IDENTIFIKASI SECARA MORFOLOGI DAN MOLEKULER PATOGEN ...
Transcript of IDENTIFIKASI SECARA MORFOLOGI DAN MOLEKULER PATOGEN ...
IDENTIFIKASI SECARA MORFOLOGI DAN
MOLEKULER PATOGEN PENYEBAB PENYAKIT
LAYU PADA STROBERI DI BALI DAN POTENSI
PENGENDALIANNYA DENGAN MIKROBA
ANTAGONIS
Tim Peneliti :
Dr. Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, SP., M.Agr.
I Putu Sudiarta, SP., M.Si, Ph.D
Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P.
Gusti Ayu Devi Valenia Sari
PENURUNAN PRODUKSI
80%PENYAKIT LAYU
STROBERI
Gejala serangan penyakit Layu Stroberi
TUJUAN PENELITIAN
1. Mengetahui spesies patogen penyebab penyakit
layu tanaman stroberi berdasarkan analisa
morfologi dan molekuler
2. Mengetahui mikroba antagonis yang
mempunyai potensi sebagai agen pengendali
patogen penyebab penyakit layu stroberi di
Bali.
METODEPENELITIAN
Identifikasi Patogen penyebab
penyakit layu Stroberi
Analisa
Filogenetik
Sequencing
Ekstraksi DNAmiselium berumur 4 hari kit Wizard Genomic
purification, Promega Corp
Amplifikasi PCR
Primer didesain dari Internal Transkribed
Spacer (ITS) 1 (5-TCCGTAGGTGAACCGC
GG-3) dan ITS 4 (5-TCCTCCGC
TTATTGATATGC-3) 500 - 800bp
Identifikasi Patogen secara Molekular
8
mengetahui tingkat homologi atau kesejajaran
dengan sekuen gen
filogenetika menggunakan software Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5.05).
Isolasi Mikroba Antagonis Patogen Penyebab
Penyakit Layu Pada Stroberi
Kandidat mikroba antagonis dari golongan jamur dibiakkan dari tingkat
pengenceran 10-3-10-4, sedangkan dari golongan bakteri dibiakkan dari
pengenceran 10-5-10-6.
1
ml
1
ml
1
ml
1
ml
1
ml
1
ml
500 ml + 50 gr
tanah
9 ml
Mikroba antagonis di isolasi dari 5 tanah di areal rhizosfer tanaman yang berbeda
Uji In Vitro Kemampuan Mikroba Antagonis
Mengendalikan Patogen Penyebab Penyakit Layu
Stroberi.
A : Patogen Penyakit Layu, B : Mikroba Antagonis, L1 : Luas jamur patogen pada perlakuan (cm) L0 : Luas jamur
patogen pada kontrol
Rumus presentase daya hambat mikroba antagonis terhadap pertumbuhan patogen
penyebab penyakit layu secara in vitro
P = L0-L1 x 100%
L0
Perlakuan Kontrol
L0
L1
Persentase penyakit layu di sentra
produksi stroberi
No Daerah
Persentase
Penyakit
(%)
1 Desa Pancasari, Kecamatan
Sukasada, Kabupaten
Buleleng
90
2 Desa Candikuning,
Kecamatan Baturiti,
Kabupaten Tabanan
82
Gejala penyakit Layu
Stroberi di bawah
permukaan tanah
Gejala penyakit Layu
Stroberi di atas
permukaan tanah
Apakah Penyebabnya
Fusarium Ralstonia Verticillium
Penyakit Layu Pada Tanaman Stroberi
Fusarium oxysporum
Ralstonia solanacearum
Verticillium sp.
Perubahan warna pada bagian pucuk
menjadi cokelat kemerahan, yang
menyebabkan Kelayuan tanaman sehingga
tanaman akan mati secara cepat dan akar
tanaman mengalami pembusukan
Daun stroberi bagian luar dan tua terkulai
layu. Bercak coklat atau hitam kebiruan
pada stolon dan tangkai daun, Akar baru
yang tumbuh dari batang utama seringkali
kerdil dan menghitam.
Tanaman akan mengalami kelayuan akibat
tersumbatnya pembuluh xylem oleh jutaan
sel R. solanacearum, transportasi air dan
mineral dari tanah terhambat
Isolasi dan Identifikasi mikroba yang
berasosiasi dengan stroberi bergejala layu
A B
C D
3 HSI
7 HSI
Memiliki makrokonidia dan mikrokonidia. Makrokonidia
berbentuk tabung memanjang dengan bagian ujung yang
meruncing dan memiliki 3 – 5 sel,. Mikrokonidia berbentuk
lonjong dapat terdiri dari 1 sel atau 2 sel. Memiliki Fialid
Jamur yang berasosiasi dengan stroberi yang
menunjukkan gejala
Struktur patogen F.
oxysporum. menurut CMI.
(1979).
Cabang utama konidiofor yang
menghasilkan konidia disebut fialid.
Fialid berbentuk oval. mikrokonidia
kecil, uniseluler atau bi-seluler,
berbentuk bola atau oval. Ukuran
bervariasi dari 5 x 15μm x 2-4 μm.
Makrokonidia panjang, berbentuk
bulan sabit, runcing diujungnya
multi-septate (3-5 septa),
Uji patogenitas hasil isolasi patogen penyebab
penyakit layu stroberi
a b
(a) Tanaman bergejala penyakit layu di lapangan. (b) Tanaman kontrol yang
diinokulasikan air. (c) Tanaman bergejala yang diinokulasi patogen penyakit
layu.
a b
Hasil pengamatan mikroskopis jamur yang berasosiasi
dengan tanaman stroberi yang menunjukkan gejala layu.
(a) Makrokonidia dan
Mikrokonidia jamur dari hasil uji
patogenitas.
(b) Makrokonidia dan
mikrokonidia
yang diisolasi dari tanaman sakit
di lapangan.
Internal Transcribed Spacer
20
ITS1 : 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'
ITS4 : 3' TCCTCCGCTTATTGATATGC 5'
Polymerase Chain Reaction
Identifikasi secara molekuler
21
Visualisasi pita DNA jamur hasil amplifikasi
menggunakan pasangan primer ITS1 dan ITS4. M,
Penanda DNA 1 kb (Promega USA); 1, isolat jamur
yang diisolasi dari stroberi layu di Pancasari.
544 bp
M 1
No IsolatHomologi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1. PLSPs_01 ID 99% 90% 90% 85% 84% 91% 91% 91% 92% 90% 57%
2. DQ452448 99% ID 90% 91% 85% 84% 91% 92% 91% 93% 91% 57%
3. U61679 90% 90% ID 99% 83% 82% 89% 90% 85% 91% 86% 60%
4. U34580 90% 91% 99% ID 84% 83% 90% 91% 86% 91% 86% 59%
5. NR121457 85% 85% 83% 84% ID 96% 84% 85% 81% 90% 81% 52%
6. NR121203 84% 84% 82% 83% 96% ID 83% 83% 80% 86% 80% 53%
7. NR120263 91% 91% 89% 90% 84% 83% ID 99% 86% 88% 86% 56%
8. NR120262 91% 92% 90% 91% 85% 83% 99% ID 87% 88% 87% 56%
9. NR111142 91% 91% 85% 86% 81% 80% 86% 87% ID 88% 99% 58%
10. AY213655 92% 93% 91% 91% 90% 86% 88% 88% 88% ID 89% 57%
11. AY213654 90% 91% 86% 86% 81% 80% 86% 87% 99% 89% ID 58%
12. AB585937 57% 57% 60% 59% 52% 53% 56% 56% 58% 57% 58% ID
PLSPs01 = Jamur Pancasari; DQ452448 = F. oxysporum; U61679 = F. concolor; U34580 = F.
polyphialidicum; NR121457 = F. equiseti; NR121203 = F. boothii; R120263 = F. circinatum;
NR120262 = F. bactridioides; NR111142 =F. acutatum; AY213655 = F. chlamydosporum
AY213654 = F. annulatum; AB585937 = Verticillium dahlia var.longisporum
Tingkat kesamaan hasil sekuen Internal Transcribe Spacer
patogen penyebab penyakit layu dengan jamur lainnya
Hubungan kekerabatan 12 isolat jamur hasil analisis
Internal Transcribe Spacer dengan metode Parsimoni.
24
Hasil ini merupakan laporan pertama tentang
F. oxysporum sebagai patogen penyebab
penyakit layu pada stroberi di Bali
Hasil sekuen Internal Transcribed Spacer
(ITS) F. oxysporum merupakan laporan
pertama nukleotida dari Internal Transcribed
Spacer (ITS) patogen penyebab penyakit layu
stroberi di Indonesia.
25
Diawali perkecambahan konidia dan pembentukan tabung kecambah,
di zona akar rambut, menembus epidermis akar. Hyphae
mengkolonisasi sel epidermis dan korteks kemudian memasuki
pembuluh xilem, menyebar dan akhirnya menghalangi sistem
vaskular, menyebabkan tanaman layu .
Kelayuan disebabkan tidak hanya oleh akumulasi miselium di xilem
yang menyebabkan kekurangan air, tetapi juga oleh produksi toksin
dan respon pertahanan tanaman inang seperti tyloses.
Proses infeksi Fusarium dan gejala layu tanaman
No Isolat Persentase Hambatan Keterangan
1 PsA1 42% Rizosfir pisang Baturiti, Bakteri2 PsA2 39% Rizosfir pisang Baturiti, Bakteri3 StP1 48% Rizosfir Stroberi Pancasari, Jamur4 StP2 51% Rizosfir Stroberi Pancasari, Jamur5 StP3 25% Rizosfir Stroberi Pancasari, Jamur6 StP4 37% Rizosfir Stroberi Pancasari, Bakteri7 StP5 24% Rizosfir Stroberi Pancasari, Bakteri8 KrB1 48% Rizosfir Kebun Raya, Jamur9 KrB2 34% Rizosfir Kebun Raya, Jamur10 KrB3 60% Rizosfir Kebun Raya, Jamur11 KrB4 18% Rizosfir Kebun Raya, Jamur12 CkG1 86% Rizosfir Cengkeh, Gitgit, Jamur13 CkG2 40% Rizosfir Cengkeh, Gitgit, Jamur14 CkG3 38% Rizosfir Cengkeh, Gitgit, Jamur15 CkG4 35% Rizosfir Cengkeh, Gitgit, Jamur16 SpP1 52% Kotoran Sapi, Pancasari, Jamur17 SpP2 54% Kotoran Sapi, Pancasari, Jamur18 SpP3 42% Kotoran Sapi, Pancasari, Jamur19 SpP4 20% Kotoran Sapi, Pancasari, Jamur20 SpP5 28% Kotoran Sapi, Pancasari, Bakteri
Persentase hambatan kandidat mikroba antagonis dalam menekan
pertumbuhan F.oxysporum penyebab penyakit layu stroberi pada media PDA
Kandidat mikroba antagonis pada media
PDA tampak berwarna Hijau
Trichoderma pada media PDA tampak
koloni berwarna hijau menurut Gusnawaty,
2014
Warna koloni diawali dengan warna putih, kemudian putih kehijauan,
hijau muda, hijau dan hijau tua setelah berumur 7 hari.
Hasil pengamatan mikroskopis kandidat
mikroba antagonis terbaik penghambat
pertumbuhan Verticillium
bentuk spora serta fialid Trichoderma
menurut Gusnawaty, 2014
1
2
1
2
1. Konidiofor 1. Konidiofor
2. Fialid Fialid
konidia berbentuk semi bulat, konidiofor
bercabang seperti piramida, memiliki
fialid
konidiofor bercabang menyerupai
piramida.Fialid tampak langsing dan panjang,
konidia berbentuk semi bulat hingga oval.
isolat CkG1 , isolat yang diperoleh dari
rhizosfer tanaman cengkeh memiliki daya
hambat paling tinggi 86% pada 7 hsi.
dual kultur isolat kandidat mikroba
antagonis dengan patogen
penyebab penyakit layu. (a)
Fusarium (b) Trichoderma.
a bTrichoderma ampu menekan
perkembangan patogen : mikroparasit
dan menghasilkan beberapa senyawa
penghambat.
Trichoderma spp. juga menghasilkan
berbagai senyawa atau enzim yang
berfungsi untuk menghambat atau
memecah dinding sel patogen tanaman.
Trichoderma mempunyai kemampuan
untuk meningkatkan ketahanan tanaman
Kesimpulan
Berdasarkan hasil identifikasi morfologi dan molekuler penyebab
penyakit layu stroberi di Kawasan Bedugul adalah F. oxysporum.
Patogen ini menyebabkan penyakit layu pada stroberi di Desa
Pancasari, Kecamatan Sukasada, Kabupaten Buleleng dan
Desa Candikuning, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan
sebesar 90% dan 82% .
Trichoderma sp. CkG1 yang diisolasi dari tanaman cengkeh
mampu menekan pertumbuhan F. oxysporum penyebab penyakit
layu stroberi. Mekanisme penekanan Trichoderma sp. CkG1
terhadap F. oxysporum melalui sifat mikoparasitnya dan
kemampuannya untuk menghasilkan senyawa antijamur.
Saran
Penggunaan Trichoderma spp. sebagai agens hayati
bisa menjadi alternatif bagi petani untuk mengendalikan
penyakit layu pada tanaman stroberi yang disebabkan
oleh patogen dari golongan jamur Verticillium spp.
Dengan ditemukannya mikroba antagonis Trichoderma
sp. yang mampu menekan pertumbuhan F. oxysporum,
penyebab penyakit layu stroberi pada media PDA,
penelitian diharapkan dapat dilanjutkan untuk menguji
Trichoderma sp. untuk menekan penyakit stroberi di
lapang.