II 2. Inchamento Mitocondrial Final

Grupo 1:

Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professora: Marta Silva

Objectivos

2 DQB-Licenciatura em Bioquímica

• Tentar reproduzir os resultados das experiências realizadas por Brian

Chappell

Protocolo Bioquímica Experimental II 2011/2012

Resumo


Centrifugação diferencial

Isolamento dos mitocôndrios

7 ensaios

(VT = 2,5 mL)

Sais de amónio de metabolitos

Sais com malato/fosfato de

potássio

Inchamento mitocondrial

(Abs520 nm)

Procedimento

Isolamento dos Mitocôndrios


Descascou-se batatas,

cortaram-se em cubos

pequenos e pesou-se cerca

de 300g.

Meio de isolamento

Centrifugações e

ressuspensão do

sedimento

sucessivas Ressuspensão

do sedimento

Suspensão

Mitocondrial

Procedimento

Isolamento dos Mitocôndrios


Alterações ao protocolo:

Menor

quantidade de

batatas

Processo mais

rápido

Melhor

funcionamento

dos

transportadores

Extracção do

sedimento de

cor esverdeada

Menor

acidificação do

meio

Integridade dos

mitocôndrios

1.

2.

Procedimento

Inchamento mitocondrial na presença de sais de amónio de

ácidos fracos ou metabolitos


Leituras de absorvência a 520nm a 30°C

Ensaio 1

2,4 mL de H2O

0,100 mL de extracto

mitocondrial

Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4

1 mL de cloreto de potássio


mitocondrial

1,350 mL de Tris-HCl/EDTA

pH 7,4

1 mL de cloreto de

amónio


mitocondrial


pH7,4

1 mL de acetato de

amónio


mitocondrial


pH 7,4

Procedimento

Inchamento mitocondrial na presença de sais de amónio de

ácidos fracos ou metabolitos


Leituras de absorvência a 520nm a 30°C *Após 1 minuto **Após 1 minuto

Ensaio 5

1 mL de fosfato de

amónio

0,150 mL de extracto mitocondrial

1,350 mL de Tris-HCl/EDTA pH 7,4

Ensaio 6

1 mL de malato de amónio

00,025 mL de rotenona



0,100 mL de fosfato de sódio*

Ensaio 7 1 mL de citrato de

amónio

0,025 mL de rotenona



0,100 mL de fosfato de sódio*

0,100 mL de malato de potássio**

Análises: Ensaio 1


H2O (controlo positivo)

Figura 1. Espectro do ensaio 1 de inchamento

mitocondrial – controlo positivo.

Esperado:

Positivo

Experimental:

Positivo

Figura 2. Espectro do ensaio 1 para a PL1. Este

ensaio foi o controlo positivo.

Análises: Ensaio 1 – Em esquema


Matriz Mitocondrial Meio

• Os mitocôndrios são colocados

numa solução hipotónica em

relação ao seu meio interior

• A água atravessa a membrana

mitocondrial para igualar as

concentrações

Inchamento Mitocondrial

ÁGUA

Figura 3. Passagem de água através de uma membrana.

Adaptado Aulas Teóricas de Processos de Oxidação Redução

em Bioquímica 2011/2012

Análises: Ensaio 2


Esperado:

Negativo

Experimental:

Negativo

KCl


mitocondrial. Houve a adição de cloreto de

potássio para este estudo.


mitocondrial da PL1.

Controlo

Positivo

Controlo

Positivo

Análises: Ensaio 2– Em esquema


• Para que ocorra inchamento

mitocondrial os iões K+ e Cl- teriam de

atravessar a membrana

• A membrana é impermeável a iões

Não ocorre


Figura 5. Passagem de KCl através de uma membrana.

Adaptado Aulas Teóricas de Processos de Oxidação

Redução em Bioquímica 2011/2012

Controlo

Positivo

Análises: Ensaio 3


Esperado:

Negativo

Experimental:

Negativo

NH4Cl


mitocondrial. Para este ensaio utilizou-se cloreto

de amónio.



Controlo

Positivo



• Tal como no caso do KCl, para que

ocorra inchamento mitocondrial os

iões NH4+ e Cl- teriam de atravessar a

membrana

• A membrana é impermeável a iões

Não ocorre


Figura 8. Passagem de NH4Cl através de uma

membrana. Adaptado Aulas Teóricas de Processos de

Oxidação Redução em Bioquímica 2011/2012

Controlo

Positivo

Controlo

Positivo

Análises: Ensaio 4


Esperado:

Positivo

Experimental:

Positivo

Acetato de Amónio


mitocondrial . Para este ensaio utilizou-se acetato de

amónio.


mitocondrial da PL 1. Para este ensaio utilizou-se

acetato de amónio.



Figura 11. Esquema da entrada de malato no mitocôndrio por adição de acetato de amónio.

Adaptado Aulas Teóricas de Processos de Oxidação Redução em Bioquímica 2011/2012

Entrada por difusão

simples

Dissociação do acetato de amónio nos

seus iões

Desprotonação/protonação

Perda do

gradiente Inchamento mitocondrial

Controlo

Positivo

Controlo

Positivo

Análises: Ensaio 5


Esperado:

Positivo

Experimental:

Positivo

Fosfato de Amónio


mitocondrial . Para este ensaio utilizou-se fosfato

de amónio.





Figura 14. Esquema da entrada de fosfato de amónio no mitocôndrio.


Simporte do ião fosfato com

H+/ antiporte com OH-

Desprotonação do NH4+

Ião fosfato

Difusão através da membrana

Transportador

Análises: Ensaio 6


Esperado:

Positivo

Experimental:

Negativo


mitocondrial. Houve a adição de malato de amónio,

fosfato de sódio e rotenona para este estudo.

Malato de amónio/Rotenona Fosfato de sódio 1 min

Figura 16. Espectro do ensaio 6, fornecido pela PL

1, de inchamento mitocondrial. Houve a adição de

malato de amónio, fosfato de sódio e rotenona para

este estudo.

Controlo

Positivo

Controlo

Positivo

Experimental:

Positivo



Figura 17. Esquema da entrada de malato no mitocôndrio por adição de malato de amónio e fosfato de sódio.


Análises: Ensaio 7


Figura 18. Espectro do ensaio 7, de inchamento

mitocondrial. Houve a adição de malato de amónio,

fosfato de sódio e rotenona para este estudo.

Esperado:

Positivo

Experimental:

Positivo

Citrato de amónio Fosfato de amónio Malato de sódio 1 min 1 min

Figura 19. Espectro do ensaio 7, fornecido pela PL 1, de

inchamento mitocondrial. Houve a adição de malato de

amónio, fosfato de sódio e rotenona para este estudo.

Controlo

Positivo

Controlo

Positivo

Experimental:

Negativo



Figura 20. Esquema da entrada de citrato no mitocôndrio por adição de citrato de amónio, fosfato de sódio e malato de potássio.


Conclusões


Incham Não Incham

Cloreto de potássio

Cloreto de amónio

Acetato de amónio

Fosfato de amónio

Malato de amónio + fosfato de sódio

Citrato de amónio + fosfato de sódio + malato

de potássio

Conclusões


Estequiometria:

H2PO4- Entrada de 1 H+

Malato Entrada de 2 H+

Citrato Entrada de 3 H+

• Os mitocôndrios respondem a mudanças na pressão osmótica do

meio de suspensão;

• A membrana mitocondrial é impermeável a pequenos iões;

•A membrana mitocondrial é permeável a moléculas neutras pequenas.

Referências


• Nelson, D., Cox, M., Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition, W. H. Freeman and

Company, New York, 2008.

• Nicholls, D., Ferguson S. (2002) Bioenergetics 3, Second Edition. UK : Academic Press.

• Chappell, J.B. & Haarhoff, K.N. (1967) The penetration of the mitochondrial membrane by anions and

cations. In Biochemistry of Mitochondria (Slater, E.C., Kaniuga, Z. & Wojtczak, L., eds.), pp.75-91,

London and New York; Academic Press.

• Cain, K. & Skilleter, D.N. (1987) Preparation and use of mitochondria in toxicological research. In

Biochemical Toxicology – a practical approach (Snell, K. & Mullock, B., eds.), pp 217-254, Oxford: IRL

Press.

• Ng, L.T., Selwyn, M.J., Choo, H.L. (1993) Effect of buffers and osmolality on anion uniport across the

mitochondrial inner membrane. Biochim. Biophys. Acta, 1143, 29-37.

• Rickwood, D., Wilson, M.T., Darley-Usmar, V. (1987) Isolation and characteristics of intact

mitochondria. In Mitochondria – a practical approach (Darley-Usmar, V., Rickwood, D., Wilson, M.T.),

pp. 1-16, Oxford: IRL Press.

• Verleur, J.D. (1965) “Studies on the Isolation of Mitochondria from Potato Tuber Tissue”, Plant Physiol

40, pp.1003-1007.

II 2. Inchamento Mitocondrial Final

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