Het optimaliseren en visualiseren van western blot

voor collageen Type I

BMTE0740

Karim Abdullah

December 2007

Supervisor: Ing. W.L. van de Loo

Dr. A. mol

Dr. M. de Liefde

Stagedocente: Mw. C.A.M Huijbregts

Opleiding: ROC Eindhoven MLO

Differentiatie: Microbiologie niveau 4

Stagebedrijf: TU/Eindhoven

Faculteit: Biomedische technologie

Afdeling: Soft tissue engineering

Periode: September t/m December 2007

School: ROC Eindhoven LMP

Samenvatting:

Het hart is een holle spier die door geregeld samen te trekken bloed door het

lichaam pompt. De hartkleppen zorgen ervoor dat het bloed in één richting

gaat. Als een klep niet goed werkt, kan men deze vervangen. In de TU is men

bezig met de mogelijkheden van het maken van kunstmatige hartkleppen m.b.v.

tissue engineering. Er wordt gezocht in welke verhouding welke type collageen

bevindt, zodat er zoveel mogelijk een gelijke kunstmatige hartkleppen gemaakt

kan worden.

Het eiwit collageen zorgt ervoor dat de weefsels flexibel en sterk zijn. Dit eiwit

heeft verschillende typen met elk een eigen functie en plaats in het lichaam.

Omdat in de hartkleppen collageen type I en III bevinden, wordt collageen type

I als positief controle gebruikt bij het optimaliseren van western blotting voor

collageen type I. De stage gaat over het optimaliseren van western blotting voor

collageen type I. Collageen Type III wordt als negatief controle gebruikt.

Western blot bestaat uit twee delen, het eerste deel is het runnen van eiwitten in

een SDS-page gel. De tweede deel is het blotten en het aantonen van de

eiwitbandjes in de gel m.b.v. antilichamen en chemolumonicentie.

Het doel van dit onderzoek is het visualiseren en optimaliseren van het protocol

van western blot dat in het lab aanwezig is. Bij het optimaliseren van dit

protocol wordt naar de verdunningen van de antilichamen gekeken. De juiste

verdunning wordt gebruikt bij het onderzoek naar de verschillende typen

collageen. Ook van het apparaat waarmee de foto’s gemaakt kunnen worden,

Versa Doc (Bio-Rad) moet een handleiding gemaakt worden.

Na het testen van verschillende verdunningen van de 1e en 2

e antilichaam is

gebleken dat de optimale verdunning van de 1e antilichaam 1:1500 is. Bij de 2

e

antilichaam is gebleken dat de optimale verdunning 1:12500 is.

Voorwoord:

Dit verslag is geschreven in het kader van de stage die als onderdeel is van mijn

vierde studiejaar van mijn opleiding aan ROC Eindhoven.

Ik wil hierbij de volgende mensen bedanken voor de ondersteuning, uitleg en

de samenwerking:

• Ing. Anita van de Loo, door haar steun en hulp is deze stage voor mij

een leerzame en leuke stage geworden.

• Dr. Anita Mol voor de mogelijkheid om in het lab stage te mogen lopen.

• Dr. Moniek de Liefde voor haar hulp tijdens mijn stageperiode.

• Mijn medestagiaire Roel Lalieu voor zijn medewerking en zijn

gezelschap tijdens mijn stageperiode.

• Ook wil ik graag alle collega’s bedanken waarmee ik heb

samengewerkt.

Afkortingen:

µl = microliter

ml = milliliter

mg = milligram

V = volt

mA = milliampère

RPM = rotations per minute

SDS-page

SDS = sodium dodecyl sulfate

Page = poly acrylamide gel electroforese

APS = Ammonium persulfaat

HRP = Horse radish peroxidase

PVDF = Polyvinylidene fluoride

ECM = Extracellulaire matrix

Inhoudsopgave:

1. Inleiding ....................................................................................................... 1

2. Achtergrond informatie................................................................................ 2

2.1 Het menselijke hart ........................................................................ 2

2.2 Hartkleppen .................................................................................... 3

2.3 Tissue engineering ......................................................................... 5

2.4 Collageen........................................................................................ 6

3. Onderzoek en methoden............................................................................... 7

3.1 Onderzoek ...................................................................................... 7

3.2 Methoden........................................................................................ 8

3.2.1 Gel-electroforese (SDS-Page)............................................... 8

3.2.2 Western blotting .................................................................... 9

3.2.3 Ponceau kleuring................................................................... 10

4. Resultaten..................................................................................................... 11

5. Discussie ...................................................................................................... 13

6. Conclusie...................................................................................................... 14

7. Bronnen ........................................................................................................ 15

8. Bijlagen ........................................................................................................ 16

• I: Gel-electroforese............................................................................... 16

• II: Schema Gel Percentage ................................................................... 18

• III: Western Blot .................................................................................. 19

• IV: Antilichamen, controles en markers .............................................. 22

• V: Ponceau kleuring............................................................................. 23

• VI: Indeling collageen volgens Bornstein en Traub ............................ 24

• VII: Handleiding Versadoc Apparaat................................................... 25

1

1. Inleiding:

Op TU/e faculteit Biomedische technologie houdt men zich met tissue

engineering bezig. Deze faculteit onderzoekt de mogelijkheid om getissue-

engineerde hartkleppen en bloedvaten te maken.

Er zijn twee soorten hartkleppen: de mechanische en de biologische.

Mechanische kunstkleppen zijn geheel gemaakt van duurzaam metaal of

kunststof. Voordeel is dat ze een leven lang meegaan. Helaas hebben ze als

groot nadeel dat de patiënt dan altijd bloedverdunners moet blijven slikken. Dit

moet om de kans op het coaguleren van bloedplaatjes, veroorzaakt door de

kunstklep, tegen te gaan.

Biologische kleppen zijn gemaakt van speciaal bewerkt weefsel van dieren,

meestal van een varken of rund. Het kan ook een menselijke donorklep zijn van

een overledene. De biologische klep heeft als groot voordeel dat je geen

bloedverdunners nodig hebt. Nadeel is dat deze klep een beperkte

duurzaamheid heeft, vergeleken met een mechanische klep. De patiënt moet

ook medicijnen innemen om de afstoting van de nieuwe hartklep tegen te gaan.

Biologische kleppen gaan tegenwoordig ongeveer vijftien jaar mee.

Biologische kleppen worden verdeeld in drie soorten. Dit zijn menselijke klep

(donor), dierlijk klep en getissue-engineerde klep. De TU/e houdt zich met de

derde soort (getissue-engineerde klep) bezig.[1]

De belangrijkste eigenschap van de hartkleppen is dat ze sterk en duurzaam

zijn. Het eiwit collageen is een van de eiwitten die daarvoor verantwoordelijk

is. Van dit eiwit zijn er verschillende typen bekend. Het is ook bekend dat in de

hartklep en bloedvaten de typen collageen I en III aanwezig zijn.

De techniek western blotting wordt gebruikt om te bepalen welke typen

collageen aanwezig zijn in de getissue-engineerde hartkleppen. De verhouding

tussen de verschillende typen die aanwezig zijn wordt ook met western blotting

bepaald.

Het protocol dat aanwezig is in het lab is niet helemaal geoptimaliseerd.

Daarom moet het nu verder geoptimaliseerd worden. De verdunningen van de

antilichamen die gebruikt worden bij het blotten moeten geoptimaliseerd

worden. Wanneer het optimaliseren afgrond is, moet ook een protocol gemaakt

worden om de blot te visualiseren.

2

2. Achtergrond informatie

2.1 Het menselijke hart

Het hart is een holle spier die zich midden achter het borstbeen bevindt. Het

zorgt ervoor dat het hele lichaam bloed krijgt door geregeld samen te trekken.

Het hart is verdeeld in vier ruimten die gescheiden zijn door kleppen

(afbeelding 1). De vier ruimten vormen twee pompen die verantwoordelijk zijn

voor de long- en lichaamscirculatie van bloed. De hartspier is sterker dan een

normale spier. Dit komt doordat het hart als een pomp werkt. Het heeft ook een

ingewikkelde bouw.

Afbeelding 1: het menselijke hart. [2]

De vier holtes van het hart zijn twee boezems en twee kamers. Deze vier holtes

trekken zich samen onder de leiding van de sinusknoop. De sinusknoop is een

gespecialiseerd stukje weefsel die elektrische signalen afgeeft aan de vier

kamers. Onder invloed van deze signalen trekken de kamers en de boezems

afwisselend samen. Door het samentrekken wordt het bloed door het hele

lichaam gepompt. De linkerkamer trekt veel krachtiger samen dan de

rechterkamer. Zijn spierwand is dan ook dikker. Dat komt doordat deze kamer

het bloed pompt door het hele lichaam[3].

3

2.2 Hartkleppen

Tussen de kamers van het hart en ook tussen de kamers en de slagaders zitten

verschillende kleppen. Deze kleppen hebben als functie het voorkomen dat het

bloed terugstroomt in de kamers. De kleppen bestaan uit de eerste laag van de

hartwand, endocard. De geluiden die men hoort vanuit het hart, zijn de

veroorzaakt door de kleppen.

Er zijn verschillende soorten kleppen in het hart. De eerste soort is de inlatende

kleppen, hieronder behoren de triscuspidalisklep en de mitralisklep. De

triscuspidalisklep bevindt zich tussen de rechterboezem en rechterkamer. De

mitralisklep bevindt zich tussen de linkerboezem en linkerkamer. De tweede

soort zijn de uitlatende kleppen, die zijn ook verdeeld tot pulmonalisklep

(longslagaderklep) en aortaklep (lichaamsslagaderklep). [1, 4]

Zonder deze kleppen verliest het hart zijn pompfunctie. Er zijn verschillende

typen aandoeningen bij de hartkleppen; dit zijn:

• Hartinsufficiëntie, waarbij de kleppen lekken.

• Stenose, waarbij de hartklep vernauwd is en niet goed opent.

• Atresie, de hartklep ontbreekt (een aangeboren afwijking). [4]

Om deze aandoeningen aan te pakken, heeft men verschillende oplossingen. Er

zijn meer soorten kleppen te implanteren, biologische (afbeelding 2) en

mechanische (afbeelding 3). De biologische wordt verdeeld in drie soorten,

menselijk klep (donor), dierlijk klep en getissue-engineerde klep. Het komt niet

vaak voor dat een klep wordt gedoneerd. Als er wel een donor is, dan zal het

beter zijn dat men het hele hart transplanteert.

Afbeelding 2: getissue-engineerde hartkleppen. [6]

De mechanische hartkleppen zijn de oplossing daarvoor. De patiënt hier is niet

afhankelijk van donors. Een mechanische klep is een duurzame klep, maar het

heeft ook zijn eigen nadelen, namelijk:

• De mechanische klep kan het hele leven mee gaan, maar het zal niet met

het lichaam meegroeien. Dit heeft geen nadeel bij oudere mensen, maar

bij kinderen en baby’s moet het na enige tijd vervangen worden door

een grotere klep. Gezien het inbrengen van een hartklep erg veel risico’s

met zich mee brengt is dat erg gevaarlijk.

4

• De mechanische kleppen maken geluid dat buiten het lichaam te horen

is. Dit kan een psychisch probleem veroorzaken bij de patiënt.

• Aan het oppervlak van de kunststof zal er coagulatie gevormd worden,

daardoor moet de patiënt zijn hele leven bloedverdunners innemen om

dit tegen te gaan.

Afbeelding 3: mechanische hartkleppen. [6]

De dierlijke hartkleppen kunnen lang blijven functioneren maar uiteindelijk

worden ze door het immuunsysteem geweigerd. Ook hebben ze als nadeel dat

ze niet met het lichaam meegroeien.[5]

5

2.3 Tissue engineering

Tissue Engineering, ook wel cel- en weefseltechnologie genoemd, is een

wetenschap dat verschillende wetenschapsgebieden met elkaar verbindt.

Voorbeelden van deze wetenschappen zijn moleculaire, chemische en medische

wetenschappen als ook biomechanica en engineering.

Het doel van deze wetenschap is het maken van (bio)implantaten om de

beschadigde of slechte organen te vervangen of te ondersteunen.

Tissue Engineering kan ook gebruikt worden om specifieke cellen, die

genetisch aangepast zijn, te implanteren. Deze cellen kunnen bepaalde stoffen

afgeven die het lichaam niet meer maakt, bijvoorbeeld insuline bij diabetes. [8]

Bij de TU/e onderzoekt men de mogelijkheden om geheel getissue-engineerde

hartkleppen, spiertjes en bloedvaten te maken. Hieronder een afbeelding dat het

principe van het hele proces aanduidt (afbeelding 4). Er worden cellen van de

patiënt genomen, deze cellen worden in grote hoeveelheden opgekweekt. De

opgekweekte cellen worden op de drager materiaal gezaaid. Daarna gaan ze

groeien tot een weefsel. Als laatste worden deze cellen geïmplanteerd.

Afbeelding 4: tissue engineering van een hartklep.[9]

6

2.4 Collageen

Het bindweefsel in het menselijke lichaam zorgt ervoor dat ons

lichaam stevig blijft. Daarnaast is het verantwoordelijk voor de

vormgeving en bescherming van ons lichaam. Tussen de cellen

die het weefsel vormen, bevinden zich niet-levende draadachtig

vezels die voornamelijk uit collageen bestaan. Collageen vormt

70% van het bindweefsel in het menselijke lichaam. In de

hartkleppen bevindt zich collageen type I en III. Collageen zorgt

voor de stevigheid van de hartkleppen.

De functie van collageen hangt sterk af van de plaats dat het in

het lichaam zich bevindt. In bijvoorbeeld de huid, komt een

andere soort collageen dan in kraakbeen. Het meeste

voorkomende type van collageen in het menselijke lichaam is

type I. [11]

De aanwezige typen van collageen in het menselijke lichaam

zijn: • Collageen type I: bot, pezen, ligamenten, huid, fascia,

bloedvaten, fibrotisch kraakbeen

• Collageen type II: hyalien kraakbeen,

tussenwervelschijven.

• Collageen type III: huid, synovia, bloedvaten.

• Collageen type IV: basale membraan. [11]

Afbeelding 5: Collagentriplehelix [10]

Collageen is opgebouwd uit drie om elkaar gedraaide polypeptideketens die elk

bestaan uit herhalingen van een motief Glycine-X-Y(Afbeelding 5)[10,11].

Hierbij is het aminozuur op de X-positie meestal proline en op de Y-positie

meestal hydroxyproline. In bijlage VI is er meer informatie over de indeling en

de typen van collageen.

7

3. Onderzoek en methoden

3.1 Onderzoek

De western blotting methode dient geoptimaliseerd worden voor verschillende

typen collageen. Tijdens de stage periode wordt de western blotting verder

geoptimaliseerd voor collageen type I. Door dit onderzoek wil men te weten

komen welke type collageen in de ge-tissue engineerde weefsel en in welke

verhouding het voorkomt. In het aanwezige protocol is de western blot

gedeeltelijk geoptimaliseerd, het protocol moet verder geoptimaliseerd worden.

In deze periode zullen de gebruikte verdunningen van de antilichamen in het

onderzoek bepaald worden. Deze antilichamen worden bij het visualiseren van

de eiwitbandjes in het membraan gebruikt.

In de hartkleppen komen er collageen type I en III voor. Voor het opzetten van

western blotting voor collageen type I wordt collageen type III als negatieve

controle gebruikt worden. Dit om te controleren of de antilichamen specifiek

zijn voor collageen type I. Ook collageen type I Rat wordt als negatieve

controle gebruikt. De gebruikte controles zijn terug te vinden in bijlage IV.

8

3.2 Methoden

3.2.1 Gel - electroforese (SDS - Page)

SDS-Page is een methode om de eiwitten uit elkaar te scheiden. De eiwitten

worden hier op basis van hun grootte gescheiden in een gel onder invloed van

elektrische spanning (afbeelding 6).

De eiwitten moeten voor het onderzoek uitgevouwen worden, dit gebeurt door

de monsters te incuberen met Laemmli buffer bij 96 ºC. Deze buffer bevat SDS

(sodium dodecyl sulfaat) dat verantwoordelijk is voor het uitvouwen van de

eiwitten zodat ze in de gel gescheiden kunnen worden. De bandjes die

gescheiden zijn in de gel zijn onzichtbaar op dit moment. Laemmli buffer bevat

ook broomfenolblauw (BFB). Dit wordt als indicator gebruikt en geeft aan hoe

ver het electroforese proces is. Laemmli buffer bevat ook DDT ( β-

mercaptoethanol) om de zwavelbruggen in de eiwitten te verbreken.

De monsters, die eiwitten bevatten, worden in de gel gebracht na het uitvouwen

daarvan. De kleine eiwitten migreren sneller in de gel dan de grote eiwitten.

Door het scheiden van de verschillende eiwitten in de gel, kunnen er na afloop

bandjes gezien worden. Deze bandjes zijn kenmerkend voor de verschillende

eiwitten.

Er worden ook markers bij een elektroforese proces gebruikt. De markers zijn

eigenlijk eiwitten met verschillende grootte die ook verschillende bandjes in gel

geven. Deze markers worden gebruikt voor het afleiden waar de bandjes met

welke formaat zich op de gel bevinden. Er kan gekozen worden tussen

gekleurde en ongekleurde marker. De gekleurde marker is te zien met het blote

oog op de gel. [5, 16].

De werkwijze en de verschillende gel

percentages zijn in bijlage I en II terug

te vinden, en bijlage IV voor de

gebruikte markers en controle.

Afbeelding 6: SDS Page [12]

9

3.2.2 Western blotting

Western blotting is een methode die m.b.v. antilichamen een bepaald eiwit kan

aantonen. Om dit proces uit te voeren moet eerst de eiwitten vanuit de gel op

een membraan gebracht worden (PVDF-membraan). Dit gebeurt door een

zogenaamde sandwich van de gel en het membraan te maken. Het gebruikte

apparaat voor dit proces lijkt op een normaal electroforese apparaat. De stroom

wordt nu recht op de ‘sandwich’ gezet. Daardoor worden de eiwitten bandjes

vanuit de gel naar het membraan getrokken (afbeelding 7). Hierna dient het

membraan gekleurd worden d.m.v. ponceau kleuring. Ponceau kleuring wordt

in de volgende paragraaf uitgelegd (zie paragraaf 3.2.3).

Voor het aantonen van het gezochte eiwit, moet eerst na het afronden van het

blotten het verkregen membraan geblokt worden. Deze stap voorkomt dat de

toegevoegde antilichamen aan het membraan zelf gebonden zullen worden. Het

blokken wordt bereikt door het membraan met een eiwitrijke oplossing te

verzadigen, bijvoorbeeld melk.

De tweede stap is het toevoegen van 1e antilichaam. Dit is een antilichaam dat

gericht is tegen het gezochte eiwit. Het antilichaam wordt in een dier gekweekt

(bijvoorbeeld konijn). Voordat het 2e antilichaam toegevoegd kan worden,

wordt het verkregen membraan gewassen om de overtollige 1e antilichaam weg

te wassen. Het 2e antilichaam is in een ander dier gekweekt en gericht tegen 1

e

antilichaam. Het is gelabeld met HRP (horse radish peroxidase). HRP is een

enzym dat door H2O2 wordt geactiveerd en dan het substraat luminol zal

omzetten in o.a. licht. Luminol wordt toegevoegd bij het gebruiken van ECL

oplossing. Deze oplossing bestaat uit twee componenten, luminol en

waterstofperoxide. Door het activeren van het label door deze oplossing

ontstaat chimoluminicentie. Dit betekent dat alleen het bandje van het gewenste

eiwit licht zal uitstralen. Dit licht is waar te nemen in het donker, waarvan een

foto kan gemaakt worden.

Afbeelding 7; principe western blot en immuno-blot [14]

10

De factoren die invloed kunnen hebben op het hele proces zijn;

� Monsterbehandeling; de juiste verdunning en het verhitten daarvan

� De stroom; dit moet 200 mA zijn

� De duur van het hele proces; tussen 120 en 130 minuten

� De temperatuur (koeling); dit gebeurt m.b.v. een ijspak. De ijspak wordt

halverwege vervangen [16, 17]

� Samenstelling van de blotbuffer.

Andere vormen van blotten zijn Southern blotting voor DNA, en northern

blotting voor RNA [5, 13, 16, 17]. Het western blotting protocol is in bijlage III

terug te vinden.

3.2.3 Ponceau kleuring

Ponceau kleuring is een kleuringsmethode om te controleren of de eiwitten op

het membraan terecht gekomen na het blotten. Het is een aspecifieke kleuring

dat alle eiwitten kleurt. Het wordt ook gebruikt om te controleren dat er geen

luchtbellen op het membraan ontstaan. Ponceau is een rode synthetische

kleurstof (afbeelding 8). Het kan worden afgespoeld met (demi)water. De

werkwijze en de benodigdheden zijn in bijlage V terug te vinden.

Afbeelding 8: Ponceau kleuring.[15]

11

4. Resultaten

4.1 Eerste antilichaam

Bij western blot wordt de verdunning 1:250 als standaard verdunning gebruikt.

Dit zou nog verder doorverdund kunnen worden. Volgens de bijsluiter dat bij

het antilichaam komt ligt de grens waar het 1e antilichaam verdund kan worden

tussen 1:100 en 1:500 (zie bijlage VIII). Daarom is besloten om de volgende

verdunningen te testen; 1:500, 1:1000, 1:1500 en 1:2000. De laatset drie

verdunningen zijn getest omdat bij de verdunning 1:500 de belichtingstijd kort

was (20 sec) en de bandjes waren duidelijk te zien. Als de bandjes nog

zichtbaar zijn bij een belichtingstijd dat gelijk aan of minder dan (60 sec) is,

dan kan het antilichaam doorverdund worden. Als er belichtingstijd langer dan

(60 sec) nodig is om de bandjes zichtbaar te maken, dan hoeft er niet

doorverdund worden.

Bij de verdunning 1:250 was bij een belichtingstijd van 15 sec waren de

bandjes goed te zien. Daarna is de verdunning 1:500 getest. De belichtingstijd

was gelijk aan de belichtingstijd bij de eerste verdunning (15 sec) maar de

bandjes waren zichtbaar op het blot. Doordat de bandjes nog goed te zien

waren, is besloten om de volgende verdunning te testen, de verdunning 1:1000.

Hierbij waren de bandjes nog te zien. De belichtingstijd was iets langer dan bij

de vorige verdunningen (20 sec), maar nog minder dan de grens (60 sec).

Daarom is besloten om naar de volgende verdunning te gaan. De volgende stap

was het testen van de verdunning 1:1500. Bij het gebruiken van deze

verdunning waren de bandjes nog te zien bij een belichtingstijd van (30 sec).

Omdat deze belichtingstijd binnen de grens ligt, is besloten om door te

verdunnen. Als laatste was de verdunning 1:2000 gebruikt. Deze verdunning

was te groot. Bij een belichtingstijd van (40 sec) waren de bandjes niet goed te

zien. Ook bij een belichting van (60 sec) waren de bandjes niet goed te zien.

Daarom is besloten om niet door te gaan verdunnen, en dat was eigenlijk de

laatste verdunning van de 1e antilichaam die getest wordt. Na het uitvoeren van

western blotting met verschillende verdunningen was gebleken dat verdunning

1:1500 de optimale verdunning is.

Sluitertijd 30 sec bij verdunning 1:1500

12

4.2 Tweede antilichaam

De verdunning 1:5000 werd als standaard gebruikt bij western blotting. Dit zou

verder doorverdund kunnen worden. In de bijsluiter van dit antilichaam staat

dat het doorverdund kan worden tussen 1:1000 en 1:100.000 (zie bijlage VIII).

Bij het testen van het antilichaam is gebleken dat alleen tot 1:20.000 verdund

kan worden. Bij deze antilichaam is besloten om de volgende verdunningen te

testen als begin; 1:10.000, 1:12.500, 1:15.000 en 1:20.000. Als bij verdunning

1:20.000 de bandjes nog goed te zien dan kan er doorverdund worden. Als de

bandjes nog zichtbaar zijn bij een belichtingstijd dat gelijk aan of minder dan

(60 sec) is, dan kan het antilichaam doorverdund worden. Als er belichtingstijd

langer dan (60 sec) nodig is om de bandjes zichtbaar te maken, dan hoeft er niet

doorverdund worden. Bij deze verdunningen zijn de volgende belichtingstijden

gebruikt (15, 30, 45 en 60 sec).

Bij het testen van de verdunning 1:5000 zijn de bandjes nog te zien bij een

belichtingstijd van (30 sec). Daarna is verdunning 1:10.000 getest. De bandjes

waren nog duidelijk te zien bij een belichtingstijd van (45 sec). Daarom is

besloten om de volgende verdunning te gaan testen, verdunning 1:12.500. Bij

deze verdunning waren de bandjes ook te zien bij een belichtingstijd van (45

sec). Hierdoor was besloten om de volgende verdunning te gaan testen,

verdunning 1:15.000. Bij deze verdunning waren de bandjes moeilijk te zien bij

een belichtingstijd van (45sec). Bij een belichtingstijd van (60 sec) waren de

bandjes beter te zien dan bij (45 sec). Hierna was de verdunning 1:20.000 als

laatste getest. Hierbij zijn dezelfde belichtingstijden gebruikt als bij de andere

verdunningen. De bandjes waren helemaal niet te zien ook bij een

belichtingstijd van (60 sec). De enige bandjes die te zien waren, waren de

bandjes van de magic marker. Na dit resultaat is besloten om te stoppen met het

doorverdunnen, omdat het geen nut heeft om door te gaan verdunnen.

Bij de verdunning 1:12.500 waren de bandjes duidelijk te zien dan bij

verdunning 1:15.000 bij dezelfde belichtingstijden. Uit de resultaten van de

western blotting met de verschillende verdunningen is gebleken dat optimale

verdunning van de 2e antilichaam is 1:12.500.

Sluitertijd 45 sec bij verdunning 1:10.000.

13

5. Discussie en aanbevelingen

Tijdens dit onderzoek is geprobeerd om de western blot methode te

optimaliseren voor collageen I. Gedurende het onderzoek zijn veel problemen

opgetreden waardoor het experiment opnieuw uitgevoerd moest worden.

Een voorbeeld van deze problemen; tijdens dit onderzoek is een ponceau

kleuring gebruikt om te controleren of de blotting proces goed vergelopen is. In

het begin waren er geen bandjes te zien op het membraan, ook na langere tijd

kleuren. Uiteindelijk was gebleken dat de ponceau kleuring die gebruikt is,

uitgewerkt was omdat het waarschijnlijk over de datum was. Het heeft als

resultaat dat er geen bandjes op het membraan te zien waren. Daarna was er

nieuwe fles gekocht als vervanging voor de oude. Na het gebruik van de

nieuwe fles waren er wel bandjes zichtbaar op het membraan.

Veel factoren van de western blot methode waren al opgezet in het protocol die

in het lab aanwezig was. Het protocol was ver uitgewerkt, alleen de

verdunningen van de 1e en de 2

e antilichamen zouden nog bepaald moeten

worden. Ook het visualiseren van de western blot voor collageen type I zou nog

geoptimaliseerd moeten worden.

In het begin van het onderzoek was collageen type I rat als negatieve controle

gebruikt. Bij de laatste zes experimenten is collageen type III ernaast als

negatieve controle gebruikt. Dit gebeurt om te controleren of de 1e antilichaam

specifiek is voor collageen type I humaan. Het gebruik van collageen type III is

besloten na het gesprek met de supervisor. Collageen III moet altijd als

negatieve controle gebruikt worden bij het optimaliseren van western blotting

voor collageen type I. Dit om te controleren of het 1e antilichaam specifiek is

voor collageen type I.

Doordat er niet genoeg tijd was, is alleen western blot voor collageen type I

humaan onderzocht. Voor het optimaliseren van western blot methode voor

collageen type III humaan, moet hetzelfde proces opnieuw gedaan worden.

Uiteindelijk zullen de twee typen collageen op hetzelfde manier bepaald

kunnen worden.

Voor de komende tijd is aan te raden dat men direct met twee gels tegelijk aan

de slag te gaan. Op deze manier is het sneller om western blot te optimaliseren.

Ook is het wenselijk dat alles van tevoren gecontroleerd wordt. Een voorbeeld;

als de buffers op zijn moeten deze gemaakt worden. Dit moet voor het

beginnen met het experiment zodat het proces snel begint en de

gels/membranen niet droog gaan worden.

14

6. Conclusie

• Na het gebruik van verschillende verdunningen van het 1e antilichaam is

gebleken dat de optimale verdunning die gebruikt kan worden bij de

western blot methode voor collageen type I humaan verdunning 1:1500

is.

• Na het gebruik van verschillende verdunningen van het 2e antilichaam is

gebleken dat de optimale verdunning die gebruikt kan worden bij de

western blot methode voor collageen type I humaan verdunning

1:12500 is.

15

7. Bronnen

1) http://www.mstwente.nl/thoraxcentrum/hart/problemen_met_de_hartkleppe

n.doc/

2) http://www.yayabla.nl/users/Innercircle/Uploads/img_113.jpg

3) http://www.natuurinformatie.nl/nnm.dossiers/natuurdatabase.nl/i002083.ht

ml

4) http://nl.wikipedia.org/wiki/Hartklep

5) R. van Wezel; ROC stage verslag; Juni 2007.

6) http://roy.schrijft.nl/hartkleppen.jpg

7) http://www.lumc.nl/2070/patientenzorg/operaties/foto/replac1.jpg

8) http://www.dpte.nl/site/index.php?id=17

9) http://biomed.brown.edu/Courses/BI108/BI108_2007_Groups/group12/ho

mepage.html

10) http://nl.wikipedia.org/wiki/Afbeelding:Collagentriplehelix.png

11) http://nl.wikipedia.org/wiki/Collageen

12) http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/sds_page2.gif

13) http://www.chemieforum.nl/forum/index.php?showtopic=1349&st=0&

14) http://www.chemicon.com/images/ant101/A2WB.gif

15) http://www.western-blot.org/photos/rouge_ponceau_1.jpg

16) Braam, W.G.M.; Electroforese; EPN te Houten; 2000, 4edruk.

17) W.L. van de Loo; Fontys stageverslag; augustus 2004.

16

Gel elektroforese Bijlage I

(SDS-Page)

Materialen:

• Glasplaat met opstaande randjes (0,75mm)

• Afdek glas

• Mal

• Kam

• Houder

• Bak

• Power supply

• Runningbuffer

• Separating Gel

• Stacking gel

• Pipetten 1000 µl / 100 µl / 10 µl

• Bijbehorende puntjes

• Leammli buffer

• Marker

Gels:

Bijvoorbeeld 8% gel (andere percentages en stacking gels zijn terug te vinden

in bijlage II) (onderstaande waarden zijn gebaseerd op 1 gel)

• Water: 2,3 ml

• Bisacrylamide: 1,3 ml Let op: Kankerverwekkend! R45

• Tris buffer: 1,3 ml

• APS (ammonium per sulfaat): 0,05 ml

• SDS: 0,05 ml

• TEMED: 0,003 ml

Let op: Na toevoegen van TEMED zal de gel polymeriseren. Dus direct

verwerken!

Gebruik bij het maken van een polyacrylamide gel altijd blauwe handschoenen!

Leammli buffer:

2x Laemmli Buffer omdat deze met het monster verdund zal worden bij

verwerking

• 125 mM Tris-HCl pH 6,8

• 20 % (v/v) Glycerol

• 5% SDS

• 0.02% Broom phenol Blue

• 10% 2-mercaptoethanol

De Laemmli buffer kan bij -20oC lang bewaard blijven.

17

Procedure: Bijlage I

• Neem de 2 glasplaatjes en plaats ze in de mal. Haal deze over de

labtafel om zeker te zijn dat beide onderzijden gelijk staan.

• Plaats de mal in de houder op het rubber sponsje om lekken te

voorkomen.

• Maak zowel de stacking gel als de separating gel (Voeg pas TEMED

toe bij gebruik).

• Pipeteer de separating gel tussen de twee glasplaatjes en laat ongeveer

1,5 cm vrij. Vul deze ruimte af met ethanol. Binnen 30 minuten is de gel

gepolymeriseerd en kan de ethanol er afgegoten worden. Pipeteer nu de

stacking gel hier boven op en plaats de kam in de gel. Laat deze gel ook

polymeriseren.

• In de tijden dat de gels moeten polymeriseren moeten de monsters

verdund en verwerkt worden. De verdunde monsters worden 1:1

vermengd met Leammli buffer en 10 minuten verhit bij 96oC.

• Haal de gel die tussen de glasplaatjes zit uit de mal en plaats deze in de

houder. Zet de houder in de bak en vul de bak met running buffer.

(Indien 1 gel runt, moet de tegenoverliggende houder afgedekt worden

met de plastic plaat die hiervoor bestemd is).

• Was de slotjes uit door de buffer in en uit het slotje te pipetteren.

• Voeg 5µl van de gewenste marker toe aan het eerste en laatste slotje in

de rij. Pipeteer van de verhitte monsters 15µl in elk slotje.

• Sluit de bak af met het hiervoor bestemde deksel en sluit deze aan op de

power supply. (Let hierbij op dat zwart staat voor – en rood voor +) Stel

in op 90 Volt en start running. Na ongeveer 10 minuten de voltage

verhogen naar 120 Volt.

• Als de blauwe kleur van de Leammli buffer de onderkant van de gel

bereikt heeft is het runnen voltooid.

• Neem glasplaatjes met de gel uit de houder en haal voorzichtig de

glasplaatjes van elkaar. Steek de stacking gel weg en steek een klein

hoekje af van het begin zodat je weet waar het eerste en laatste eiwit in

gepipetteerd is.

• De gel kan gekleurd worden in bijvoorbeeld zymo staining of coomassi

staining. Indien nodig kan de gel gebruikt worden voor western blot.

(Let op: Een gel is niet houdbaar!)

18

Tabel 1: Schema Gel percentage Bijlage II

Separating gels

6% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml

H2O 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5

30% acrylamide 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0

1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04

8% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml

H2O 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2

30% acrylamide 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3

1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03

10% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml

H2O 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8

30% acrylamide 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7

1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

12% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml

H2O 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5

30% acrylamide 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0

1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

15% gel 5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml

H2O 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5

30% acrylamide 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0

1,5M Tris pH8,8 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5

10% SDS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

10% APS 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

TEMED 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02

Stacking gels

5% 1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml

H2O 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8

30% acrylamide 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7

1,0M Tris pH6,8 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25

10% SDS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1

10% APS 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1

TEMED 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01

Bron: Sambrook & Russel; Molecular cloning and laboratory manual; 3e editie 2001

[13]

19

Western Blot Bijlage III

Materialen:

• PVDF membraan

• Whatman papier

• Sponsjes

• Blotmal

• Schaaltje

• Blotbak

• Ijsbak

• Roervlo

• Roerder

• Blotbuffer (Bio-Rad)

• 100ml 10x blotbuffer

• 200 ml MeOH

• 700 ml MilliQ

• PBS-Tween 0,1%

• 5 tabletten PBS per Liter water

• 1000 ml MiLiQ

• 1 ml Tween

• Handschoenen

• 50ml buis

• Melkpoeder

• PBS-tween 0,1%

• Eerste antilichaam (USBiological, C7510-17K)

• Tweede antilichaam (pierce, 31402)

• PBS

• ECL oplossing ;kit met luminol en waterstofperoxide. (Thermo 34075)

Oplossingen:

Runningbuffer:

• 100 ml Running buffer 10x Bio-Rad

• 900 ml Milli Q water

Blotbuffer:

• 100 ml Blotbuffer 10x Bio-Rad

• 300 ml Methanol

• 598 ml Milli Q water

• 2 ml 10%SDS oplossing

PBS-Tween:

• 5 PBS tabletten (Sigma; P4417t00TAB)

• 1 L Water

• 1 ml Tween

20

Procedure: Bijlage III

Knip de membranen op formaat van de gel (90 mm bij 60 mm), draag hierbij

handschoenen om te voorkomen dat er eiwit van je handen op het membraan

komt. Week het membraan ongeveer één min. in 100% methanol. Week het

membraan daarna in de blotbuffer samen met de sponsjes en whatman

papiertjes.

Leg de blotmal in een schaaltje met blotbuffer en leg de materialen er in de

volgende volgorde in:

• Zwarte kant van de blotmal (-)

• Sponsje

• Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier)

• Gel (verkregen via gel elektroforese)

• PVDF membraan

• Whatman papier (aantal is afhankelijk van de dikte van het papier)

• Sponsje

• Transparante kant van de blotmal (+)

Plaats de blotmal in de blotbak met de zwarte kant aan de zwarte zijde. Zet de

ijsbak en een roervlo er in. Zet de roerder rustig aan en blot ± 2 uur bij 200 mA.

Na 1 uur blotten op pauze drukken en de ijsbak vervangen voor een nieuwe.

Vries de gesmolten ijsbak opnieuw in voor latere blots.

Na 125/130 minuten blotten:

Spoel het blot met PBS-Tween en bewaar het blot in PBS-Tween. Het

membraan kan zo ongeveer één dag bewaard blijven bij 4oC en onbeperkt bij -

20oC.

Het verkregen membraan bevat nu de eiwitten die in de gel een bandje

vormden. Om de eiwitten zichtbaar te maken is een immuno blot mogelijk maar

ook een ponceau kleuring. Immuno blot wordt gebruikt bij het aantonen van

een specifiek eiwit. Ponceau kleuring is een aspecifieke methode voor alle

eiwitten. Deze methoden sluiten elkaar niet uit, maar ze kunnen ook aanvullend

gebruikt.

Immunoblot:

Als onderdeel van western blot.

• Melkpoeder

• PBS /PBS-tween (0,1%)

• Primair antilichaam

• Secundair antilichaam

• 50 ml buis

• Versa Doc (Bio-Rad)

• Geblot PVDF membraan

• Rollenbank (gekoeld)

21

Werkwijze: Bijlage III

• Dag 1:

o 3.5% melkpoeder in PBS tween maken.

o Leg het membraan wat is verkregen door blotten in een schaaltje en

voeg hier 30 ml 3,5% PBS tween melk aan toe. Het melkpoeder

oplossen in PBS-Tween 0,1%. Laat het 1 uur incuberen bij

kamertemperatuur.

o Stop vervolgens het membraan in een 50 ml buis met de bovenkant

naar binnen. Maak de juiste verdunning van het eerste antilichaam

in 3,5% melkpoeder met PBS-Tween. Leg de buis in de koelkast op

de rollenbank, laat overnacht incuberen.

• Dag 2:

o Was de volgende dag het blot door het buisje leeg te gieten en 5 tot

10 ml PBS-Tween toe te voegen. Leg het buisje 5 minuten op de

rollenbank (bij kamertemperatuur). Herhaal deze wasstap 3x.

o Maak een verdunning van het 2e antilichaam in 3,5% melkpoeder

met PBS-Tween en voeg die aan de buis met het membraan.

o Leg de buis gedurende 1 uur op de rollenbank bij kamertemperatuur

om het 2e antilichaam te laten incuberen.

o Was daarna het blot weer 3 keer met PBS-Tween en één keer met

PBS, elke keer voor 5 minuten en op de rollenbank bij

kamertemperatuur incuberen.

o Leg het membraan op een overhead sheet en maak de ECL

oplossing klaar door 1:1 de 2 componenten (luminol en

waterstofperoxide) bij elkaar te voegen.

o Druppel de substantie over het membraan en laat ongeveer 2

minuten incuberen. Laat het membraan uitdruppen en leg het op een

nieuwe overhead sheet met een andere sheet er boven op zodat het

membraan niet uit kan drogen. (Voorkom hierbij luchtbellen die er

tussen kunnen komen).

o Maak nu een foto met het de Versa Doc (Bio-Rad) van Bio-Rad. Het

uitgezonden licht is van de bandjes afkomstig en wordt zo zichtbaar

gemaakt.

Afbeelding: Voorbeeld van membraan gekleurd met behulp van immunoblot

Sluitertijd 60 sec. rechts en links magic mark™ midden collageen.

Eerste 6 bandjes collageen type I humaan in verdunningen, 7e bandje collageen type I rat,

lege plaats is collageen type III humaan. (Geen binding van 1e antilichaam aan type III)

22

Tabel 2: Gebruikte antilichamen, controles en markers Bijlage IV

Mag

icma

rk xp

All b

lue m

arker

Co

ntro

les

Ra

bb

it an

ti go

at

imm

un

op

ure

IgG

HR

P

lab

eled

Secu

nd

aire

an

tilicha

men

Go

at a

ntih

um

an

imm

un

op

ure

col. T

ype I

Prim

aire

an

tilicha

men

Co

llag

en typ

e

III hu

ma

n

Co

llag

een typ

e I

rat

Co

llag

een typ

e I

hu

man

Co

ntro

les

---------

---------

1:5

.000

– 1

:10

0.0

00

1:1

00

– 1

:50

0

---------

---------

---------

Verd

un

nin

g

Inv

itrog

en

Bio

-Rad

Pierce

Bio

techno

log

y

US

Bio

log

ical

Sig

ma

Sig

ma

Sig

ma

Fa

brik

an

t

---------

---------

Ca. 1

30

kD

Ca. 1

30

kD

Ca. 1

30

kD

Fo

rmaa

t

(kD

)

LC

560

2

16

1-0

373

31

40

2

C7

510

-17

K

C4

407

C8

897

C7

774

Pro

d. N

r.

Reco

mb

inan

te

eiwitten

Reco

mb

inan

te

eiwitten

Rab

bit

Go

at

Hu

man

placen

ta

Rat tail

Hu

man

placen

ta

Oo

rspro

ng

---------

---------

Mo

no

clon

al

Po

lyclo

nal

---------

---------

---------

Po

ly/m

on

o-

clon

al

23

Ponceau kleuring Bijlage V

Materialen:

• Ponceau oplossing. (Sigma Aldrich; P7170-1L)

• PVDF membraan (al wel geblot)

• Schaaltje

• Water

• Overhead sheet

• Pincet

• Tissues

Procedure:

• Giet een bodem ponceau in het schaaltje.

• Neem het membraan voorzichtig met een schoon pincet van het

blotpapiertje af en leg deze in een schaaltje met ponceau oplossing.

Zorg dat het membraan goed onder gedompeld is. Laat ongeveer 15 min

staan. (evt. op een schudplaat)

• Giet nu voorzichtig de ponceau oplossing terug in de fles en vul het

schaaltje met water uit de kraan. Let op: niet rechtstreeks op het

membraan laten spoelen!

• Spoel enkele seconden met het water en giet het water door de

gootsteen. Vul het schaaltje opnieuw met een bodem water (weer niet

direct op het membraan gieten). Haal het membraan uit het water en leg

het op de overhead sheet.

• Een gedroogd membraan is onbeperkt te bewaren*. Een gedroogd

membraan is echter niet meer te bewerken. Om het membraan te

gebruiken voor immunoblot mag het zeker niet drogen.

Afbeelding: Voorbeeld membraan kleuring met ponceau kleuring [5]

*Mogelijk ontkleuren de membranen door blootstelling aan licht en lucht. Dit is nog niet bekend.

24

Tabel 3: Indeling collageen volgens Bornstein en Traub Bijlage VI

Type Notes

I

This is the most abundant collagen of the human body. It is present in

scar tissue, the end product when tissue heals by repair. It is found in

tendons, the endomysium of myofibrils and the organic part of bone.

II Articular cartilage and Hyaline cartilage, makes up 50% of all cartilage

protein

III

This is the collagen of granulation tissue, and is produced quickly by

young fibroblasts before the tougher type I collagen is synthesized.

Reticular fiber. Also found in artery walls, intestines and the uterus

IV Basal lamina; eye lens. Also serves as part of the filtration system in

capillaries and the glomeruli of nephron in the kidney.

V most interstitial tissue, assoc. with type I, associated with placenta

VI most interstitial tissue, assoc. with type I

VII forms anchoring fibrils in dermal epidermal junctions

VIII some endothelial cells

IX FACIT collagen, cartilage, assoc. with type II and XI fibrils

X hypertrophic and mineralizing cartilage

XI cartilage

25

Handleiding Versadoc Apparaat Bijlage VII

• Start het apparaat aan 2X:

o Start de camera

o Start de Versadoc apparaat

• Zet de pc aan.

• Altijd controleren of in het apparaat de korte of de lange lens staat.

Voor western blot moet altijd de korte lens gebruikt worden.

• Start Quantity One op.

• Selecteer scanner; Versa Doc.

• Selecteer onder de button Select: Versadoc.

• Selecteer channel 1 (het staat meestal al op channel 1)

• Druk op de button “Select” en kies hieronder ‘blotting’ en dan ‘Chem

Hi Sensitivity’.

• Druk op de button “position” om de positie van het membraan vast te

stellen, (Light off).

• Draai aan de lens en kijk naar het scherm om een scherp beeld te

krijgen.

• Scherpstellen op het membraan door op de button “Focus” te drukken.

• Light off.

• Stel de sluitertijd om te beginnen in op 10 sec.

• Druk op de button “Acquire” om de foto te maken.

• Zoom op het sterkste bandje door middel van het zoom icoon.

• Activeer de “density tool”, dit is te vinden onder View → Plot density,

daarna kan gekozen worden tussen verschillende opties; bijvoorbeeld

density at cursor. De maximale haalbare intensiteit is 4000.

• De behaalde intensiteit is aangegeven als “Average Quantity” onder in

beeld. Stel dat deze 35.9 is, zal de berekening van de gewenste

sluitertijd als volgt zijn:

4000/36= 111 X meer dan wat nu gebruikt is, dus 111*10= 1110 sec.

Ander voorbeeld: stel dat de “Average Quantity” 550 is, dus

4000/550= 7.3X meer dan wat nu gebruikt is, dus 7.3*10= 73 sec

sluitertijd.

• Kies de gewenste sluitertijd en druk op “Acquire” om de foto vast te

stellen.

• Na het vaststellen van de foto verschijnt de foto in het wit, om het in

zwart te krijgen moet het volgende gedaan worden; rechter muisknop →

transform kiezen → onder display kies invert display. Door de pijlen

van (high en low) te veranderen kan het contrast veranderd worden.

• Foto opslaan.

• Om de foto te kunnen openen op alle PC’s, moet het volgende gedaan

worden; File → Export to TIFF Image → Export view excluding

overlays.

• Nu is de foto formaat geschikt voor alle pc’s.

• Einde.

26

Bijsluiter 1e antilichaam Bijlage VIII

27

Bijsluiter 1e antilichaam Bijlage IX