На правах рукописи

Овчинникова Алёна Сергеевна

Мышь аутбредной популяции ICR – лабораторная модель для

оценки эффективности препаратов против оспы обезьян

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Кольцово – 2016

2

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки (ФБУН)

«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный руководитель: Сергеев Артемий Александрович, кандидат медицин-

ских наук

Официальные оппоненты: Борисевич Сергей Владимирович, доктор биологиче-

ских наук, профессор, начальник Федерального государ-

ственного бюджетного учреждения «48 Центральный

научно-исследовательский институт» Министерства

обороны Российской Федерации;

Контаров Николай Александрович, кандидат биоло-

гических наук, ведущий научный сотрудник лаборато-

рии детских вирусных инфекций Федерального государ-

ственного бюджетного научного учреждения «Научно-

исследовательский институт вакцин и сывороток им.

И.И. Мечникова».

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Сибирский федеральный научный центр агробио-

технологий Российской академии наук Федерального

агентства научных организаций России.

Защита состоится «24» ноября 2016 г. в 1400

часов на заседании диссертационного сове-

та Д 001.035.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении

«Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» по ад-

ресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный переулок, д.5 А. С диссертацией можно озна-

комиться в библиотеке и на сайте Научно-исследовательского института вакцин и сыво-

роток им. И.И. Мечникова http://www.instmech.ru

.

Автореферат разослан «__» ____________ 2016 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук Яковлева Ирина Владимировна

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Прошло уже около 60 лет с тех пор как был

открыт возбудитель особо опасной зооантропонозной вирусной инфекции у людей: ви-

рус оспы обезьян (ВОО), который относится к тому же роду Orthopoxvirus (семейство

Poxviridae), что и возбудитель натуральной оспы, и обладает высокой летальной актив-

ностью для людей (до 17%) (Jezek et al., 1987; Gispen, 1975; Di Giulio et al., 2004). Тем не

менее, по настоящее время в мире не существует разрешенных к применению лечебно-

профилактических химиопрепаратов против ортопоксвирусных заболеваний, включая и

оспу обезьян (Magee et al., 2008; Grosenbach et al., 2011). В то же время по сравнению с

20-м веком масштабность и частота возникновения вспышек оспы обезьян среди людей

в 21-м веке значительно выросла (Борисевич и др., 2012; Levine et al., 2007; Rimoin et al.,

2010), что, вероятно, связано со снижением у них напряженности иммунитета и величи-

ны иммунной прослойки к возбудителю этого заболевания из-за прекратившейся более

30 лет тому назад вакцинации людей от натуральной оспы (Jezek et al., 1986; Cohen,

1997).

Одним из препятствий быстрому прогрессу в разработке медицинских средств

защиты от оспы обезьян является отсутствие дешевых модельных биосистем на основе

аутбредных иммунокомпетентных мышей для массового скрининга противооспенной

активности препаратов (Americo et al., 2010; Hutson et al., 2010; Stabenow et al., 2010),

что делает актуальной проблему разработки такой лабораторной модели.

Степень разработанности. До настоящего времени при поиске модельных видов

животных для оспы обезьян с целью оценки защитной эффективности разрабатываемых

препаратов ученые ориентировались только на воспроизведение внешних признаков

этого заболевания человека. Тем не менее, подобранные для этой цели мыши из числа

инбредных иммунодефицитных линий CAST/EiJ и C57BL/6 stat1-/- (Americo et al., 2010;

Hutson et al., 2010; Stabenow et al., 2010) не моделировали основную клиническую кар-

тину оспоподобного заболевания (отсутствие сыпи и лимфаденита), и их использование

было сопряжено с рядом других проблем, связанных с относительно высокой стоимо-

стью и неадекватным отражением состояния человеческой популяции:

- могут лишь частично воспроизводить инфекционный процесс у людей с подав-

ленной иммунной системой, процент которых во время эпидемических вспышек оспы

обезьян, видимо, не очень значителен;

- вряд ли могут быть применены для оценки защитной эффективности препара-

тов, в основе действия которых лежит механизм влияния на иммунную систему;

- относительно дорогие и не имеют выраженного генетического разнообразия, то-

гда как человеческая популяция, по существу, является аутбредной (межсемейное, меж-

национальное и межрасовое скрещивание).

В то же время существует другой подход по поиску лабораторной модели для

оценки защитной эффективности противовирусных препаратов, сориентированный на

воспроизведение не внешней клинической симптоматики вирусного заболевания у че-

ловека, а инфекционного процесса в первичных и вторичных органах и клетках-

мишенях (Сергеев и др., 2013).

Цель и задачи. Основываясь на вышеупомянутом подходе, целью нашего иссле-

дования явилось изучение возможности использования иммунокомпетентной мыши

аутбредной популяции ICR в лабораторной модели для оценки эффективности препара-

тов против оспы обезьян.

Чтобы достичь данной цели, надо было решить следующие задачи:

4

1) оценить чувствительность первичных клеток-мишеней животных и человека к

патогенным ортопоксвирусам;

2) изучить чувствительность мышей к ВОО в экспериментах по их интраназаль-

ному (и/н) заражению;

3) сделать прогнозную оценку чувствительности к патогенным ортопоксвирусам

животных и человека, используя данные по заражению их первичных клеток-мишеней и

животных;

4) изучить динамику распространения ВОО в организме и/н зараженных мышей;

5) исследовать патоморфологические изменения в организме мышей, и/н инфици-

рованных ВОО;

6) оценить возможность использования мыши в лабораторной модели для оспы

обезьян;

7) провести испытание лабораторной модели для оспы обезьян и определить пре-

делы практического её использования.

Научная новизна работы:

- определена чувствительность при и/н заражении мышей аутбредной популяции

ICR к ВОО (центральноафриканский штамм V79-1-005) по показателю 50%-й инфици-

рующей дозы (ID50), оцененному по наличию инфекционного процесса в легких; на ос-

нове данных по чувствительности первичных клеток животных определены прогнозные

величины ID50 для ВОО в отношении мышей и сурков, а также для вируса натуральной

оспы (ВНО) (штамм Ind-3a) в отношении мышей аутбредной популяции ICR; используя

результаты опытов in vitro, выполненных на первичных человеческих моноцитах-

макрофагах крови, оценена прогнозная величина ID50 ВНО для людей;

- представлен патогенез оспы обезьян у и/н зараженных ВОО (центральноафри-

канский штамм V79-1-005) аутбредных мышей популяции ICR с учетом динамики

накопления патогена в организме этих животных (выявленные первичные и вторичные

органы-мишени для вируса), гистологических изменений и идентифицированных типов

клеток-мишеней;

- с использованием разработанной лабораторной модели «мышь аутбредной по-

пуляции ICR – центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО» представлены данные

по оценке защитной активности некоторых химиопрепаратов (НИОХ-14, НИОХ-32 и

ST-246).

Теоретическая и практическая значимость работы:

1) с использованием разработанной нами лабораторной модели «мышь аутбред-

ной популяции ICR - центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО» было успешно

проведено доклиническое исследование российского противооспенного химически син-

тезированного соединения НИОХ-14, что открывает перспективу его дальнейшего про-

движения в направлении клинических исследований;

2) разработанная нами лабораторная модель «мышь аутбредной популяции ICR –

центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО», а также соответствующие методиче-

ские рекомендации по ее использованию (МР 4.2.001-16 Федерального бюджетного

учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор» - ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») могут быть применены для оценки защитной эф-

фективности других препаратов от оспы обезьян;

3) при работе с мышами, первичными культурами клеток животных и человека с

использованием ВОО и ВНО по настоящее время применяются в ФБУН ГНЦ ВБ «Век-

тор» методы, описанные в разработанной нами инструкции № 1/02;

5

4) ранее известная методология прогнозного определения величины ID50 вируса,

основанная на использовании первичных клеточных культур человека и животных и

продемонстрировавшая адекватность результатов при ее применении тем, которые были

получены в прямых экспериментах на животных, может быть взята для оценки чувстви-

тельности того или иного макроорганизма к исследуемым патогенным ортопоксвиру-

сам.

Методология и методы исследования. С целью проверки применимости вы-

бранного вида модельного животного для оспы обезьян в работе использовали методо-

логию оценки показателей инфицирования этого вида животных ВОО через респира-

торный тракт в сравнении с таковыми у человека (или известных видов модельных жи-

вотных), основанную на изучении у них инфекционного процесса. Для изучения чув-

ствительности первичных клеток-мишеней людей и подопытных животных к патоген-

ным ортопоксвирусам (CID50) применяли ранее разработанный нами подход получения

таких клеток из органов и тканей и поддержания их в жизнеспособном состоянии необ-

ходимое время в экспериментах in vitro. В ряде случаев в работе была использована ме-

тодология прогнозной оценки величин ID50 ВОО и ВНО для животных и людей, осно-

ванная на применении для этих вирусов CID50, полученных на соответствующих пер-

вичных клетках. В исследованиях также были применены традиционные вирусологиче-

ские, культуральные, гистологические, электронно-микроскопические и серологические

методы исследований.

Положения, выносимые на защиту: 1) значение чувствительности мышей аутбредной популяции ICR к центрально-

африканскому штамму V79-1-005 ВОО (ID50), оцененной с учетом регистрации вируса в

легких через 7 сут после и/н заражения, составляет 2,4 (2,0…2,8) lg БОЕ;

2) мыши аутбредной популяции ICR при и/н заражении 25 ID50 центральноафри-

канского штамма V79-1-005 ВОО имеют генерализованную бессимптомную инфекцию,

вызывающую воспалительно-некротические изменения, ограниченные в основном ре-

спираторными органами, при этом ведущий механизм диссеминации патогена в орга-

низме этих животных – гематогенный с его размножением в клетках крови и/или крове-

носной системы;

3) у мышей аутбредной популяции ICR, и/н инфицированных ВОО (центрально-

африканский штамм V79-1-005), происходит его размножение в первичных клетках-

мишенях для этого патогена (в макрофагах и эпителиоцитах респираторных органов), а

также в некоторых других типах клеток (эндотелиоцитах, фибробластах, плазмоцитах и

ретикулярных клетках);

4) мыши аутбредной популяции ICR могут представляться в лабораторной модели

для оспы обезьян с целью оценки защитной эффективности препаратов.

Степень достоверности и апробация результатов. Статистическую обработку и

сравнение экспериментальных данных проводили стандартными методами с помощью

пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984-2001). Результаты

этой работы были доложены на 6 российских и международных научных форумах,

опубликованы в 5 печатных работах, включая 2 зарубежные.

Личный вклад соискателя: в экспериментальной оценке в опытах in vitro чувстви-

тельности мышей и сурков к ВОО, а также чувствительности сурков, мышей, цыплят и

человека к ВНО; в изучении чувствительности мышей к ВОО в экспериментах по их и/н

заражению; в изучении динамики распространения ВОО в организме инфицированных

мышей (при участии заведующего лабораторией коллекции вируса натуральной оспы и

ортопоксвирусов, кандидата медицинских наук Сергеева Ар.А.); в изучении патоморфо-

6

логических изменений в организме мышей, инфицированных вирусом (при участии за-

ведующего отделом микроскопических исследований Таранова О.С.); в проведении

оценки возможности использования мыши аутбредной популяции ICR в качестве мо-

дельного для оспы обезьян вида животных на основе имеющихся теоретических и экс-

периментальных данных; в проведении оценки эффективности противооспенных препа-

ратов на мышах (при участии научного сотрудника отдела «Коллекция микроорганиз-

мов», кандидата медицинских наук Сергеева Ал.А.).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машино-

писного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты

и их обсуждение, заключение, список сокращений и условных обозначений, список ли-

тературы и список иллюстративного материала. Диссертация иллюстрирована 17 табли-

цами и 12 рисунками. Список литературы включает 196 источников, в том числе 156 за-

рубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Литературный обзор

В диссертационной работе приведена информация из научных источников, каса-

ющаяся лабораторных животные, используемых при оценке эффективности препаратов

от оспы обезьян. Было обращено внимание на чувствительность к ВОО этих животных

и человека, в том числе их первичных клеток; на диссеминацию этого патогена в их ор-

ганизме; на изменения в их органах и тканях, а также на оценку эффективности препа-

ратов против оспы обезьян с использованием лабораторных видов модельных живот-

ных. Сделано заключение, мотивирующее необходимость проведения исследований по

разработке лабораторной модели для оспы обезьян.

2 Материалы и методы

Эксперименты с ВОО и ВНО были выполнены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» в

максимально изолированной лаборатории (BSL-4 по зарубежной классификации) с

применением изолирующих пневмокостюмов.

Вирусы. В работе использовали центральноафриканский штамм V79-1-005 ВОО

и штамм Ind-3a ВНО, полученные из Государственной коллекции возбудителей

вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Наработку вирусов

проводили в культуре клеток Vero с использованием среды DMEM (ООО «БиолоТ»,

Россия). На основе данных штаммов были приготовлены суспензии препаратов ВОО и

ВНО с концентрациями 7,1 (7,0…7,2) и 6,7 (6,6…6,8) lg БОЕ/мл соответственно.

Лабораторные животные. Для исследований было взято около 250 мышей

аутбредной популяции ICR обоего пола, массой 8…10 г (10…14-дневные), полученных

из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»; 5 разнополых 5…7-дневных цыплят

генетической линии Род-Айленд и кросса Хайсекс вайт, полученных из филиала ЗАО

«Ново-Барышевская птицефабрика» Новосибирской обл., а также 2 разнополых 1…2-

летних сурка породы Байбак (Marmota bobak), массой 3000…4000 г, полученных из

Пушкинского питомника Московской области. Все манипуляции с животными

проводили в соответствии с протоколом № 1-01.2014, утвержденным биоэтическим

комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» 28 января 2014 г.

Методы приготовления первичных культур клеток человека и подопытных

животных. При приготовлении первичных культур клеток для исследований с ВНО

7

была использована кровь от семи добровольцев, четверо из которых были вакцинирова-

ны против натуральной оспы 1…7 лет тому назад. Процедуру взятия венозной крови у

добровольцев осуществляли в соответствии с протоколом №3 от 02.12.13, утвержден-

ным этической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Путем центрифугирования в гради-

енте плотности фиколл-верографина 1,077 г/мл из крови получали мононуклеары (Ко-

вальчук и др., 2010), из которых готовили при культивировании в 24-луночных пласти-

ковых планшетах в атмосфере, содержащей 5% СО2, при температуре 37 0С в течение 24

часов монослой моноцитов-макрофагов. Концентрация таких клеток составляла 9,0

(7,5…10,5) × 105 кл./лунку. По данным световой микроскопии моноциты-макрофаги в

монослое сохраняли свою жизнеспособность длительное время (7 сут) в процессе инку-

бирования при 34,5 0С: через 3 сут- ~95 %, а через 7 сут ~83 %.

При получении монослоя селезеночных макрофагов для исследований с ВНО у

мышей брали селезенку, клетки которой дезинтегрировали в пробирке с помощью

стеклянного пестика и отмывали питательной средой RPMI-1640.Из приготовленной на

основе ростовой питательной среды клеточной суспензии получали путем

культивирования в 24-луночных пластиковых планшетах в атмосфере, содержащей 5%

СО2, при температуре 37 0С в течение 24 часов монослой макрофагов. Количество

селезеночных макрофагов в лунке составляло 9,0 (7,5…10,5)×105. По данным световой

микроскопии, эти клетки в монослое сохраняли свою жизнеспособность длительное

время (7 сут) в процессе инкубирования при 34,5 0С: через 3 сут -~98 %, а через 7 сут -

~87 %.

Суспензию клеток легких получали из легочной ткани мышей, сурков и цыплят

ранее описанным методом (Сергеев А.А., 2008) для исследований с ВНО и ВОО. При

этом в каждой пробирке находилось 5,0 (4,0…6,0)×105 клеток в 0,9 мл суспензии. По

данным световой микроскопии, клеточные суспензии легких этих видов животных

содержали различные типы живых клеток легких животных: макрофаги 12,4

(9,0…15,8)%; эпителиоциты: альвеолоциты 1-го порядка 8,6 (7,5…9,7)%, альвеолоциты

2-го порядка 1,0 (0,1…1,9) %; реснитчатые клетки 2,1 (0,5…3,7)%. Приблизительно 70%

оставшихся клеток в суспензиях были представлены лимфоцитами (60…65%) и

нейтрофилами (5 – 10%). Жизнеспособность суспензии клеток легких животных в

процессе инкубирования при 34,5 и 37,0 0С через 1 сут составила ~80 %, через 2 сут –

~50 % и через 3 сут – ~30 %.

Учитывая то, что в процессе культивирования вируса в клеточных культурах

может происходить два процесса как его накопления, так и убыли, обусловленной

термоинактивацией и возможным нейтрализующим воздействием клеточных мембран

(непродуктивная адсорбция вируса), в качестве отрицательного контроля использовали

клеточный дебрис, полученный путем 3-кратного замораживания-оттаивания культур

клеток с последующей проверкой на отсутствие жизнеспособных клеток с помощью

световой микроскопии и путем посева на культуральный планшет.

Методы инфицирования мышей вирусом и подготовки биоматериалов от

них. Во всех случаях заражение мышей осуществляли и/н способом, вводя вирусную

жидкость в объеме 0,03 мл суммарно в обе ноздри. В ряде случаев у мышей через 1…10

сут п.з. ВОО брали те или иные органа и ткани: кровь для последующего получения из

нее сыворотки и сгустка, а также легкие, трахею, носовую перегородку со слизистой,

бифуркационные лимфоузлы, головной мозг, селезенку, печень, почки, поджелудочную

железу и двенадцатиперстную кишку. Из этих органов и тканей, включая сгусток крови,

от каждого животного по отдельности, используя по 3…6 мышей на каждую временную

точку, готовили 10%-е гомогенаты методом механического растирания пестиком в

8

ступке с речным песком для вирусологического исследования. В некоторых случаях

параллельно проводили отбор органов и тканей (клетки крови, легкие, трахея,

бифуркационные лимфоузлы, носовая перегородка со слизистой, печень, селезенка,

головной мозг, почки, надпочечники, поджелудочная железа, двенадцатиперстная

кишка, брыжеечные лимфоузлы и кусочки кожи) от 4 мышей на каждую временную

точку для изучения патоморфологических изменений.

Методы инфицирования первичных клеточных культур вирусами и

подготовки проб. Приготовленные первичные клеточные культуры, инфицировали

ВОО или ВНО в той или иной дозе (0,00001; 0,003 или 0,017 БОЕ/кл.), вводя по 0,1 мл

вируссодержащего материала в лунки культуральных планшет или пробирки. В каждой

временной точке через 1…168 часов п.з. отбирали пробы по отдельности из 4…6 лунок

или пробирок после 3-кратной заморозки-оттайки для определения наличия вируса или

его биологической концентрации.. Для электронно-микроскопического исследования

инфицированные ВНО монослои моноцитов-макрофагов крови человека и

селезеночных макрофагов мышей отмывали, снимали резиновым полисменом и

готовили образцы.

Методы определения 50%-х инфицирующих доз вируса на мышах и

первичных клеточных культурах подопытных животных и человека. Через 7 сут

после и/н заражения мышей разными дозами ВОО (по 6 особей на разведение)

оценивали у каждой из них наличие вируса в легких с последующим расчетом ID50.

Через 3, 6 или 7 сут п.з. первичных культур клеток подопытных животных и человека

разными дозами ВОО или ВНО, используя по 6 лунок или пробирок на разведение,

оценивали в каждой из них наличие вируса с последующим расчетом 50 %-й

инфицирующей дозы вируса для клеточной культуры (CID50).

Химически синтезированные соединения. В исследованиях были использованы

химические соединения, синтезированные в Новосибирском институте органической

химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН: 7-[N`-(4-Трифторметилбензоил)-

гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.02,4]нон-8-ен-6-карбоновая кислота (НИОХ-14),

ранее проявившее противовирусную активность в опытах in vitro в отношении

ортопоксвирусов (Селиванов и др., 2011); ST-246 (4-трифторметил-N-

(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a-октагидро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп[f]изоиндол-2(1H)-ил)-

бензамид) с установленной высокой противооспенной активностью; НИОХ-32 (Гидрат

N-{3,5-диоксо-4-азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10]додец-11-ен-4-ил}-2-

гидроксибензамида) со слабым антипоксвирусным действием (Selivanov et al., 2011).

Все лабораторные образцы химиопрепаратов были охарактеризованы и

паспортизованы и их подлинность была подтверждена инфракрасной спектроскопией,

результатами элементного анализа и спектрами ядерного магнитного резонанса.

Метод вирусологического анализа проб. Титры вирусов (ВОО или ВНО) в

биоматериалах определяли стандартным для поксвирусов методом негативных колоний

на культуре клеток Vero (Leparc-Goffart et al., 2005).

Методы патоморфологических исследований. Для световой микроскопии об-

разцы органов и тканей мышей фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида, го-

товили парафиновые срезы и окрашивали гематоксилином и эозином Для электронно-

микроскопического исследования образцов применялась дополнительная фиксация 1 %-

м раствором осмиевой кислоты, ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и

цитратом свинца. Микроскопические исследования и микрофотосъемку проводили с

использованием светооптического микроскопа Imager Z1 (Zeiss, Германия) и электрон-

ного микроскопа JEM 1400 (Jeol, Япония).

9

Метод прогнозной оценки 50 %-х инфицирующих доз вируса для животных и

человека. Использовали разработанный ранее частный алгоритм прогнозирования ID50

для хозяина на основании экспериментов с первичными культурами клеток органа-

мишени хозяина и лабораторного модельного животного, адекватность которого

показана для вирусов Марбург и гриппа (Жуков и др., 2007; Жуков, 2011; Zhukov et al.,

2001). Была выбрана упрощенная модель прогнозирования, предназначенная для

экспресс-прогнозирования потенциальной чувствительности хозяина, так как в модели

учитываются только один параметр восприимчивости клеток, характеризуемой CID50,

при условии, что учитываемые клетки не только восприимчивы к вирусу, но и обладают

вирус-продуцирующей способностью (N>0). Прогноз ID50 вируса для целевого объекта

(животного, отличного от модельного животного, или человека) и/или вируса

(отличного от модельного вируса) делали по уравнению:

, где индекс «m» относит параметр к модельному

животному и/или вирусу, а параметр без индекса соответствует целевому объекту и/или

вирусу. Дисперсию S2

prog прогнозной величины lg ID50 полагали равной дисперсии

величины lg ID50m модельного животного и/или вируса.

Методы статистической обработки результатов. Статистическую обработку и

сравнение результатов проводили стандартными методами (Закс, 1976), используя пакет

компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984-2001) (Халафян, 2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3 Изучение возможности использования мыши аутбредной популяции ICR в лабо-

раторной модели для оспы обезьян с целью оценки эффективности препаратов

3.1 Чувствительность подопытных животных и человека к патогенным

ортопоксвирусам

Данные по чувствительности к вирусу оспы обезьян первичных клеток-

мишеней животных. Учитывая то, что на территории России не было ни одного случая

оспы обезьян среди людей, а также низкий уровень изменчивости возбудителя этого за-

болевания, в качестве инфекционного агента использовали во всех экспериментах зару-

бежный штамм V79-1-005 ВОО, относящийся к центральноафриканским, обладающим,

как известно, более высокой вирулентностью для людей (летальность - до 17%), чем за-

падноафриканские штаммы этого вируса (гибель не выявлена). На первом этапе нами

была предпринята попытка экспериментального определения степени чувствительности

к ВОО первичных культур клеток легких мышей и сурков, приготовленных ранее разра-

ботанным нами способом с максимальным сохранением (достаточное время для опытов)

жизнеспособности всех видов клеток этого органа. Прежде всего, необходимо было

оценить возможность размножения ВОО в клетках легких мышей и сурков.

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о размножении ВОО в

клетках легких мышей и сурков, при этом наблюдали значимый прирост биологической

концентрации вируса уже через 48 и 72 часа п.з. Максимального уровня накопления в

суспензии клеток легких вирус достигал через 72 часа п.з. В этой связи в дальнейшем

были проведены эксперименты по изучению их чувствительности к ВОО, оцененной с

учетом регистрации данных о наличии вируса в легких через 72 часа п.з. При этом были

определены следующие показатели инфекционности вируса в клетках легких мышей и

сурков: CID50 = 1,7 (1,4…2,0) и 0,5 (0,2…0,8) lg БОЕ соответственно.

10

Таблица 1 - Данные по динамикам накопления штамма V79-1-005 вируса оспы обезьян в

суспензии клеток легких (СКЛ), по 5,0 (4,0…6,0)×105 кл./пробирку, мышей аутбредной

популяции ICR и степных сурков, доза инфицирования - 0,00001 БОЕ/кл.

Вид биоматериала

от животных

Концентрация вируса, lg БОЕ/мл, M (I95) для n=4, в клеточных

материалах через разные часы после заражения:

1 48 72

СКЛ сурка <0,7 1,2 (1,0…1,4)** 1,4 (1,1…1,7)**

СКЛ мыши 0,7 (0,5…0,9) 1,4 (1,3…1,5)** 1,7 (1,5…1,9)**

Дебрис СКЛ сурка и

мыши*

0,7 (0,6…0,8) <0,7 <0,7

Примечания

М – среднее значение

n – число проб, взятых на временную точку

I95 – доверительный интервал для М с вероятностью 95%

<0,7 – величина ниже порога чувствительности (0,7 lg БОЕ/мл) применяемого

метода титрования

* Контроль приготовлен путем деструкции смеси СКЛ сурка и мыши в равных

объемах

** Величина выше таковой через 1 час после заражения клеточной культуры со-

ответствующего вида животного при p<0,05 (сравнение по двусторннему t-критерию

Стьюдента)

Таким образом, при инфицировании дозой 0,00001 БОЕ/кл ВОО наблюдалось его

размножение в суспензиях клеток легких мышей аутбредной популяции ICR и степных

сурков. Определены СID50 ВОО для клеточных культур легких мышей - 1,7 (1,4…2,0) lg

БОЕ и сурков - 0,5 (0,2…0,8) lg БОЕ.

Данные по чувствительности к вирусу натуральной оспы первичных клеток-

мишеней животных и человека. С целью проведения в дальнейшем прогнозной оцен-

ки чувствительности к ВНО человека исследованию с использованием данного патогена

подвергали первичные клетки крови человека (моноциты-макрофаги). Сначала необхо-

димо было оценить возможность размножения ВНО в этой клеточной культуре.

По данным таблицы 2 видно, что происходит размножение ВНО в монослое мо-

ноцитов-макрофагов крови человека, при этом в зависимости от используемой в экспе-

рименте заражающей дозы вируса наблюдали значимый прирост биологической его

концентрации уже через 24 и 48 часов п.з. Максимального уровня накопления вирус до-

стигал в основном через 144 часа п.з. При проведении электронной микроскопии обна-

ружены признаки размножения вируса в этой клеточной культуре.

В связи с этим в дальнейших исследованиях по изучению чувствительности мо-

ноцитов-макрофагов к ВНО была использована кровь от четырех добровольцев, 1 – 7

лет тому назад вакцинированных против натуральной оспы, имеющих титры антител:

1:76; 1:100; 1:128; 1:216, и трех не вакцинированных. Используя результаты проведен-

ных исследований (таблица 2), изучаемые значения этого показателя были рассчитаны с

учетом регистрации данных через 144 часа п.з. монослоя моноцитов-макрофагов крови о

наличии в них вируса. При этом были определены средние величины инфекционности

вируса для клеток четырех вакцинированных добровольцев: CID50 = 0,01 (-0,15…0,17) lg

БОЕ и трех невакцинированных: CID50 = 0,09 (-0,37…0,55) lg БОЕ. Видно, что моноци-

ты-макрофаги крови от этих двух групп людей проявляли существенно неразличимую

11

высокую чувствительность к ВНО, что нам и позволило провести оценку средней вели-

чины этого показателя: CID50 = 0,04 (-0,08…0,16) lg БОЕ.

Таблица 2 - Данные по динамикам накопления штамма Ind-3a вируса натуральной оспы

в монослое моноцитов-макрофагов крови (ММ-МК), по 9,0 (7,5…10,5)×105 кл./лунку, не

вакцинированного против натуральной оспы человека

Вид кле-

точной

культуры

Доза за-

ражения

(БОЕ/кл.)

Концентрация вируса, lg БОЕ/мл, M (I95) для n=4, в первич-

ных культурах клеток крови человека через разные часы по-

сле заражения:

1 24 48 72 144

ММ-МК 0,017 4,1

(3,9…4,3)

3,5

(3,5…3,5)

4,4

(4,4…4,4)2

5,2

(5,1…5,3)3

5,0

(4,9…5,1)3

0,003 3,4

(3,4…3,4)

2,4

(2,4…2,4)

4,2

(4,1…4,3)2

4,3

(4,3…4,3)2

5,5

(5,5…5,5)4

Дебрис

ММ-МК

(контроль)

0,0171 4,1

(4,0…4,2)

3,8

(3,7…3,9)

3,4

(3,2…3,6)

3,2

(3,1…3,3)

1,8

(1,6…2,0)

0,0031 3,5

(3,5…3,5)

2,5

(2,5…2,5)

1,7

(1,5…1,9)

1,8

(1,7…1,9)

<0,7

Примечания

М – среднее значение

n – число проб, взятых на временную точку

I95 - доверительный интервал для М с вероятностью 95%

<0,7 – величина ниже порога чувствительности (0,7 lg БОЕ/лунку) использован-

ного метода титрования 1 Величина определена в пересчете на начальное количество взятых клеток до их

деструкции 2, 3, 4

Величины достоверно выше, чем через 1, 24, 48, 72 час после заражения со-

ответственно при p<0,05 (сравнение по двусторонним t-критерию Стьюдента и U-

критерию Манна-Уитни)

В дальнейшем была проведена оценки степени чувствительности к ВНО первич-

ных культур клеток животных. Первоначально необходимо было оценить возможность

размножения этого вируса в селезеночных макрофагах мыши.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствовали о размножении ВНО в мо-

нослое селезеночных макрофагов мыши, при этом наблюдали значимый прирост биоло-

гической концентрации этого вируса уже через 48, 72 и 168 часов п.з. Максимального

уровня накопления в клеточных культурах патоген достигал через 48 часов п.з. дозой

0,017 БОЕ/кл. и через 168 часов п.з. дозой 0,003 БОЕ/кл. При проведении электронной

микроскопии были обнаружены признаки размножения вируса в этих клетках.

Используя результаты вышепредставленных исследований, в дальнейшем были

выполнены эксперименты по изучению чувствительности селезеночных макрофагов

мыши к ВНО, рассчитанные с учетом регистрации данных через 168 часов п.з. о нали-

чии в них вируса. При этом была определена чувствительность данных клеток к этому

патогену: CID50 = 1,0 (0,7…1,3) lg БОЕ.

Затем необходимо было оценить возможность размножения ВНО в суспензии

клеток легких, полученных от мышей, сурков и цыплят.

12

Таблица 3 - Данные по динамикам накопления штамма Ind-3a вируса натуральной оспы

в монослоях макрофагов селезенки (ММС), по 9,0 (7,5…10,5)×105 кл./лунку, мышей

аутбредной популяции ICR

Вид кле-

точной

культуры

Доза за-

ражения,

БОЕ/кл.

Концентрация вируса, lg БОЕ/мл, M (I95) для n=4, в первич-

ной культуре клеток мыши через разные часы после зараже-

ния:

1 48 72 144 168

ММС 0,017 4,1

(3,6…4,6)

5,2

(5,1…5,3)*

4,7

(4,6…4,8)*

4,0

(3,7…4,3)

4,9

(4,8…5,0)*

0,003 3,5

(3,5…3,5)

4,1

(4,1…4,1)*

4,5

(4,5…4,5)*

3,5

(3,4…3,6)

5,3

(5,3…5,3)*

Дебрис

ММС

(контроль)

0,017** 4,1

(4,0…4,2)

3,4

(3,2…3,6)

3,2

(3,1…3,3)

1,8

(1,6…2,0)

1,4

(1,2…1,6)

0,003** 3,5

(3,5…3,5)

1,7

(1,5…1,9)

1,8

(1,7…1,9)

<0,7 <0,7

Примечания

М – среднее значение

n – число проб, взятых на временную точку

I95 - доверительный интервал для М с вероятностью 95%

<0,7 – величина ниже порога чувствительности (0,7 lg БОЕ/мл) использованного

метода титрования

* Величина выше, чем через 1 час после заражения соответствующей дозой при

p<0,05 (сравнение по двусторонним t-критерию Стьюдента и U-критерию Манна-

Уитни)

** Величина определена в пересчете на начальное количество взятых клеток до

их деструкции

По данным таблицы 4 было отмечено размножение вируса в суспензии клеток

легких всех подопытных животных, при этом наблюдали значимый прирост биологиче-

ской концентрации патогена уже через 48 и 72 часа п.з. Максимального уровня накоп-

ления вирус достигал через 72 часа п.з. В связи с этим в дальнейшем были проведены

эксперименты по изучению чувствительности клеток легких исследуемых животных к

ВНО, рассчитанные с учетом регистрации данных через 72 часа п.з. При этом были

определены следующие показатели инфекционности ВНО для клеток мышей, сурков и

цыплят: CID50 = 1,3 (0,8…1,8); 2,3 (1,8…2,8) и 0,0 (-0,4…0,4) lg БОЕ соответственно.

Таким образом, размножение ВНО наблюдалось в монослое моноцитов-

макрофагов крови человека и в монослое селезеночных макрофагов мыши аутбредной

популяции ICR, зараженных дозами 0,003 и 0,017 БОЕ/кл., а также в суспензиях клеток

легких мышей, степных сурков и цыплят линии Род-Айленд, зараженных дозой 0,00001

БОЕ/кл. Определены CID50 ВНО для моноцитов-макрофагов крови человека - 0,0 (-

0,1…0,2) lg БОЕ, селезеночных макрофагов мышей - 1,0 (0,7…1,3) lg БОЕ и клеток лег-

ких цыплят - 0,0 (-0,4…0,4) lg БОЕ, мышей - 1,3 (0,8…1,8) lg БОЕ и сурков - 2,3

(1,8…2,8) lg БОЕ.

13

Таблица 4 - Данные по динамикам накопления штамма Ind-3a вируса натуральной оспы

в суспензии клеток легких (СКЛ), по 5,0 (4,0…6,0)×105 кл./пробирку, мышей аутбредной

популяции ICR, степных сурков и цыплят линии Род-Айленд, доза инфицирования -

0,00001 БОЕ/кл.*

Вид клеточной культу-

ры

Концентрация вируса, lg БОЕ/мл, M (I95) для n=4, в культу-

ре клеток легких через разные часы после заражения:

1 48 72

СКЛ мыши 0,7 (0,5…0,9) 1,4 (1,1…1,7)** 1,4 (1,3…1,5)**

СКЛ сурка <0,7 1,9 (1,7…2,1)** 2,0 (1,7…2,3)**

СКЛ цыпленка 0,7 (0,5…0,9) 1,2 (1,0…1,4)** 1,4 (1,3…1,5)**

Дебрис СКЛ мыши,

сурка и цыпленка (кон-

троль)

0,7 (0,5…0,9) <0,7 <0,7

Примечания

М – среднее значение

n – число проб, взятых на временную точку

I95 - доверительный интервал для М с вероятностью 95%

<0,7 – величина ниже порога чувствительности (0,7 lg БОЕ/мл) использованного

метода титрования

* Величина определена и для контроля в пересчете на начальное количество взя-

тых клеток в смеси до их деструкции

** Величина выше таковой через 1 час после заражения клеточной культуры со-

ответствующего вида животного при p<0,05 (сравнение по двустороннему t-критерию

Стьюдента)

Оценка чувствительности к вирусу оспы обезьян мышей при интраназаль-

ном заражении. Оценка чувствительности мышей к ВОО в прямых экспериментах по

их заражению была необходима с целью проведения сравнения величины этого показа-

теля с таковыми, определенными прогнозным путем для человека и этого вида живот-

ных с использованием результатов опытов in vitro. Для определения величины данного

параметра требовалось сначала изучить динамику накопления вируса в легких мышей

для выбора временной точки, когда концентрация вируса в данном органе достигнет

максимальных значений. При этом мышей и/н инфицировали высокой дозой ВОО (5,0

lg БОЕ). В результате этого исследования было отмечено, что максимальное накопление

вируса в легких у животных происходит через 5…7 сут п.з. (6,0 lg БОЕ/легкие). После

чего было определено значение ID50 ВОО по регистрации наличия вируса в легких мы-

шей через 7 сут п.з. Для этого животных инфицировали вирусом в дозах 1,0; 2,0; 3,0; 4,0

и 5,0 lg БОЕ. В результате проведенных исследований было отмечено, что процент ин-

фицированности мышей, регистрируемый по наличию вируса в легких через 7 сут после

и/н заражения, имел четкую зависимость «доза-эффект», что и позволило нам оценить

ID50 ВОО для этих животных по результатам трех экспериментов, которая составила 2,4

(2,0…2,8) lg БОЕ и оказалась на 2,4 lg ниже, чем значение ID50, определенное путем ре-

гистрации клинической картины заболевания (Сергеев, 2016).

Следует отметить, что при использовании обычного и/н метода заражения мышей

более 90 % материала, содержащего ортопоксвирус, попадает в желудочно-кишечный

тракт и лишь около 10 % - в респираторный (Титова и др., 2016). Если учесть лишь ко-

личество апплицированного в дыхательном тракте материала, то ID50 ВОО для мышей в

14

нашем случае, рассчитанная только с учетом развития инфекционного процесса в лег-

ких, должна быть существенно ниже (на 1 lg) и составить 1,4 (1,0…1,8) lg БОЕ, что сви-

детельствует о высокой чувствительности данного вида животных к этому возбудителю

заболевания,, близкой к таковой у человека, определенной прогнозным путем: ≤1,0 lg

БОЕ (Сергеев, 2016).

Таким образом, введение ВОО мышам аутбредной популяции ICR и/н способом

приводило к его накоплению в легких в относительно высоких концентрациях (до 6 lg

БОЕ/легкие) через 7 сут п.з. Величина ID50 для мышей при и/н заражении ВОО, опреде-

ленная на основе данных регистрации у них инфекционного процесса в легких через 7

сут п.з., составила 2,4 (2,0…2,8) lg БОЕ.

Прогнозная оценка чувствительности человека и животных к патогенным

ортопоксвирусам, используя данные по заражению их первичных клеток-мишеней

и животных. Обобщенные результаты прогнозной оценки значений ID50 ВОО и ВНО

для подопытных животных и человека, основанные на использовании величин их CID50

ВОО и ВНО для первичных клеток-мишеней, в сравнении с таковыми, полученными

нами и другими учеными в прямых экспериментах по и/н заражению этих животных, а

также путем прогнозной или экспертной оценки в отношении человека, представлены в

таблице 5.

Таблица 5 - Обобщенные данные по чувствительности людей, мышей аутбредной попу-

ляции ICR и степных сурков к вирусам оспы обезьян (ВОО) и натуральной оспы (ВНО)

Вид

объекта

Прогнозная величина ID50, lg БОЕ, M

(I95) из экспериментов in vitro:

Величина ID50, lg БОЕ, M (I95) в экс-

периментах in vivo:

для ВОО для ВНО для ВОО для ВНО

Мышь 2,0 (1,4…2,6)

n=4

1,8 (1,2…2,4)

n=6

1,4 (1,0…1,8)

n=3

1,7 (1,3…2,1)*

n=3

Сурок 0,6 (-01…1,3)

n=3

2,7 (2,3…3,1)

n=1

1,2 (0,0…2,4)*

n=1

Н.д.

Человек Н.д. 1,0 (0,6…1,4)

n=7

≤1** ≤1** и 1…2**

Примечания

М – среднее значение

n – число определений

I95 - доверительный интервал для М с вероятностью 95%

* Величина получена другими исследователями (Сергеев А.А., 2016; Titova et al.,

2016)

** Величина определена путем прогнозной или экспертной оценки другими ис-

следователями (Дроздов и др., 1987; Сергеев, 2016; Chimerix, 2012)

Видно, что приведенные прогнозные данные в отношении ВОО и ВНО для мы-

шей и сурков, основанные на опытах in vitro, достоверно не отличались от тех, которые

были получены в экспериментах in vivo. Кроме того, определенная прогнозная величина

ID50 ВНО для человека согласуется с данными экспертной оценки других исследовате-

лей. При этом важно также отметить, что мыши в отличие от сурков обладают близкой к

человеку чувствительностью к ВНО. В то же время оба этих вида животных не отлича-

лись между собой по ID50 ВОО и от прогнозной величины этого показателя в отношении

человека.

15

Таким образом, используя данные по чувствительности первичных культур кле-

ток людей и животных и ранее разработанный метод экстраполяции ID50, сделаны про-

гнозы величин ID50 ВОО для мышей аутбредной популяции ICR и степных сурков, а

также ВНО для людей, мышей и сурков. При этом оценки прогнозных значений этого

показателя для животных не отличались значимо (p=0,05) от таковых, определенных в

экспериментах in vivo в отношении ВОО для мышей и сурков, а также в отношении

ВНО для мышей. Оба этих вида животных (наши данные) и человек (данные литерату-

ры) проявляли сходную чувствительность к ВОО. Прогнозная величина ID50 ВНО для

человека составляла 1,0 (0,6…1,4) lg БОЕ, что согласуется с результатами экспертной

оценки этого показателя другими авторами, и была близка таковой мыши.

3.2 Распространение вируса оспы обезьян в организме мышей

Учитывая то, что мыши по результатам регистрации ВОО (штамм V79-1-005) в

легких проявляли высокую чувствительность к этому патогену при и/н заражении, срав-

нимую с таковой у человека, в дальнейшем был использован именно этот вид животных,

в том числе при изучении диссеминации данного возбудителя заболевания в его орга-

низме после и/н заражения с целью сравнения с таковой у человека и существующих

видов модельных животных.

Из данных таблицы 6 видно, что через 2 сут п.з. возбудитель заболевания был об-

наружен в относительно высоких концентрациях сразу в нескольких органах и тканях:

клетки крови, носовая перегородка со слизистой, легкие, селезенка и двенадцатиперст-

ная кишка. Затем через 5 сут п.з. патоген был зарегистрирован (1,4…3,3 lg БОЕ/мл) и во

многих других органах (головном мозге, трахее, печени и почках) и в сыворотке крови.

Причем величины его концентрации в легких и носовой перегородке со слизистой су-

щественно превысили таковые в других органах, тканях и сыворотке. Через 7 сут п.з.

ситуация существенно не изменилась по сравнению с 5-ми сут, если не считать резкого

скачка концентрации вируса в головном мозге (до 5,3 lg БОЕ/мл) и печени (до 3,3 lg

БОЕ/мл) и его появления в поджелудочной железе.

Через 9 сут п.з. концентрация вируса практически во всех органах, кроме носовой

перегородки со слизистой, резко снизилась вплоть до нерегистрируемых величин, а че-

рез 14 сут п.з. величина этого показателя составила <0,4 lg БОЕ/мл в подавляющем

большинстве видов биоматериала, не считая носовой перегородки со слизистой, легких

и головного мозга. Самые большие значения концентрации ВОО были выявлены в но-

совой перегородке со слизистой, легких и головном мозге, причем это наблюдение в ря-

де случаев отмечали через 5, 7 и 9 сут п.з. При этом во все сроки исследования от 2 до

14 сут п.з. вирус вообще не был зарегистрирован в бифуркационных лимфоузлах.

Таким образом, результаты исследований по изучению диссеминации ВОО в ор-

ганизме мышей аутбредной популяции ICR, и/н зараженных дозой 3,8 lg БОЕ (25 ID50),

были близки к известным показателям инфекционного процесса у человека при нату-

ральной оспе и оспе обезьян: наличие генерализованной инфекции и накопление вируса

в слизистой носа. При этом факт репродукции вируса не только в респираторных орга-

нах мышей, но и в некоторых других (висцеральных) согласуется с таковым у модель-

ных для оспы обезьян видов животных. У мышей выявлен основной механизм диссеми-

нации ВОО в организме этих животных от первичных органов-мишеней: гематогенный

с его размножением в крови и/или кровеносной системе. Показано, что органами макси-

мального накопления этого патогена у и/н инфицированных мышей являются легкие,

нос (носовая перегородка со слизистой) и головной мозг, где в некоторых случаях кон-

16

центрация вируса превышала 5 lg БОЕ/мл гомогената. Выраженное размножение вируса

отмечено у этих животных в двенадцатиперстной кишке, печени и почках, достигающее

титров 3…4 lg БОЕ/мл.

Таблица 6 - Данные по динамикам накопления штамма V79-1-005 вируса оспы обезьян в

биоматериалах* от мышей аутбредной популяции ICR, интраназально инфицированных

дозой 3,8 lg БОЕ (25 ID50)

Вид биомате-

риалов от мы-

шей

Концентрация вируса, lg БОЕ/мл, М (I95) в биоматериалах от мышей

(n=4) через различные сут после заражения:

2 5 7 9 14

Клетки крови 3,3

(3,2…3,4)

3,2

(2,9…3,5)

3,8

(3,5…4,1)**

<0,4 <0,4

Сыворотка

крови

<0,4 2,9

(2,8…3,0)**

2,5

(2,4…2,6)**

<0,4 <0,4

Носовая пере-

городка со сли-

зистой

2,0

(1,9…2,1)

5,2

(4,9…5,5)**

5,7

(5,6…5,8)**

5,7

(5,6…5,8)**

5,3

(5,0…5,6)**

Трахея <0,4 1,5

(1,2…1,8)**

1,5

(1,2…1,8)**

<0,4 <0,4

Легкие 3,0

(2,9…3,1)

5,5

(5,2…5,8)**

5,5

(5,4…5,6)**

3,7

(3,6…3,8)**

2,8 (2,7…2,9)

Бифуркацион-

ные лимфоузлы

<0,4 <0,4 <0,4 <0,4 <0,4

Головной мозг 0,9

(0,1…1,7)

3,0

(2,7…3,3)**

5,3

(5,0…5,6)**

2,9

(2,6…3,2)**

3,9

(3,6…4,2)**

Печень 0,7

(0,6…0,8)

1,4

(1,1…1,7)**

3,3

(3,0…3,6)**

0,9

(0,1…1,7)

<0,4

Селезенка 2,0

(1,9…2,1)

2,1

(1,8…2,4)

1,7 (1,4…2,0) 0,8

(0,3…1,3)

<0,4

Поджелудоч-

ная железа

0,7

(0,6…0,8)

<0,4 2,0

(1,9…2,1)**

<0,4 <0,4

Двенадцати-

перстная кишка

2,0

(1,9…2,1)

3,8

(3,2…4,4)**

4,0

(3,9…4,1)**

2,3

(1,2…3,4)

<0,4

Почки 0,8 (0,2…1,4) 3,3

(3,2…3,4)**

3,1

(3,0…3,2)**

1,7

(1,6…1,8)**

<0,4

Примечания

М – среднее значение

n – число животных, взятых на временную точку

I95 - доверительный интервал для М с вероятностью 95%

<0,4 - величина ниже порога чувствительности (0,4 lg БОЕ/мл) использованного

метода титрования

* Органы и ткани в составе 10%-х (по объему) гомогенатов и сыворотка крови

** Величина отличается от таковой, полученной через 2 сут после заражения. для

соответствующего органа при p≤0,05 (сравнение по двусторонним t-критерию Стью-

дента и U-критерию Манна-Уитни)

17

3.3 Патоморфологические изменения у мышей, инфицированных вирусом

оспы обезьян

У и/н зараженных мышей дозами ВОО 3,8 lg БОЕ (25 ID50) и 5,0 lg БОЕ (400 ID50)

наиболее выраженные патологические изменения были сосредоточены в основном в ор-

ганах респираторного тракта. Как и у некоторых других известных видов модельных

животных к данному патогену, у мышей в органах и тканях отмечены сходные гистоло-

гические изменения воспалительного и некротического характера с встречающимися

тромбозами кровеносных сосудов и кровоизлияниями. У инфицированных мышей заре-

гистрирован факт присутствия и репродукции вируса в традиционных первичных клет-

ках-мишенях для этого патогена (макрофаги и эпителиоциты в респираторных органов –

рисунки 1 и 2), а также в некоторых других видах клеток (эндотелиоцитах, фибробла-

стах, плазмоцитах и ретикулярных клетках). Морфологические характеристики репро-

дукции патогена в чувствительных клетках мышей соответствовали таковым, описан-

ным в научной литературе для этого возбудителя заболевания.

Рисунок 1 - Электронограмма, ткань легкого мыши аутбредной популяции ICR

через 7 сут после интраназального заражения штаммом V79-1-005 вируса оспы обезьян

дозой 3,8 lg БОЕ (25 ID50): очаг воспаления

А – разрушенные клетки эпителия в окружении нейтрофилов (1) в воспалитель-

ном очаге

Б – эпителиоцит, содержащий вирусные частицы различной степени зрелости

(увеличение участка снимка А)

3.4 Испытание лабораторной модели для оспы обезьян и пределы

практического её использования

C целью оценки возможности применения лабораторной модели на основе мыши

аутбредной популяции ICR и штамма V79-1-005 ВОО были проведены исследования по

изучению противовирусной активности разрабатываемого в России химиопрепарата

НИОХ-14 в сравнении с американским ST-246, ранее уже продемонстрировавшим соот-

18

ветствующий защитный эффект, и российским НИОХ-32, обладающим низкой анти-

поксвирусной активностью.

По данным таблицы 7, отмечено, что количество обработанных химическими со-

единениями НИОХ-14 и ST-246 мышей с зарегистрированным содержанием ВОО в лег-

ких через 7 сут п.з. достоверно ниже, чем в контроле. Было установлено, что химиопре-

парат НИОХ-32 значимо не отличался по этому признаку от контроля. При этом исполь-

зование химических соединений НИОХ-14 и ST-246 в одинаковых дозах не выявило

существенных различий между ними по эффективности действия.

Рисунок 2 - Электронограмма, ткань кровеносного сосуда артериального типа в ткани

легкого мыши аутбредной популяции ICR через 7 сут после интраназального заражения

штаммом V79-1-005 вируса оспы обезьян дозой 3,8 lg БОЕ (25 ID50)

А – капиллярный сосуд с базальной мембраной (показан черными стрелками), в

просвете которого макрофаг (1) с вирусными частицами в цитоплазме (показаны белы-

ми стрелками) и некротизированные эндотелиоциты (2) с вирионами

Б – эндотелиоцит с вирусными частицами в цитоплазме (увеличение участка

снимка А)

Эксперименты по оценке эффективности противовирусного действия химиопре-

паратов ST-246, НИОХ-14 и НИОХ-32 ранее проводили многие исследователи с исполь-

зованием различных видов ортопоксвирусов, культур клеток и соответствующих из-

вестных видов модельных животных, и результаты таких исследований не противоречи-

ли нашим данным, полученным на мышах с использованием ВОО. Это обстоятельство

свидетельствует о реальной возможности использования в дальнейшем для этой цели

подобранного нами вида модельного животного для оспы обезьян.

С учетом результатов исследований, проведенных при разработке лабораторной

модели «мышь аутбредной популяции ICR - центральноафриканский штамм V79-1-005

ВОО», и её испытаний были оценены пределы практического использования:

- применение профилактической (экстренно-профилактической) или лечебно-

профилактической схемы введения мышам контрольных и опытных препаратов (реко-

мендуется подвергать испытаниям препараты, ранее показавшие противовирусное дей-

ствие в экспериментах in vivo и in vitro на ортопоксвирусах III и IV групп патогенности);

19

Таблица 7 - Данные по лечебно-профилактической активности препаратов, перорально

вводимых мышам аутбредной популяции ICR1, интраназально зараженным штаммом

V79-1-005 вируса оспы обезьян дозой 3,4 lg БОЕ (10 ID50)

Наименование

показателя

Величины показателей для мышей, обработанных препаратами:

НИОХ-14 НИОХ-32 ST-246 плацебо

Суточная доза пре-

паратов, мкг/г

60 60 60 2

Кол-во животных 6 6 6 6

Титр вируса в лег-

ких (в lg

БОЕ/легкие) у каж-

дой мыши через 7

сут после заражения

(п.з.)

<1,7 3,5 3,0 4,9

<1,7 4,9 <1,7 4,9

<1,7 3,6 <1,7 4,9

<1,7 4,9 <1,7 4,9

<1,7 4,9 <1,7 4,6

<1,7 4,9 <1,7 4,9

Титр вируса в лег-

ких мышей, lg

БОЕ/легкие, М (I95)

1,7

(1,7…1,7)3

(n=6)

4,5

(3,8…5,2)

(n=6)

1,9

(1,3…2,5)3

(n=6)

4,9

(4,8…5,0)

(n=6)

ИППВ (lg) в легких

мышей

>3,2 0,4 >3,0 Н.о.

Кол-во (%) инфици-

рованных мышей

04 (0) 6 (100) 14 (17) 6 (100)

КЗИ 1004 0 83

4 Н.о.

Примечания

М – среднее значение

I95 - доверительный интервал для М с вероятностью 95%

1,7 – величина ниже порога чувствительности (1.7 lg БОЕ/легкие) метода титро-

вания (использована при расчете М в виде самой величины порога чувствительности)

Н.о. – величина не определяется

ИППВ - индекс подавления продукции вируса = lg концентрации вируса в лег-

ких мышей в контроле - lg концентрации вируса в легких мышей в опыте

КЗИ - коэффициент защиты от инфекции = % животных с вирусом в легких в

контроле – % животных с вирусом в легких в опыте 1 Препараты вводили за 1 сут до заражения, через 2 часа п.з. и далее ежедневно

в течение 6 сут п.з. 2 Мышам контрольной группы вводили в дозе 0,2 мл/мышь раствор с 0,75 % ме-

тилцеллюлозы и 1 % твина-80, используемый для суспензирования химиопрепаратов 3 Достоверное отличие от контроля при p≤0,05 (сравнение по двустороннему t-

критерию Стьюдента с одинаковыми дисперсиями) 4 Достоверное отличие от контроля при p≤0,05 (сравнение по двусторонним

критерию χ2 и точному тесту Фишера)

- применение не менее 6 аутбредных разнополых мышей популяции ICR (10…16-

сут) по каждому опытному и контрольному препарату;

- применение центральноафриканского штамма V79-1-005 ВОО, наработанного на

куриных эмбрионах или культуре клеток, с известной для этих мышей при и/н зараже-

нии инфекционностью (ID50 по наличию вируса в легких через 7 сут п.з.) в пределах 2,0-

2,8 lg БОЕ;

20

- введение мышам 10…100 ID50 центральноафриканского штамма V79-1-005 ВОО

при и/н заражении в объеме 0,03 мл/мышь;

- пероральное однократное введение мышам суспензии, эмульсии или раствора

контрольных и опытных препаратов в объеме 0,2 мл/мышь;

- обнаружение у инфицированных ВОО мышей, обработанных опытным препара-

том, отсутствия или наличия вируса в легких и его концентрации спустя 7 сут п.з. в

сравнении с контролями по результатам титрования их гомогенатов;

- статистическое сравнение уровней накопления вируса в легких и величин пока-

зателя его наличия в данном органе в контрольных и опытных группах мышей.

Таким образом, при изучении защитной активности разрабатываемых противоос-

пенных препаратов (на примере трех химически синтезированных соединений: ST-246,

НИОХ-14 и НИОХ-32) на мышах аутбредной популяции ICR с применением штамма

V79-1-005 ВОО подтверждено наличие ранее отмеченного нами и многими исследова-

телями (эксперименты с использованием различных видов ортопоксвирусов, культур

клеток и известных видов модельных животных) соответствующего положительного

эффекта, что доказывает возможность использования для этой цели данной лаборатор-

ной модели. Проведена оценка пределов её практического использования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенных исследований были сделаны следующие выводы.

1 В экспериментах по интраназальному заражению мышей аутбредной популяции

ICR вирусом оспы обезьян (центральноафриканский штамм V79-1-005) была определена

величина его 50%-й инфицирующей дозы, равная 2,4 (2,0…2,8) lg БОЕ, оцененная по

регистрации вируса в легких, и которая с учетом 10%-й его аппликации в этом органе

при данном методе инфицирования соответствовала таковой, полученной при прогноз-

ной оценке на основе данных исследований на первичных клетках легких этих живот-

ных.

2 У мышей, интраназально зараженных вирусом оспы обезьян (доза 3,8 lg БОЕ),

наблюдалась генерализованная инфекция с механизмом гематогенным диссеминации

патогена, включая его репродукцию в крови и кровеносной системе. Показано, что ор-

ганами максимального накопления патогена у мышей являются легкие, нос и головной

мозг, где в ряде случаев его концентрация превышала 5 lg БОЕ/мл гомогената. Выра-

женное размножение вируса отмечено у этих животных в двенадцатиперстной кишке,

печени и почках, достигающее концентраций 3…4 lg БОЕ/мл.

3 У интраназально зараженных мышей дозами 3,8 и 5,0 lg БОЕ вируса оспы обе-

зьян наиболее выраженные патоморфологические изменения воспалительно-

некротического характера, сходные с таковыми у человека при натуральной оспе и ви-

дами модельных животных для оспы обезьян, были сосредоточены в основном в респи-

раторных органах.

4 У мышей, интраназально инфицированных вирусом оспы обезьян, зарегистри-

рован факт его присутствия и размножения в традиционных для ортопоксвирусов пер-

вичных клетках-мишенях (в клетках системы мононуклеарных фагоцитов и эпителиоци-

тах в органах респираторного тракта), а также в некоторых других типах клеток (эндо-

телиоцитах, плазмоцитах, фибробластах и ретикулярных клетках).

5 С применением мышей и центральноафриканского штамма V79-1-005 вируса

оспы обезьян на примере трех химически синтезированных соединений (ST-246, НИОХ-

14 и НИОХ-32) подтверждено наличие противовирусного эффекта, ранее отмеченного

21

многими исследователями на других модельных биосистемах, что свидетельствует о

возможности использования мышей аутбредной популяции ICR в качестве лаборатор-

ной модели для оценки защитного действия препаратов от оспы обезьян.

Созданную лабораторную модель «мышь аутбредной популяции ICR - централь-

ноафриканский штамм V79-1-005 ВОО», а также соответствующие методические реко-

мендации по ее использованию (МР 4.2.001-16 ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») предлагается

применять для оценки защитной эффективности разрабатываемых препаратов от оспы

обезьян. Входящие в состав этой лабораторной модели мыши в отличие от линейных и

иммунодефицитных мышей являются более дешевыми иммунокомпетентными и аут-

бредными животными, которые имеют выраженное генетическое разнообразие, как и

человеческая популяция, представляющаяся, по существу, аутбредной (межсемейное,

межнациональное и межрасовое скрещивание) и в основном иммунокомпетентной. Ра-

нее известная методология прогнозного определения величины ID50 вируса, основанная

на использовании первичных клеточных культур человека и животных и продемонстри-

ровавшая адекватность результатов при ее применении тем, которые были получены в

прямых экспериментах на животных, может быть взята для оценки чувствительности

того или иного макроорганизма к исследуемым патогенным ортопоксвирусам. В перспективе дальнейшая разработка темы данной работы связана с возможно-

стью усовершенствования созданной лабораторной модели путем изменения ее состава в части, касающейся штамма ВОО, который может быть заменен на другой после его изоляции во время новых эпидемических и эпизоотических вспышек оспы обезьян. Кроме того, пределы практического использования данной модели могут быть расшире-ны в направлении оценки лечебной эффективности препаратов после проверки ее рабо-тоспособности, используя показатели присутствия/отсутствия и концентрации вируса во основных вторичных органах-мишенях мышей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Discovery of new antivirals for smallpox treatment and prevention. Assessment of nu-tralizing activity of vaccine blood sera using live variola virus / L.E. Bulychev, Ar.A. Sergeev, A.S. Kabanov, Al.A. Sergeev, O.V. Pyankov, S.A. Bodnev, D.O. Gorbatovskaya, A.S. Za-medyanskaya, N.I. Bormotov, L.N. Shishkina, A.P. Agafonov, A.N. Sergeev // WHO Adviso-ry Committee on Variola Virus Research Report of the Fifteenth Meeting, Geneva, 24–25 Sept. 2013, - WHO, 2013. – P. 23.

2 Изучение чувствительности животных и первичных культур клеток-мишеней к

особо опасным ортопоксвирусам / Ал.А. Сергеев, А.С. Кабанов, Л.Е. Булычев, О.В.

Пьянков, Ар.А. Сергеев, С.А. Боднев, Д.О. Горбатовская, А.С. Замедянская, Л.Н.

Шишкина, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // Диагностика и профилактика инфекционных

болезней: Материалы научно-практической конференции «Диагностика и профилактика

инфекционных болезней», Новосибирск, 26 – 28 сент. 2013. – Новосибирск, изд-во

«Ареал», 2013. – С. 23-25.

3 Инфекционные свойства вируса натуральной оспы на первичных культурах мо-

ноцит-макрофагов человека и мыши / А.С. Замедянская, К.А. Титова, А.А. Сергеев,

А.С. Кабанов, Л.Е. Булычев, Ар.А. Сергеев, Д.О. Галахова, А.Е. Нестеров, О.В. Носаре-

ва, Л.Н. Шишкина, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // I международная конференция моло-

дых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов: Сборник тезисов

Новосиб. Гос. Ун-та, Новосибирск, 5-10 сент. 2014. - РИЦ НГУ, 2014. – С. 64–67.

22

4 The possibility of using the ICR mouse as an animal model to assess anti-monkeypox drug efficacy / A.А. Sergeev, A.S. Kabanov, L.E. Bulychev, A.A., Sergeev, O.V. Pyankov, S.A. Bodnev, D.O. Galahova, A.S. Zamedyanskaya, K.A. Titova, A.G. Glotov, O.S. Taranov, V.V. Omigov, L.N. Shishkina, A.P. Agafonov, A.N. Sergeev // Transboundary and Emerg-ing Diseases. - 2015, doi: 10.1111/tbed.12323.

5 Диссеминация вируса оспы обезьян при интраназальном инфицировании мы-шей / Сергеев Ал.А., Кабанов А.С., Булычев Л.Е., О.В. Пьянков, Ар.А. Сергеев, С.А. Боднев, Д.О. Горбатовская, А.С. Замедянская, Л.Н. Шишкина, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // Проблемы особо опасных инфекций. – 2015. - № 4. – С. 86-90.

6 Использование мыши в качестве модельного животного для оспы обезьян при оценке эффективности противооспенных препаратов / А.С. Замедянская, Ал.А. Серге-ев, К.А. Титова, А.С. Кабанов, Л.Е. Булычев, Ар.А. Сергеев, Д.О. Галахова, Л.Н. Шиш-кина, О.С. Таранов, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // Седьмая Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», Новосибирск, 21-22 апреля 2015. - С. 84-85.

7 Экспериментальная оценка чувствительности первичных культур лейкоцитов крови человека к вирусу натуральной оспы / А.С. Замедянская, К.А. Титова, Ал.А. Сергеев, А.С. Кабанов, Л.Е. Булычев, Ар.А. Сергеев, Д.О. Галахова, А.Е. Нестеров, О.В. Носарева, Л.Н. Шишкина, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // Седьмая Всероссийская науч-но-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», Новосибирск, 21-22 апреля 2015. - С. 82-84.

8 Чувствительные к вирусу оспы обезьян мыши для оценки эффективности про-тивооспенных препаратов / А.С. Овчинникова, Ал.А. Сергеев, К.А. Титова, А.С. Каба-нов, Л.Е. Булычев, Ар.А. Сергеев, Д.О. Галахова, Л.Н. Шишкина, О.С. Таранов, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // II международная конференция молодых ученых: биотехно-логов, молекулярных биологов и вирусологов: Сборник тезисов Новосиб. Гос. Ун-та, Новосибирск, 1-2 октября 2015. - РИЦ НГУ, 2015. – С. 131–132.

9 Оценка чувствительности человека и животных к возбудителям особо опасных ортопоксвирусных инфекций с помощью первичных клеточных культур/ А.С. Замедян-ская, А.Е. Нестеров, Д.О. Галахова, М.А. Скарнович, О.Ю. Мазурков, Г.В. Вдовиченко, О.А. Серова, В.В. Омигов, В.И. Кузубов, З.И. Гинько, Н.Н. Рындюк, В.И. Чернов, Л.Е. Булычев // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с междуна-родным участием «Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания», Сочи, 2 - 5 ноября 2015. – Москва, изд-во ООО «Пре100принт», 2015 - С. 65.

10 Оценка чувствительности животных к особо опасным ортопоксвирусам c ис-пользованием первичных культур клеток легких / А.С. Замедянская, Ал.А. Сергеев, К.А. Титова, А.С. Кабанов, Л.Е. Булычев, Ар.А. Сергеев, А.Е. Нестеров, О.В. Носарева Д.О., Галахова, Л.Н. Шишкина, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // Проблемы особо опас-ных инфекций. – 2016. - № 1. – С. 75-78.

11 Оценка чувствительности человека к вирусу натуральной оспы c использова-нием первичных культур моноцитов-макрофагов / А.С. Замедянская, К.А. Титова, Ал.А. Сергеев, А.С. Кабанов, Л.Е. Булычев, Ар.А. Сергеев, Д.О. Галахова, А.Е. Несте-ров, О.В. Носарева, Л.Н. Шишкина, О.С. Таранов, В.В. Омигов, А.П. Агафонов, А.Н. Сергеев // Вопросы вирусологии. – 2016. - № 2. – С. 69-73.

12 The new effective chemically synthesized anti-smallpox compound NIOCH-14 / O.Yu. Mazurkov, A.S. Kabanov, L.N. Shishkina, Al.А. Sergeev, M.O. Skarnovich, N.I. Bor-motov, M.A. Skarnovich, A.S. Ovchinnikova, K.A. Titova, D.O. Galahova, L.Ye. Bulychev, A.A. Sergeev, O.S. Taranov, B.A. Selivanov, A.Ya. Tikhonov, E.L. Zavjalov, A.P. Agafonov, A.N. Sergeev //Journal General Virology. - 2016, doi: 10.1099/jgv.0.000422.

А.С. Овчинникова = А.С. Замедянская

23

CПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВНО - вирус натуральной оспы

ВОО - вирус оспы обезьян

ГНЦ ВБ «Вектор» - Государственный научный центр вирусологии и биотехноло-

гии «Вектор»

И/н - интраназально

ФБУН - Федеральное бюджетное учреждение науки

CID50 - 50%-я клеточная инфицирующая доза

ID50 - 50%-я инфицирующая доза

Lg - десятичный логарифм

Vero - перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки