BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

HUỲNH THỊ TUYẾT ANH

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH

THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG MỘT SỐ

DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY CHÙM RUỘT

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số : 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2015

DaihocDaNang

Công trình được hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN MẠNH LỤC

Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thị Liên Thành

Phản biện 2: PGS.TS. Lê Tự Hải

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt

nghiệp thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 18 tháng

12 năm 2015

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm thông tin - học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

DaihocDaNang

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò

hết sức quan trọng trong đời sống con người. Từ trước khi có sự ra đời của thuốc tây, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên đã được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh và rất có hiệu quả.

Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới có thảm thực vật phong phú, rất nhiều loài cây thuộc chi Phyllanthus, họ Phyllanthaceae được dùng để bào chế thuốc chữa nhiều bệnh. Mặc dù những loài thuộc các chi kể trên có nhiều giá trị sử dụng như vậy nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hoá học, hoạt tính của các cây thuộc chi nói trên vẫn chưa hoàn toàn đầy đủ và có tính hệ thống [4], [6].

Chùm ruột, còn gọi là tầm ruột có tên khoa học là Phyllanthus acidus (L.) Skeels (danh pháp đồng nghĩa Phyllanthus distichus, Cicca disticha, Cicca acida hay Averrhoa acida), là loài cây duy nhất có quả ăn được trong họ Phyllanthaceae [2], [8].

Mỗi bộ phận của chùm ruột từ quả, lá, rễ, vỏ đều có tác dụng chữa bệnh, trong đó đáng chú ý là lá chùm ruột. Lá chùm ruột có khả năng trị bệnh scorbut (bệnh do thiếu hụt vitamin C). Lá nấu chín đắp lên mụn nhọt giúp hút mủ rất tốt. Người ta còn nhai lá chùm ruột để xoa dịu các chứng viêm họng và miệng. Lá đun nước tắm có thể chữa lở, nổi mề đay và các bệnh ngoài da khác.

Trong khi đó, kết quả nghiên cứu được công bố trên tạp chí Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine của châu Á chỉ ra rằng, chiết xuất từ lá chùm ruột còn có khả năng chống viêm, giảm đau và chống oxi hóa mạnh mẽ. Không chỉ thế, một bài báo đăng trên tạp chí European Journal of Pharmacology của châu Âu khẳng định, chiết xuất từ lá chùm ruột có khả năng hạ huyết áp rất tốt. Ngoài ra, theo một nghiên cứu được công bố trên tạp chí Nature and Science thì các chất trong lá chùm ruột có thể ức chế và tiêu diệt vi

DaihocDaNang

2

khuẩn E. coli và khuẩn tụ cầu rất tốt.Vì vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của lá cây chùm ruột” làm luận văn thạc sĩ nhằm đóng góp thông tin khoa học về thành phần hóa học của loài cây này.

2. Đối tượng và mục đích nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu

Lá cây chùm ruột (Phyllanthus acidus (L.) Skeels) được thu hái vào tháng 9 năm 2014, tại quận Liên Chiểu, Đà Nẵng.

2.2. Mục đích nghiên cứu - Xác định một số thông số hóa lý của lá chùm ruột. - Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số

hợp chất có trong lá chùm ruột. - Phân lập một số chất có trong lá chùm ruột (Phyllanthus

acidus (L.) Skeels) ở Liên Chiểu – Đà Nẵng. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết - Tham khảo các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài

nghiên cứu. - Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về đặc

điểm hình thái thực vật, nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học, ứng dụng của lá chùm ruột.

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách, phân lập và xác định thành phần hóa học các chất từ thực vật.

3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Xử lí mẫu: Lá chùm ruột được rửa sạch, phơi khô và xay nhỏ. - Phương pháp ngâm chiết mẫu. - Xác định độ ẩm hàm lượng tro bằng phương pháp trọng lượng. - Phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử để xác định

hàm lượng các kim loại trong lá chùm ruột.

DaihocDaNang

3

- Phương pháp sắc ký khí – khối phổ liên hợp (GC/MS) thực hiện khi chiết soxhlet với các dung môi có độ phân cực tăng dần, xác định các thành phần có trong dịch chiết.

- Phân lập một số chất trong dịch chiết lá chùm ruột bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, các phương pháp kết tinh phân đoạn.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Cung cấp các thông tin khoa học về quy trình chiết tách các

chất trong lá chùm ruột. - Cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoa học về thành phần

được chiết tách từ loài Phyllanthus acidus (L.) Skeels và qua đó góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của chúng trong ngành dược liệu.

5. Bố cục luận văn Luận văn có cấu trúc như sau:

Mở đầu (3 trang) Chương 1. Tổng quan (11 trang) Chương 2. Nghiên liệu và phương pháp nghiên cứu (31 trang) Chương 3. Kết quả và thảo luận (40 trang) Kết luận và kiến nghị (2 trang)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CHI PHYLLANTHUS - HỌ PHYLLANTHACEAE 1.2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT

1.2.1. Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây tầm ruột, cây tùm ruột, cây chùm ruột. - Tên tiếng Anh: Otaheite gooseberry, Mala gooseberry,

Tahitian gooseberry, Country gooseberry, Star gooseberry, West India gooseberry, Simply gooseberry tree.

DaihocDaNang

4

- Tên khoa học: Phyllanthus acidus (L.) Skeels, họ Diệp hạ châu (Phyllanthaceae).

- Tên đồng nghĩa: Ph. distichus; Cicca acida; C. disticha; Averrhoa acida.

- Phân loại khoa học: (Theo Hệ thống APG III - 2009). 1.2.2. Nguồn gốc và phân bố a. Trên thế giới b. Ở Việt Nam Cây chùm ruột trồng phổ biến ở miền Nam vừa làm cây cảnh

trước sân, trong vườn vừa được dùng làm rau, lấy quả. 1.2.3. Điều kiện sinh trưởng và phát triển 1.2.4. Mô tả chung về cây chùm ruột a. Thân b. Rễ c. Lá d. Hoa e. Quả f. Nhân 1.2.5. Các nghiên cứu về dược tính trong y học dân gian ở

Việt Nam và trên thế giới a. Dược tính theo Đông y Việt Nam b. Dược tính theo y học nước ngoài c. Dược tính theo Y học cổ truyền nước ngoài d. Dược tính theo Tây Y

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.1.1. Nguyên liệu Lá cây chùm ruột (Phyllanthus acidus (L.) Skeels) được thu

hái vào tháng 9 năm 2014, tại quận Liên Chiểu, Đà Nẵng.

DaihocDaNang

5

2.1.2. Xử lí nguyên liệu Lá chùm ruột sau khi hái được rửa sạch, để khô trong không

khí, sau đó nghiền nhỏ, bảo quản trong bao polyetylene và đựng trong hộp nhựa có nắp.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất a. Thiết bị, dụng cụ - Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS. - Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer. - Bộ chiết soxhlet, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bếp cách

thủy, sinh hàn hồi lưu, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình tam giác, ống đong, bếp điện, phễu lọc, phễu chiết, các loại pipet, bình định mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, bản mỏng, cột chạy sắc ký...

b. Hóa chất Bảng 2.1. Hóa chất được sử dụng trong quá trình làm thí nghiệm

STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc 2 Chloroform Tinh khiết TCCS Trung Quốc 3 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc 4 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc

5 Ethanol tuyệt đối Tinh khiết TCCS Việt Nam

6 Dung dịch H2SO4

Đậm đặc (98%) TCCS Trung Quốc

7 Dung dịch HNO3

Đậm đặc (63%) TCCS Trung Quốc

8 Dung dịch CH3COOH

Đậm đặc (98%) TCCS Trung Quốc

9 Silicagen Tinh khiết TCCS Đức 10 Vanilin Thương mại TCCS Trung Quốc

DaihocDaNang

6

2.1.4. Sơ đồ chiết tách bằng phương pháp chiết soxhlet

Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm chiết soxhlet

DaihocDaNang

7

2.1.5. Sơ đồ chiết tách, xác định thành phần hóa học của các phân đoạn từ tổng cao metanol

Hình 2.5. Sơ đồ điều chế cao chiết

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp phân tích trọng lượng 2.2.2. Cơ sở lý thuyết của phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS 2.2.3. Cơ sở lý thuyết về phương pháp chiết a. Định nghĩa b. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng c. Phương pháp chiết soxhlet

DaihocDaNang

8

2.2.4. Cơ sở lý thuyết của phương pháp GC/MS 2.3. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ

2.3.1. Xác định độ ẩm 2.3.2. Xác định hàm lượng tro 2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại

2.4. CHIẾT SOXHLET VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT 2.5. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT LÁ CHÙM RUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH

2.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến quá trình chiết bột lá chùm ruột

a. Ảnh hưởng của nhiệt độ sôi b. Ảnh hưởng của thời gian 2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ rắn - lỏng đến quá trình

chiết bột lá chùm ruột 2.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến quá trình

chiết bột lá chùm ruột 2.6. ĐIỀU CHẾ CAO CHIẾT CHO PHÂN LẬP BẰNG SẮC KÝ 2.7. KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG

2.7.1. Nguyên tắc 2.7.2. Chuẩn bị dụng cụ và thuốc thử 2.7.3. Cách tiến hành 2.7.4. Cách hiện hình vết sắc ký để xác định Rf

2.8. SẮC KÝ CỘT 2.8.1. Lựa chọn dung môi 2.8.2. Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột 2.8.3. Nạp mẫu vào cột ở dạng khô

DaihocDaNang

9

2.8.4. Chạy cột tổng silicagel 2.8.5. Dung môi giải ly 2.8.6. Theo dõi quá trình giải ly 2.8.7. Chọn phân đoạn tiếp tục khảo sát

2.9. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua

giếng thạch với hai chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureu tại Trung tâm chất lượng Nông Lâm Thuỷ sản vùng 2- NAFIQAD- 31 Ngũ Hành Sơn, Đà Nẵng.

2.9.1. Nguyên liệu 2.9.2. Hóa chất 2.9.3. Dụng cụ 2.9.4. Phương pháp

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ

3.1.1. Độ ẩm Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của bột lá chùm ruột

STT m0 (g) m1 (g) m2 (g) Độ ẩm(%) 1 35.069 5.009 39.590 9.742 2 39.007 5.010 43.498 10.359 3 35.477 5.004 40.019 9.232

Độ ẩm trung bình 9.778 Nhận xét: Độ ẩm trung bình của bột lá chùm ruột khô là 9.778%, đây là

độ ẩm tương đối an toàn. Với độ ẩm này, bột lá chùm ruột khô có thể giữ được chất lượng tốt khi bảo quản trong thời gian dài mà không bị ẩm mốc, đảm bảo yêu cầu cho bột dược liệu.

DaihocDaNang

10

3.1.2. Hàm lượng tro Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng tro của lá chùm ruột

STT m0 (g) m1(g) m3(g) Tro (%) 1 35.069 5.009 35.398 6.568 2 39.007 5.010 39.311 6.068 3 35.477 5.004 35.804 6.535

Hàm lượng tro trung bình 6.390 Nhận xét: Vậy hàm lượng tro trung bình là 6.390%. Từ bảng

trên ta thấy, trong lá chùm ruột có chứa hàm lượng lớn chất hữu cơ và một lượng rất nhỏ các chất vô cơ, trong đó có thể có mặt các hợp chất của một số kim loại.

3.1.3. Hàm lượng kim loại Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại trong lá chùm ruột

STT

Kim

loại

Phương pháp thử (AAS)

Kết quả (mg/l)

Kết quả (mg/kg)

Hàm lượng cho

phép (mg/kg)

1 Pb TCVN 6193:1996 0.090610 0.044327 2 2 Cu TCVN 6193:1996 1.942611 0.097498 30 3 As TCVN 6826:2000 0.000214 0.000010 1

Nhận xét: Hàm lượng kim loại Pb, Cu, As có trong lá chùm ruột là rất

thấp. Đây là một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá việc sử dụng lá chùm ruột làm dược liệu là an toàn, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.

Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BHT – QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô,tôi nhận thấy hàm lượng kim loại nặng có trong lá chùm ruột thấp hơn nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép. Do vậy có thể dử dụng an toàn lá chùm ruột trong dược liệu, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

DaihocDaNang

11

3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÁC DỊCH CHIẾT SOXHLET KHÁC NHAU TỪ LÁ CHÙM RUỘT

Chiết soxhlet với các dung môi hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol bằng cách sử dụng nồi cách thủy và thu được 4 dịch chiết tương ứng với dung môi chiết.

3.2.1. Kết quả khối lượng cao chiết Bảng 3.4. Khối lượng cao của các dịch chiết hexane, ethyl acetate,

chloroform, methanol

STT Dung môi Khối lượng mẫu bột (g)

Khối lượng cao chiết (g)

% cao chiết (%)

1 hexane 30.002 2.083 6.943 2 ethyl acetate 30.004 2.234 7.446 3 chloroform 30.002 2.354 7.846 4 methanol 30.007 6.510 21.695

Nhận xét: Từ bảng 3.4, ta nhận thấy methanol có % cao chiết lớn nhất,

đứng thứ hai là chloroform và thứ ba là ethyl acetate. 3.2.2. Dịch chiết soxhlet bằng hexane

Sắc kí đồ GC của dịch chiết hexane từ lá chùm ruột được thể hiện ở hình 3.2. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết được đưa ra ở bảng 3.5.

Nhận xét: Từ bảng 3.5 cho thấy phương pháp GC/MS đã định danh được

11 cấu tử trong dịch chiết hexane từ lá chùm ruột, chiếm 62,79% trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Các cấu tử có hàm lượng > 5% như γ-Sitosterol (8.02%), Vitamin E (6.44%), Palmitic acid (6.34%), α-Linolenic acid (5.52%). Ngoài ra còn thấy xuất hiện Stigmasterol (2.68%).

DaihocDaNang

12

3.2.3. Dịch chiết soxhlet bằng dung môi chloroform Sắc kí đồ GC của dịch chiết chloroform từ lá chùm ruột được

thể hiện ở hình 3.3. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết được đưa ra ở bảng 3.6.

Nhận xét: Từ bảng 3.6 cho thấy phương pháp GC/MS đã định danh được

14 cấu tử trong dịch chiết chloroform từ lá chùm ruột, chiếm 73,40% trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Các cấu tử có hàm lượng > 5% như 1-Heptacosanol (19.49%), γ-Sitosterol (8.10%), Vitamin E (5.05%), Palmitic acid (5.50%). Ngoài ra còn thấy xuất hiện Stigmasterol (2.37%), Stearic acid (1.72%).

3.2.4. Dịch chiết soxhlet bằng dung môi ethyl acetate Sắc kí đồ GC của dịch chiết ethyl acetate từ lá chùm ruột được

thể hiện ở hình 3.4. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết được đưa ra ở bảng 3.7.

Nhận xét: Từ bảng 3.7 cho thấy phương pháp GC/MS định danh được 10

cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate từ lá chùm ruột, chiếm 75,93% trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Các cấu tử có hàm lượng > 5% như γ –Sitosterol (13.45%), Palmitic acid (13.33%), α-Linolenic acid (5.90%), Vitamin E (5.40%). Ngoài ra còn thấy xuất hiện Stigmasterol (3.69%), Ergost-5-en-3β-ol (2.93%).

3.2.5. Dịch chiết soxhlet bằng dung môi methanol Sắc kí đồ GC của dịch chiết methanol từ lá chùm ruột được thể

hiện ở hình 3.5. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết được đưa ra ở bảng 3.8.

Nhận xét: Từ bảng 3.8 cho thấy phương pháp GC/MS đã định danh được

13 cấu tử trong dịch chiết methanol từ lá chùm ruột, chiếm 85,09%

DaihocDaNang

13

trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Các cấu tử có hàm lượng > 5% như Palmitic acid (17.42%), γ –Sitosterol (11.62%), α-Linolenic acid (10.10%), All-trans-Squalene (7.11%), Phytol (6.09%), Stearic acid (5.45%). Ngoài ra còn thấy xuất hiện Methyl palmitate (1.89%), Campesterol (1.73%).

3.2.6. Tổng kết thành phần trong các dịch chiết từ lá chùm ruột Bảng 3.9. Thành phần hóa học trong các dịch chiết soxhlet từ

lá chùm ruột Diện tích peak (%)

STT Tên gọi hexane chloroform ethyl acetate methanol

1 Pinane 0.67 - - - 2 Palmitic acid 6.34 5.50 13.33 17.42 3 Phytol 10.55 2.50 14.26 6.09 4 α-Linolenic acid 5.52 2.96 5.90 10.10 5 All-trans-Squalene 5.28 4.76 9.01 7.11 6 9-Octylheptadecane 9.58 9.22 - - 7 Vitamin E 6.44 5.05 5.40 4.15 8 1,19-Eicosadiene 6.43 5.83 - - 9 Stigmasterol 2.68 2.37 3.69 2.94

10 Octacosyl trifluoroacetate 1.28 - - -

11 γ-Sitosterol 8.02 8.10 13.45 11.62

12 2,6,6Trimethylbicyclo[3.1.1] heptane - 1.51 3.85 2.67

13 Stearic acid - 1.72 4.11 5.45

14 1-Iodo-2-methylundecane - 1.36 - -

15 1-Heptacosanol - 19.49 - -

16 2-Hexadecyloxirane - 3.12 - -

17 Ergost-5-en-3β-ol - - 2.93 - 18 Methyl palmitate - - - 1.89 19 Campesterol - - - 1.73

DaihocDaNang

14

Diện tích peak (%) STT Tên gọi hexane chloroform ethyl

acetate methanol

20

1-Butanamine, 2-methyl-N-(2-methylbutylidene) (C10H21N)

- - - 1.57

21

4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-

- - - 12,35

Nhận xét chung: Từ bảng 3.9 cho thấy phương pháp GC/MS đã định danh được

21 cấu tử trong cả 4 dịch chiết; trong đó, dịch chiết hexane được 11 cấu tử, dịch chiết chloroform được 14 cấu tử, dịch chiết ethyl acetate được 10 cấu tử, dịch chiết methanol được 11 cấu tử. Phần trăm diện tích peak các cấu tử được định danh trong dịch chiết methanol là lớn nhất (85,09%), sau đó đến dịch chiết etyl axetat (75.93%), dịch chiết chloroform (73.40%), và nhỏ nhất là dịch chiết hexane (62.79%). Điều này chứng tỏ ethyl acetate có khả năng hòa tan tốt và chiết được nhiều cấu tử phân cực lẫn không phân cực với hàm lượng lớn từ lá chùm ruột. 3.3. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT LÁ CHÙM RUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG NINH

Dựa vào kết quả ở bảng 3.7, cho thấy dung môi ethyl acetate chiết được khá nhiều các cấu tử có nhiều ứng dụng trong y học như Phytol, All-trans-Squalene, γ-Sitosterol, Vitamin E, Stigmasterol với hàm lượng lớn.

3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian Bảng 3.10. Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng dung môi ethyl

acetate

DaihocDaNang

15

STT Thời gian

Khối lượng mẫu bột lá chùm ruột

(g)

Khối lượng cao chiết (g)

% cao chiết (%)

1 2h 10.004 0.484 4.838 2 4h 10.001 0.488 4.879 3 6h 10.005 0.510 5.097 4 8h 10.002 0.515 5.148 5 10h 10.004 0.515 5.147

Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.10 ta nhận thấy thời gian chưng

ninh thích hợp với dung môi ethyl acetate là 8h. Tại thời gian này, phần trăm chất chiết thu được có giá trị lớn nhất là 5,148%. Khi tăng thời gian lên thêm nữa thì phần trăm chất chiết thu được có xu hướng gần như không đổi.

3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết bằng dung môi ethyl

acetate

STT Nhiệt độ Khối lượng mẫu bột lá

chùm ruột (g)

Khối lượng cao chiết (g)

% cao chiết (%)

1 50oC 10.001 0.325 3.250 2 60oC 9.999 0.345 3.450 3 70oC 10.004 0.398 3.978 4 80oC 10.000 0.448 4.480 5 90oC 10.003 0.450 4.498

Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.11. ta nhận thấy nhiệt độ chưng

ninh thích hợp với dung môi ethyl acetate là 800C. Tại nhiệt độ này, phần trăm chất chiết thu được có giá trị là 4,480%. Khi tăng thời gian lên thêm nữa thì phần trăm chất chiết thu được có xu hướng tăng theo do nhiệt độ tỉ lệ thuận với tốc độ phản ứng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá cao có thể làm cho một số chất trong dịch chiết lá chùm ruột cũng bị phân hủy bởi nhiệt.

DaihocDaNang

16

3.3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn – lỏng Bảng 3.12. Kết quả khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng chiết bằng dung

môi ethyl acetate

STT

Thể tích

dung môi (ml)

Khối lượng mẫu bột lá chùm ruột

(g)

Khối lượng

cao chiết (g)

% cao chiết (%)

Tỉ lệ rắn- lỏng

1 60 10.000 0.441 4.410 1:6 2 80 9.998 0.537 5.371 1:8 3 100 10.000 0.577 5.770 1:10 4 120 10.002 0.578 5.778 1:12 5 140 10.001 0.578 5.809 1:14

Nhận xét: Với 10g mẫu, thể tích dung môi thích hợp dùng để chưng ninh

là 100ml, tỉ lệ rắn - lỏng là 1:10. Với tỉ lệ này thu được phần trăm chất chiết là 5.770%. Ở thể tích này thị lượng chất tách ra gần như hoàn toàn và tăng thêm không đáng kể khi tăng thể tích.

3.3.4. Ảnh hưởng của số lần chiết Bảng 3.13. Kết quả chưng ninh bột lá chùm ruột trong dung

môi ethyl acetate ở điều kiện thích hợp Khối lượng mẫu

bột lá chùm ruột (g)

Lần chiết Khối lượng cao chiết (g)

% cao chiết (%)

Lần 1 0.591 5.910 Lần 2 0.113 1.130 Lần 3 0.004 0.400 10.000

Tổng 0.708 7.080 Nhận xét: Lượng cao chiết sau 3 lần chưng ninh với 100 ml dung môi

ethyl acetate là 7.080%. Khối lượng cao chiết lần 1, lần 2, lần 3 so với tổng khối lượng cao cả 3 lần chiết lần lượt là 83.476%, 15.890%,

DaihocDaNang

17

0.634%. Lượng cao chiết soxhlet dung môi ethyl acetate là 7.446%, cho thấy chiết soxhlet hiệu quả hơn chiết chưng ninh. Ta thấy khối lượng cao chiết lần 3 thu được là không đáng kể so với tổng khối lượng cao nên chỉ cần chưng ninh 2 lần (7,01%) là đã chiết được gần hết các chất trong lá chùm ruột.

Như vậy, tiến hành chiết bằng phương pháp chưng ninh bột lá chùm ruột bằng dung môi ethyl acetate thì điều kiện thích hợp là: thời gian là 8 giờ, nhiệt độ 800C, tỉ lệ rắn - lỏng là 1:10 (g/ml) sau 2 lần chiết thì hiệu suất chiết là:

7,01 .100 94, 22%

7, 446=

3.4. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ TỔNG CAO METHANOL TỪ LÁ CHÙM RUỘT BẰNG CHIẾT PHÂN ĐOẠN LỎNG - LỎNG Dùng phương pháp chưng ninh với dung môi methanol để thu cao methanol. Từ cao tổng methanol thực hiện chiết lỏng - lỏng lần lượt với dung môi hexane và ethyl acetate được các cao chiết tương ứng. Cân xác định khối lượng và tiến hành đo GC/MS được các phổ.

3.4.1. Cao chiết hexane từ tổng cao methanol Sắc kí đồ GC của dịch chiết hexane từ tổng cao methanol của

lá chùm ruột được thể hiện ở hình 3.6. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết được đưa ra ở bảng 3.14.

Nhận xét: Từ bảng 3.14 cho thấy phương pháp GC/MS đã định danh

được 5 cấu tử trong dịch chiết hexane từ lá chùm ruột, chiếm 5,49 % trong tổng số các cấu tử phát hiện. Các cấu tử có hàm lượng dưới 1% như 2(4H)-Benzofuranone, 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-, (R)- (0,77%), Fumaric acid, ethyl 2-methylallyl ester (0,46%),

DaihocDaNang

18

Ethyl citrate (0,47%), Hexadecanoic acid, methyl ester (0,42%). Ngoài ra còn thấy xuất hiện Hexadecane, 2,6,10,14-tetramethyl (3,37%).

3.4.2. Cao chiết ethyl acetate từ tổng cao methanol Sắc kí đồ GC của dịch chiết ethyl acetate từ tổng cao methanol

của lá chùm ruột được thể hiện ở hình 3.7. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết được đưa ra ở bảng 3.15.

Nhận xét: Từ bảng 3.15 cho thấy phương pháp GC/ MS đã định danh

được 13 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate từ lá chùm ruột, chiếm 30,96% trong tổng số các cấu tử phát hiện. Các cấu tử có hàm lượng dưới 3% như Heptadecane, 9-octyl (1,03%), Octadecanoic acid (1,40%), cis-Vaccenic acid (2,13%), 9,12 Octadecadienoic acid (Z,Z)- (2,64%), 9,15-Octadecadienoic acid, methyl ester, (Z,Z)- (1,22), Hexadecanoic acid, methyl ester (1,06), Tetradecanoic acid (1,29), Benzoic acid (1,03%), Succinic anhydride (1,12), và 2-Methoxy-4-vinylphenol (1,19). Ngoài ra còn thấy xuất hiện 2(3H)-Furanone, dihydro-5-methyl (3,73%), Butanedioic acid, monomethyl ester (4,79) và Hexadecanoic acid (8,33%). 3.5. KẾT QUẢ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE

Quá trình phân lập chất từ cao chiết ethyl acetate được trình bày trên sơ đồ hình 3.8.

DaihocDaNang

19

Hình 3.8. Sơ đồ phân lập chất từ cao ethyl acetate 3.5.1. Kết quả chạy cột tổng và cột sắc kí phân đoạn Với lượng cao ethyl acetate từ tổng cao methanol là 5,113g, sử

dụng cột sắc kí 35∅= cm thu được 8 phân đoạn: - Phân đoạn E.A1 đến E.A5 được gộp lại thành 1 phân đoạn

EA1.5, cho bay hơi tự nhiên thành cao, cân cao được 0,393g. - Đem EA1.5 chạy cột sắc kí phân đoạn, sử dụng cột sắc kí

phân đoạn 10∅= cm thu được 2 phân đoạn nhỏ là Aa1.6 (0,117g) và Aa7.17 (0,209g). Đem các phân đoạn Aa1.6 và Aa7.17 đi đo GC/ MS. Sắc ký đồ Aa7.17 được thể hiện ở hình 3.9 và kết quả định danh được thành phần trình bày ở bảng 3.16.

- Phân đoạn E.A6 đến E.A8 được gộp lại thành 1 phân đoạn EA6.8, cho bay hơi tự nhiên, cân cao được 0,348g. Tiến hành tách riêng phân đoạn EA6.8 được 2 phân đoạn nhỏ là phân đoạn ea1

DaihocDaNang

20

(0,125g) và phân đoạn ea2 (0,136g). Sắc ký đồ ea1 và ea2 được thể hiện ở hình 3.10, hình 3.11 và kết quả định danh được thành phần trình bày ở bảng 3.17 và 3.18.

3.5.2. Sắc ký đồ GC phân đoạn Aa7.17 Từ kết quả ở bảng 3.16 cho thấy phương pháp GC/MS đã định

danh được 6 cấu tử và chiếm 50,15% trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Cấu tử có hàm lượng dưới 1% là Phenol, 2-methoxy- (0,13%), cis-Vaccenic acid (0,17%) và 2-Methoxy-4-vinylphenol (0,35%). Cấu tử có hàm lượng >5% là n-Hexadecanoic acid (5,10%), và Benzaldehyde, 2-methyl- (40,66%).

3.5.3. Sắc ký đồ GC phân đoạn ea1 Từ kết quả ở bảng 3.17 cho thấy phương pháp GC/MS đã định

danh được 4 cấu tử và chiếm 6,67% trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Cấu tử có hàm lượng <2 % là 2(3H)-Furanone, dihydro-5-methyl- (0,04%), 2-Methoxy-4-vinylphenol (1,09%) và n-Hexadecanoic acid (1,84%). Ngoài ra cis-Vaccenic acid chiếm hàm lượng cao nhất lên đến 3,7%.

3.5.4. Sắc ký đồ GC phân đoạn ea2 Từ kết quả ở bảng 3.18 cho thấy phương pháp GC/MS đã định

danh được 3 cấu tử và chiếm 2,59% trong tổng số các cấu tử phát hiện được. Cấu tử có hàm lượng <1% là 2(3H)-Furanone, dihydro-5-methyl- (0,06%), và Succinic anhydride (0,13%). Ngoài ra 2-Methoxy-4-vinylphenol chiếm hàm lượng cao nhất 2,40%. 3.6. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH

Tiến hành khảo sát tính kháng khuẩn của các cao chiết lá chùm ruột với hai vi khuẩn E.coli và Staphylococcus. Kết quả xác định bằng tạo vòng kháng khuẩn của các cao chiết.

DaihocDaNang

21

Các hình 3.12 và 3.13 cho thấy kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các dịch chiết lá chùm ruột trong các dung môi ethanol, methanol và ethyl acetate.

3.6.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn E.Coli

Hình 3.12. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn E.Coli

Khi thử 3 dịch chiết của các dung môi methanol, ethanol và ethyl acetate với vi khuẩn E.Coli thì chỉ có dịch chiết với dung môi ethyl axetat tạo vòng tròn kháng khuẩn với đường kính kháng khuẩn là 20mm. Còn dịch chiết với dung môi methanol và ethanol thì không tạo vòng kháng khuẩn với vi khuẩn E.Coli.

3.6.2. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus

DaihocDaNang

22

Hình 3.13. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus

aureus Khi thử 3 dịch chiết của các dung môi methanol, ethanol và

ethyl acetate với vi khuẩn Staphylococcus aureus thì chỉ có dịch chiết ethyl acetate tạo vòng tròn kháng khuẩn với đường kính kháng khuẩn là 16 mm. Còn dịch chiết của các dung môi methanol và ethanol thì không tạo vòng kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus.

Nhận xét chung: Từ hình 3.12 và 3.13, ta thấy dịch chiết với dung môi ethyl

acetate đối với hai loại vi khuẩn kiểm định đều xuất hiện vòng kháng khuẩn, dịch chiết ethyl acetate có khả năng kháng vi khuẩn E.coli mạnh hơn so với vi khuẩn Staphylococcus, cho vòng kháng khuẩn to và rõ nét hơn. Dịch chiết với dung môi methanol tạo vòng nhỏ, mờ

DaihocDaNang

23

và không rõ nét. Riêng đối với dịch chiết ethanol không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm đinh.

Như vậy, dịch chiết với dung môi ethyl acetate lá chùm ruột có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định, với dịch chiết của dung môi ethanol và methanol thì không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Sau khi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học của một số dịch chiết lá chùm ruột”, tôi đã thu được một số kết quả như sau:

1. Xác định được các thông số hóa lý của nguyên liệu lá chùm ruột:

- Độ ẩm trung bình của bột lá chùm ruột khô là 9.778%. - Hàm lượng tro trung bình là 6.390%. - Hàm lượng các kim loại As, Pb, Cu đều nằm trong khoảng

cho phép theo quyết định của Bộ Y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 04 năm 1992 về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô.

2. Dùng phương pháp chiết soxhlet đã xác định và định danh bằng GC/MS được 11 cấu tử trong dịch chiết hexane, 14 cấu tử trong dịch chiết chloroform, 10 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate và 13 cấu tử trong dịch chiết methanol.

3. Dùng phương pháp chiết lỏng - lỏng với tổng cao methanol và định danh bằng GC/MS đã định danh được 5 cấu tử trong dịch chiết hexane, 13 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate.

DaihocDaNang

24

4. Đã khảo sát các điều kiện của quá trình chiết chưng ninh với dung môi ethyl acetate cho kết quả tốt nhất là: thời gian: 8 giờ, nhiệt độ: 80oC, tỉ lệ rắn - lỏng: 1(g):10(ml)

5. Hoạt tính sinh học Cao chiết phân đoạn ethyl acetate lá chùm ruột có hoạt tính

kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định, với cao chiết phân đoạn methanol và ethanol không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định.

Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn, thông qua kết quả của đề tài

chúng tôi mong muốn đề tài được phát triển rộng hơn về một số vấn đề như sau:

1. Trong quá trình nghiên cứu, tôi có kiến nghị sau: Hàm lượng Phytol, γ-Sitosterol, All-trans-Squalene, Vitamin E

trong lá chùm ruột tương đối cao, nên có thể xem lá chùm ruột là nguồn dược liệu quý. Vì vậy cần nghiên cứu các phương pháp tách các cấu tử có nhiều ứng dụng trong y học và thực phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu cuộc sống. Đồng thời thử hoạt tính sinh học của các chất tách được để có cái nhìn tổng quát về hoạt tính sinh học của lá chùm ruột, góp phần làm tăng giá trị sử dụng cũng như chữa bệnh của lá chùm ruột.

2. Các kết quả nghiên cứu trên đây là cơ sở để có thể tạo ra một chế phẩm có hoạt tính độc tế bào, góp phần vào việc điều trị bệnh từ cao chiết EtOAc lá chùm ruột, một loài cây được trồng rất phổ biến ở các thành phố lớn trong cả nước.

DaihocDaNang