 최종목표 : 유방암 세포에서 항암제의 내성과 관련된 새로운 인자의 발굴과 더불어, 기작 발굴을 통

하여 내성의 원리에 있어서 새로운 모델을 제시하여 암의 치료에 적용될 수 있는 토대를 제공 함.

(2) 세부 목표

- Doxorubicin 치료에서 재발한 환자의 초기 암세포에서 Jnk1과 Stat3의 활성이 어떠한 지에 대한 연구

- Doxorubicin에 의해 활성화된 Jnk1 또는 Stat3가 doxorubicin에 의한 저항성을 가지게 하는 기작에

대한 연구

- Doxorubicin에 의해 활성화된 Stat3와 Jnk1이 세포성장과 관계된 어떠한 유전자와 signaling

pathways를 활성화 하는가에 대한 연구

- Salinomycin에 의한 Doxorubicin의 저항성을 극복하는 기작 연구

- Doxorubicin에 내성을 가지는 세포를 sensitize 하는 새로운 물질의 탐색

2. 연구의 내용 및 결과

(1) Doxorubicin 치료에서 재발한 환자의 초기 암세포에서 Jnk1과 Stat3의 활성이 어떠한 지

에 대한 연구

- 유방암 환자에서의 Jnk1과 Stat3의 활성도를 immunohistochemistry로 관찰한 결과 negative 한 결과

를 얻었음 (preliminary data is not shown). Samples의 숫자가 적었거나 암의 stages에 따라 다를 수

있을 것 같음. Samples의 수를 늘려서 실험 또는 다른 항암 조직에서의 관련성의 증명이 필요함.

(2) Doxorubicin에 의해 세포성장이 줄어들지 않는 세포주는 Jnk inhibitor인 SP600125에 의해 효

과적으로 apoptosis를 유도할 수 있음 (BBRC, 2009)

- Doxorubicin에 의해 비교적 세포성장이 줄어들지 않는 세포주를 찾은 후, 이 세포주의 공통된

특징을 찾으려고 노력 함. 이것은 항암제 내성에 대한 큰 기여를 할 것임.

- 세포의 성장은 세포내에 존재하는 주요한 signaling pathways와 깊은 관계를 가짐. 예를 들어

Akt, Erk, Jak, Jnk, p38, Src 등이 있을 수 있음. 이들에 비교적 specific한 inhibitors가 알려져 왔

음.

- Doxorubicin에 의해 세포성장이 줄어들지 않는 세포주에서 signaling pathways와 관련된 어떠

한 kinase inhibitors가 효과적으로 세포성장을 줄일 수 있는가를 관찰함. 그림 1에서 보는 바와

같이 내성 세포주가 Jnk pathway의 inhibitor (SP600125)와 Akt의 inhibitor (LY294002)에 의해서

성장이 줄어 듬을 관찰할 수 있었음.

- Doxorubicin에 의해서 세포성장이 줄어드는 세포주는, SP600125에 의해서는 비교적 성장에 영

향을 끼치지는 않지만 LY는 크게 성장에 영향을 끼침을 볼 수 있었음 (그림 1). 두 inhibitors 중

에서 내성 세포에게 SP600125가 더 효과적인 것을 제시함.

- 위의 결과는 doxorubicin에 내성인 세포주에게 Jnk inhibitor인 SP600125가 효과적일 것이라는

간접적인 가설을 세우게 함. 하지만 doxorubicin과 SP600125를 동시에 사용할 시에 유방암 세포

주를 apoptosis 하는데 더욱 효과적이지는 않았음 (data not shown).

- 또한 유방암 세포주에서 doxorubicin에 의해 성장이 저해되지 않는 세포주를 SP600125 (SP)

또는 Jnk siRNA에 의해서 세포 성장이 줄어 드는 것을 48 또는 72시간 후에 MTS assay로 관찰

함.

- 위의 결과를 토대로 doxorubicin에 내성인 세포주에서 Jnk1의 활성이 어떠한지에 대하여 관찰

- 7 -

0

35

70

105

140

MCF71 MDA-MB2311 SK-BR3 ZR75-1 T47D

Kin

ase

inhi

bito

rs:

Cel

l via

bilit

y (%

)

A

B

0

35

70

105

140

Hs578T MCF72 MCF7-R MDA-MB2312

Kin

ase

inhi

bito

rs:

Cel

l via

bilit

y (%

)

Co

SP Ly U0

PD SB AG

Co

SP Ly U0

PD SB AG

Co

SP Ly U0

PD SB AG

Co

SP Ly U0

PD SB AG

Co

SP Ly U

0PD SB A

G

Co

SP Ly U

0PD SB A

G

Co

SP Ly U

0PD SB A

G

Co

SP Ly U

0PD SB A

G

Co

SP Ly U

0PD SB A

G

하였음. 하지만 Jnk1의 높은 활성도와 SP60015에 의한 세포 성장이 줄어드는 것에 대한 큰 관련

성을 찾지는 못했음 (data not shown).

- 이러한 SP600125의 doxorubicin의 저항 세포주에서 어떠한 기작이 작용하는지를 보기위하여 FACS

analysis를 실행함. 또한 doxorubicin에 의해 성장이 저해되지 유방암 세포주는 SP600125을 처리

했을 시에 G2 arrest가 크게 증가 되는 것을 볼 수 있었음. 따라서 SP600125는 doxorubicin의 저

항 세포에 G2를 arrest 함으로써 성장을 저해함을 알 수 있었음.

- 또한 위암 또는 간암 세포주에서 doxorubicin에 의해 성장이 저해되지 않는 세포주를 탐색한

결과 간암 세포주에서 doxorubicin에 의해 성장이 저해되지 않는 세포주 (MKN28)을 찾았음. 이

세포주에서 SP600125을 처리 했을 시에 성장이 저해 되는 지를 관찰 했을 시에 유방암 세포주에

서 보였듯이, 성장이 저해되고 또한 G2가 arrest되는 것을 관찰 함. 이것은 SP600125의 효과가 유

방암 세포주 뿐만 아니라 다른 세포주에서도 conserved 된 것을 의미함.

- Nude mouse에 doxorubicin 내성 세포주 또는 sensitive 세포주인 MDA-MB2311을 graft하여

주입한 후에, doxorubicin 또는 SP600125를 처리한 후에 mouse에서 tumor size의 변화를 control

과 비교하였음. 그림 2에서 보는 봐와 같이 doxorubicin에 비교적 저항을 가지는 세포주는

SP600125에 의해서 성장이 크게 줄어드는 것을 볼 수 있었음.

- 이상의 결과는 SP600125가 doxorubicin의 저항을 가지는 암세포에 효과적으로 사용할 수 있음을 제

시함.

그림 1. 유방암 세포주에서 doxorubicin에 의해 성장이 저해되는 세포주 (B)와 성장이 저해되지

않는 세포주 (A)에 세포성장에 관련된 Kinases의 inhibitors인 SP600125 (SP), LY294002(LY),

U0126(U0), PD98059(PD), SB203580(SB), AG490(AG)를 처리 한 후 20시간 후에 MTS assay로

세포성장의 차이를 관찰함. Con은 doxorubicin을 처리 하지 않은 control 샘플임.

- 8 -

CON DOX SP600125

Tumo

r weig

ht (g

rams

)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

*

**

CON DOX SP6001250.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

**

Time (Days)

1 3 5 7 9 11 14 17 21

Tumor volum

e (mm

3 )

0

500

1000

1500

2000

2500

ControlDOXSP600125

*

**

**

***

A

Time (Days)

1 3 5 7 9 11 14 17 21

Tumor volum

e (mm

3 )

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

ControlDOXSP600125

* * * * * *

BMCF72 MDA-MB2311

DCMCF72 MDA-MB2311

Tumo

r weig

ht (g

rams

)

그림 2. Nude mouse에 doxorubicin 내성 세포주 또는 sensitive 세포주인 MDA-MB2311을 graft

하여 주입한 후에, doxorubicin 또는 SP600125를 처리한 후에 mouse에서 tumor size의 변화를

control과 비교하였음.

(3) Doxorubicin에 의해 활성화된 Jnk1에 의해서 활성화된 Stat3는 암세포의 doxorubicin에 대한

내성과 positive하게 관계함 (Biochem Pharm, 2010)

- 유방암 세포주 (MDA-MB231)에서 doxorubicin을 20시간 처리한 후 세포 성장의 차이를 MTS

assay 방법으로 측정함. 측정 결과 MDA-MB231이 doxorubicin에 의해 세포의 수가 늘어나지 않

고 성장이 줄어 듬을 관찰함. 또한 세포성장과 관련된 Cyclin D1의 level이 줄어드는 것을 관찰

함.

- MDA-MB231의 세포성장이 줄어들 때 세포성장과 관련된 어떠한 signaling pathways (Jnk,

Erk, Jak, Akt, c-Src, IKKa/b 등)의 활성이 늘어나고 줄어들었는지를 관찰함.

- 이러한 결과는 doxorubicin에 의한 세포성장과 관계된 중요한 signaling pathway를 탐색할 수

있는 기회를 제공할 것임.

- Signaling pathways에 관계된 대표적인 kinase 단백질의 levels이 doxorubicin에 의해 변화가

없음을 관찰 할 수 있었음. 이들의 활성형태인 phosphorylated-form의 변화를 볼 때 Jnk1의 경

우 크게 늘어나는 것을 제외하고는, 대부분의 활성화된 단백질이 detection 되지 않거나 줄어드는

것을 볼 수 있었음.

- 또한 Jnk1의 활성도를 immunocytochemistry로 분석 했을 시에 핵 내에서 Jnk1의 활성을 관찰

할 수 있었음. 유방암 세포주 뿐만 아니라 간암 세포주에서도 같은 결과를 가져옴. 또한 유방암

세포주인 MDA-MB231와 간암 세포주인 HepG2에서 doxorubicin 또는 etoposide를 20시간 처리

한 후, merged image에서 볼 때, control에 비해 doxorubicin이나 etoposide를 처리한 세포주의

경우 DAPI와 Jnk1 staining의 중간 색깔을 볼 수 있었음. 또한 Tubulin staining에 의해서 세포가

circular formation을 하는 것을 볼 수 있음. 이것은 세포가 apoptosis를 거치고 있는 것을 의미

- 9 -

함.

- MDA-MB231의 세포성장이 줄어들 때 어떠한 전사인자의 활성이 늘어나고 줄어들었는지를

관찰함. 이러한 결과는 doxorubicin에 의한 세포성장과 관계된 중요한 전사인자를 탐색할 수 있는

기회를 제공할 것임. 또한 Jnk1 활성과 관계된 전사인자를 밝히는데 도움이 될 것임.

- 항암제와 관련된 중요한 전사인자 family는 크게 세 가지로 나눌 수가 있음. 이들은 Stat,

AP1, NF-kB family임. 이들 전사인자가 doxorubicin에 의해 단백질의 양 또는 활성도에서의 변

화가 있는지를 관찰했음.

- 먼저 Stat family의 경우에는 Stat2와 Stat5의 단백질 level이 줄어들고, Stat1과 Stat4의 활성도

가 doxorubicin에 의해 줄어 듬을 알 수 있었음.

- AP1 family의 members인 c-Jun, c-Fos, ATF2, JunD의 활성도 또는 단백질 levels이 줄어듬

을 볼 수 있었음. 하지만 NF-kB의 주요 member인 p65의 경우는 변화가 없음을 관찰함.

- 활성화된 Stat3의 형태인 phospho-tyrosine-Stat3는 암 세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려졌

음. 하지만 놀랍게도 doxorubicin의 20시간 처리 시에, Stat3의 활성이 늘어나는 것을 관찰 함.

- 활성화된 Stat3는 핵 내로 가서 target 유전자의 전사를 조절한다고 알려졌음. Doxorubicin에

의해 활성화된 Stat3가 핵 내로 들어가는 것을 관찰함. 이것은 doxorubicin에 의해 활성화된

Stat3가 핵 내에서 active한 전사인자로 활동할 수 있음을 나타냄.

- 이상의 결과에서 doxorubicin에 의해 세포성장이 줄어드는 MDA-MB231에서 Stat3의 활성도가

커지는 것을 볼 수 있었음.

- 그림 3에서 보는 바와 같이 Stat3의 activation은 시간에 따라 증가 하는 것을 볼 수 있음. 직접

적으로 Stat3의 transcriptional activity를 관찰하기 위하여, Stat3가 binding을 할 수 있는 sites를

가지는 luciferase plasmid (pZLuc-TK)를 transfection 한 후 doxorubicin을 처리 하였을 시에

Stat3의 활성도를 관찰 함.

- 또한 그림 3에서 보는 봐와 같이 doxorubicin의 농도를 증가 시키거나, 시간이 지날수록 Stat3

의 transcriptional activity는 증가가 되는 것을 볼 수 있음. 또한 이러한 activity는 Jnk pathway

에 의존 한다는 것을 SP600125와 같이 처리 할 시에 줄어드는 것으로 알 수 있음. 하지만

doxorubicin과비교적 비슷한 기능을 하는 etoposide를 처리 할 시에는 transcriptional activity가

없는 것을 볼 수 있음.

-위의 결과는 살아남는 세포가 계속해서 Stat3의 activity를 증가 시킨다는 것을 알 수 있음. 따라

서 Stat3의 활성이 doxorubicin에 의한 내성과도 관계가 있다는 가설을 세울 수 있음.

- Doxorubicin에 의해서 활성화된 Jnk1과 Stat3의 활성이 세포성장에 미치는 영향을 알기 위하여

Jnk pathway의 inhibitor인 SP600125를 doxorubicin과 같이 처리 할 시에 세포 성장이 어떠한 지

를 MTS assay로 관찰하였음.

- MTS assay로 볼 수 있는 것은 단지 세포 성장임으로, doxorubicin과 SP600125를 같이 처리

할 시에 apoptosis나 cell cycles에 있어서 어떠한 영향을 끼치는가를 관찰함. 그림 4에서 보는 봐

와 같이 24시간에서는 큰 차이를 보이지 않지만 48시간에는 doxorubicin 단독 처리 했을 시보다

SP600125와 동시에 처리할 시에 G0 phase 가 40% 이상 증가 되는 것을 관찰할 수 있었음. 따라

서 doxorubicin에 의해 활성화되는 Jnk1과 Stat3를 SP600125에 의해 줄인다면 세포를 보다 효과

적으로 apoptosis로 이끌 수 있다는 결론을 얻을 수 있었음.

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pY-Stat3

pJnk1

Doxorubicin (mM)

0 1.8 3.5 5.2 7 8.8

A

Paclitaxcel (mM)

0 0.4 0.8 1.6 2.4 3.2

pY-Stat3

b-Actin

Jnk1b-Actin

Stat3

pY-Stat3

20 hour6 hour

pJnk1Jnk1

SP Co Do Do+SP

Co Do Do+SP Co Do Do+SP

B

b-Actin R

elat

ive

luci

fera

se a

ctiv

ity

6 12 hr

0

6

12

18

24

30

36

42

Doxo: 0 3 15 3 9 15 (mM)

F

0

1

2

3

4

Co Do Do+SP Et

pZLuc-TK

Rel

ativ

e lu

cife

rase

act

ivit

y

D

E

0

3

6

9

12

15

12 24 36 hrCo Do Co Do Co Do

C

Rel

ativ

e lu

cife

rase

act

ivit

y

*

*

*

*

*

**

그림 3. MDA-MB231 세포주에 doxorubicin (D), SP600125 (SP), 또는 Doxo 처리전에 Jnk

inhibitor인 SP를 6시간 또는 20시간 처리 한에 phospho-tyrosine-Stat3, phospho-Jnk1, Jnk1, 그

리고 actin에 대한 Western blot analysis. C은 doxorubicin을 처리 하지 않은 control 샘플임. 유

방암 세포주인 MDA-MB231에 Stat3가 binding을 할 수 있는 sites를 가지는 luciferase plasmid

(pZLuc-TK)를 transfection 한 후 doxorubicin (D, Doxo), Etoposide (Et) 또는 Doxo 처리전에

Jnk inhibitor인 SP600125(SP)를 지적된 시간에 따라 처리 한 후 Luciferase activity를 관찰함.

"C"는 doxorubicin을 처리 하지 않은 control 샘플임.

- 위와 같은 SP600125를 동시에 처리 할 시에 얻는 효과를 다른 장기로부터 유래된 암세포에서

도 보이는 지를 관찰하기 위하여 간암 세포주인 HepG2를 사용하여 doxorubicin과 SP600125를 동

시에 처리 했을 때의 효과를 관찰하였음 (그림 4).

- 앞에서 SP600125의 doxorubicin과의 co-treatment에서 보았듯이, doxorubicin의 효과를 증대 시

키는 물질을 찾는 것은 환자에게서 combination-chemotherapy의 기회를 넓히는 기회를 제공할

것으로 보여짐. 따라서 이러한 목적으로 여러 가지 drugs을 screening 한 결과 Salinomycin이

doxorubicin과 combination에 있어서 효과를 보이는 preliminary data를 가지고 이후 salinomycin

에 대한 많은 연구를 2, 3년차에 진행함.

- 11 -

Resistance to doxorubicin

Doxorubicin

p-Jnk1 activation

Cancer Cells

p-Stat3activation

B

Control Doxorubicin SP600125 Doxo+SP

C

A

Cell

num

ber

DNA content

G1 : 47.7%S : 27.9 %G2 : 28.5%<G1 : -0.1%

G1 : 15.5 %S : 27.6 %G2 : 30.8 %<G1 : 6.38%

G1 : 20.4 %S : 28.8 %G2 : 19.2%<G1 : 28.5%

G1 : 44.5 %S : 25.2 %G2 : 18.3%<G1 : -2.1%

G1 : 35.8 %S : 27.4 %G2 : 25.2 %<G1 : 1.3%

G1 : 50.5 %S : 17.1 %G2 : 22.7%<G1 : -0.6%

G1 : 38.9 %S : 40.4 %G2 : 25.6 %<G1 : 3.5%

G1 : 16.9 %S : 22.3 %G2 : 18.4 %<G1 : 42.5 %

G1 : 38.9 %S : 28.6 %G2 : 9.4 % <G1 : 2.1%

G1 : 39 %S : 38.1 %G2 : 17.5%<G1 : -0.5%

G1 : 30.3 %S : 24.4 %G2 : 18.9%<G1 : 0.3%

G1 : 21.7 %S : 40.2 %G2 : 21.6 %<G1 : 5.4 %

그림 4. 유방암 세포주인 MDA-MB231 (A-B) 또는 간암 세포주인 HepG2 (C)에 doxorubicin

(Do), SP600125 (SP) 또는 Doxo 처리 전에 Jnk inhibitor인 SP600125(Do+SP)를 24시간 또는 48

시간 처리 한 후 FACS analysis로 cell cycle의 분포도와 apoptosis를 관찰 함.

그림 5. 이 결과를 바탕으로 세워진 Proposed model (Biochem Pharm, 2010)

- 12 -

(4) Salinomycin은 doxorubicin 또는 etoposide가 처리된 암세포를 민감하게 하고, DNA damage를 증가

시키며 p21 protein를 줄임 (Br J Pharmacol, 2011).-부연적으로 DNA damages를 증가 시킬 수 있는

agents의 선별시에 salinomycin을 발견 할 수 있었음.

- 유방암 세포주에 salinomycin을 처리하였을 때 DNA breakages가 증가되는 것을 Comet assay (그림

6A and 6B)를 통해 관찰함. 또한 DNA breakages가 salinomycin의 농도에 의존하여 더욱더 증가되는

것을 볼 수 있음. 또한 salinomycin이 DNA damage response proteins의 level을 증가시켰으며 (그림

6C) immunocytochemistry assay (그림 6D)를 통해 DNA foci 형성도 함께 증가시키는 것을 관찰함.

그림 6. 유방암 세포주에서 salinomycin에 의해 DNA breakage와 damage가 증가되는 것을 comet assay (A and B),

western-blot (C), and immunocytochemistry assay (D)를 통해 확인함.

- 또한 그림 7에서 보는 바와 같이 salinomycin의 유방암 세포주에 대한 sensitivity를 확인하기 위해

MTS assay를 가지고 세포 성장을 측정하였을 때, 세포 성장은 salinomycin의 농도에 의존하여 저해됨

(그림 7A). 또한 western-blot을 수행하여 salinomycin이 cell cycle 조절 단백질 중 cyclin D1을 줄임으

로써 세포의 성장을 저해하는 것을 알 수 있음 (그림 7B).

- Doxorubicin과 salinomycin의 co-treatment의 의한 유방암 세포주의 세포 성장을 MTS assay를 통해

측정한 결과, 세포 성장을 더욱 저해시키는 것을 알 수 있음 (그림 7A). 또한 salinomycin 단독처리 또

는 salinomycin과 doxorubicin과의 co-treatment 하였을 때 confluence-independent하게 세포성장을 저

해하였고 (그림 7C), 이 결과를 통해 salinomycin은 confluence-dependent resistance를 극복할 수 있음

을 알 수 있음. 이러한 salinomycin이 세포 성장을 저해하는 것을 네 가지 다른 세포주에서 MTS

assay를 통해 측정한 결과, doxorubicin과 co-treatment 하였을 때 cell line-dependent하게 세포성장을

- 13 -

저해하는 것이 관찰됨 (그림7D).

그림 7. (A) 유방암 세포주에서 salinomycin을 농도별로 48시간 동안 처리 후에 MTS assay를 통해 세포 성장 저해를 측정하였

고 (왼쪽), 또한 doxorubicin과의 salinomycin을 함께 처리한 후에 같은 방법으로 세포 성장 저해를 측정함 (오른쪽). (B) Hs578T

와 MDA-MB231 두 가지 유방암 세포주에서 cell cycle 조절에 관계된 단백질들을 western-blot analysis를 수행함. (C and D)

MTS assay.

- 또한 doxorubicin과 salinomycin의 co-treatment는 apoptotic pre-G1 phase를 증가시켰고, 더욱이

salinomycin 농도가 높을수록 apoptotic pre-G1 phase를 더욱 증가시키는 것을 확인함(그림 8A). 또한

유방암 세포주에 salinomycin과 doxorubicin의 co-treatment에 의해서 cellular separation 또는

detachment가 더욱 증가되는 것을 현미경을 통해 관찰함 (그림 9A). 이를 통해 salinomycin이

doxorubicin과 combination을 하였을 때 apoptosis를 더욱 증가시킴을 제시함.

- 또한 DNA breakage를 일으키는 doxorubicin과 유사한 항암제인 etoposide의 작용을 doxorubicin의

작용과 비교함. 다섯 가지의 다른 암세포주에서 etoposide와 salinomycin의 co-treatment를 MTS assay

를 가지고 실험한 결과 etoposide와의 co-treatment에서도 salinomycin은 cell line-dependent하게 암세

포의 세포성장을 저해함을 볼 수 있음 (그림 8B).

- 그림 3C에서 보는 바와 같이 유방암 세포주에서 Annexin V staining법을 사용하여 etoposide와

salinomycin을 co-treatement 하였을 때 더욱 apoptosis을 증가시키는 것을 확인함. 또한 etoposide와

salinomycin의 co-treatment에 의해서 pH2AX foci가 증가되는 것을 ICC assay로 확인함 (그림 9B). 따

라서 salinomycin은 etoposide와의 combination에 의해서도 암세포를 sensitization 할 수 있고, DNA

damage를 일으켜서 cytotoxic effect를 더욱 증가시키는 것을 제시함.

- 14 -

그림 8. (A) 유방암 세포주에서 doxorubicin과 salinomycin을 단독 또는 combination으로 48시간 동안 처리한 후에 FACS

analysis를 수행함. (B) 다섯 가지의 다른 암세포주에 etoposide와 salinomycin을 단독 또는 combination으로 48시간 동안 처리한

후에 MTS assay을 가지고 세포성장 저해를 측정함. (C) 유방암세포주에 etoposide와 salinomycin을 단독 또는 combination으로

48시간 동안 처리한 후에 Annexin V analysis를 수행함.

그림 9. (A) 유방암 세포주에 doxorubicin과 salinomycin을 24시간 처리 한 후 cellular growth와 detachment를 현미경을 통해

관찰함. (B) 동일한 세포주에서 etoposide와 salinomycin을 3시간 처리한 후에 pH2AX의 foci 형성을 ICC assay를 수행하여

confocal image를 찍었음.

- 15 -

- Drug-resistant 세포주인 MES-SA/Dx5 에서도 salinomycin과 doxorubicin 또는 etoposide를 함께 처

리하였을 때 세포성장을 더욱 저해하였으며 (그림 7D and 7B), 또한 pre-G1 region이 크게 증가되는

것을 관찰함 (그림 10A). 즉, apoptosis가 단독처리들에 비해 combination으로 처리되었을 때 더욱 증가

되는 것을 알 수 있으며, 이것은 cleaved-PARP 단백질의 증가를 통해서도 확인되었음 (그림 10B). 또

한 salinomycin과 etoposide를 co-treatment 하였을 때 early (그림 10C, Annexin V staining) 그리고

late (그림 10D, TUNEL staining) apoptotic event가 더욱 증가되는 것을 관찰함. 이 결과를 통해

drug-resistant cell인 MES-SA/Dx5 세포주가 drug-sensitive Hs578T 세포주보다 apoptotic event를 나

타내는 pre-G1 region에 더욱 영향을 받음을 알 수 있음.

그림 10. Drug-resistant 자궁암 MES-SA/Dx5 세포주에 salinomycin과 doxorubicin 또는 etoposide를 단독처리 그리고

co-treatment를 48시간동안 한 후에 FACS analysis (A), Annexin V staining (C), 그리고 TUNEL staining (D)을 수행하여

apoptosis를 관찰함. 또한 동일한 세포주에 salinomycin과 doxorubicin 또는 etoposide를 단독처리 그리고 co-treatment를 6시간동

안 한 후 western-blot을 수행하여 C-PARP 단백질 발현을 관찰함.

- Salinomycin, doxorubicin, etoposide는 DNA damage를 일으키는 것을 여러 실험을 통해 확인하였으

므로 salinomycin과 doxorubicin 또는 etoposide를 co-treatment하였을 때 DNA damage-related

proteins (pH2AX, p53BP1, pBRCA1, 그리고 pChk1)을 증가시키는지를 관찰하기 위해 western-blot를

수행함 (그림 11). 이 단백질들의 활성화가 증가되면 DNA breakage와 damage가 더욱 증가된 것을 나

타내며, 또한 double strand break (DSB) repair에 관계되는 DNA-PK inhibitor인 NU7026을 etoposide

와 함께 처리하였을 때 DSB가 증가된다는 보고가 있음. 따라서 유방암 세포주에서 NU7026과

doxorubicin 또는 etoposide를 함께 3시간을 처리하였을 때 pH2AX, p53BP1, pBRCA1, 그리고 pChk1

단백질이 증가됨을 관찰함. 또한 salinomycin과 co-treatment를 하였을 때 6시간째에서 이들 단백질들

- 16 -

의 발현이 증가되는 것을 관찰함. 이것은 NU7026과 salinomycin은 다른 기작을 가지고 DNA damage

를 증가시킨다는 것을 제시함. 또한 그림 6에서 보는 바와 같이 salinomycin은 doxorubicin과의

combination이 etoposide와의 combination 보다 DNA damage-related proteins을 더 빠른 시간에 증가

시키는 것을 알수 있음. 이러한 결과는 doxorubicin과 etoposide가 DNA breaking agents로써 유사하게

작용하지만, salinomycin과 doxorubicin과의 combination therapy가 etoposide와의 combination 보다 더

욱 효과적임을 알 수 있음. 또한 이상의 결과들을 통해 salinomycin이 doxorubicin 또는 etoposide와 함

께 암세포주에 처리될 때 general하게 DNA breakages와 DNA damage-related proteins을 증가시키는

기작을 갖는 것을 제시함.

그림 11. 유방암 세포주에 NU7026, salinomycin, doxorubicin, 그리고 etoposide를 단독 또는 combination으로 3시간 또는 6시간

동안 처리한 후에 western-blot을 수행함.

- 최근의 보고 된 연구에서 salinomycin이 efflux pump p-glycoprotein inhibitor로써 작용한다고 제시

됨. 이것은 salinomycin에 의해 p-glycoprotein을 inhibition함으로써 세포내에서의 doxorubicin과

etoposide의 지속시간을 증가시켜 apoptosis를 증가시키며 (그림 12), radiation이 처리된 암세포주의

DNA damage를 증가시킴 (Investigational New Drugs, 2012, in press). 따라서 salinomycin은 직접적

으로 DNA damage를 일으킴으로써 암세포주를 sensitization함을 제시함.

그림 12 유방암 세포주 Hs578T에 48시간 동안 salinomycin, p-glycoprotein inhibitors (verapamil와 C-4)를 처리한 후 MTS

assay를 수행하여 세포성장의 변화를 관찰함.

- 17 -

- 다음으로 salinomycin과 doxorubicin 또는 etoposide와 combination에 의해 세포성장을 줄이는 것이

anti-apoptotic proteins, cell cycle proteins, 또는 tumor suppressors 중에 어떤 기작에 의해 조절하는

지를 확인하기 위해 유방암 세포주를 가지고 wetern-blot 실험을 수행함 (그림 13). 그림 13A에서 보는

바와 같이 salinomycin은 20시간처리에서 Cyclin D1, p16, p21, 그리고 p27 단백질의 level을 줄이는 것

을 알 수 있고, 이것은 cell cycle regulators가 salinomycin이 유방암 세포주의 세포성장을 저해하는 표

적임을 알 수 있으며, 또한 salimycin과 doxorubicin 또는 etoposide와의 co-treatment에 의해서도 cell

cycle regulators인 Cyclin D1, p16, p21, p27 그리고 p53 단백질의 level을 줄임으로써 세포성장을 저

해하는 조절을 하는 것을 확인할 수 있음 (그림 13A and 13B).

- 또한 이들 Cell cycle regulators 중에서 특히 tumor suppressor 단백질로써 anti-apoptotic 기능을 하

며, DNA damaging agents로부터 암세포를 살아남게 하는 p21이 doxorubicin과 etoposide가 처리되었

을 때 증가되었으며, doxorubicin과 etoposide에 의해 증가된 p21을 salinomycin과 co-treatment하였을

때 줄어드는 것을 세 가지 세포주(Hs578T (그림 13A), MDA-MB231 (그림 13B), and MES-SA/Dx5

(그림 13C)에서 관찰함. 또한 이러한 조절이 early time에서도 나타나는지를 3시간과 6시간동안 처리

후에 관찰함 (그림 14A and 14B). Early time 처리에서도 salimycin에 의해 p21의 level이 조절되는 것

이 세 가지 세포주에서 관찰됨. 따라서 이 결과를 통해 salinomycin에 의해 유방암 세포주에 민감하게

작용하는 것은 p21 단백질의 level을 줄임으로써 조절됨을 제시함.

- p21 단백질의 degradation과 stability의 조절은 ubiquitination related pathway와 관계됨. 따라서 그

림 9에서 보는 바와 같이 salinomycin이 etoposide와 co-treatment하였을 때 p21을 줄이는 기작은,

proteasome inhibitors (epoxomycin 또는 MG132)와 함께 처리하였을 때 salinomycin에 의해 감소되었

던 p21의 level이 복구됨을 관찰함 (그림 14C). 따라서 salinomycin은 proteasome activity를 증가시킴으

로써 p21 level을 조절함을 알 수 있음.

- 이상의 결과를 통해 salinomycin은 doxorubicin 또는 etoposide가 처리된 암세포에서 DNA damage를

증가시키고 proteasome activity의 조절을 통해 p21 단백질의 level을 줄임으로써 apoptosis를 더욱 강

화시킴을 제시함 (Br J Pharmacol, 2011).

- 18 -

그림 13. 세 가지 암세포주 (Hs578T, MDA-MB231, and MES-SA/Dx5)에 salinomycin, doxorubicin, 그리고 etoposide를 단독 또

는 combination으로 20시간 처리한 후 western-blot을 수행함.

그림 14. (A-B) Hs578T, MES-SA, 그리고 MES-SA/Dx5 세포주에 salinomycin, doxorubicin, 그리고 etoposide를 단독 또는

combination으로 3시간 또는 6시간 처리한 후 western-blot을 수행함. (C) Hs578T 세포주에 salinomycin과 etoposide를 6시간 처

리하고, proteasome inhibitors (epoxomycin과 MG132)를 5시간 처리한 후 western-blot을 수행함.

- 19 -

(5) Salinomycin이 radiation을 처리한 암세포를 sensitization 시킴. 또한 salinomycin이 verapamil에 비

교적 저항성있는 세포를 sensitization 시킴 (Investigational New Drugs, 2012, in press).

- 그림 15A-B에서 보는 봐와 같이 salinomycin이 radiation과 같이 처리할 시에 유방암 세포의 성장을

저해 시키는 것을 볼 수 있음.

- 또한 그림 15C에서 보는 봐와 같이 salinomycin이 radiation과 같이 처리할 시에 G2 arrest를 더욱

증가 시키는 것을 볼 수 있음. 따라서 salinomycin이 radiation을 처리한 암세포를 sensitization 시키는

기작은 G2 phase를 증가 시키며 세포분열을 억제 시키는 것을 알 수 있었음.

그림 15. (A) 유방암 세포주인 Hs578T에서 radiation과 salinomycin을 단독 또는 combination으로 처리

한 후에 현미경으로 관찰함. (B) 유방암 세포주인 Hs578T에서 radiation과 salinomycin을 단독 또는

combination으로 처리한 후에 cell number를 counting함으로써 proliferation을 측정함. (C) 유방암 세포

주인 Hs578T 또는 MCF7에서 radiation과 salinomycin을 단독 또는 combination으로 48시간 동안 처리

한 후에 FACS analysis를 수행함.

- 또한 그림 16A에서 보는 봐와 같이 salinomycin이 radiation과 같이 처리할 시에 H2AX의 인산화

가 더욱 증가 시키는 것을 볼 수 있음. 따라서 salinomycin이 radiation을 처리한 암세포를 sensitization

시키는 기작은 DNA damages를 증가 시킨다는 것을 알 수 있었음.

- 20 -

- DNA damages가 증가 된다면 pH2AX와 p53BP1의 DNA foci가 증가되기 때문에

immunocytochemistry로 관찰한 결과, salinomycin이 radiation과 같이 처리할 시에 이러한 DNA foci

가 증가 되는 것을 볼 수 있었음 (그림 16B-D).

그림 16. (A) 유방암 세포주인 Hs578T 또는 MCF7에서 radiation과 salinomycin을 단독 또는

combination으로 처리한 후에 pH2AX와 GAPDH에 대한 Western-blot analysis를 수행함. (B-D)유방암

세포주인 Hs578T에서 radiation과 salinomycin을 단독 또는 combination으로 처리한 후에

immunocytochemistry analysis를 수행함.

그림 17. 유방암 세포주인 Hs578T에서 radiation과 salinomycin을 단독 또는 combination으로 처리한

후에 p21과 GAPDH에 대한 Western-blot analysis를 수행함.

- 21 -

- 이전 연구결과 (BJP, 2011)에서 doxorubicin을 sensitization 시키는 salinomycin의 기작은

anti-apoptotic protein인 p21 level을 줄이는 것이었음. 따라서 radiation을 sensitization 시키는 기

작 역시 p21 level과 관계가 있는지를 check 하였음. 그림17에서 보는 봐와 같이 salinomycin이

radiation과 같이 처리할 시에 p21 level이 감소함을 볼 수 있었음. 따라서 salinomycin을 sensitization시

키는 기작은 doxorubicin과 radiation에서 공통으로 conserved 된 것을 볼 수 있었음.

- 또한 그림 18A-B와 같이 salinomycin이 verapamil에 비교적 저항성 있는 세포를 sensitization 시키

는 새로운 결과를 알 수 있었음.

그림 18. (A-B) 유방암 세포주인 Hs578T 또는 MCF7에서 verapamil과 salinomycin을 단독 처리한 후

에 현미경으로 관찰함. Hs578T는 MCF7에 비해 비교적 verapamil에 저항성인 것을 볼 수 있음.

Ver-20, Ver-40, Ver-80, Sal-5는 verapamil과 salinomycin의 농도가 20 uM, 40uM, 80 uM, 5uM 이란

뜻임.

- 22 -

(6) Salinomycin이 antimitotic drugs을 처리한 암세포를 sensitization 시킴 (BBRC, 2012, in press).

- 위에서의 결과는 Salinomycin이 DNA damaging agents인 Doxorubicin과 radiation을 처리한 암

세포를 sensitization 시키는 결과임. Salinomycin이 antimitotic drugs인 vinblastin, paclitaxcel,

docetaxcel 등도 sensitize 하는지를 test하였음.

- 그림 19A-D에서 보는 봐와 같이 antimitotic drugs인 vinblastin, paclitaxcel, docetaxcel이

salinomycin과 같이 처리할 시에 sensitization 효과를 보이는 것을 볼 수 있음. 하지만 이러한

antimitotic drugs은 DNA damaging drugs과는 sensitization 효과를 보이지 않음.

그림 19. (A-D) 유방암 세포주인 Hs578T에 etoposide (ETO), paclitaxcel (PAC), docetaxcel (DOC),

vinblastin (VIN)과 salinomycin (sal)을 단독 또는 같이 처리한 후에 세포성장을 현미경으로 관찰함.

Sal-1, Sal-0.1는 salinomycin의 농도가 1 uM, 0.1 uM 이란 뜻임.

- 또한 그림 20A-D에서 보는 봐와 같이 salinomycin이 antimitotic drugs과 같이 처리할 시에 유방암

세포의 성장을 저해 시키는 것을 볼 수 있음. 또한 dead cells을 증가 시킬 뿐 아니라, apoptosis를 증가

시키는 것을 ethidium homodimer staining과 C-PARP production으로 알 수 있었음.

- 23 -

그림 20. (A) 유방암 세포주 Hs578T에 48시간 동안 salinomycin, antimitotic drugs을 단독 또는 동시에

처리한 후 MTS assay를 수행하여 세포성장의 변화를 관찰함. (B) 유방암 세포주 Hs578T에 48시간 동

안 salinomycin, antimitotic drugs을 단독 또는 동시에 처리한 후 calcein-AM과 ethidium homodimer

staining을 통하여 live/dead cells을 관찰함. (C-D) 유방암 세포주인 Hs578T에서 salinomycin,

antimitotic drugs을 단독 또는 동시에 처리한 후 C-PARP와 GAPDH에 대한 Western-blot analysis를

수행함.

- Antimitotic drugs을 sensitization 시키는 salinomycin의 기작을 FACS analysis로 관찰 하였음.

그림 21A-D에서 보는 봐와 같이 G2 phase를 줄이는 기작으로 sensitization을 시키는 것을 볼 수

있었음. 이는 salinomycin이 세포가 antimitotic drugs에 의한 세포분열을 늦추는 작용 (DNA

damaging을 repair하여 살아날 기회를 늘리는 역할)을 막아서 더욱 빠르게 죽일 수 있는 mitotic

catastrophe의 작용을 한다고 볼 수 있겠음.

- 이전 연구결과 (BJP 2011, Investigational New Drugs 2012 in press)에서 doxorubicin과

radiation을 sensitization 시키는 salinomycin의 기작은 DNA damaging을 증가 시키고

anti-apoptotic protein인 p21 level을 줄이는 것이었음. 따라서 antimitotic drugs을 sensitization

시키는 기작 역시 DNA damaging과 p21 level과 관계가 있는지를 check 하였음. 그림 22A-B에서

보는 봐와 같이 salinomycin이 antimitotic drugs과 같이 처리할 시에 pH2AX를 증가 시키고 p21 level

이 감소함을 볼 수 있었음. 따라서 salinomycin을 sensitization시키는 기작은 doxorubicin, radiation, 그

리고 antimitotic drugs에서 공통으로 conserved 된 것을 볼 수 있었음.

- 24 -

그림 21. (A-D) 유방암 세포주인 Hs578T에서 salinomycin, antimitotic drugs을 단독 또는 동시에 처리

한 후 FACS analysis를 수행함.

그림 22. (A-B) 유방암 세포주인 Hs578T에서 salinomycin, antimitotic drugs을 단독 또는 동시에 처리

한 후 6시간과 20시간에 p21, pH2AX와 GAPDH에 대한 Western-blot analysis를 수행함.

- 25 -

(7) Thioridazine이 doxorubicin을 처리한 암세포를 sensitization 시킴

- 여러 가지 drugs을 screening 한 결과 Thioridazine이 doxorubicin과 combination에 있어서 효

과를 보이는 preliminary data를 가지고 이후 연구를 진행함.

- 아래 그림 23에서의 FACS analysis에서 보는 봐와 같이 doxorubicin을 sensitization 시킬 수

있는 새로운 물질인 thioridazine을 선별할 수 있었음. Sensitization 시키는 기작에 대하여

molecular levels에서 계속적인 연구를 진행하고 있음.

- 또한 Doxorubicin외에 etoposide, paclitaxcel, docetaxcel을 sensitize 하는 새로운 물질의 탐색도

병행했음. 다양한 물질들을 선별하였음. Sensitization 시키는 기작에 대하여 molecular levels에서

계속적인 연구를 진행하고 있음.

그림 23. 유방암 세포주인 Hs578T에서 Thioridazine과 doxorubicin을 단독 또는 동시에 처리한 후

24시간과 48시간 후에 FACS analysis를 수행함.

- 26 -

논문명저자

(저자구분1)) 저널명(I.F.)Year;

Vol(No):Page 구분2)

지원과제번호3)

Salinomycin sensitizes antimitotic

drugs-treated cancer cells by increasing

apoptosis via the prevention of G2 arrest.

윤 성필

(교신저자)

B i o c h e m

Biophys Res

C o m m u n

(2.595)

2012, In press. 국외SCI

0910170

SOCS5 and SOCS6 have similar

expression patterns in normal and cancer

tissues.

윤 성필

(제1저자+ 교신저자)

Tu m or

Biology (2.026)

2 0 1 2 ,

33:215-221

국외SCI

2009, 연구재단

A new synthetic HDAC inhibitor,

MHY218, induces apoptosis or

autophagy-related cell

death in tamoxifen-resistant MCF-7

breast cancer cells.

윤성필

(공동저자)

Investi

gational New

Drug (3.007)

2012, In press. 국외SCI

없음

Salinomycin, a p-glycoprotein

inhibitor, sensitizes radiation-treated cancer

cells by increasing DNA damage and inducing

G2 arrest.

윤 성필

(교신저자)

Investi

gational New

Drug (3.007)

2012, In press.국외SCI

0910170

Salinomycin sensitizes doxorubicin- or

etoposide-treated cancer cells, increasing DNA

damage and reducing p21 protein.

윤 성필

(교신저자)

Br J

Pharmacolog

y (4.925)

2011, Feb

162:773-784국외SCI

0910170

Mcm1p binding sites in the

ARG1promoterpositivelyregulateARG1transcripti

onandS.cerevisiaegrowthintheabsenceofargininea

ndGcn4p.

윤 성필

( 교신저자)

Amino Acids

(4.1)

2011, Feb

40:623-631국외SCI

2009, 연구재단

Jnk signaling pathway-mediated regulation of

Stat3 activation is linked to the development

of doxorubicin resistance in cancer cell lines.

윤 성필

( 교신저자)

B i o c h e m i c a l

Pharmacology

(4.106)

2010, 79: 373- 380국외SCI

0910170

3. 연구결과 고찰 및 결론

- 유방암세포에서 doxorubicin과 관계된 새로운 조건과 유전자의 발견은 새로운 항암제 개발 또

는 임상에서 combination-chemotherapy의 이용에 큰 도움이 될 뿐만 아니라 doxorubicin의 효율

성을 더욱 확대할 것임.

- 또한 본 과제에서 얻어진 결과는 combination-chemotherapy에 있어서 doxorubicin의 좋은

partner 선택에 큰 기여를 할 것임.

- Doxorubicin이 관여하는 새로운 targets의 발견은 항암제 개발을 위한 새로운 표적 분자를 제

공하게 되고, doxorubicin의 효율을 높이는 물질, 조건, 기작을 밝혀 유방암의 치료를 위한 새로운

초석을 마련할 것.

4. 연구성과 및 목표달성도

(1) 연구성과

가. 국내 및 국제 전문학술지 논문 게재 및 신청

- 27 -

논문명 저자 학술대회명 지역1)

지원과제번호

구분1) 특허명 출원인 출원국 출원번호

저서명 저자 발행기관(발행국, 도시) 쪽수 Chapter 제목, 쪽수(공저일 경우)

Arginine Amino Acid 윤성필 저서, book chapter (Nova

Science

Publishers, Inc.)

237-24

9

Chapter 12. Newly Identified

Transcriptional Regulation

by Mcm1p at ARG1

Promoter

보고서명 정부정책 기여내용

Anti-tumor effect of apicidin on Ishikawa

human endometrial cancer cells both in vitro

and in vivo by blocking histone deacetylase

3 and 4.

윤 성필

( 공동저자)

International

Journal of

Oncology

(2.447)

2010, 36:125- 131국외SCI

없음

Mcm1p binding sites in ARG1 positively

regulate Gcn4p binding and SWI/SNF

recruitment.

윤 성필

(제1저자+ 교신저자)

B i o c h e m

Biophys Res

C o m m u n

(2.595)

2009, 381:123-128.국외SCI

없음

SP600125, an inhibitor of Jnk pathway,

reduces viability of relatively resistant cancer

cells to doxorubicin.

윤 성필

( 교신저자)

B i o c h e m

Biophys Res

C o m m u n

(2.595)

2 0 0 9 ,

25;387(3):450-5. 국외SCI

2008, 연구재단

나. 국내 및 국제 학술대회 논문 발표

1) 지역 : 국내, 국외

다. 산업재산권

1) 구분 : 발명특허, 실용신안, 의장등록 등

라. 저 서

마. 연구성과의 정부정책 기여

바. 기타연구성과

- 28 -

최종목표 연차별목표 달성내용달성도(%)연차 최종

유방암 세포에서 항

암제의 내성과 관련

된 새로운 인자의

발굴과 더불어, 기

작 발굴을 통하여

내성의 원리에 있

어서 새로운 모델

을 제시하여 암의

치료에 적용될 수

있는 토대를 제공

함

1차년도

Doxorubicin 치료에

서 재발한 환자의 초

기 암세포에서 Jnk1

의 활성과 Stat3의

활성이 어떠한 지에

대한 연구

유방암 환자에서의 Jnk1과 Stat3의

활성도를 immunohistochemistry로

관찰한 결과 negative 결과를 얻었음

70% 20%Doxorubicin에 의해

활성화된 Jnk1 또는

Stat3가 doxorubicin

에 의한 저항성을 가

지게 하는 기작에 대

한 연구

내성 세포주가 doxorubicin에 의한

survival을 증가시키기 위하여,

Stat3를 통하여 DNA damage를

repair할 수 있는 유전자의 전사를

증가 시키는 작용을 할 것으로 예

측됨.

2차년도

Doxorubicin에 내성

을 가지는 세포를

sensitize 하는 물질

의 탐색과 기작 연구

Salinomycin이 암세포주를sensitize하는 결과를 얻음.

80% 30%Salinomycin에 의한

Doxorubicin의 저항

성을 극복하는 기작

연구

DNA damaging 기작과 p21 level

을 줄이는 기작 밝힘.

3차년도

Salinomycin에 다른

항 암 제 를

sensitization 시키는

기작 연구

Radiation과 antimitotic drugs을

salinomycin이 sensitization시키는

기작 규명.90% 40%

D o x o r u b i c i n 을

sensitize 하는 새로

운 물질의 탐색

Thioridazine이 doxorubicin을 처리한 암세포를 sensitization 시키는 결과를 얻음.

평가의 착안점 자 체 평 가

Doxorubicin 치료에서 재발한 환자

의 초기 암세포에서 Jnk1의 활성

과 Stat3의 활성이 어떠한 지에 대

한 연구

결과가 negative여서 논문게제를 할 수 없었음. 따라서

10%이하의 목표를 달성 했다고 사료됨.

Doxorubicin에 의해 활성화된 Jnk1

또는 Stat3가 doxorubicin에 의한

저항성을 가지게 하는 기작에 대한

연구

Stat3와 Jnk1의 새로운 기작을 한 개의 논문 (Biochem

Pharma)이 publish 되었음. 따라서 100%의 목표를 달성 했

다고 사료됨.

(2) 목표달성도

가. 연구목표의 달성도

나. 평가의 착안점에 따른 목표달성도에 대한 자체평가

- 29 -

Doxorubicin에 내성을 가지는 세포

를 sensitize 하는 새로운 물질의

탐색

Salinomycin이 암세포주를 sensitize하는 결과를 얻음. 따라서 100%의 목표를 달성 했다고 사료됨.

Salinomycin에 의한 Doxorubicin의

저항성을 극복하는 기작 연구

DNA damaging 기작과 p21 level을 줄이는 기작 밝힘. 한

개의 논문이 2010년에 accept 됐음. 따라서 100%의 목표를

달성 했다고 사료됨.

Salinomycin에 다른 항암제를

sensitization 시키는 기작 연구

Radiation과 antimitotic drugs을 salinomycin이

sensitization시키는 기작 규명. 두 개의 논문이 2011년에

accept 됐음. 따라서 100%의 목표를 달성 했다고 사료됨.

Doxorubicin을 sensitize 하는 새로

운 물질의 탐색

Thioridazine이 doxorubicin을 처리한 암세포를 sensitization시키는 결과를 얻음. 50%의 달성도를 가지고 계속 연구하고있음.

5. 연구결과의 활용계획

(1) 연구종료 2년후 예상 연구성과

구 분 건 수 비 고

학술지 논문 게재 3건 (SCI)Impact factor 4.0 이상의 1개의 논문과

3.0이상의 2개의 논문을 예상함.

산업재산권 등록

기 타

(2) 연구성과의 활용계획

- 유방암세포에서 doxorubicin과 관계된 새로운 조건과 유전자의 발견은 새로운 항암제 개발 또

는 임상에서 combination-chemotherapy의 이용에 큰 도움이 될 뿐만 아니라 doxorubicin의 효율

성을 더욱 확대할 것임.

- 또한 본 과제에서 얻어진 결과는 combination-chemotherapy에 있어서 doxorubicin의 좋은

partner 선택에 큰 기여를 할 것임.

- Doxorubicin이 관여하는 새로운 targets의 발견은 항암제 개발을 위한 새로운 표적 분자를 제

공하게 되고, doxorubicin의 효율을 높이는 물질, 조건, 기작을 밝혀 유방암의 치료를 위한 새로운

초석을 마련할 것.

- 2009-2012년에 Jnk inhibitor와 salinomycin이 항암제를 sensitization 할 수 있다는 5개의 논문

을 발표했음 (참고문헌). 따라서 추가적으로 계속적인 연구 개발은 경쟁적 있는 분야라고 할 수

있겠은.

6. 참고문헌

SP600125, an inhibitor of Jnk pathway, reduces viability of relatively resistant cancer cells to

doxorubicin. Kim JH, Kim TH, Kang HS, Ro J, Kim HS, and Yoon S. Biochem Biophys

Res Commun. 2009 Sep 25;387(3):450-5.

- 30 -

○ 본 연구의 성과로 논문, 저서, 산업재산권, 정책정책 기여 등이 있을 경우 관련 증빙자료를 첨

부토록 함

Jnk signaling pathway-mediated regulation of Stat3 activation is linked to the development of

doxorubicin resistance in cancer cell lines. Ju-Hwa Kim, Seok Chul Lee, Jungsil Ro, Han Sung

Kang, Hyung Sik Kim, and Sungpil Yoon.Biochemical Pharmacology, 2010 Feb,79:373-380

Salinomycin sensitizes cancer cells to the effects of doxorubicin and etoposide treatment by

increasing DNA damage and reducing p21 protein. Ju-Hwa Kim, Minji Chae, Won Ki Kim,

You-Jin Kim, Han Sung Kang, Hyung Sik Kim, and Sungpil Yoon. Br J Pharmacology, 2011

Feb, 162:773-784.

Salinomycin, a p-glycoprotein inhibitor, sensitizes radiation-treated cancer cells by

increasing DNA damage and inducing G2 arrest. Won Ki Kim, Ju-Hwa Kim, Kyungsil

Yoon, Sunshin Kim, Jungsil Ro, Han Sung Kang, and Sungpil Yoon. Investigational New

Drugs, 2012 in press.

Salinomycin sensitizes antimitotic drugs-treated cancer cells by increasing apoptosis via the

prevention of G2 arrest. Ju-Hwa Kim, Hye-In Yoo, Han Sung Kang, Jungsil Ro,and

Sungpil Yoon. Biochem Biophys Res Commun. 2012 In press.

7. 첨부서류