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REPORTE FINAL DE SERVICIO SOCIAL

JNOMBRE: B Edith Guerrero Sanchez TELEFONO PARTICULAR: 382-29-42 MATRICULA: 90335601

/LICENCIATURA: Ingenieria de los alimentos TRIMESTRE LECTIVO: 97-1 HORAS SEMANA: 20 horas

J TITULO DEL TRABAJO: Efecto de las condiciones de cultivo en la producción simulthea de endopoligalacturonasa y p-galactosidasa de Kluyveromyces niarxionus. M. en C. Lorena del Carmen Gómez Ruiz. Profesora Titular C. Tiempo completo. Universidad Autónoma Metropolitana- lztapalapa Depto. Biotecnologia. Area de Alimentos.

M. en C. Alma Eliiabeth Cruz Guerrero I'rofesora Asociado D. Tiempo completo. Universidad Autónoma Metropolitana- laapalapa Depto. Biotecnologia. Area de Alimentos

Planta piloto de Carnes. Universidad Autónoma Mctropolitana. U. laapalapa IO de noviembre de 1995 IO de abril de 19%

/ASESORAS:

LUGAR DE REALIZACION:

FECHA DE INICIO: &ECHA DE TERMINACION:

NOMBRE DEL PROYECTO Producción dc cnzirnas de Klttyveromyces m<ir.riuiiiis.

I , I

ALUMNA Edith Guerrero Sánchez

ASESORA M. en C. Lorcna del Carmen G6mez Ruiz

ASESOKA M. cn C. Alma Illiiahcih Cruz Guerrero

!

I INTRODUCCION

~/ltJl,o.i~r,,~nyt*t*.c niur.riunrt.v esti catalogada como microorganisnio <IRAS (Gcncrall!. I{cc',ynitgd A s Safe fur human consumption por la food and drug admiiiisiration). lo CUJI periiiiie que l ~ n l o la levadura como sus meiabolitos puedan ser adicionados a los alimentos. La levadura ~/u,,.e-)rcs mcrrxionur CDDB-L-278 es capaz de sintetizar cficientemcnie la Iactasa y la prelj-. La l a c m es una enzima inmcelular. la pectinasa es extracelular (Garcia-Carihay et al. 1917). P>r 10 cual podria resultar ser una levadura de intcres conicrcial ya que adcmis cs capxi. de cmccr en sucro de leche el cual es un producto de desecho de la industria lcchera y qur consiiiuyc un problema xvcro de contaminación. (EspinofA et a1.1992).

Deda la separación nalural de las enzimas (intra y extncelular). el proceso de separación y puhficaci6n dc las enzimas no implicarh ninguna operación adicional al procedimiento normal de scparaci6n de enzimas producidas por fermentación. por lo que.El propósito de cstc trahajo cs (J &terminar las condiciones de cultivo en las cuales K.murxiuni/s presente la mkinia producción de pcciinasa y laciasa simulláneamenic obteniendo dc esta manen dos productos de gran valor ccondmico a partir de un producto de desecho de la industria IecheraJ

Las sustancias péciicas son constituyentes de los tejidos vegetales. encontrándose en la pared cclular y en la lámina media. en donde funcionan como material de cementación para mmtener unidas las células entre si; las enUmas pccticas o pectinasas modifican en alguna forma la estructura de las sustancias pkcticas prcscntcs en los icjidos vcgctales. Las pectinasas de los hongos son de importancia comercial y representan aproximadamente cl 3% del total de Ins enzimas en el mercado con un amplio rango de aplicaciones en las industrias procesadoras de frutas y vino. La endo-poligalacturonasa es la Unica enzima pCctica producida por la'lcvadura Klu-weromyces morxianiu (Gómez-Ruiz el al. 1988); est6 hidroliza los enlaces glucosidicos al azar de Ius sustancias pécticas (elementos estructurales de las capas iniermcdia y primaria de la pared celular de los vegetales superiores). Las alteraciones en el grado de polimerimci6n y estenficacion de dichas sustancias pCcticas pueden producir cambios en la t e ~ t u n de las frutas y Icgumbrcs durante su maduración. almacenamiento y procesado. (Fennema, 1985).

La lactosa o aziicar de la leche es un disacarido encontrado en la leche de los mamíferos. La lactosa no es dulce. tiene una baja solubilidad y no pucdc ser absorbida direciamcntc por cl inicsiino. La lactasa (tambicn llamada P-galactosidasa) Iiidroliw la laciosa cn glucosa y galaciosa y se encusnfra en el intestino de los niamiticros jóvcncs (la actividad de la laciasa desaparece después del periodo de destete). plantas, hongos, levaduras y bacterias.

Las lactasas de valor comercial en la industria Iccliera y otras industrias de alimentos son producidas por la levadura K/it~~eroni~r~*s Iucris y el hongo ,~l.vpcr,qi//its jiigvr.

lil rcconocimicnto dc la esisicncia de la intolsraiicia a la Iactos:i e11 1950 jugo uti papcl iiiiponaiiie cn el dcsarrollo de preparaciones de enzinias coiiicrcialcs dc liiciiics niicrobianas y IO aplicacion a gran cscala para la produccion de productos lactcos bajos en lactosa. El iraianiieiiio de la leche y productos licteos con lactasa (P-galactosidasa) reduce su conicnido de laciosa lo cual puede hacer que la leche. un alimento de gran valor nutritivo. este disponible para un grnn niiniero de adultos y nifios intoleranies a la lactosa. (Bales y Castillo.1979)

o

OBJETIVOS

OHJ E l l VO C EN ERAL: hicnninar las condicioncs de culiivo óptimas (temperatura. pli, conccntracion dc lactosa

Jdicionada como sucm dc lcchc en polvo y conccniraci6n de pcciina) para produccion simulidnca de P-ynlnctosid;isa y endo-poligalaciuronasa de K/io.,.c,rr~ni~.crs ntur.ricinccs- CDIlIl- 1.27R

la

OIUETIVOS ESPECI FiCOS I .- Deierminar dentro de las variables estudiadas (temperatura, pH. concentración dc

lactow y concentración de pcctina) su imponancia y cual tiene mayor efecto en la producción sintulidnea de 0-yalactosidasa y cndo-poligalacturonasa.

?.-.llctcrmiiiar cl nivel Óptimo para la produccion de 0-galactosidasa y la cndo- pi>ligalaciuronas;i.de cada una de las variahlcs estudiadas (tcmpcratura. pH, conccntracibn dc Iaciosa y concentmción de pectina).

M ETODOLOG IA UTILIZADA

MICR0011GANISMO. Se empleó la cepa de J3uyveromyce.r marxiunits CDBB-L-278, que proviene del ccpario del Departamento de Bioingenería y Biotecnologia dcl,Cenvo de Invcsiigación y Estudios Avanzados del Instituto Polittcnico Nacional, la cual se conservó para su uso en agar papa-dextrosa a temperatura de refrigeración.

MEDIO DE CULTIVO. Se uiiliz6 el siguienie medio de cultivo base en el cual se varió la concentración de pectina (Sigma) y la conccniracih de lactosa (adicionada como suem de Icche en polvo cuya conceniracion de laciosa es del 69%). 0.2% de estracto de levadura (Bioxon) 0.1% de (NH4)z SO4 (Baker) 0.05% de K1 I2P0.1 (Uakcr) 0.05% de MgSO.1 (Baker)

medio de cultivo se pasteurizo durante IO minutos. El pH del medio se ajustó con soluciones de NaOH ylo ácido acCtico (CHJCOOH): El

i

CONDICIONES DE CULTIVO: a) Para el estudio de la inlluencia de la temperatura se corriernn fcrmeiiiaciones a 25. 30 y 35°C. hi Para cI cstudio de la influencia del pH se corrieron fcrmentacioncs a 3.5.4.0 y 4.5. c ) Para el estudio de la influencia de la concentración de pectina se corrieron fcrmentacioncs a las

d ) Para el cstudio de la influencia dc la Iactosa dcl suero de lcchc sc corrieron lhneniacioncs a las siguicntcs concentraciones de lactosa I . 2.5 y 5%.

siguicnics cnnccntraciones de pectina 0.25. 0.5 y 1 .O%.

x i o n de laciosa y’ 3 I - -

!

Todas las fermentaciones se llevaron a cabo por duplicado en inairaces de 500 ml i conrciiicndo 100 ml de medio de culii\o. iiicubhdose a iciiiperniuras coniroladas y con agiiacion 13 ( I 2 0 rpni) adicionando 3 .8 ing levadura conlo inoculo. El iicnipo de li.riiicniacion fui. de 24 ( horas.

ANALISIS DE LAS MUESTRAS I I

:$ 1 1 Conccntrncibn dc biornasa. Esta sc dctsrininó niidicndo turbiedad 3 una longitud Jc

,,n,ja de 650 nm y fc cornlacion6 con la siguicntc curva patrón: C(mylml) - ( & uiilitd

) factor de dilucion I .92

mdio de cultivo esiCril correspondicnie a cada exprhcnto como blanco.

2) Dctcrminici6n dc la actividad cnzímáiicri. [.a biomesa x spar6 por centrifugación a 3500 rpm durmtc 20 minutos. Utilizindosc cl

poywte celular pya la deierminación de aciividad de lactasa y el sobrenadante como solucion dc pecliwa.

1 0) pee/Jmnra-La dcierminaci6n de la actividad se llev6 a cabo midiendo el aumcnto de azucarcs reduciorcs . debido a la acción de 'la cndo-poligalaciuronasa en una solución de Qcidol.9 po1il)nlaciutc)nico por el mCtodo de Nelson-Somogyi. s-

Unidad de poligaraciuronasa (uPG): es la cantidad de enzima que libera Ipmol de grupos reduciorcs del ácido poligalactur6nico por minuto a 30°C pH 5.

Dcrcnninrcidn de rcduciorcs: Este mctodo implicn la preparación dc los siguientes rcactivos:

REAmvo I Solucidn A.- En 800 ml de agua desiilada disolvcr 25 g de carbonato de sodio anhidro

(Na~C03). 25 g de tartrato de sodio y potasio (KNaC4H406.4H20). 20 g de bicarbonato de sodio (NaHCOi) y 200 g de sulfato de sodio (Na;isO4). Aforar a i litro.

Soluci6n B.- En 200 mi de agua destilada agregar 4 gotas de ácido sulfiirico concentrado (H2SOo disolver 30 g de sulfalo de cobre pentahidratado (CUSOJ.SH~O). El reactivo I x prepara mezclando 1 ml de la soluci6n B más 25 mi de la solution A.

.

REACTWO 11 \ En 450 ml de agua destilada disolver 21 mi de íicido sulfuflco concentrado (H~SOJ) y 25

Por separado disolvcr 3 g dc arsenato de sodio hcpiahidratado (Na2HAs04.7 1 - 1 2 0 ) en 25

Mezclar lentamcnte y con agitación. Aforar a 500 ml y calentar a 5 5 T durante 30 min.

- Una vez preparados los reactivos mezclar 1 nil de la solución prohlcnia con I ml dcl

- Incubar durantc 20 minutos cn un baño de agua hirviendo. - Retirar del baño dc agua y dejar enfriar. - Agregar 1 ml del rcactivo !I y agitar vigorosamente, - Agregar I7 ml de agua destilada y agitar. - Leer en el especiofoióniciro a 520 nni.

g de molibdato de amonio [ ( " J ) ~ M o ~ O Z ~ . ~ H ~ O ) ] .

ml dc agua destilada

rcactivo 1 de Nelson-Soniogyi en u n tubo de ensaye.

neterminacidn de la actividad enzim9tica: I

- A un tubo de ensaye con 9.9 mi de solución de icido poligalaciur6nico al 0.1% (preparado en solución amortiguadora de acciaios 0.1 M. ptl 5); se agrego 0.1 nil de solucion dc pectinasa. Esie tubo se mantuvo en un barlo a tcmpeniura controlada a 30°C.

- Se tomaron alicuotas de I ml a los minutos I . 5. 1 O y I5 y sc vaciaron a sendos tubos de cnsayc a los que previamente se les había agrcgado I ml dcl reactivo I de Nclson-Somogyi, considerando el tiempo transcurrido desde el momcnto en quc la enzima cntn cn contacto con el icido poligalactur6nico hasta que se mezcla con un ml de el rcactivo I Jc Nelson-Simogyi. quc dsiiene la reacción enzimdiica. - Se h i d la detcminaci6n de reductom como se dcscribi6 antcnomcnie

Estos datos K corrclacionaron con una curva patrón de ácido gnlaciudnico. Para esta curva se preparó una soluci6n de O.OOO?S glnil dc iicido galaciurdnico en agua y sc hicicron difcrcntes diluciones de mmcra que x cubriera un rango de concentración de O a I . I780 pmol/ml

j ? b)Lucfusu.- La dcierminaci6n de la actividad se llev6 a cabo midiendo el aumento de orto- nimfenol debido a la acción de la 0-galactosidasa en una soluci6n de o-nimfenol-p- gal actopi ranosido.

Una unidad de lactasa ( u t ) es la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un pnol de orto-nitmfenol kgaiactopiranosido por minuto a 37OC. pH 6.6

Dctcrminicl6n de 11 actividad cnzimltica: - Al paquete celular obtenido al centnfugar 40 ml de caldo de fermentacion a 3500 rpm durante 20 min, K le adiciond 5 ml de alcohol isoamilico en un matraz volumevico de 25 ml y se aforó con soluci6n amortiguadora de fosfatos de 0.1 M pH 6.6 el cual contiene sulfato de magnesio (MgSO4) I mM y sulfato de manganeso (MnSO4) O. I mM. (solución amortiguadora A).

agit6 la mezcla a temperatura ambiente por 1 hora. - Una vez agiiado se separo el alcohol isoamilico de la mczcla mcdianie un cmhudo dc

separacion, quedando la solución enzimiiica en la fase infcrior del embudo. - Se coloco en una celda cspcctofoiómctrica 0.1 ml de solución cnzimatica con 2.7 nil de

solucion amortiguadora A y 0.2 ml de solucion o-niirofenol-P-galaciopiranosido 0.034 M y se incube a 37OC en el controlador de temperatura insialado en el espcctrofotonietro.

- El contenido del matraz volumdtrico se va& a un matraz erlenmcyer de 125 ml y se i

- La absorbancia se rcgisiró a 420 nm coniinuainsnte duranie 3 minutos.

Estos datos se correlacioiiaron con una curva patron de orto-niirofcnol. Para csii cuma sc preparo una solución de 0.0695 gllt dc orto-nitroicnol en agua y se hicieron diferentes diluciones de manera que se cubricri un rango de concentncion de 0-0.5 pmollml.

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ACTIVIDADES REALIZADAS

Las actividades de trabajo se dividieron en tres etapas: la primera etapa consisiio sn una revision bibliográfica con el fin de obtener la información necesaria respecto a las enzinias producidas por la levadura Klrcywromycrs murxiunus.

En la segunda etapa se realiz6 el trabajo experimental en el cual se obtuvó las mejores condiciones para la producción simuliánca dc dos enzima (Iactasa y pectinasa) poi la lcvadura Khywroniycrs murxiunirs.

En la tercera etapa se elaboró el informe final.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Se logr6 determinar como influye la temperatura, la concenuaci6n de pectins y laciosa. as1 como el pH del medio de cultivo en la producción de P-galactosidasa y’endo- poligalacmnasa de la levadura Kluyveromyces morxianur CDBB-L-278 mediante la elaboración de 27 diferentes medios de cultivo obtenidos de manera aleatona con el f in de obtener una rnuesm representativa en donde varien todas las condiciones de cultivo analizadas. También se logr6 determinar las condiciones optimas de temperatura, pH. concentración de pectina y lactosa en las cuales se obtiene la maxima p d u c c i d n de P-galactosidasa y endo- poli&dacturonasa de la levadura Khyveromyces murxianus CDBB-L-278.

..- a r.

1 RESULTA DOS LACTASA

En la tabla No. I se pueden apreciar los resultados de la producción de lactasa en los 27 cxperimenios que se desarrollaron en este proyecto. Obsemhdosc que en cl esperinicnio 2.t se obtuvó iu máxima producción (326.24 uUp) mientns que en el experimento 27 fui la mininia (12.39 uUg).

La producción de lactasa obtenida en el experimento 24 (326.24 uLlg) es parecida P la rcporiada por Hewiit y Groofwassink (1984). quienes estudiaron la producción sirnultbea dc dos enzimas (inulinasa y lactasa) de la levadura Klujveromycrs mmianus. cncuntrando que al adicionar lactosa como Única fuenie de carbono se obtiene la mayor produccion de lactasa (310 uUg) y al adicionar inulina como Única fuente de carbono se obtiene la mayor produccion de inulinasn. Tabla No. I

_._r _,_, ~ ,... "_._ ~ I-- ., , , . ., .."+.."" .,..."...... *."- __.__u.-

Analizando los resultados por el meiodo esiadisiico de 'I'aguchi. podcmos decir quc las mejores condiciones de producción de la enzima son: un pH dc 4.5 a 30°C. I % de pcctina y 2.5% dc. lactosa.

Si analizamos el coeficiente de correlacion que existe entre el pH. temperatura. concentracibn de pectina, concentracibn de lactosa con rcspecto a la produccion de lactasa sc cncontro que solo existe correlacibn entre el pH y la produccibn de la enzima (cuyo coeficientr dc comlacibn es 0.27462 con un nivel de confiabilidad de 0.0001). lo cual no concuerda con cl milisis de varianzn que nos indica que tambicn existe efecto de la concentracibn de lactosa cn la produccibn de lactasa. y con io investigado por Mahoncy et al. (1975) quienes reportaron que la la actividad de la lactasa por mg de levadura vm'a dcpndiendo de la fuente de carbono utilizada, ya que ai adicionar I % glucosa como unica fuente de carbono se obtuv6 0.49 unidades de lactosa que al adicionar 15% de lactosa se obtuvó 2.83 unidades de lactasa. (Ver Apendice I )

Del &Uisis de varianza realizado se puede decir que el pH y la conccnmcibn de lactosa tienen un efecto significativo en la produccibn de lactasa con una confiabilidad de 0.0001 y 0.0002 respectivamente. (ver Apendice 2)

En la prueba mhtiple de Duncan x enconlrb que: * Existen diferencias significativas en la produccibn de lacias en los tres diferentes pH siendo el

de mejor produccibn a pH 4.5 (94.557 uUg). * No existen diferencias significativas en la produccibn de lactasa en las tres diferentes

temperaturas estudiadas. * Existe diferencia significativa en la produccibn de l a c m cuando adicionamos la mayor concentración de pectina (I"/.) mientras que cuando adicionamos (0.5 y 0.25%) no existe diferencia.

lactasa con respecto a las otras dos concentraciones (1 y 2.5%) utilizadas. (Ver Apendice 3) A 5% de lactosa adicionada al medio existe diferencia significativa en la produccibn de

PECTINASA 1

En la tabla No.:! se pueden apreciar los resultados obienidos sobre la produccicin de pcciinasa en los 27 expcnmenios desarrollados en esic proyecto. 0bsem;indosc quc cn el cspenmento 17 se obiuvó la mixima produccion (1.7251 uPGlml) mientras que en los experimentos 3 y I 5 Tu¿ la minima (O. 1356 uPGlml y 0.1 344 uPGlml respectivarnentc).

Tabla No.:!

!

Los rcsuliados obtcnidos por cI rnl'todo de 'füguclii y por 10s otros metodos cstadisiicos uiilii;idos nos indican quc las mcjorcs condiciones para I;i producción de cndo-poligalaciuronasa son : pH de 5.5 a 30°C. 0.5% dc pcciina y 5% de laciosa. lisias condiciones concuerdan con Iü

bihliografia. Sinchcz et al. (1964) reporto que cl pl I opiinio para la producción de pcctinasa fui. Jc 5. en I987 Garcia-Gwibay rcportó que usando lactoa como liicnic de carbono la cepa CüIiIi- L-278 es mejor productor dc la cnzima que al utilizar suero dc Icchc.

Los resultados estadisticos dificrcn con los rcsuliados ohtcnidos en los cspcrinicnios rcalii;idos en cstc proyccto unicanicnic cn la coiiccntracicin de laciosa adicicinada al nicdio. cncontmdo que a 2.5% dc Iaciosa se tiene mayor producción dc la enzima. Por lo quc podcnios decir quc las rncjorcs condiciones para la producción de cndo-poligalaciuronasa son: ptl de 5.5 a 30°C. 0.5% de pcctina y 2.5% de Iaciow.

Analizando el coeficiente de correlación que existe entre cl pH, tcniperatura. conccnmción de pectina y suero de leche con rcspccto u la producción de pectinasa encontramos que sdo existe corrclación enirc el pi¡ y la concentración de lactnsa de leche con la produccibn dc pcciinasa lo cual nos dice quc solo'cstos dos parirnctros tienen una influencia real en la producción de la enzima. (Ver Aphdice 3).

Del análisis de varianza se puede decir que cl pH. la concentración de pectina y lactosa tienen un efccto significativo en la producción dc peciinasn con una confiabilidad de 0.0001, (Ver Apkndice 5).

Existen diíercncias significativas en la produccibn de peciinasa en los tres diferentes ptí siendo

No existen diferencias significativas entre las temperaturas de 35 y 25°C pero si entd estas

En la prueba miiliiple de Duncan encontramos que:

cI de mejor producción a pH de 5.5 ( 0.5878 Ulml).

temperaiuras y 30°C. encontrando que a 30°C existe la mayor producción de pcciinasa (0.3927 Ulml).

sólo a I % de pectina se encontró diferencia si.gnificaiiva con respecto a las otras dos conccnuaciones. sin embargo a 0.5% dc conccntracion de pcctina se obtuv6 la niayor producción de pectinasa (0.4027 U/ml). La laciosa al 1% resulto significativamente diferentc a las otras dos concentraciones

cstudiadas (2.5. 5%) y ademis 3 niayor concciiiración dc lac t ix~ se ohiicnc iii:iyor producción de pcctinasa (0.4059 IJlinl). (Vcr :\pCiidice 6).

No se encontraron difcrcncii sigiiificaiivas ctitrc la concentraciiiri de 0.5 y 0.25% de peciina.

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c:( ) NC LUS ION ES

Se lop6 dcicrminar para anihas cn7.inias lii (I-gaIaci4dasa >' In ciido-piili~nlnciur(it~;i~;i. cL~;iIcs de las variablcs estudiadas (icnipcraiura. pH. concciitrnciOn de Iackisii y concciiirxiiiri de pcciina) prcscntan mayor inllucncia en su producción.

Sc cnconiro quc para la produccion de P-galactosidnsa cI pH inlluyc de niancra direcia en 1 ; 1 produccicin dc la cnzinia ya qiic a un pH dc 3.5 no crew l a levadura. a 4 .5 se iicnc la niisiiiin prodiicci6ii y ;I un pl I de 5.5 In prodiiccion disminuye casi e11 un 50%.

Para la priiducci6n de cndii-poligalriciur~itl~~~~, el pl I -y la conccnirriciiin de Iaciosa ilitliiycn de tiinnera dirccia ya que a un pl-l de 5.5 se prcscnia la niüpor aciividad. a u n pIl de 4.5 la ncrividrid disininuyc a la mitad y a un pti dc 3.5 no sc presenta actividad.

I Sc logrci dcicrminar cl nivcl opiimo de producci6n dc Iu &galaciosidasa encontrando 1111 pl i de 4 .5 a 30" C con una conccnirncibn de pcciinii de I % y tina concciiiracih [IC Iaciiisa de 2.306. por to cual podentos decir quc las nxjorcs condiciones para Ia produccibn de [i- j

Para la enzima cndo-poligalaciuronasa las mejores condiciones fueron un pH de 5.5 a giliiciosidasa son las dcl expcrimcnio 24.

30°C. 0.5% dc conccniración dc pcciina y 2.5% dc 1;iciosa siendo las condiciones del cxpcrimicnio 17.

encontramos que para cl cxpcrimcnto 24 donde se iienc ia mayor produccion de laciasa (3.26 u!-lnig) se ticnc una produccion de endo-poligalacturonasa dc 0.077 I uPG/mg lo cual representa mcnos del 10% de la producción mhxirna; mienins que en el cxpcrimenio 17 dondrse ticnc la mayor producción dc endo-poligalaciuronisa (1.0918 u l W n i g ) In produccibn dc laciasa cs dc ) J'

0.57 u l h g lo cual representa un 20% de la producción niisinia. Por Io cual no podcmos concluir cual dc las dos condiciones scn la niis adccuada para la uptima

1

AI comparar las aclividadcs de amhas cnzinias cn los cxpcrimcntcis rca1i;r;idos.

~

,, .~;:

J produccion simuliinca dc las dos cnzimas csiudiadas.

Mcdianic iiibiodos csiadisiicos y bibliografiri podcnios decir quc las iiicjores condicioncs ~

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O para la prodiiccicin de amhas eiiziriias son: ;I ?Oo(.' p l l de J.S. ccw una concciiiraciiin dc pcciinn tlc (' t 0.3% >' con 2.5oó dc 1;icios;i. esiis condicioiics no currcspoiidcii :I iiiiig\iii:is ilc los cspcriniciiiob

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li E CO M E P: 1) A C I O N ES 1:s iicccsxiu rc;ili/;ir la fhicniaci6ti coli I x coiiiliciimcs de ciiI[i\ o siiccridas p x i

coiiqirohar si soti c s ~ i s las coiidicioiics ¿ipiimas cii 1a.i cii;~Ics >e iiciic 13 i i ir i ! (Ir prodiicciiin de ;inih;is ctiziiii;is y si n o sc ohrieiic se pdriii variar el plI mire 4 . 4 y 5.5 y 1i1 concciiir;iciiiii de

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AI'F.SI)ICf. I

I {ESULTADOS SOIIHE EL C0t:FICIEN'I'E I>E C O K H E L A C I O N QUE EXISTE E N T K E LAS VAHIAR1,F.S ESTLfI>IAI)AS SOIIH<E 1.A A C T I V I D A D DE L A ENZIMA LACTASA

\'.irt.ihlc N hiean Std I>cv Suni Minimuni Maximuni

Ik\pzrirncnlo 2 1 6 I4 O0 780697 >O24 I .o0 27.00 216 4 50 I1 8 I8;0 972 3.50 5.50 rll

I cttrpcraiura ? I 6 ? ' ,X I .; 0 7 2 j 4 6440 25.00 35.00 c'<mccniraciOn dc peciina 216 05x 0.:1?'3 126 0.25 I .o0 t'uncwiración de I . ~ i ~ i s a 216 2.8X 161581 624 I .o0 5.00 ,\~iividad dc la Iwasa 216 47.89 66.75273 10345

Conílaiion Coeflicienis / Proh IR1 undcr I Io: RIii). 0 ' N = 2 I6

Expcrimcnio

Ptl

Temperatura

Conc. dc peciina

Conc. de ' Iactosa

Aciividad IaCIaSa

Expcrinicnio PI I

I .ooooo o.Ooo0

0.25042 0.0002

0.09599 O. I598

0.92646 0.000 I

0.08997 0.1878

0.27462 0.000 I

0.25047 0.0002

I .ooooo 0.0000

-0.05123 0.4027

o.onono I .o000

0.04221 0.5372

O 301 I3 0.0001

I cnipcr.iiura

O 09599 o IS08

-0 O5723 o 4077

I00000 o ooon

o u.1995 0 4652

o ON'( O 4234

O O6727 0 ;?<I

Conccniracibn de pcciina

0.92616 0.0001

o.ooo0o I .o000

0.04995 0.4652

I .ooooo 0.0000

0.04605 0.5008

O. 1113 17 I1 0060

O 326.97

Conccniración de IJCiOIa

0.08997 o. 1878

o 0422 I 0.5372

0.05475 0.4234

O 04605 o SO08

I 00000 o O000

-0.1651 I 00151

Aclividad l a c m a

0.27462 0.0001

0.301 13 0.0001

, 0.06727 0.3251

o. 18: I7 0.0069

-0.16511 0.015I

I .ooooo o moo

'!

Numero de observaciones cn cada vanable :- 216

Dependent Variable: LACTASA

Sum of Mean Source DF squares square F Value Pr > F

Modcl 8 41133605556 5I41700693 I9 37 0.0001

Error ?O7 546688.22655 265 1.00593

Corrccicd Total 21s 958024.28201

R-Square C.V. Root MSE LACTASA Mean

’ 0.429359 107.30172 51.390718 473936574!

And)sis oí Variance Procedure

Dcpciidcni Variable: LACTASA

Source [IF Anova SS Mean Square F Value Pr -. I

Pf l 2 .;??O40 96701 IhlO?O.J8j5l 60.97 00001 Icin pcr.liur:l 2 10351.07416 5175 5j7us I 9 6 O . l J \ ? concmtracion dr periina - 7?604.81716 16302 4 l l ‘ S 6 17 0.(10?? -. c‘iiiccnirx.ibii Jc I a c i o r ~ 2 46339.18713 3 1 6 9 59356 X 77 0.(1002

Duncan's Muliiplc Kangc lcr l Tor varwblc 1 AC'I'ASA

M c m s uiih the same lctlcr arc iwi significantly dill'crcni

Duncan Grouping

A 8 C

Duncan Grouping

A A A

Duncan Grouping

A I3 B

hican N pt l

94.557 71 4.5 49 I24 7 2 5.5 o 000 72 3.'

-

Mean N Temperatura

S4.979 80 30'C 49.458 64 35OC 38.63 I 72 25°C

Mean N Conccntracibn de pcciina

64.812 72 I ? á 42.600 72 0.5 ?'o

36208 72 0.2s 0.

i

I>iiiicJn Grouping hlcan N Conwntr:iciiin de laciosa

A 62.945 80 2 . 5 o á A 51.091 65 I ?D B X . 3 X 72 59.

VariJhlc N hlcan SIJ I k v Suni hliniriiciiri hta.\iniurn

I:\pcriincnto 216 i4.OooOo 7.80697 3025 1.00000 27.00000

I'ciiipcr.iiura 216 ?9.81581 .¡.Y7?j4 6440 25 (iO00il 35 00000 ['I I 216 4.5oooO 0.81R1'7 CI7? .L50000 r,'oo00

C'oricciiiriiiiim Jc p ~ i i i i . ~ 2 I h 0,58333 0 . i I25i I :(> I1 ?5llll0 I Oncilin Concuitracion Jc laciusa ?I6 ?.X8889 I61281 624 1.l10000 5.00000 Actividad de la pciinasa 216 0 ?WS9 o.&!3fi? 62.SS O 1.75000

Conclation CoctXcicnir I Proh IR1 undcr tlo Rho 0 ' N - 216

I~xpcriniciit~i pll Icmpei,iura Conc. Jc pcciina

Experimento I .oOooO 0250.12 0.09599 O 92656 O oouo O.OOO? o. 1598 0.0001

rll 0.25042 1.00000 -0.OS723 0.00000 O.OOO2 0.0000 0.5027 I .0000

'Tcmpcniun 0.09S99 -0.OS723 I.W#O 0.04995 O. I S98 0.4027 O.oo00 0.4652

Conc. de 0.92646 . 0.00000 0.0499S I .o0000 pcciina 0.000 I 1.0000 0.46S2 0.0000

d Conc. de 0.08997 0.04221 0.05475 0.04605 IacIosa 0.1878 0.S372 0.i234 0.5008

Actividad 0.018SJ 0 . s 4 1 - w ~ -noiisq -11.202 I I pcciinasn 0.7865 0.LlOIiI 0 8655 I1 1102s

Conc. Jc IJCIOSJ

0.08997 0.1878

0.04221 0.5372

0.05475 0.4234

0.04605 0.5008

I .00000 0.0000

0 ?.I I.? I o Il(10.~

Aciividd pcctinm

0.0 I854 O 7865

O 54156 o 0001

-0 o1 159 O 8655

.o ?O2 I I O 0028

024131 o O003 : I nonno 0 (111110

APENDICE 5

I < E S l I L T A l > O S DEL A N A L I S I S I>F. V A K 1 A S X . A I'AKA L A A C T I V I D A I ) DE 1.A ESZI>IA PECTINASA

Variablrr indrpcndicnics Niiclcs Valarci

[>I I ; ;,5 4 5 5 . 5

I ciiipcraiurn _. > 5 y .304c' '5'C

3 I.. 0.?5% 0.59. Conccninci6n dc pcccina

Conccntncidn de Iaciosi~ 3 1% ?.S? í 5%

Nuiiihcr ofohscrvaiiiins in da12 xi 2 16

Analysis r f Variance Procedure

Dcpcndcni Variable: PECTINASA

Sum of Mcm Source DF Squares Square F Value

hloJcl X 19.18255hSI 2.39781960 2 I .46

I h i r 207 23,12942926 0.1 1173637

Conccicd 'rolal 2 I5 42.3 I 198607

P r > F I

0.ooo I

?

K-Square c v Rooi hlSli PI?XiNA hlem o 45;760 I I 5 4 jOOJ U 3 .X26W I 0.2R058657

APENOICE 6

Duncan's Multiple Range l c r i for variable: PliCI'INASA

Means with ihc same lcltcr arc no! significanil! dill'crcni

1)unc;in Grouping h1c:iil N pll A 0.5870 7 2 5 5 U 0.2818 7? 4.S C 0.0000 72 3 s

I)tincm Grouping híCJi1 N 'Tcmpcraiura A I1 3929 KO 30'C I3 0.2184 72 25.C U 0.2183 65 3S'C

Duncan Grouping Mean N Conccnimcibn de peciina A 0.4027 7 2 0.5 Tí A 0.1257 7 2 0.2s ?. n 0.1403 72 I *i

Duncan Grouping Mean N Conccnirición de l x l o r a A 0.4OSP 72 5 % A 0.1112 80 2.5 *: n 0.139 64 I %