Hidrofilos

Estructura de Macromoléculas. Dpto. de Química Física. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada.

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5.-INTERACCIÓN HIDRÓFOBA. Contenidos 5.1.- Introducción

5.2.- La interacción hidrófoba en compuestos modelo.

5.3.- Hidrofobicidad de los restos aminoácidos y nucleótidos.

5.4.- La interacción hidrófoba en proteínas.

5.5.- La interacción hidrófoba en ácidos nucleicos.

5.6.- La interacción hidrófoba en membranas.

5.1. Introducción.

Las interacciones electrostáticas, los enlaces de hidrógeno y las interacciones de

van der Waals entre grupos polares de macromoléculas en entornos acuosos no son

particularmente favorables desde un punto de vista energético, debido esto a que hay

interacciones comparables que compiten con las primeras entre las macromoléculas y

las moléculas de agua que les rodean. No obstante las interacciones con el agua no son

tan favorables en el caso de moléculas con un marcado carácter apolar o no polar. El

agua es un mal disolvente de moléculas no polares comparada con la mayoría de los

disolventes orgánicos. Las moléculas apolares no pueden formar puentes de hidrógeno y

las disoluciones de estas sustancias presentan muchas propiedades fisicoquímicas

anómalas. La ausencia de interacciones favorables entre agua y moléculas no polares da

lugar a que éstas interaccionen entre ellas mismas de forma más favorable a lo que lo

harían en disolventes orgánicos; es decir, los grupos moleculares no polares “prefieren”

los entornos no polares. Esta “preferencia” de las moléculas no polares por los entornos

no acuosos se conoce como “Interacción hidrófoba”. Esta interacción es uno de los

principales factores de la estabilidad de las estructuras de las proteínas, ácidos nucleicos

y membranas.


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5.2. La interacción hidrófoba en compuestos modelo.

Hace muchos años que se observó que moléculas apolares forman hidratos cristalinos muy estables, en los que las moléculas de agua forman unas especies de “jaulas poliédricas” que encierran a la molécula apolar (ver la estructura dodecaédrica de la figura 2.13, tomada del libro Bioquímica de Mathews y van Holde) . Estas jaulas se unen entre sí para formar una gran malla característica de estos hidratos conocidos como “clatratos”.

Figura i.h.1. Estructura dodecaédrica de moléculas de agua alrededor de un hidrocarburo. Estos “clatratos” presentan propiedades interesantes, así son marcadamente estables y elevan el punto de congelación del agua por encima de 0 ºC; Las disoluciones acuosas con formación de estos hidratos presentan una capacidad calorífica a presión constante, ∆Cp, marcadamente grande; tienen una entalpía de formación negativa y grande en valor absoluto, siendo casi independiente de la molécula apolar con que se forma. Así en la siguiente tabla (extraída del texto de Cantor y Schimmel), en la que se muestran los calores de formación de algunos clatratos, podemos observar como la entalpía es casi constante en torno a los –15 kcal/mol. Este valor < 0, relativamente grande de la entalpía y casi independiente del átomo o molécula apolar, induce a pensar que esta energía corresponde a las interacciones H2O ↔ H2O, es decir, corresponde a la energía liberada al construir la estructura clatrática en la que se establecen puentes de hidrógeno reforzados entre las moléculas de agua. De esta forma se optimiza la interacción desfavorable entre la molécula no polar y las moléculas de agua. La magnitud de la interacción hidrófoba se suele expresar en términos de la energía libre de transferencia, ∆Gtr, de moléculas no polares desde los estados gaseoso, líquido o sólido a agua líquida.

Tabla i.h.1


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La tabla i.h.2 (extraída del texto de Cantor y Schimmel) muestra los cambios de entalpía, entropía y energía libre para la transferencia de varias sustancias apolares desde un disolvente no polar a H2O, a 25 ºC. Energéticamente estos procesos son favorables porque en todos ellos el cambio de entalpía es < 0, lo cual es consecuencia de lo anteriormente explicado. Coherentemente con la formación de las estructuras clatráticas todos estos procesos transcurren con un marcado descenso de la entropía que da lugar a que el término -T∆S predomine resultando valores > 0 para la energía libre de transferencia; es decir, estos procesos no son espontáneos o termodinámicamente favorables, en otras palabras, las moléculas no polares prefieren los ambientes no acuosos.

Para consolidar estos conceptos vamos a analizar termodinámicamente el proceso de transferencia de una molécula apolar del tamaño del ciclohexano desde los diferentes estados físicos al agua.

Es necesario entender los signos y amplitudes de los cambios en los parámetros termodinámicos que se incluyen en la figura i.h.2. (del texto Proteins de T.E. Creighton).

Hay que destacar:

• A temperaturas cercanas a la TH (20ºC), como consecuencia de un marcado descenso de entropía por ordenación de las moléculas de agua, la transferencia de una molécula apolar desde el líquido apolar al agua no resulta favorable. A dicha temperatura ∆H = 0, lo que implica una similar amplitud de las interacciones de van der Waals en ambas situaciones.

• El anormalmente elevado valor de ∆Cp proviene de la “fusión” del agua

ordenada en las estructuras clatráticas. Como

∂∆∂

=

∂∆∂

=∆TS

TTH

CP

p

su valor elevado implica una fuerte dependencia de ∆H y ∆S con T. El valor de ∆Cp es proporcional al área superficial accesible al disolvente de la molécula apolar expuesta al agua. Ver figura i.h.3.

• A temperaturas por encima de TH el cambio de entropía de transferencia disminuye, se hace menos negativo, con lo que se va convirtiendo en un factor menos desfavorable, pero el cambio de entropía aumenta, haciéndose mas positivo, por lo que se convierte en un factor desfavorable.

Tabla i.h.2


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Figura i.h.2. Termodinámica de transferencia de una molécula apolar entre las fases gaseosa, líquida y sólida.


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Figura i.h.3. Izquierda: Termodinámica de transferencia de pentano desde líquido a disolución acuosa. Derecha: Termodinámica de disolución acuosa de algunos hidrocarburos líquidos como una función del área superficial accesible de los hidrocarburos. (del texto Proteins de T.E. Creighton).

• El marcado cambio de la entropía y la entalpía de transferencia se compensa de forma que el valor de ∆Gtr cambia mucho menos, alcanzando un máximo a TS donde ∆Str = 0.

• A la temperatura TS el cambio nulo de entropía de transferencia sugiere que no hay efecto neto de ordenación del agua. Pero ∆Cp, aunque ha disminuido, sigue siendo elevada, lo que sugiere al contrario que queda ordenamiento; no obstante, solo el suficiente para compensar el aumento de entropía de las moléculas apolares.


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Tenemos que hacer las siguientes puntualizaciones sobre el concepto de interacción hidrofóbica:

o La interacción hidrófoba no es el resultado de repulsiones entre las

moléculas de agua y las moléculas apolares, como sugiere el término, de hecho las interacciones entre estas son favorables en un amplio intervalo de temperatura, aunque menores que los contactos de van der Waals en el líquido apolar o los puentes de hidrógeno en el agua.

o es el resultado de la tendencia de las moléculas no polares a interaccionar preferentemente entre sí en lugar de hacerlo con el agua.

o La interacción hidrófoba tiene la propiedad poco común de disminuir su amplitud al bajar la temperatura, lo que es consecuencia del aumento de estructuras clatráticas con el descenso de temperatura.

o La formación de clatratos aumenta la solubilidad de las moléculas apolares porque se optimiza la interacción con las moléculas de agua, de hecho el ∆Gtr se hace menos positivo al bajar la temperatura.

o Como consecuencia es incorrecto usar términos como interacción hidrófoba, hidrofobicidad o efecto hidrófobo para referirnos al efecto de ordenación del agua o a las propiedades termodinámicas anómalas resultantes de la interacción molécula apolar-agua.

5.3.- Hidrofobicidad de los restos aminoácidos y nucleótidos. 5.3.1.- Hidrofobicidad de los aminoácidos. 5.3.1.a.- Polaridad de las cadenas laterales de los aminoácidos. Gran parte del mayor o menor carácter hidrófobo de una cadena polipeptídica lo determina la polaridad de las cadenas laterales de los restos que la forman; como consecuencia nos interesa conocer la polaridad y el tipo de interacción con el agua de estos grupos moleculares. En la tabla de Aminoácidos Proteicos especificamos la polaridad de las cadenas laterales y podemos resumir las siguientes conclusiones:

• En principio las cadenas que son no polares tendrán una solubilidad baja en agua; pertenecen a esta categoría las cadena laterales alifáticas de los aminoácidos: Ala, Val, Ile, Leu. También podemos incluir en este grupo los aminoácidos aromáticos Phe y Trp y la Met.

• Las cadenas que son polares tendrán una solubilidad elevada en agua. Pertenecen a esta categoría los aminoácidos Glu, Asp, Arg y Lys. Los aminoácidos Asn y Gln, que tienen cadenas laterales amídicas también son muy polares. La Ser y Thr también son polares debido al gran momento dipolar y a la capacidad de formar puentes de Hidrógeno del grupo hidroxilo.

• La polaridad de los cinco restantes aminoácidos es más ambigua. Así la Cys y la His, por tener un pKa próximo al pH fisiológico puede estar cargado o no dependiendo del pH del medio, por lo que pueden


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clasificarse en una u otra categoría. La Tyr, a pesar de tener un grupo −OH. se comporta como muy poco polar porque la resonancia electrónica del anillo aromático reduce el momento dipolar del grupo OH. Por último Gly y Pro son especiales; por un lado Gly no tiene cadena lateral y puede acceder a conformaciones inaccesibles a otros aminoácidos, pero por la forma en que se comporta en proteínas se le considera frecuentemente como no polar. Por otro lado la Pro es un iminoácido con propiedades conformacionales diferentes; es difícil asignarle una polaridad pero por su localización en proteínas se comporta más frecuentemente como polar.

Charles Tanford estudió la hidrofobicidad de los aminoácidos analizando la

energía libre de transferencia de éstos desde etanol a agua. Este parámetro termodinámico no se puede medir directamente pero es posible calcularlo a partir de los datos de solubilidad del aminoácido cristalino anhidro en ambos disolventes, haciendo uso del siguiente ciclo termodinámico cerrado:

Figura i.h.4. Cambios de energía de Gibbs para la transferencia de

aminoácidos desde H3CH2COH a H2O. Método de Charles Tanford para estudiar la hidrofobicidad de los aminoácidos.

Aminoácido sólido Cristalino anhidro: RH2NHCCOO

Disolución acuosa

H

R C COO

NH3 +

Disolución alcohólica (CH3-CH2OH)

H R C COOH NH2

∆G1

∆G2

∆Gt =∆G1 + ∆G2


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Puesto que el estado de referencia era el mismo para los dos procesos de solubilización, el ∆G se puede calcular combinando las energías libres de disolución.

La siguiente tabla muestra los valores de los cambios de energía de Gibbs para la

transferencia de la Gly y algunos aminoácidos de cadena lateral no polares, desde H3CH2COH a H2O.

Puesto que la solubilidad de estos aminoácidos es menor en etanol que en agua, el ∆G de transferencia debe ser negativo, como se puede comprobar en la tabla para todos los aminoácidos incluidos, es decir que, si de algún modo pudiera realizarse el experimento de transferencia directa, estos aminoácidos se transferirían espontáneamente al agua. Ahora bien este ∆G incluye las contribuciones de las cadenas laterales, del grupo α-carboxílico, del grupo α-amino y de los procesos de ionización y la correspondiente solvatación en agua:

Tabla i.h.3

C

O

NH2CH2 OH

Etanol

C

O

NH3+

CH2 O-

AGUA


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Para obtener los valores ∆Gt, que representan las contribuciones de las cadenas laterales al ∆G de transferencia, Tanford escogió la Gly como referencia porque este aminoácido no tiene cadena lateral. Así los valores de ∆Gt, que aparecen en la tabla i.h.3 se obtienen restando el valor –4,63 kcal.mol-1 de la Gly a los ∆G de transferencia de los aminoácidos completos. Estos valores son positivos indicando que las cadenas laterales apolares evitan los ambientes acuosos, y aumentan con el aumento del tamaño de la cadena lateral. Por otra parte el ∆G de transferencia de etanol a agua para el metano y el etano son:

Si comparamos la diferencia en el cambio de energía de Gibbs de transferencia

entre metano y etano con las correspondiente a las parejas Ala-Gly y Leu-Val:

Parece que la contribución del grupo -CH2- es similar para diferentes moléculas, actuando como eslabones que contribuyen independientemente de forma aditiva. En todo caso lo relevante es que la contribución de las cadenas laterales apolares al ∆G de transferencia tienen signo positivo como resultado del valor grande pero negativo del ∆S de transferencia, que a su vez es consecuencia del ordenamiento de las moléculas de agua que producen los grupos no polares. 5.3.2.- Hidrofobicidad de los nucleótidos. En la siguiente tabla se muestra el valor del “parámetro de solvatación atómico” (ASP) correspondiente a átomos de los nucleótidos. Este parámetro representa la contribución por unidad de área de un determinado tipo de átomo a la energía libre de transferencia desde un disolvente orgánico al agua. Los valores negativos corresponden a loa átomos polares que consecuentemente contribuyen favorablemente a la transferencia; los valores positivos corresponden a los átomos no polares que obviamente contribuyen desfavorablemente a la transferencia. En su conjunto los nucleótidos libres son solubles pero las bases representan regiones hidrófobas que muestran tendencia a apilarse como veremos a continuación.

CH4 CH3 CH3 Diferencia ∆G + 3,02 + 2,26 +0,76

Ala Gly Diferencia ∆G - 3,90 - 4,63 +0,73

Leu Val Diferencia ∆G - 2,21 - 2,94 +0,73

Tabla i.h.4


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5.4.- La interacción hidrófoba en proteínas. Los residuos apolares en proteínas representan entre el 30 y 50 % del conjunto total de restos aminoácidos. Las proteínas globulares con muchas de sus cadenas laterales no polares enterradas en su interior hidrófobo deben una gran parte de su estabilidad al efecto hidrófobo. El cambio de energía libre de transferencia total que se obtiene contabilizando todos los restos no polares enterrados que contiene una determinada proteína es una estimación aproximada de la contribución del efecto hidrófobo a la estabilidad de la proteína. Una manifestación del efecto hidrófobo en proteínas es la correlación que existe entre el cambio de capacidad calorífica a presión constante, ∆CP, y el área superficial no polar enterrada en el interior de la proteína y que se expone al disolvente en el proceso de desplegamiento, figura i.h.5. (del texto Proteins de T.E. Creighton) El estado desplegado se caracteriza por una CP mayor que la del estado plegado, siendo esto consecuencia de la existencia de una mayor proporción de moléculas de agua ordenadas en estructuras clatráticas, hidratando una mayor superfice apolar accesible al agua, en el estado desplegado. En la figura i.h.5 observamos que a medida que aumentamos la superficie apolar expuesta en el desplegamiento, desde la Ribonucleasa A hasta la Mioglobina, el ∆CP aumenta aproximadamente de forma proporcional. Consecuentemente la estabilidad de una proteína debe ser sensible a los cambios de la polaridad del disolvente y a la presencia de cosolventes que modifiquen el efecto hidrófobo. Especial interés tiene comprender el mecanismo por el que actúan desnaturalizantes tales como Urea y Clohidrato de Guanidinio. La tabla i.h.5 nos muestra los cambios de energía de Gibbs de trasferencia de algunos aminoácidos desde agua a una disolución 8M de Urea. Es evidente que los aminoácidos con mayor superficie molecular apolar, Leu, Phe y Tyr, se tranfieren espontáneamente y que las contribuciones de las cadenas laterales son favorables a la trasferencia.

Figura i.h.5. Correlación entre el cambio de capacidad calorífica a presión constante, ∆∆CP, y el área superficial no polar expuesta al disolvente en el proceso de desplegamiento.


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Los agentes desnaturalizantes aumentan la solubilidad de las cadenas laterales tanto polares como no polares, como lo demuestra la figura i.h.6 en la que podemos observar una buena correlación lineal entre la energía de Gibbs de transferencia desde agua a las disoluciones 8 M de Urea y/o 6 M de GdmCl y la superficie accesible total de la molécula. Ambas moléculas tienen una capacidad de formación de puentes de hidrógeno comparable con la del agua pues contienen grupos que pueden actuar de donador y/o aceptor:

C O

NH2

NH2

C

NH2

NH2

NH2+

Urea ion guanidinio

El carácter desnaturalizante de estas moléculas se explica en términos de una

interacción, tanto con los grupos polares como no polares, más favorable que la interacción del agua con éstos. Por otra parte estas moléculas actúan como ligandos que unen preferentemente al estado desplegado, el cual expone una superficie polar y no polar mayor, dando lugar a un cambio de energía de Gibbs mayor (negativo) que el correspondiente a la unión al estado plegado. Como consecuencia general un ligando que une preferentemente a un estado estabilizan ese estado.

Tabla i.h.5


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Figura i.h.6. Energías de Gibbs de transferencias desde agua a disoluciones 8 M de Urea y 6 M de GdmCl, en función del area superficial accesible al disolvente de aminoácidos de cadena lateral completamente apolar (••) y de cadena lateral con grupo/s polar/es (o)


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5.5.- La interacción hidrófoba en ácidos nucleicos. ¿Juegan las interacciones hidrófobas un papel importante en la estabilización de las dobles hélices en el ADN y ARN? Podemos responder afirmativamente a esta pregunta, pero no es fácil justificar la respuesta, que en todo caso pasa por analizar el fenómeno del apilamiento de bases. Las estructuras cristalinas de los ácidos nucleicos revelan que los planos de bases adyacentes son casi paralelos, el ángulo diedro entre los planos es menor de 20º, y solapan en gran extensión, figura i.h.7. Este apilamiento es consecuencia de los requerimientos geométricos de la estructura Watson-Crick para la optimización del apareamiento de bases. No obstante, el apareamiento en si es energéticamente favorable y como consecuencia ayuda a estabilizar estas estructuras.

Figura i.h.7. Apilamiento de bases en la doble hélice de los ácidos nucleicos (del texto “Principles of Physical Biochemistry” de K.E. an Holde, W. Curtis Jonson y P. Shing Ho)

La energética de las interacciones de apilamiento se han determinado para dinucleotidos con bases no apareadas y con bases apareadas. El análisis termodinámico de la dependencia con la temperatura del apilamiento de bases muestran cambios de entalpía y entropía negativos, ver tabla i.h.6. (del texto “Principles of Physical Biochemistry” de K.E. an Holde, W. Curtis Jonson y P. Shing Ho)

En general para una interacción predominantemente hidrófoba ∆H > 0 y ∆S > 0,

lo que hace pensar que en el apilamiento de bases las interacciones hidrófobas no juegan un papel importante y son interacciones predominantemente entálpicas las que rigen el proceso. Éstas serían interacciones dipolares, las bases tienen un momento dipolar intrínseco, y las interacciones de van der Waals. La tabla i.h.7 (del texto “Principles of Physical Biochemistry” de K.E. an Holde, W. Curtis Jonson y P. Shing Ho) muestra los resultados de calcular la energía del apilamiento de dinucleótidos con bases apareadas, como interacciones dipolares y de van der Waals.


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Tabla i.h.6

Tabla i.h.7


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Sin embargo, se observa que los disolvente orgánicos disrrumpen las estructuras de doble hélice y que grupos hidrófobos planos se intercalan entre las bases, figura i.h.7.

Una demostración directa de que el apilamiento es más estable en disolución acuosas que en disolventes apolares lo constituye la formación de un dimero de timidina fotoquimicamente inducido en el dinucleotido TpT. Está comprobado que la irradiación de ADN a 280 nm produce la formación de enlaces covalentes entre bases de timidna adyacentes. Cuando TpT se irradia con una intensidad constante y durante un tiempo fijo, la cantidad de dímero que se forma es muy sensible al disolvente usado. En la tabla i.h.8 aparecen ordenados varios disolventes en orden creciente de su habilidad para inducir apilamiento y podemos observar que este orden corresponde perfectamente al % de dímero de timidina formado.

Disolvente % T-T formado t-butanol 5´0 Etanol 5´5

Metanol 6´0 n-Butanol 7´5

Etilén glicol 19 Formamida 21

Glicerol 33 Agua 35

Otra evidencia de que hay contribución hidrófoba es que cuando añadimos metanol al medio los valores de ∆H y ∆S de la tabla i.h.6 disminuyen, es decir, se hacen más negativos, poniendo así de manifiesto una contribución hidrófoba enmascaradas por las interacciones dipolares y de van der Waals. Concluyendo la interacción hidrófoba juega un papel importante en el apilamiento de las bases, el agua se excluye del interior de la doble hélice, lo que hace que los puentes de hidrógeno entre las bases apareadas llegan a contribuir favorablemente. La disminución de entropía del proceso puede atribuirse a la perdida de entropía conformacional de las bases que se ordenan en el apilamiento. No obstante hay conceptos en hidratación e hidrofobicidad que permanecen sometidos a debate, por ejemplo en la estructura cristalina de la forma B del ADN se encuentra una “espina” de moléculas de agua en el surco menor, que están formando puentes de hidrógeno, figura i.h.8.. No está claro si esta espina de hidratación debería tener un papel estabilizante o desestabilizante de la doble hélice de ADN, porque aunque la formación de los puentes de hidrógeno son interacciones que estabilizan la estructura, esas moléculas de agua inmovilizadas suponen una disminución de entropía.

Tabla i.h.8


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Figura i.h.8. “Espina” de moléculas de agua unidas por enlaces de hidrógeno en el surco menor del B-ADN (del texto “Principles of Physical Biochemistry” de K.E. an Holde, W. Curtis Jonson y P. Shing Ho).


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5.6.- La interacción hidrófoba en membranas. Es bien conocida la estructura de las membranas celulares y que la matriz lipídica que forma la bicapa característica de este complejo supramacromolecular está dirigida por fuerzas hidrófobas. El ordenamiento molecular adoptado por los lípidos encierra a las cadenas hidrocarbonadas de las colas de estas moléculas en un interior no polar, y solo se exponen al disolvente (agua) las cabezas hidrófilas. Así mismo es también conocido que las proteínas de membrana que atraviesan la bicapa, conocidas como proteínas integrales de membrana, están localizadas en la matriz lipídica gracias a la composición predominante de restos aminoácidos de cadena lateral apolar que “prefieren” el ambiente hidrófobo, mientras que los restos de cadena lateral hidrófila se localizan en las regiones expuestas al espacio extracelular y citoplasmático. Ver la figura i.h.9.

Figura i.h.9. Modelo del Mosaico Fluido de las membranas celulares con dos proteínas integrales de membrana.

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