Identificación y medición de la respuesta inmune PRUEBAS SECUNDARIAS.
IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE
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IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNEDE LA RESPUESTA INMUNE
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RESPUESTA INMUNE HUMORAL
SEROLOGÍAsuero estudio
“Ciencia de la detección de anticuerpos”
Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines diagnósticos, a partir del suero de un animal.
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Sensibilidad
Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos”
(VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”.
Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA
Especificidad
Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos”
(VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”.
Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING
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Negativo Negativo verdaderoverdadero
Falso negativoFalso negativo--
Falso positivoFalso positivoPositivo Positivo verdaderoverdadero++
SANOSANOENFERMOENFERMO
AnimalPr
ueba
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1. PRIMARIAS
2. SECUNDARIAS
3. TERCIARIAS
Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado
Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in vitro
Miden las consecuencias o el efecto protector de anticuerpos en el animal (in vivo)
CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL
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0200400600800
10001200140016001800
0 30 60 90120 150 180 210 240 270 300 330 360
Post-infecciónPost-infección NaturalNatural
Post- VacunaciónPost- Vacunación B. abortus B. abortus cepa 19cepa 19
Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus
Ig MIg M
Ig GIg G
0200400600800
10001200140016001800
Ig M
Ig GIg G
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Respuesta inmune humoral Brucella abortus
Isotipo Cantidad Presencia Características
IgM Abundante Temporaria Inespecífica ? IgG1 Abundante Continua Específica
IgG2 Escasa Discontinua EspecíficaIgA Abundante Discontinua Específica
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APLICACIONES EN R. A. BRUCELOSIS BOVINA
Resolución 438/2006 del SENASA.
Prueba
TAMIZ BPA – ELISA I
COMPLEMENTARIAS SAT + 2-ME – FPA ELISA C
DEFINITORIA FC
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
PAL - ELISA I
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Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a
través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del
sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.
ENZIMAS UTILIZADAS
• PEROXIDASA
• Fosfatasa alcalina
SUSTRATO
• ortofenildiamina
• paranitrofenilfosfato
ELISA
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS
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Tipos de pruebas
INDIRECTA COMPETICIÓNSANDWICH
detección de ANTICUERPO
detección de ANTÍGENO
detección de ANTICUERPO
ELISA
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ELISA INDIRECTO
ANTÍGENO adsorbido (reactivo)
Suero PROBLEMA
ANTIGLOBULINA marcada con
ENZIMA (reactivo)SUSTRATO de la enzima (reactivo)
CAMBIO DE COLOR
Lavado
Detección de ANTICUERPOS
Lavado Lavado
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NNEEGGAATTIIVVOO
PPOOSSIITTIIVVOO
Antígeno Suero
ProblemaAc
monoclonalConj. con
enzima peroxidasa
Sustrato cromógeno
COLOR
Y Y Y Y
AUSENCIA DE COLOR
ELISA COMPETICIÓN
Lavado Lavado Lavado Lavado
Lavado Lavado Lavado Lavado
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ELIS
AVENTAJAS
Alta sensibilidad y especificidad Rápido Reactivos estables Resultado visual
DESVENTAJAS
Costo microplacas Costo equipo automatización
Brucelosis IBR BVD Peste porcina Aujesky Newcastle
BiaLeucemia felinaSalmonellaAftosaEstreptococosTBC
Babesia Trichinella Toxoplasma Toxocara Hormonas Micotoxinas
Cuantificación de inmunoglobulinas
APLICACIONES EN VETERINARIA
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PRUEBAS SECUNDARIAS
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SOLUBLE
PARTICULADO
SUPERFICIE + COMPLEMENTO
PRECIPITACIÓN
AGLUTINACIÓN
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
La prueba a realizar depende de las
características del Ag
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Comparación precipitación - aglutinación
Antígeno SOLUBLE
Antígeno PARTICULADO
Y
YYY
Y
YFormación de “retículo” “Amontonamiento”
Y
YY Y
PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN
Anticuerpo
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AGLUTINACIÓN
Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo:
bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une
por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión
agruma, produciendo una reacción de aglutinación.
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Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con
respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de
tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión
de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de
dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la
aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de
sueros muy positivos.
FENÓMENO DE ZONA O PROZONA
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Antígeno particulado (reactivo)
+YYYY Y
Suero problema
Proporción
Medio
YY
Y
YYAGLUTINACIÓN
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AGLUTINACIÓN
En PLACA En TUBO
BrucellaSalmonella Micoplasma
BPA
Brucella
SAT+2-ME PAL
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Aglutinación en placa: BPA
1. Suero problema 2. Antígeno específico (reactivo)
Aglutinoscopio + placa de vidrio
Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado
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3. Mezclar
8 MINUTOS
LECTURA E INTERPRETACIÓN
Con GRUMOS Sin GRUMOS
AGLUTINACIÓN POSITIVA Negativa
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Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME
SAT (Seroaglutinación en Tubo)
Ig M Ig G
2- ME (2- Mercaptoetanol)
+ Se realizan en simultáneo
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En TUBO: SAT + 2- ME
SUERO BPA (+)
1. Suero problema
Título
SAT
2-ME
37ºC-48 hs
2. Solución fisiológica fenicada (SFF)
2. Solución 2-ME
3. Antígeno
60 MINUTOS
1/25 1/50 1/100 1/200
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LECTURA e INTERPRETACIÓN
37ºC-48 hs
POSITIVA INCOMPLETA NEGATIVA
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FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento
por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen
complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se
une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene
hemólisis.
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FIJACIÓN DE COMPLEMENTO2 sistemas
Sistema de PRUEBA Sistema INDICADOR
• Suero problema
• Antígeno específico
• Complemento
• Eritrocitos
• Hemolisina (Ac. anti eritrocitos)
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FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
CEritrocitos
Ac antieritrocitos
Y
YY YAntígeno
Suero problema Complemento
Suero problema
-
SIN HEMÓLISIS
POSITIVO
Con HEMÓLISIS
Negativo
Y
C
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APLICACIONES EN VETERINARIA
BRUCELOSIS IBR DVB AFTOSA MOQUILLO CANINO TOXOPLASMOSIS
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POLARIZACIÓN FLUORESCENTE POLARIZACIÓN FLUORESCENTE (FPA)(FPA)
Fundamento:Fundamento:Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo, Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo,
enfrentando el suero de un animal enfermo de enfrentando el suero de un animal enfermo de brucelosis con una fracción de del antígeno de brucelosis con una fracción de del antígeno de bruecella (cadena O), este complejo forma una masa bruecella (cadena O), este complejo forma una masa grande que en suspensión gira mas lentamente . grande que en suspensión gira mas lentamente . Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados de despolarización en función de su velocidad de de despolarización en función de su velocidad de rotación.rotación.
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Aglutinación en tubo: PAL
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE
Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra
un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno
particulado coloreado, ambos se unirán, formando un
complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y
asciende con la nata
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1. Leche problema
2. Antígeno (reactivo)
37ºC-1 hora
LECTURA e INTERPRETACIÓN
+ ++ +++ ++++
PAL
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DESCANSO
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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
PRUEBAS MOLECULARESPRUEBAS MOLECULARES
HIBRIDOMA
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Multiplicación de una secuencia de ADN
específica y conservada de la especie a
identificar, que puede ser visualizada y
cuantificada
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NUCLÉOTIDONUCLÉOTIDO
FosfatoBase nitrogenada
Azúcar
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CADENA DE AZÚCAR Y FOSFATO
AZÚCAR
FOSFATO
BASE
ADN
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ADNADN
OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)
A T
G C NUCLEÓTIDOS
POLIMERASA
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Primers
Primers
Polimerasa
Polimerasa
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100
90
80
70
60
50
40
30
20Detección
35 ciclos
ADN
Primers
Polimerasa
dNTP
Desnaturalización 94º C
1 min
Extensión 72º C
1 min
Hibridación 56º C
1 min
![Page 41: IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062521/5681566b550346895dc41ef6/html5/thumbnails/41.jpg)
Producto de PCR para identificar Brucella spp en muestras de leche
![Page 42: IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062521/5681566b550346895dc41ef6/html5/thumbnails/42.jpg)
Producto de PCR para caracterizar cepas de Brucella abortus en muestras de leche
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ID 111733586111316817218924225514871511571792282601380124
PCRB. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.B. abortus silv.
B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51B. abortus silv – RB51
B. abortus RB51
Cultivo-------------+-----
FC ++++++++++++++++++-
ELISA-C ++++++++++++++++++-
ELISA-I ++++++++++++++++++-
37 % con B. abortus silvestre se infectó con RB51 0,8 % de las sanas se infectó con B. abortus RB51
(p<0,0001)
n=223
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Tipos de Tipos de PCRPCR CON PRIMERS ANIDADOSCON PRIMERS ANIDADOS
ASIMÉTRICAASIMÉTRICA
INVERSAINVERSA
MULTIPLEXMULTIPLEX
NESTEDNESTED
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VENTAJASVENTAJAS
FIDELIDADFIDELIDAD
SENSIBILIDADSENSIBILIDAD
ESPECIFICIDADESPECIFICIDAD
AUTOMATIZACIÓNAUTOMATIZACIÓN
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APLICACIONESAPLICACIONES
Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)
Enfermedades hereditariasEnfermedades hereditarias
Enfermedades autoinmunesEnfermedades autoinmunes
OncologÍaOncologÍa
Medicina forenseMedicina forense
ArqueologíaArqueología
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HIBRIDOMA
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M
MMM
M M
MM
M
MMM
M M
MM
Selección in vitro en el medio HAT
M
MMM
M M
MM
M
MMM
M M
MM
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