Hemoglobinopatilere Hemoglobinopatilere Laboratuvar YaklaşımıLaboratuvar Yaklaşımı

Dr. Çağatay KundakDÜZEN LABORATUVARLAR GRUBU

• 1949 yılında Orak Hücre Anemisi olan hastalarda elektroforetik olarak farklı bir hemoglobin tipi tanımlanmıştır.

• Bir tek proteindeki moleküler varyasyonun bir hastalığı karakterize edecek tüm klinik, laboratuvar ve patolojik bulgulardan sorumlu olabileceği bir molekmoleküüler hastaller hastalıık k konseptikonsepti ortaya çıkmıştır.

• Hb A (α2β2). Normal erişkin hemoglobini(%94-98)

• Hb F (α2γ2). Fetüs ve yenidoğanın majör hemoglobini. 2 yıl bittikten sonra normal çocuklarda % 2’nin altına inmelidir.

• Hb A2 (α2δ2). Normal erişkin hemoglobinin % 1.5 – 3.5’idir.

HemoglobinHemoglobin VaryantlarıVaryantları

Hemoglobin varyantları alfabenin harfleri veya tanımlandıkları coğrafik bölge ismi ya daher ikisi ile birlikte adlandırılırlar. Polipeptid zincirinde hangi aminoasitte anormallik varsa zincir sembolünün üzerine pozisyonu ve yerine gelen aminoasidin kısaltması yazılır. Örn: Hb S = α2β26Val

Hemoglobinopatiler ve Talasemiler genetik açıdan iki farklı hastalık grubu olsalar da her ikisi de klinik olarak ciddiyeti ve patofizyolojisi değişken olan ANEMİ ile karakterizedirler.

Talasemi ve Hemoglobinopati Tanısında Kullanılan Testler

• Tam Kan Sayımı• Elektroforez• HbH inklüzyon cisimleri• IEF (Alkali elektroforez ile aynı paternde göç ederler ancak

rezolüsyon çok iyidir ve daha güvenilir bir kantifikasyon vardır)

• Kapiller IEF (Kapiller EF + HPLC)• HPLC• DNA Analizi

Tam Kan Sayımı

• MCV (< 72 fl)• RDW (normal)• RBC (artmış)• Hemoglobin (azalmış)

Elektroforez

• Geleneksel olarak elektroforez, varyant hemoglobinlerin tanımlanması ve kantifikasyonu için tercih edilen bir metottur.

• İki ayrı pH değerinde Agaroz jel kullanılarak yapılır.

• Yavaş ve emek yoğun bir yöntemdir.

Alkali Hb Elektroforezi(pH: 8.6)

• Hb A, F, S ve C için tarama amaçlı kullanılır.•• Minör varyant olan G ve D’yi HbS’den ayıramaz.Minör varyant olan G ve D’yi HbS’den ayıramaz.•• Minör varyant olan E ve O’yu HbC’den ayıramaz.Minör varyant olan E ve O’yu HbC’den ayıramaz.•• CDC bu yöntem ile HbF ve HbCDC bu yöntem ile HbF ve HbAA22’’ninnin dansitometrik dansitometrik

taranmasını (kantifikasyon için) önermemektedir.taranmasını (kantifikasyon için) önermemektedir.•• HbH ve HbBart’s gibi hızlı hemoglobinler için HbH ve HbBart’s gibi hızlı hemoglobinler için

sensitivitesi düşüktür.sensitivitesi düşüktür.

Asit Hb Elektroforezi(pH:6.0)

• HbG ve HbD’nin HbS’den ayrılmasına olanak sağlar.

• HbE, HbO ve HbC’nin birbirlerinden ayrılmasına olanak sağlar.

• Hemolizat iyi yıkanmamış hücrelerden elde edilirse Albumin HbS ile aynı bölgeye göç eder.

Hemoglobin Elektroforezinde Başlıca Hemoglobinlerin göç etme Paternleri

HPLC• Özellikle HbA2 ve HbF’i ayırmak ve yüzde

olarak miktarlarını belirtmek için tasarlanmış,aynı zamanda anormal hemoglobinlerin dekalitatif tespitlerini yapabilecek tam otomatikHPLC sistemleri mevcuttur.

• En sık rastlanan hemoglobin varyantları D, S, C ve E’dir. D, S ve C kendi adları ile anılan pencerelerde elüe olurlar. HbE, HbA2 ile birlikte elüe olur.

HPLC Analit Tanımlama Pencereleri

HPLC Yönteminin Kısıtlamaları•• Yüksek Yüksek HbAHbA22 ddüüzeyizeyi,, eeşşlik eden bir demir eksiklilik eden bir demir eksikliğği anemisi i anemisi

taraftarafıından maskelenebilir.ndan maskelenebilir.•• HbS ve diğer HbS ve diğer gegeçç elelüüe olan hemoglobin varyantlare olan hemoglobin varyantlarıı HbAHbA22 ile ile

birlikte elbirlikte elüüe olan mine olan minöör komponentler ir komponentler iççerirler. Buerirler. Bu durumdurum HbAHbA22ddüüzeyinde sahte bir yzeyinde sahte bir yüüksekliksekliğğe yol ae yol aççabilir.abilir.

•• HbE, HbG ve Hemoglobin Lepore gibi nadiren HbD’nin de HbE, HbG ve Hemoglobin Lepore gibi nadiren HbD’nin de HbAHbA22ile birlikte elile birlikte elüüe olduklare olduklarıı ggöörrüülmlmüüşşttüür. %10r. %10’’u au aşşan HbAan HbA22oranlaroranlarıında muhtemel varyant hemoglobin varlnda muhtemel varyant hemoglobin varlığıığı iiççin diin diğğer er incelemeler yapincelemeler yapıılmallmalııddıır.r.

•• Hb BartHb Bart ve Hbve Hb HH analiz baanaliz başşlamadan lamadan öönce elnce elüüe olurlare olurlar. Bu. Bunedenle kantifiye edilmeleri zordurnedenle kantifiye edilmeleri zordur..

•• DiabetikDiabetik öörneklerde tipik olarak P2 piki yrneklerde tipik olarak P2 piki yüüksektir. HbF ile P2 ksektir. HbF ile P2 arasarasıında ilave bir unknown pik de gnda ilave bir unknown pik de göörrüülebilir.lebilir. Bu pikin hatalı Bu pikin hatalı olarak HbF’e dahil olmamasına dikkat etmek gerekir.olarak HbF’e dahil olmamasına dikkat etmek gerekir.

Beta Talasemi• Heterozigot beta talasemi durumlarında

HPLC ile bakıldığında HbA2 %4-9 arasındadır. Hastaların %30-40’ında >%1 HbF vardır. (%3.5-%4.0 arasındaki HbA2 değerleri mutlaka hastanın kan sayımı sonuçları, klinik bulguları ve aile hikayesi ile birlikte değerlendirimelidir)

• Homozigot durumlarda normal ya da artmış HbA2’nin yanısıra HbF %80-100 arasında görülür.

Beta Talasemi• Beta Talasemi sıklıkla heterozigot olarak

BBeta eta TTalasemi alasemi MMinorinor (trait) olarak görülür.• Beta talasemi geni taşıyıcıları hafif anemik oldukları

gibi asemptomatik de olabilirler. Heterozigot çiftlerden doğacak çocukların homozigot beta talasemi genine sahip olma riskleri vardır.

• Homozigot formu olan BBeta talasemi majeta talasemi majöörr, yeterli tedavisi olmayan ölümcül bir hastalıktır. Ciddi anemi, sarılık, splenomegali, kemik malformasyonları, büyüme geriliği görülür ve genellikle erişkin yaşa ulaşmadan kaybedilirler.

β-Talasemi ve Herediter F Persistansı durumlarında görülen Hb oranları

HbA2 HbF

Heterozigot β -Talasemi % 4 - 9 % 1 - 5

Homozigot β -Talasemi Normal ya da yüksek % 80 - 100

Heterozigot HPFH < % 1.5 % 10 - 20

Homozigot HPFH yok % 100

Beta Talasemi Sendromları

Beta-TalasemilerSENDROM GENOTİP KLİNİK ÖZELLİKLER HEMOGLOBİN ÇALIŞMALARI

Homozigot durumlar:β+-Talasemi β+/β+ Talasemi Majör/Intermedia ↓ Hb A, ↑ Hb F, değişken Hb A2

β0-Talasemi β0/β0 Talasemi Majör Hb A yok, değişken Hb A2 kalanın tümü Hb Fδβ0-Talasemi δβ0/δβ0 Talasemi Intermedia Hb A ve A2 yok, %100 Hb FHb Lepore Lepore/Lepore Talasemi Majör Hb A ve A2 yok, %75 Hb F, %25 Hb Lepore

Heterozigot durumlar:β+-Talasemi β+/β Talasemi Minör ↑ Hb A2, hafif ↑ Hb Fβ0-Talasemi β0/β Talasemi Minör ↑ Hb A2, hafif ↑ Hb F

δβ0-Talasemi δβ0/δβ Talasemi Minör %5-20 Hb FHb Lepore Hb Lepore/β Talasemi Minör ↑ Hb F, ↓ Hb A2 %5-15 Hb Lepore

Homozigot Beta Talasemi (Talasemi Majör)

• Sarılık, splenomegali, mongoloid görüntü• Hipokrom mikrositer hemolitik anemi, ileri poikilositoz, target

hücreler, Howell Jolly Cisimleri, siderositler ve şiddetli normoblastozis görülür.

• β0 Talasemilerde HbA yoktur ve HbF %98’e kadar bulunabilir. HbA2 yaklaşık %2’dir.

• β+ Talasemilerde HbA vardır ve HbF oranı %60 – 95 arasındadır.

• Çoğunlukla 3.dekadın sonlarına doğru (sık transfüzyona bağlı) miyokardial siderozisin yol açtığı kalp yetmezliği sonucu kaybedilirler.

Heterozigot Beta Talasemi(Talasemi Minör)

• Tamamen normal klinik bulgular olabileceği gibi hafif-orta düzeyde anemi görülebilir.

• RBC yüksek, Hgb ve Hct düşük, MCH <22 pg, MCV 50-70 fl arasındadır.

• Orta derecede mikrositoz, poikilositoz, Target hücreler, normal ya da yüksek serum demiri görülür.

• Hemoglobin A2 yüksektir. Yarısında HbF hafifçe yükselmiştir. Eğer HbF %5’den yüksek ise Herediter Hemoglobin F Persistansı (HPHF) geni de mevcut olabilir.