IDENTIFIKASI MOLEKULER HAMA LALAT BUAH PENDATANG …
Transcript of IDENTIFIKASI MOLEKULER HAMA LALAT BUAH PENDATANG …
IDENTIFIKASI MOLEKULER HAMA LALAT BUAH PENDATANG BARU BERDASARAKAN GEN MITOKONDRIAL CYTOCHROME
C OXIDASE SUBUNIT I (COI) DI BALI
I Putu Sudiarta, SP., M.Si, Ph.D (0007117904)
Dr. Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, SP., M.Agr. (0015016802)
Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P.( 0009106204)
Hibah Unggulan Udayana 2016
Latar Belakang
• hama tanaman hortikultura isu nasional & pembatas perdagangan (trade barrier)
• Lalat buah dengan tingkat invasif yang tinggi, kemampuan penyebaran yang efisien & kemampuan beradaptasi pada lingkungan tropis dan subtropik
• Identifikasi secara morfologi telah banyak dilakukan
• Namun ciri morfologinya sangat mirip? Keakuratan diragukan?
• Maka perlu dilakukan identifikasi secara molekuler
Identifikasi molekuler
Struktur Gen Internal Transcribed Spacer region ITS1 pada DNA inti
Sumber: Pathogenic Fungi Database http://www.pfdb.net/
DNA ribosomal (rDNA) adalah daerah penyandi genom untuk
komponen RNA ribosom. Pada eukariot deret rDNA terletak pada
nukleus/inti dan mitokondria. Daerah rDNA dipisahkan antara satu
dengan yang lainnya oleh suatu pembatas yang disebut spacer
Mitocondria Citochrome Oxidase I (MT-CO1)
• Gen Cytochrome c oxidase
subunit I (MT-CO1)
merupakan reprensentatif dari
semua gen penyandi protein
DNA mitokondria.
Tujuan penelitian
• Mengetahui karakteristik morfologi lalat buah
pendatang baru yang ditemukan di Pulau Bali.
• Mengetahui karakteristik molekuler lalat buah
pendatang baru dengan menggunakan Gen ITS1
dan MT-CO1.
• Mengetahui keragaman genetik lalat buah
pendatang baru yang ditemukan di Pulau Bali
berdasarkan gen ITS1 dan MT-CO1.
• Mengetahui hasil analisis filogenetik lalat buah
pendatang baru yang ditemukan di pulau Bali
berdasarkan ITS1 dan MT-CO1.
Metode Penelitian
• Pemasangan
perangkap
• Identifikasi
morfologi
• Identifikasi
molekuler
• Similarity/
alignment
• Pohon filogeni
Identifikasi morfologi
• bentuk spot pada muka, warna mesonotum, ada
tidaknya pita kuning di kedua sisi lateral dan
tengah toraks, warna, pola dan jumlah rambut
pada skutelum, pola pada pembuluh sayap (costa
band), bentuk dan pola abdomen, serta warna dan
spot pada tungkai
• Sebagai pustaka acuan digunakan buku yang
berjudul ”Fruit Flies of Indonesia : Their
Identification, Pest Status and Pest Menegement”
yang dikeluarkan oleh Griffith University, Brisbane,
Australia dan Kementerian Pertanian RI tahun
2008
Identifikasi Molekuler
Ekstraksi DNA dan PCR
• Ekstraksi DNA dari sampel lalat buah menggunakan QiagenDNeasy® (Qiagen, Hilden, Germany) Blood and Tissue kits.
• PCR menggunakan primer yang didesain dari Gen Mitocondrial cytochrome C Oxidase I (COI) Fruit Fly
• Gen ITS1 yaitu baITS1f 5’ GGA AGG ATC ATT ATT GTG TTC C 3’ dan baITS1r 5’ ATG AGC CGA GTG ATC CAC C 3’ (Plant Health Australia, 2011). 790 – 820 bp
• Primer MT-CO1 Fruit Fly MT-CO1-F (FFMT-CO1-F)5’-GGA GCA TTA ATY GGR GAY G-3’ dan HCO 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA ATC A-3’ (Plant Health Australia, 2011), 658bp
• Elektroforesis dan Sekuensing
Produk PCR 5 μl (ditambah 2 μl loading
dye) dielektroforesis dalam gel agarose
2%. Elektroforesis dilakukan selama 30
menit pada 100 Volt. DNA yang telah
dielektroforesis kemudian divisualisasi
dengan UV transluminator. Sekuensing
dilakukan di Universitas Islam Negeri
Sunan Kalijaga Yogyakarta untuk dilakukan
sekuen nukleotida.
– Analisis Sekuen
Hasil sekuen dianalisis untuk membuat allignment kemudian digunakan untuk mengetahui tingkat homologi atau kesejajaran dengan sekuen gen B. bryoniae yang telah dipublikasikan di GeneBank dengan Program Basic Local Alignment Tool (BLAST) (NCBI 2014).
– Tingkat similaritas sekuen dari Bali, papua dan maluku dianalisis dengan menggunakan program ClustalW
– Analisis Filogenetik
Data sekuen nukleotida kemudian dilanjutkan dengan analisis filogenetika menggunakan software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 5.05).
Hasil dan pembahasan
B. cucurbitae B. calumniata B. carambolae B. papayae
B. umbrosa B. albistrigata B. tau B. caudata
Identifikasi morfologi
• new exotic species of fruit fly in Bali B.
bryoniae
caput: spot pada wajah
berbentuk bulat tak beraturan
skutum berwarna hitam,
Scutellum berwarna kuning
Sayap dengan costal band
yang sangat tebal confluent
Microtrichia hanya menutupi setengah
bagian sudut second costal cell
(a,b) Caput : spot pada wajah
berbentuk oval agak besar,
(c,d) Skutum hitam kecuali
bagian posterior dan sekitar
prescutelar setae berwana
coklat kemerahan, pada
skutum terdapat strip kuning
pada kedua sisi lateral dan
pada bagian tengah tidak ada
strip kuning, (e,f) costal band
overlapping R2+3 dan
dengan jelas melebar di
bagian apeks sayap, cubital
streak yang meruncing (g,h)
Abdomen terga III – V
dengan band yang melintang
dan melebar dibagian lateral,
ceromae berwarna coklat-
orange terang.
Identifikasi molekuler
• Hasil PCR ITS-1
820 bp
M BbryITS BbryITS
1000bp
500 bp
Pohon filogeni
B. carambolae Malaysia
B. fuscitibia Indonesia
B. endiandra Australia
B. tryoni
B. invadens
BbryBaliITS
Ceratitis capitata
78
100
100
52
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
Pohon Filogeni B. bryoniae asal Bali dibandingkan dengan beberapa Bactrocera yang berasal
dari negara lain berdasarkan gen ITS1. Nomor aksesi B. endiandra Australia AF297564, B.
tryoni AF121159, B. carambolae Malaysia AF297560, B. fuscitibia Indonesia AF297565, B.
invadens KM453398 dan Ceratitis capitata ALD83767 sebagai pembanding luar spesies.
Pohon filogeni dikonstruksi menggunakan perangkat MEGA versi 6.06 (Algoritma UPGMA
dengan 1000 bootstrap method Replications).
Analisis filogenetik B. bryoniae berdasarnya gen ITS1 menunjukkan bahwa B.bryoniae berada
pada kelompok tersendiri berbeda kelompok dengan spesies B. endiandrae Australia, B.
tryoni, B. carambolae, B. fuscitibia, dan B. invadens. B.bryoniae berada pada kelompok yang
berbeda dengan lima spesies Bactrocera tersebut.
• Hasil PCR MT-OC-1
500bp
M K - K + Bryoni Bali
658 bp
Hasil pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa sekuen asam nukleat gen
MT-CO1 B. bryoniae Bali menunjukkan homologi (98,4%) dengan sekuen B,
bryoniae yang berasal dari Australia VAITC0073 dan Bbry76 sebesar 95,8%,
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
170 180 190 200
BbryCO1BALI ACTACCTCCT TCCCTTACTC TATTATTAGT GAGAAGTATA
JQ671139 Bbry76 Au ACTACCTCCT TCCCTTACAC TATTATTAGT GAGAAGTATA
JQ420911VAITC0073 Au ACTACCTCCT TCCCTTACAC TATTATTAGT GAGAAGTATA
Clustal Consensus ********** ******** * ********** **********
....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240
BbryCO1BALI GTAGAAAATG GATCTGGTAC AGGTTGAACA GTTTACGCAC
JQ671139 Bbry76 Au GTAGAAAATG GAGCTGGTAC AGGTTGAACA GTTTACCCAC
JQ420911VAITC0073 Au GTAGAAAATG GAGCTGGTAC AGGTTGAACA GTTTACCCAC
Clustal Consensus ********** ** ******* ********** ****** ***
Perbandingan sekuen asam nukleat gen MT-CO1
spesies B. bryoniae Bali dan Australia.
KF659792 Bactrocera tryoni isolate 5 CHINA
KF659789 Bactrocera tryoni isolate 2 CHINA
JQ692673 Bactrocera kandiensis KENYA
KF659840 Bactrocera wuzhishana isolate 6 CHINA
BbryCOIBALI
JQ420911 Bactrocera bryoniae voucher VAITC0073 AUSTRALIA
JQ671139 Bactrocera bryoniae voucher Bbry76 AUSTRALIA
ALD83767 Ceratitis capitata
100
55
100
97
79
0.0 0.2 0.4 0.6
B. bryoniae asal Bali berada pada
kelompok monofiletik bersama dengan B.
bryoniae dari negara Australia dengan nilai
bootstrap 100
• B. Occipitalis
(berdasarkan
CO-1)
• On going
research
Kesimpulan
• Berdasarkan karakteristik morfologi
dan analisis Gen MT-CO1, B.
bryoniae Bali memiliki similaritas yang
tinggi dengan dua spesies B. bryoniae
asal Australia yaitu dengan JQ420911
VAITC0073 (98,4%) dan JQ671139
Bbry76 (95,8%).