1

Høyoppløselig LC‐MSNITO‐kurs i kromatografi og massespektrometri

Trondheim 24.05.2018Åse Marit Leere Øiestad

2

Oversikt

• Bakgrunn og definisjoner

• Prinsipper for ulike høyoppløsnings‐instrumenter

• Eksempler fra rettstoksikologiske prøver

• Oppsummering

2

3

Bakgrunn

• Måling av nøyaktig masse når man har tilstrekkeliggod oppløsning gjør det mulig å begrense det store antallet av mulige molekylformler som kan gi opphavtil en spesifikk molekylmasse.

“If the mass of an ion from a chemical compound is determined with sufficient accuracy, the elemental composition of that compound could be deduced” 

– Beynon JH. Qualitative analysis of organic compounds by mass spectrometry. Nature 174 (1954) 735‐37.

4

Bakgrunn

• Høyoppløsnings massespektrometri:

– Oppløsning > 10 000.

– m/z for hvert ion måles med en nøyaktighet på flere desimaler (oftest 4).

– Kan skille mellom stoffer som har samme nominell masse.

– Til sammenlikning har kvadrupolinstrumenter typisk massenøyaktighet på 0 ‐ 1 desimal.

3

5

Bruksområder

• Vanlige bruksområder for høyoppløsningsinstrumenter:

– Proteomikk/metabolomikk

– Non‐targeted screening av matvarer eller miljøprøver

– Analyse av urenheter innen f.eks. farmasøytisk produksjon

– Metabolittidentifisering

– Strukturoppklaringer

– Utvikling av nye legemidler

• Etterhvert også bruk innen kliniske/toksikologiskemiljøer

6

Høyoppløsningsmassespektrometre

• Ulike typer instrumenter som kan gi høy oppløsning:

– Magnetsektorinstrumenter

– FT‐ICR‐MS (Fouriertransformasjon‐ionesyklotronresonans MS)

– TOF‐MS (time‐of‐flight MS)

– Orbitrap

• Magnetsektorinstrumenter var den første typen som ble brukt til 

å bestemme nøyaktig masse, men har ikke like god 

massenøyaktighet og oppløsning som de andre instrumentene.

• FT‐ICR‐MS krever superledende magnet og er kostbar i innkjøp 

og drift.

• TOF og Orbitrap mest brukt. Begge typer instrumenter har 

mulighet for å ha en konfigurasjon slik at man får MS/MS‐data.

4

7

Fordeler med høyoppløsningsmassespektrometri:

– Sikrere identifisering av forbindelser vha. nøyaktig masse, isotopmønster og evt. fragmentering/spektra.

– Kan måle mange flere stoffer i samme kjøring enn med trippelkvadrupoler. «All of the ions, all of the time», men i praksis er det noen begrensninger.

– Kan legge til nye stoffer i metoden uten at det går utover kvaliteten og med liten grad av metodeutvikling (viktig å bestemme cut‐off).

– Retrospektiv analyse – kan se etter nye stoffer uten å måtte analysere prøven på nytt.

– Mulig å få en tentativ bestemmelse av stoffer man ikke har referanser for.

8

Ulemper med høyoppløsningsmassespektrometri:

– Genererer store datafiler for hvert run.

– Krever mye datakraft.

– Kan ikke skille strukturisomerer hvis de ikke separeres kromatografisk.

– Dårligere følsomhet enn de beste trippelkvadrupolene.

– Krever en god del opplæring

5

C11H12Cl2N2O5

Nominell masse Molekylmasse Monoisotopisk masse Eksakt masse

Forbindelse

Molekylmasse = summen av gjennom-snittsmassene til elementene i molekylet

Monoisotopisk masse = summen av de eksaktemassene til isotopene til elementene i molekylet

Isotoper er atomer som inneholder samme antall protoner, men ulikt antall nøytroner.  Antallet protoner (atomnummeret) er det samme for hver isotop, f.eks. karbon‐12, karbon‐13 og karbon‐14 har alle 6 protoner, men antallet nøytroner i hver isotop er forskjellig.

Kloramfenikol(øyedråper)

Nominell masse = summen av massetallene til de hyppigst fore-kommende isotopene til elementene i molekylet

Definisjoner I

322 323.132 322.01212C11

1H1235Cl214N2

16O5

12C1013C1H12

35Cl214N216O5

323.012

Massespektrometeret måler eksakte og diskrete verdier!C6

12 1312.0107

carbon

C11H12Cl2N2O5

Nominell masse Molekylmasse Monoisotopisk masse Eksakt masse

Forbindelse

Molekylmasse = summen av gjennom-snittsmassene til elementene i molekylet

Monoisotopisk masse = summen av de eksaktemassene til isotopene til elementene i molekylet

Isotoper er atomer som inneholder samme antall protoner, men ulikt antall nøytroner.  Antallet protoner (atomnummeret) er det samme for hver isotop, f.eks. karbon‐12, karbon‐13 og karbon‐14 har alle 6 protoner, men antallet nøytroner i hver isotop er forskjellig.

Kloramfenikol(øyedråper)

Nominell masse = summen av massetallene til de hyppigst fore-kommende isotopene til elementene i molekylet

Definisjoner I forts.

322 323.132 322.012

C6

12 1312.0107

carbonH1

1 21.00794

hydrogenCl17

35 3735.453

chlorineN7

14 1514.0067

nitrogenO8

16 17 1815.9994

oxygen

6

Isotoper

element    isotope abundance(%) exact mass average mass

C 12C 98.9% 12.000000 12.01113C 1.1% 13.003355

H 1H >99.98% 1.007825 1.00794N 14N 99.63% 14.003074 14.0067

15N 0.37% 15.000108O 16O 99.76% 15.994915 15.994

18O 0.2% 17.99916Cl 35Cl 75.77% 34.968852 35.453

37Cl 24.23% 36.965903

12

Definisjoner I forts.• Beregnet eksakt masse (monoisotopisk):

– Beregnet basert på massene til de individuelle isotopene for et gitt ion. Vanligvis isotopene med lavest masse.

– Metadon – eksakt masse = 309,20926

– Men vi måler som regel MH+‐ioner, dvs. eksakt masse = 310,21654

• Nøyaktig masse (egentlig «målt eksakt masse»):

– Det vi måler med instrumentene (MH+)

7

13

Massenøyaktighet

• Massenøyaktigheten er forskjellen ΔM mellom eksakt 

masse og målt eksakt masse. Oppgis enten som mDa

eller som ppm (ΔM/M x 106).

• God massenøyaktighet er < 5 ppm eller < 3 mDa

– Morfin (M=285,34), 5 ppm ≈ 1,4 mDa

– Amfetamin (M=135,21), 5 ppm ≈ 0,68 mDa

14

Oppløsning

• Masseoppløsningsevne:

– defineres som evnen til å separere ioner med nærliggende 

m/z

• Masseoppløsningen:

– er målet på separasjonen av de to toppene i massespekteret

• Oppgis gjerne som R=10 000, 20 000, 40 000 etc.

• Høy oppløsning

– muliggjør måling av nøyaktig masse.

– gir sikrere identifisering.

– øker kvantitativ nøyaktighet («siler» bort andre forbindelser 

som ellers kunne forstyrret).

8

Masseoppløsning: R = m/m

Stor verdi for R:God masseseparasjon

50%

10%

m m +

m

m

Masseoppløsning

Masseoppløsning vs. massenøyaktighet

Lav oppløsningLav nøyaktighet

Høy oppløsning (R>20 000)Høy nøyaktighet (E<3 ppm)

249.0577 249.0702 249.1473249

9

17

Definisjoner II

• Isobar:

– Atomære eller molekylære spesies med samme nominelle masse, men forskjellig eksakt masse.

• Isomer:

– Forbindelser som har samme molkylformel, men hvor atomene er fordelt ulikt

• Strukturisomere: atomene og de funksjonelle gruppene er satt sammen på ulike måter.

• Stereoisomere: bindingsstrukturen er den samme, men den geometriske posisjonen av atomer og funksjonelle grupper i rommet er ulik.

18

Differensiering mellom isobariske forbindelser på grunnlag av nøyaktig masse

Metamfetamin MH+ C10H16N = 150.1

Eksakt masse 150.12773

Katinon MH+ C9H12NO = 150.1

Eksakt masse 150.09134

ΔM = 36.4 mDa or 242 ppm

10

19

Bruk av retensjonstid for å skille isomere

E. Tyrkkö, A. Pelander, I. Ojanperä, Prediction of liquid chromatographic retention for differentiation of

structural isomers, Analytica Chimica Acta, 720 (2012) 142.

DMA=dimetoksyamfetamin

20

Mulige formler for små molekyler med elementene C, H, N, O, P, S og Cl

Grange and Sovocool, Liquid chromatography Time-of-Flight Mass Spectometry: Principles, Tools, and

Applications for Accurate Mass Analysis. Edited by I. Ferrer, E.M. Thurman, Wiley 2009

11

21

Bruk av isotopmønstre

“A mass spectrometer capable of 3 ppm mass accuracy

and 2% error for isotopic abundance patterns

outperforms mass spectrometers that have less than 1 

ppm mass accuracy as well as hypothetical mass

spectrometers with 0.1 ppm mass accuracy that do not 

include isotope information in the calculation of 

molecular formulae.”

T. Kind, O. Fiehn. Metabolomic database annotations via query of 

elemental compositions: mass accuracy is insufficient even at less 

than 1 ppm. BMC Bioinformatics 7 (2006) 234.

12

23

Time‐of‐flight ‐ TOF

• time‐of‐flight = flyvetid

• ”Feltfri” masseseparator ‐ kombinerer pulsing av ioner 

med et langt feltfritt flyverør

• Enkelt konsept – for en gitt kinetisk energi vil lette ioner 

ha større fart og bruke kortere tid på å bevege seg til 

detektoren enn tunge ioner 

24

-+Detektor

Måler tid

E = ½ M v2

++ + ++

+

P=760 torr

P= 1 x 10-5

torr

mi = mass of analyte ion zi = charge on analyte ion E = extraction field ti = time-of-flight of ion ls = length of the source ld = length of the field-free drift region e = electronic charge (1.6022x10-19 C)

13

25

Historikk ‐ TOF

• Ideen ble introdusert av Stephens i 1946

• Første instrument bygget av  Cameron og Eggers i 1948 

og benyttet til å studere kvikk‐sølvioner

• Forbedringer i oppløsning pga. romlig fokusering av 

ionene ‐ Wiley og McLaren, 1955

• Første kommersielle instrument tilgjengelig i 1958

26

Historikk ‐ TOF

• Refokusering av spredning av ioneenergi vha. reflektron

(ionespeil) – Mamyrin 1966

• 1980‐1990‐årene – kombinasjon av matriks‐assistert 

laser desorpsjon (MALDI) og TOF

• Kobling til kontinuerlige ionkilder – Dawson og Guilhaus

i 1989, Dodonov i 1991

– Orthogonal axis time‐of‐flight (oa‐TOF)

14

27

oa‐TOF

J.C. Fjelsted, Liquid chromatography Time-of-Flight Mass Spectometry: Principles, Tools, and

Applications for Accurate Mass Analysis. Edited by I. Ferrer, E.M. Thurman, Wiley 2009

28

Høytoppløsende TOF‐instrumenter• Tilgjengelig i mange år

• Primært brukt til strukturoppklaring og identifikasjon av 

metabolitter

• Tidligere lite egnet til kvantitative bioanalytiske

applikasjoner:

– Ikke optimale scanhastigheter

– Begrenset dynamisk område

– Dårlig følsomhet

15

29

Spesifikasjoner for dagens HR‐TOF

• Masseoppløsningsevne 10 000 – 60 000

• Massenøyaktighet  ~ 1 ‐ 5 ppm

• Masseområde > 10 000 m/z

• Scanhastigheter 10 – 100 Hz (muliggjør kobling til UPLC/UHPLC)

• Gode isotopfordelingsmønstre

• Følsomhet som nærmer seg trippelkvadrupoler

• Dynamisk område på inntil 5 dekader

• Mulig å bruke kvantitativt

• Vanlig å ha koblet til en kvadrupol, slik at man kan få MS/MS‐data

30

Orbitrap

• Orbitrap analyzer = en elektrostatisk felle

• Ionene fanges i et elektrostatisk felt

• En sentral elektrode holdes på en høy spenning

• En ytre elektrode er splittet opp og kan detektere en 

strøm (image current) fra ionepakker som beveger seg 

inne i fellen.

16

31

Orbitrap koblet til kvadrupol

32

Tverrsnitt av C‐trap’en ogOrbitrap analysatoren. 

• Ionene kommer inn i analysatoren litt skjevt (off‐axis)

• Feltet inne i fellen får ionepakkene til å oscillere

• Det dannes ringer som gir opphav til en strøm på de ytre elektrodene.

• Frekvensen til de harmoniske oscillasjonene er proporsjonal med ionene m/z.

• ω/

• Bruker fouriertransformasjon for å omdanne frekvenssignalet til et spektrum

Thermo Fisher Scientific (Bremen) ‐ Artwork by Thermo Fisher Scientific

17

33

Historikk ‐ Orbitrap

• Ideen om orbital innfanging (orbital trapping) ble fremsatt av 

Kingdon i 1923.

• Det ble gjort forsøk med å fange partikler i elektro‐statiske felt i 

tiårene som fulgte, men oppsettene var ikke gode nok til at dette 

kunne brukes til å separere masser.

• På midten av 90‐tallet begynte Dr. Alexander Makarov å jobbe med 

høyoppløsning MS, og etter hvert koblet han sammen teknikker fra 

orbital trapping, image current deteksjon fra FT‐ICR‐MS og 

injeksjonsmetoder fra TOF‐MS, hvilket endte opp i det første 

Orbitrap‐instrumentet 

34

Historikk ‐ Orbitrap

• Begrepet «Orbitrap analyzer» ble første gang presentert på ASMS 

(det amerikanske MS‐møtet) i 1999. 

• Første kommersielle instrument lansert på ASMS i 2005. Det var da 

20 år siden sist gang en fundamentalt ny masseanalysator ble 

lansert.

• I 2011 ble Q Exactive lansert, som koblet tandem masse‐

spektrometri med orbitrap, og dermed ga mulighet for å ta opp 

MS/MS‐spektra.

18

35

Spesifikasjoner for Orbitrap

• Masseoppløsningsevne fra 15 000 – 450 000 (avhengig av 

instrumenttype og scanhastighet ‐ omvendt proporsjonal med 

opptakshastigheten)

• Massenøyaktighet  ~ 1 ppm ‐ 3 ppm

• Masseområde ≤ 4000/6000 m/z

• Scanhastigheter opptil 18 Hz (muliggjør kobling til UPLC/UHPLC)

• Følsomhet som nærmer seg trippelkvadrupoler

• Dynamisk område på inntil 5 dekader

• Mulig å bruke kvantitativt

• Modeller med tilknyttet kvadrupol tilgjengelig

Masseoppløsning vs. opptakshastighet

Orbitrap Q Exactive

TOF

Effect of MS Scan Speed on UPLC Peak Separation and Metabolite Identification: Time‐of‐Flight HRMS vs. OrbitrapYun W. Alelyunas, Mark D. Wrona, Kevin Cook, Stephen McDonald, Paul D. RainvilleWaters Corporation, Milford, MA, USA 

19

37

Bruk av fragmentering• Nøyaktig masse, isotopmønster, retensjonstid og evt. metabolitt‐

mønster gir en foreløpig identifikasjon, men ikke nødvendigvis sikker bekreftelse

• Økt sikkerhet ved bruk av fragmentering (kan evt. skille isomere)

• Collision‐induced dissociation (CID)  ‐ Q‐TOF‐MS

• In‐source CID  ‐ singel TOF‐MS. Øker spenningen for kapillæret og skimmer i ionekilden.

• Higher‐energy collisional dissociation (HCD) – spesifikk for Orbitrap.

• Gir informasjon som kan brukes til strukturbestemmelse.

• Det finnes i dag mange bibliotek med massespektra som kan brukes rutinemessig, men kan være forskjeller mellom instrumenttyper.

38

Prøveopparbeidelse/kromatografi

• Prøveopparbeidelse er fortsatt viktig – ser ikke stoffer som ikke lar seg ekstrahere eller ionisere!

• Bruk av retensjonstid i databasesøk gir signifikant øktspesifisitet i forhold til nøyaktig masse alene. Dettegjør det lettere å skille isobariske forbindelser.

=> krever standardisert kromatografi med høyoppløsningsevne og reproduserbarhet

20

39

MSMS Library Search for High Confidence Compound IDIsomers are identified

MSMS spectra contain structural information

2x10

0

0.5

1

Cpd 360: 8.567: +ESI Product Ion (8.567 min) Frag=150.0V CID@22.3 (304.3042[z=1] -> **) L353_10_basDCM_5µl.d

182.1176

82.0647 105.0332 150.0906 272.1261

2x10

-1

0

1

Cpd 360: 8.567: +ESI Product Ion (8.567 min) Frag=150.0V CID@22.3 (304.3042[z=1] -> **) L353_10_basDCM_5µl.d

182.1176

82.0647 105.0332 150.0906 272.1261

2x10

0

0.5

1

Cocaine C17H21NO4 + Product Ion Frag=150.0V CID@20.0 ForensicsLib_Stand0912_plus_100602.cdb

182.1174

82.0654 105.0334 150.0909 272.1275

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

- Benzoylecgonine!- Roletamide?- Norcocaine?

- Cocaine!- Fenoterol?- Hydromorphinol?- Scopolamine?

- Dexamisole?- Tetramisole!

Measured

Comparison

Library

Measured

Comparison

Library

- Benzoylecgonine- Roletamide?- Norcocaine?

- Cocaine?- Fenoterol?- Hydromorphinol?- Scopolamine?

- Dexamisole?- Tetramisole?

Gjengitt med tillatelse fra Johnny Tran, Matriks

40

Kalibrering

• God kalibrering er alfa og omega for nøyaktig massebestemmelse

• Ekstern kalibrering av instrumentet

– Kontrolleres daglig, men kan ofte gjøres med noen dagers mellomrom/ukentlig

• Intern kalibrering vha. lock spray e.l.

– Korrigering av massene mot kjente masser for hvert eneste spektrum

21

41

Databaser/bibliotek

• Moderat størrelse database vs. ”oversized” databaser

– Moderat: 500‐5000 masser

– Oversized >10 000 masser

– De største databasene gir opphav til mange falske positive funn

• Nøyaktig teoretisk masse legges inn i enkle regneark/lister

• Kan også ha informasjon om retensjonstid, fragmenter og spektra

42

Qualitative and Quantitative Analysis

Unknown Screening –what’s in the sample?

Target Screening – are specific compounds 

present

& how much?

Quantitation – how much compound(s) is in 

the sample?

Non-Selective Selective

Gjengitt med tillatelse fra Johnny Tran, Matriks

22

43

Toksikologisk screening

• Strategi 1

– STA ‐ Systematic toxicological analysis

– GUS (general unknown screening)

• Leter etter ”alt”, bruk av lister, bibliotek etc

• Strategi 2

– ”Multi target screening”

• Spesifikke komponenter

Bruksområder for Q‐TOF ved avdeling for rettsmedisinske fag, OUS

• Rutinescreening av obduksjonsprøver

• Identifikasjon av ulike beslag

• Spesialanalyser (uvanlige stoffer eller matrikser, se 

etter «alt mulig») 

• Metabolismestudier av nye psykoaktive stoffer (2018)

23

Screening av obduksjonsprøver

• Ca. 2000 saker i året

• Alle prøver screenes (targeted) for et utvalg stoffer– 4 alkoholer inkludert etanol ‐ GC‐FID– 31 misbruksstoffer slik som opiater, amfetaminer, kokain, benzodiazepiner, z‐hypnotica, metadon, buprenorfin, LSD, GHB etc. ‐UHPLC‐MS/MS

– 11 nye psykoaktive stoffer (NPS), bl.a. flere designer benzodiazepiner ‐UHPLC‐MS/MS

– 56 legemidler ‐ Q‐TOF 

Repertoar obduksjonsscreening Q‐TOF

Positiv mode 56 komponenter

• Antiepileptika

• Antipsykotika

• Antidepressiva

• Antihistaminer

• Anxiolytika

• Analgetika

• Betablokkere

• Kalsiumantagonister

Negativ mode 6 komponenter

• Salisylsyre

• Ibuprofen

• Pentobarbital

• Fenobarbital

• Tiopental

• Fenytoin

24

Screening av obduksjonsprøver

• I tillegg utføres det et søk på Q‐TOF‐data mot en database med ca. 600 stoffer med retensjonstid (legemidler og narkotiske stoffer som ikke forekommer så ofte eller er nye).

• 75 – 80 % av sakene er positive for ett eller flere stoffer.

Screening av obduksjonsprøver

• 100μL fullblod opparbeides på Hybrid SPE‐PPT‐kolonner og 3μL injiseres

• 19min lang gradient i positive mode, 3,5 min i negativ mode

• Instrumentparametre:– Positive ioner ‐ AutoMSMS med «Preferred list», negative ioner ‐ TOF– 2GHz extended dynamic range– masseområde: 50‐1000 m/z– high sensitivity mode– Algoritme ‐ Find‐by‐Formula

25

Screening av nye psykoaktive stoffer (ikke cannabinoider) eller stoffer i lave konsentrasjoner

• 500μL fullblod væske‐væske

• Basisk væske‐væske ekstraksjon med etylacetat/heptan

• 4 µL injiseringsvolum

• Som regel positiv mode

• Ellers likt med forrige metode

Database og bibliotek(PCDL)

Forensic/ Tox, Broecker, Herre & Pragst

Database (MS) 

• ~ 9000 forbindelser– Molekylmasser

– Molekylformler

– Strukturformler

Bibliotek (MS/MS) 

• ~3000 forbindelser– Retensjonstider

– CID‐spektrum

• Kollisjonsenergier: 

10, 20 og 40 eV

• Nye komponenter kan legges til• RT kan legges inn for ekstra identifikasjon• Kan lage flere mindre PCDL for spesifikke 

søk

26

Bruk av Q‐TOF til spesialanalyser

• I noen saker ønsker vi å se etter et større repertoar av stoffer enn de vi vanligvis analyserer i rutinen, for eksempel insektsmidler, veterinær‐medisiner, giftstoffer, stoffer vi ikke har renstoffer til eller beslag.

• Analyse på Q‐TOF’ene og sammen‐likning  med en stor database/bibliotek kan da hjelpe oss å løse noen saker, andre ganger finner vi ikke noe svar.

«CSI‐light»

52

• Har vi tilgang på molekylformelen kan vi screene etter stoffer vi ikke har renstoffer til og som heller ikke finnes i biblioteket, for eksempel designerdrugs eller metabolitter eller mer uvanlige legemidler. 

27

Spesialanalyser 

• «Kjente ukjente»

– Har bibliotekspekter/eksakt masse i databasen 

– Mangler renstoffmangler retensjonstid

• «Ukjente»

– Stoffer som ikke finnes i biblioteket/databasen

– Mulighet for generering av molekylformel

– MSMS‐spektertolkning

Beslag – piller, pulver, væsker, plante‐materiale etc. • Saker med spørsmål om bekreftelse av identitet (som regel fra Kripos)

– Analyseres nesten alltid med Q‐TOF

– Har vanligvis spekter og/eller RT

– Ved behov for kvantitative svar benytter vi LC‐MS/MS. Må da ha renstoff.

• Ukjente prøver som ikke er biologiske

– Analyseres alltid med Q‐TOF først

28

Eksempel 1: hvitt/rosa pulver

• Funnet ved en behandlingsinstitusjon. 

• Pulveret ble identifisert som diklazepam – et benzodiazepin‐designerdrug. 

• Første gang vi fant dette stoffet. Det er nå en del av rutinerepertoaret vårt, med hyppige funn.

Eksempel 2: tabletter og kapsler

• Yrkeslivssak med spørsmål om identifisering av diverse kapsler og tabletter

• Påvist ulike legemidler og koffein

• Ingen narkotiske stoffer funnet

29

Biologiske prøver

• Saker med spørsmål om gitte stoffer som ikke inngår i vårt vanlige repertoar

– Eks. spesielle legemidler, kontrastmidler, giftstoffer, legemidler i bruk i utlandet m.m.

• Urinprøver med positive utslag på immunologi hvor vi ikke finner noe med våre vanlige metoder

– Eks. designerbenzodiazepiner

• Saker hvor vi skal se etter «alt mulig»

Eksempel 3: urinprøve med utslag på benzodiazepiner på immunologisk screening

• Positiv urinprøve på immunologisk screening 

• Negativ på bekreftelsesmetode for benzodiazepiner i urin

• Analysert på Q‐TOF– Metabolitt‐spekter i PCDL (7‐aminonorflunitrazepam)

– «Moderstoff» også funnet. Masse til Fonazepam (N‐desmetylflunitrazepam) lagt inn i databasen ikke lenge før på bakgrunn av opplysninger fra det europeiske «early‐warning»‐systemet.

30

Eksempel 3: urinprøve med utslag på benzodiazepiner på immunologisk screening

31

Eksempel 4: kontrastmidler i bukvæske

• Spørsmål om å se etter virkestoff fra to ulike kontrastmidler

– Iohexol (Omnipaque)

– Amidotrizoinsyre (Gastrografin)

• Høye molekylvekter pga. 3 jodatomer

– Iohexol m/z=822,8803

– Amidotrizoinsyre m/z=613,7696

• Hadde spekter for begge stoffene.

Eksempel 5: designerfentanyl

• En person ble funnet død etter å ha inntatt en væske som var merket Xanax (=alprazolam, benzodiazepin).

• Vi fant ikke alprazolam ved analyse.

• Andre funn i saken var lite sannsynlige som dødsårsak.

• Videre analyser med Q‐TOF ga treff for furanylfentanyl. Prøven ble deretter kvantifisert med UHPLC‐MS/MS.

Furanylfentanyl

32

Oslo University Hospital, Clinic of laboratory medicine, Forensic sciences

Eksempel 6: dødsfall pga. NPS

• Mottatt blodprøve fra en ung mann 

som døde uventet.

• Opplysninger om at han hadde brukt 

stoffer kjøpt på internett.

• Funn av to poser med hvitt pulver, 

merket hhv. 4‐FMA og 3‐MMC, men 

dette materialet var ikke sendt med.

33

Eksempel 6: dødsfall pga. NPS

• Standardrepertoaret viste at prøven var positiv på 

paracetamol og kodein

• Prøven ble også analysert for nye psykoaktive stoffer 

(NPS) med UPLC‐MS/MS. Vi hadde da renstoff for 4‐MMC 

(= mefedron), men ikke 3‐MMC eller 4‐FMA. 

• Stor topp for bromodragonfly med sur mobilfase, men 

ikke riktig retensjonstid med basisk mobilfase.

Eksempel 6: dødsfall pga. NPS

• Analyse med Q‐TOF viste en stor topp ved ca. samme RT 

som bromodragonfly, men med annen molekylformel.

• Ingen treff i databasen.

• Intens søking på internett ga forslag om AH‐7921, en 

opioid reseptor agonist med ganske like egenskaper som 

morfin.

• Renstoff ble bestilt og identitet bekreftet.  

34

Erfaringer med bruk av LC‐QTOF‐MS

Prøveopparbeidelse/kromatografi

• Massenøyaktigheten er dårligere for stoffer med enten veldig lav intensitet eller veldig høy intensitet.

• Prøveopparbeidelse er fortsatt viktig. Vi ser ikke stoffer som ikke lar seg ekstrahere eller ionisere.

• Bruk av retensjonstid i databasesøk gir signifikant økt spesifisitet i forhold til nøyaktig masse alene. Dette gjør det lettere å skille isobare forbindelser.

35

Bruk av fragmentering

• Økt sikkerhet ved bruk av fragmentering.

• Kan få strukturinformasjon fra MS/MS‐spektrene. Kan skille mellom isomere hvis de har ulike fragmenter.

• Veldig fornøyde med å ha Q‐TOF, ikke bare TOF.

Fordeler med QTOF‐MS

• Kortere tid til metodeutvikling da det ikke er nødvendig å optimalisere MRM‐overganger

• Mulig å reprosessere lagrede data for å se etter andre forbindelser

• ”All of the ions, all of the time”

– Kan se på mange flere stoffer samtidig enn med trippelkvadrupoler

70

36

Fordeler med QTOF‐MS

• Ved tilgang på databaser eller bibliotek kan man få forslag til identifikasjon av stoffer som man i liten grad ville hatt mulighet til å finne ut av ellers.

• Men vi kjøper inn renstoff og bekrefter mot dette i etterkant.

• LC‐QTOF‐MS er et utrolig nyttig verktøy innen rettstoksikologisk analyse som vi bruker til nesten alt som er utenfor det vanlige rutinerepertoaret.

• Det tar tid å bli god i å søke på kryss og tvers i store databaser og å benytte seg av alle de ulike måtene å søke på.

37

• Unni Johansen, Kristin Opsal Svendsen, An‐Magritt Haneborg, Inger Ann Hansen, Siv Jarvis Munkeby og Elisabeth Leere Øiestad, RMF, OUS

• Johnny Tran, Matriks

• Léon Reubsaet, Farmasøytisk institutt, UiO

Takk til