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Manual de Estágio 1 |

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AA FFLLOORREESSTTAA AAOO MMIICCRROOSSCCÓÓPPIIOO IIII

Estágio n.º 3109

88 aa 1122 JJuullhhoo ddee 22001133

Responsável - MMaarriiaa ddee LLuurrddeess IInnáácciioo


SSeemmaannaa ddee EEssttáággiioo

22ªª ffeeiirraa,, 88 JJuullhhoo manhã

Receção dos alunos e apresentação da Unidade de investigação florestal e da equipa do projeto; enquadramento das atividades a desenvolver ao longo do estágio

tarde Instalação de amostras para extração do nemátode da madeira do pinheiro; procedimento de extração do nemátodes para identificação; observações à lupa e ao microscópio


Isolamento de fungos em cultura pura a partir de árvores infetadas

tarde Observação das fases do ciclo de vida de insetos vetores de doenças na floresta: observações à lupa; demonstração dos principais meios de luta (ex: armadilhas iscadas com feromonas)


Extração e purificação de DNA de fungos patogénicos e envio do material para sequenciação

tarde Continuação do isolamento de fungos patogénicos; observação de preparações microscópicas de fungos simbiontes (micorrizas) ou de antagonistas


Avaliação dos resultados obtidos na Patologia e Biologia Molecular

tarde Análise das sequências de DNA obtidas e possível identificação dos fungos atendendo às suas características morfológicas e aos resultados da sequenciação do DNA ribossomal


Apresentação (em grupos) do estágio pelos alunos no auditório da ex-EFN

tarde Continuação das apresentações Entrega dos diplomas do estágio Ciência Viva Lanche

NNoottaa:: os alunos em estágio têm ainda a possibilidade de assistir diariamente a palestras subordinadas a

diversos temas, entre as 12.15-12.45h, antes do período de almoço.


22ªª ffeeiirraa,, 88 JJuullhhoo

10:00 - Receção dos estagiários pelos dinamizadores dos estágios no edifício da ex- Estação Florestal

Nacional, Oeiras (EAN, Quinta do Marquês) – Entrega das Pastas de Acolhimento

10:45 - Abertura do evento “INIAV é Ciência Viva” pelo Conselho Diretivo do INIAV – Dr. Carlos Caldas

11:00 - Apresentação do Programa Estágios “INIAV é Ciência Viva” pela Coordenadora do Programa -

Paula Sá Pereira.

11:20 – Início do estágio “A Floresta ao Microscópio I”

Apresentação da equipa de trabalho

Visita às instalações/ laboratórios

Enquadramento das atividades a desenvolver ao longo do estágio

13.00 - Almoço

14.00 – Breve introdução aos principais agentes causadores de doenças na floresta: nemátodes e fungos;

o seu transporte por insetos.

Caso particular da doença da murchidão do pinheiro, causada pelo nemátode da madeira do

pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus.

Laboratório de Nematologia (MMªª LLuurrddeess IInnáácciioo ++ MMaarrggaarriiddaa FFoonntteess)

Normas de funcionamento num laboratório de organismos de quarentena.

Preparação e instalação de amostras de pinheiro bravo para extração e deteção do NMP

Observação da suspensão de nemátodes à lupa.

Técnica de “pescagem” de nemátodes.

Observação ao microscópio ótico (MO) de preparações entre lâmina e lamela.

Microfotografia.


Laboratório de Nematologia

O nemátode da madeira do pinheiro (NMP), Bursaphelenchus xylophilus é um animal de dimensões

muito reduzidas (em média 1 mm de comprimento), filiforme (tipo lombriga) e ataca os pinheiros na

floresta (sobretudo o pinheiro bravo), causando a doença da murchidão do pinheiro, que mata milhares

de árvores no nosso país todos os anos.

Como os sintomas são comuns a outras doenças, são retiradas amostras de serrim do tronco (com uma

broca) dos pinheiros que se apresentem com as agulhas secas e acastanhadas, e trazidas para o nosso

laboratório. Aqui, são instaladas de acordo com um protocolo específico para se extrair o NMP e efetuar

a sua identificação através das características morfológicas e por métodos de biologia molecular. Há

outros nemátodes naturalmente presentes no pinheiro muito parecidos com o NMP mas que não

causam doença e por isso a identificação desses nemátodes só pode ser feita por especialistas

(Nematologistas).

Para passar de uma árvore para a outra, os nemátodes têm de ser transportados pelo inseto

Monochamus galloprovincialis (longicórnio do pinheiro). Por isso, o NMP também pode ser identificado

diretamente a partir destes insetos (Figura 1).

Figura 1. a) Inseto vetor do nemátode da madeira do pinheiro (NMP); b) suspensão de nemátodes; c) pormenor da cabeça e da cauda do NMP (macho).

Nota:

As diferentes etapas do trabalho são devidamente enquadradas e exemplificadas e todos os trabalhos

serão acompanhados por técnicos de laboratório. Está também instalado um computador com uma

apresentação em diapositivos, possibilitando aos estagiários a qualquer momento rever todo o processo

de instalação das amostras até à identificação do NMP ao microscópio.

a b

c


Laboratório de Nematologia (cont.)

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee IINNSSTTAALLAAÇÇÃÃOO ddaass AAMMOOSSTTRRAASS ppaarraa EEXXTTRRAAÇÇÃÃOO ddee NNMMPP

1. As amostras de serrim são pesadas e anotado o seu peso em tabela de laboratório

2. São colocadas sobre uma folha de papel que por sua vez está sobre uma folha de tecido (étamine)

3. Faz-se um embrulho (com a maior espessura de tecido virada para cima) que se coloca sobre a rede do tabuleiro

4. Enche-se o tabuleiro com água (cerca de metade da altura) e deixa-se ficar durante 48 h.

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee EEXXTTRRAAÇÇÃÃOO ddee NNMMPP aa ppaarrttiirr ddoo iinnsseettoo MMoonnoocchhaammuuss ggaalllloopprroovviinncciiaalliiss

1. Os insetos são divididos em machos (antenas pretas) e fêmeas (antenas brancas e pretas)

2. São esmagados com um pequeno pilão dentro de uma placa de Petri pequena

3. Com o esguicho, enche-se a placa com água até cerca de metade

4. Deixa-se ficar durante 2-3 h

5. Côa-se a suspensão para nova placa para observação

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee OOBBSSEERRVVAAÇÇÃÃOO DDOO NNMMPP ÀÀ LLUUPPAA ee aaoo MMOO EENNTTRREE LLÂÂMMIINNAA EE LLAAMMEELLAA

1. A suspensão de nemátodes é colocada numa siracusa.

2. Faz-se a focagem e o ajuste das ampliações para observação de machos, fêmeas e estados juvenis do NMP.

3. Com o auxílio de uma “pestana”, pesca-se um nemátode (acompanhando a focagem) e coloca-se na gota de água na lâmina.

4. Mata-se o nemátode passando a lâmina gentilmente à chama e depois coloca-se a lamela por cima.

5. Observa-se ao MO, focando com a objetiva de menor ampliação (x4) e passando para as seguintes, de forma a ver as diferentes estruturas distintivas da espécie.

6. Microfotografias do material biológico observado.



10:00 – Visita à Micoteca Florestal do INIAV

Isolamento em meio artificial de cultura de fungos causadores de doença em sobreiro para obtenção de

culturas puras.

12:15- Palestra P5 “Marcadores genéticos: dos genes às populações/ Melhoramento genético de

castanheiro para a resistência à doença da tinta”. Rita Costa e José Matos. Auditório Florestal.

13.00 - Almoço

14.00 – Breve introdução às principais pragas florestais de pinheiro, sobreiro e eucalipto com visita à

Entomoteca Florestal do INIAV e às câmaras de crescimento de insetos para acompanhamento das

diferentes fases dos ciclos de vida (larva, pupa e adulto). Observações das diferentes estruturas dos

insetos à lupa binocular.

Breves noções de bioecologia e de meios de luta para controlo das populações de pragas florestais, com

particular ênfase nos métodos biotécnicos com recurso a armadilhas iscadas com feromonas e luta

biológica com utilização de parasitoides e fungos entomopatogénicos.

Laboratório de Micologia (HHeelleennaa BBrraaggaannççaa// HHeelleennaa MMaacchhaaddoo))

Existem muitos fungos nos ecossistemas florestais com diferentes funções: saprófitas, simbiontes

(micorrizas), antagonistas de outros fungos, entomopatogénicos (causadores de infeção nos insetos,

sobretudo nos nocivos) e fitopatogénicos (causadores de doenças nas plantas). Pelo seu interesse,

vamos trabalhar sobretudo com estes últimos. A partir de tecidos de árvores doentes (tronco, agulhas),

com suspeita de infeção por fungos, será efetuado o isolamento do agente patogénico em cultura pura,

com recurso a meios artificiais de cultura, com a chamada de atenção para a enorme biodiversidade

micológica contida numa amostra de tecido vegetal. Será estudado com maior pormenor o fungo

Biscogniauxia mediterranea, causador da doença do carvão do entrecasco no sobreiro.

Laboratório de Entomologia (PPeeddrroo NNaavveess))

Observação e manipulação de insetos à lupa binocular: o longicórnio do pinheiro M. galloprovincialis,

(Cerambicídeo), o plátipo do sobreiro Platypus cylindrus (Platipodídeo) e o gorgulho do eucalipto

Gonipterus scutellatus (Curculionídeo). Captação de imagens. Breves noções sobre montagem e

etiquetagem de insetos para coleção.

Observação das principais armadilhas usadas para o controlo de pragas florestais. Observação de insetos

parasitados e/ou infetados com fungos entomopatogénicos.


Laboratório de Micologia

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee IISSOOLLAAMMEENNTTOO DDEE FFUUNNGGOOSS PPAATTOOGGÉÉNNIICCOOSS EEMM CCUULLTTUURRAA PPUURRAA

Breve demonstração sobre a preparação de meios artificiais de cultura (Malt Extract Agar, MEA Difco®):

pesagens, diluições, autoclavagem e enchimento de placas de Petri 5mm.

Desinfeção (álcool 70%) da bancada de trabalho, dos instrumentos a usar (pinça e bisturi) e das mãos

(em alternativa, trabalhar com luvas de latex).

Avaliação da lesão no tecido vegetal e seleção do material a isolar: na zona de transição do tecido são e

tecido afetado, cortam-se pequenos pedaços com o auxílio de um bisturi. Estes pedaços são imersos em

álcool a 1% cerca de 30 seg e depois passados por água destilada e esterilizada. Em seguida, são

colocados sobre papel de filtro estilizado para remover o excesso de água e postos na placa de Petri (1

pedaço/ placa), sobre o meio de cultura. Estas operações decorrem em câmara de fluxo laminar e/ou

com a lamparina acesa e colocada a uma distância de segurança. Cada placa de isolamento tem de ser

devidamente identificada com o nº/nome da amostra, a data e o meio de cultura.

As placas são colocadas em estufa de incubação, na obscuridade e a cerca de 24±1ºC, temperatura

adequada para o crescimento da maior parte dos fungos com que trabalhamos e observadas

diariamente. É natural que apareçam diferentes fungos (Figura 3), até na mesma placa, porque na

natureza não há culturas puras, nós é que as tentamos obter no laboratório! Para isso, teremos de fazer

um acompanhamento diário das placas e fazer a repicagem do que interessa para novas placas.

Figura 3. Isolamento de fungos a partir

de tecido vegetal.

O que obtemos na placa de cultura são as hifas do fungo, que no seu conjunto constituem o micélio.

Após alguns dias, podem formar-se esporos (conídios) que servem para propagar a doença. Em

laboratório temos de ter cuidado e adotar procedimentos para que estes esporos não se libertem das

placas e vão contaminar outros trabalhos e até mesmo fazer-nos mal à saúde! Contudo, estas estruturas

reprodutivas são muito importantes para a caracterização morfológica do isolado, essencial para a

identificação dos fungos. Ao estudar os esporos, avalia-se a sua forma, tamanho, modo de formação,

inserção nos conidióforos (estrutura especializada formada por hifas simples ou ramificadas de onde são

originados os conídios).


Laboratório de Entomologia

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee OOBBSSEERRVVAAÇÇÃÃOO DDOOSS IINNSSEETTOOSS ÀÀ LLUUPPAA

1. Os insetos têm de ser manuseados delicadamente com recurso a pinças de bicos moles

2. Os insetos de maiores dimensões são colocados diretamente no prato da lupa e observados com incidência de duplo foco de luz fria

3. Os insetos de menores dimensões são colocados numa “esfera de observação” para mais fácil manipulação

4. Captação de imagens prestando particular atenção às principais regiões (cabeça, tórax e abdómen) e às estruturas de forma a ser capaz de efetuar a legenda da Figura 2.

Figura 2. Os insetos são artrópodes cujo corpo é revestido por quitina e está dividido em três regiões.

Coloca as letras A, B e C à frente dos nomes da coluna:

Abdómen ____

Cabeça ____

Tórax ____

Completa as frases abaixo com as estruturas convenientes: patas, antenas, élitros, asas membranosas.

O inseto vetor do NMP é o longicórnio do pinheiro. Tem esta designação porque tem umas _________

muito longas. As asas coriáceas designam-se por __________ e protegem o corpo do inseto e as _____

________________ que servem para voar. Os insetos têm 3 pares de ________ que às vezes podem

estar modificadas ou ausentes.

Nota: como nos ecossistemas florestais é frequente os patogénios (nemátodes e fungos) serem

transportados por insetos para vencerem as distâncias entre as árvores hospedeiras, às vezes a observação de insetos à lupa permite distinguir a presença de nemátodes ou de micélio de fungo no corpo dos artrópodes.



10:00 – Extração de DNA de fungos patogénicos

Quantificação do DNA extraído

Reação PCR

Preparação do gel para eletroforese

12:15 - Palestra P6 “A biodiversidade vegetal e a alimentação. Alimentos geneticamente modificados.

Controlo de pesticidas em alimentos vegetais”. Isabel Duarte e Cristina Aleixo e Susana Luz. Auditório

Florestal.

13.00 - Almoço

14.00 – Continuação do isolamento de fungos patogénicos em cultura pura; repicagens.

Observação de preparações ao MO entre lâmina e lamela

Conclusão da extração de nemátodes por crivagem debaixo de água (crivo 38 mesh) e

confirmação da presença do NMP por observação à lupa e ao MO.

Laboratório de Genética Florestal (FFiilloommeennaa NNóóbbrreeggaa ++ JJooaannaa HHeennrriiqquueess))

Discussão da importância do diagnóstico preciso em Fitopatologia, do conhecimento dos ciclos de vida

dos fungos e decorrente aplicação de meios de controlo. A genética molecular como ferramenta

imprescindível no diagnóstico das doenças florestais pelo conhecimento dos genes do fungo: através da

sequenciação parcial do seu genoma, e comparação com as bases de dados mundiais (Genbank), é

possível completar a identificação do fungo patogénico.

O DNA existe em praticamente todas as células vivas e no caso dos fungos em cultura pura, a sua

extração é feita diretamente a partir do micélio que se desenvolveu na placa de Petri. Para obter o DNA,

tem que se separar dos outros componentes celulares. Assim, as células são fragmentadas e o DNA

separado do conteúdo lipídico das membranas da célula e dos organitos e depois das proteínas. Este

DNA tem de ser analisado por espectrofotometria para sabermos a quantidade e qualidade de material

genético que obtivemos.

Depois de extraído o DNA, é-lhe adicionada uma mistura (mix) que contém os dNTPs

(desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases azotadas ligadas com um três fosfato, os primers

(também designados oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase numa solução

tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-

estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). Este

processo é conhecido como PCR (Polimerase Chain Reaction) e destina-se a obter maiores quantidades de material genético.


Laboratório de Genética Florestal

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee EEXXTTRRAAÇÇÃÃOO ddee DDNNAA ddee FFUUNNGGOO PPAATTOOGGÉÉNNIICCOO


Laboratório de Genética Florestal (cont.)

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee PPCCRR

A técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase) é um método de amplificação enzimática in vitro (de

criação de múltiplas cópias) de DNA. Durante a PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a

separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos

iniciadores (primers). Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, uma

solução tampão salina contendo a enzima Taq DNA polimerase, os oligonucleótidos iniciadores, os

quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura é submetida a vários

ciclos de amplificação que consistem em: desnaturação do DNA alvo pelo calor de modo a separar as

duas cadeias; hibridação ou emparelhamento dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em

cadeia simples, por arrefecimento da mistura de reação e extensão dos iniciadores através da síntese da

cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela Taq DNA polimerase. O processo

envolvendo estes três passos pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar,

em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA existente, levando a uma amplificação exponencial.



PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee EELLEETTRROOFFOORREESSEE

A electroforese é o método mais utilizado para estimar o tamanho dos fragmentos do DNA. A separação

eletroforética de DNA é feita normalmente em gel de agarose. Por aplicação de um campo elétrico as

amostras colocadas no gel vão migrar para o polo positivo (ânodo), uma vez que os ácidos nucleicos têm

carga negativa em pH neutro. Esta migração dos ácidos nucleicos origina bandas que podem ser

visualizadas com o auxílio de luz ultravioleta, após coloração com brometo de etídeo, uma substância

mutagénica que se intercala nas cadeias de DNA e que exposta a radiação UV emite uma fluorescência

alaranjada. Durante o endurecimento (polimerização) do gel, coloca-se um pente que cria poços que

serão utilizados para a colocação das amostras. Cada uma é uma pista e na presença de uma corrente

elétrica vai deixando o seu rasto. São estes rastos ou bandas que vamos comparar.


Laboratório de Micologia (cont.)

PPRROOTTOOCCOOLLOO ddee OOBBSSEERRVVAAÇÇÂÂOO ddee FFUUNNGGOOSS AAOO MMOO ((pprreeppaarraaççããoo eennttrree llââmmiinnaa ee llaammeellaa))

1. com o auxílio de um bisturi esterilizado (passado à chama) raspa-se ligeiramente um pouco de

micélio de placa de Petri.

2. coloca-se esse micélio entre a lamina e a lamela, sobre uma gota de ácido láctico.

3. observação ao microscópio ótico, começando por focar na ampliação mais baixa (x100)

4. microfotografia com escala

ampliação x________

Desenha aqui em traços largos o que observaste ao microscópio. Não te esqueças de anotar a ampliação que deves calcular efetuando a seguinte multiplicação

ampliação das oculares (=x10) x ampliação da objetiva

Nota: para além do microscópio ótico, também se recorre a observações no microscópio eletrónico de

varrimento (SEM = scanning electron microscope) que permite ampliações muito superiores às do MO e

microfotografias de grande beleza.



10:00 – Eletroforese em gel de agarose

12:15 - Palestra P7 “As árvores e as florestas vistas do céu/ O papel das ciências sociais na investigação

agrária ”. Augusta Costa e Alexandra Pinto. Auditório Florestal.

13.00 - Almoço

14.00 – Observação e discussão dos resultados obtidos no gel de agarose

Explicação e discussão dos resultados obtidos na sequenciação do gene em estudo (Figura 4)

possível identificação do fungo patogénico isolado de sobreiros doentes, em conjunção com as

características morfológicas do fungo observadas anteriormente.

Figura 4. representação esquemática dos genes do DNA ribossomal do fungo com particular destaque

para a região dos ITS (internal transcribed spacer).



Quando o DNA do nosso fungo corresponde a uma única banda significa que todo o processo correu

bem e que podemos enviar esse DNA purificado para a sequenciação (num sequenciador). Vamos obter

a sequência de bases da região do DNA escolhida para estudo do fungo e visualizamo-la num

cromatograma. Por comparação desta sequência com as bases de dados internacionais, conseguimos

identificar o fungo patogénico do sobreiro.

Cola aqui o teu gel da electroforese e identifica cada uma das bandas obtidas

Cola aqui o teu cromatograma e identifica cada uma das letras de cores diferentes e

a que corresponde o tamanho dos picos



10:00 – Apresentações dos estágios “Ciência Viva”

12:15 - Palestra P8 “Zoonoses: o que são e como se evitam?”. Abel Ana Botelho. Auditório Florestal.

13.00 - Almoço

14.00 – Continuação da apresentação dos estágios “Ciência Viva”

16.00 – Entrega dos diplomas “Ciência Viva”

Lanche “Viva a Ciência!” (no Lab. de Nematologia)

Despedida e um “até breve!”

A equipa do “A Floresta ao Microscópio II”

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