Hemoglobin Elektroforezi

Doç. Dr. Şule ÜnalHacettepe Üniversitesi, Pediatrik Hematoloji Ünitesi

GLOBIN BOZUKLUKLARI

1‐ YetersiznormalHb sentezi(Nicelikselhemoglobinopatiler)>>TALASEMİLER

2‐AnormalHb sentezi(Niteliksekhemoglobinopatiler)>>ORAKHÜCRELİANEMİ

3‐ Herediter persistan Hb F

1‐ Hiçglobin üretilemiyorsa(o‐ yada o ‐talasemi)

YADA

2‐ Birazglobin sentezivarsa(+‐ or+‐ talasemi)

Hb elektroforezi‐Normal erişkin

Hb A Hb A2 Hb F

YAPI 22 22 22

Normal % 96-98 % 2-3.5 % 0.5-1 (1.5)%

Ne zaman hemoglobinopati düşünelim / tarayalım ?• Öykü• Hemolitik anemi• Hipokrom mikrositer anemi• Ülkemizde evlilik öncesi taramalarda 

Hemoglobinopatilerin tanınmasında 

• Tam kan sayımı

• Periferik yayma

• HPLC (High pressure liquid chromatography)

Periferik yayma

• Hb S:  Orak hücreli anemi 

• Hb C: Hedef hücreler, Hb C kristalleri

• Talasemiler: Mikrositoz, hedef hücreler, bazofilik noktalanma

Elektroforez HPLC

GÜNÜMÜZDE HALA HPLC İÇİN ELEKTROFOREZ TABİRİNİ KULLANIYORUZ

Elektroforez: Yüklü moleküllerin elektriksel alanda hareketi esasına dayanır• Hb, amfoteriktir. İçinde bulunduğu çözeltinin pH’sına bağlı olarak pozitif ya da negatif yüklenebilir. Genellikle negatif yüklenir.

• JEL ELEKTROFOREZLERİ:• Selüloz asetat agar: pH 8.6 

• Sitrat agar jel elektroforezi: pH 6.3

Seluloz asetat elektroforez (pH 8.4) 

Sitrat Asit elektroforez

İzoelektrik odaklama• Çok daha fazla anormal Hb’nin ayırd edilmesine yarar.

• Amfolit tamponda elektrik verildiğinde

Knossos

HPLC

• High‐Performance Liquid Chromatography (HPLC)• Zayıf katyon değişim kolonu. • Elute eden solusyonun ion gücü dereceli olarak artırılır ve farklı Hb’ler farklı retansiyon zamanlarıyla ayrışırlar. 

HPLC

•HbA2 ve HbF kantite etmede en iyi metod.

•Hb S, C ve D kendi adları ile elüe olur.

•HbA2 ve Hb E beraber elüe olur.

NormalHPLC

NormalHPLC, 4 aylık bebek

Hb A2

• Hemoglobin A2– ARTMIŞ (>%3.5)

• 3.5‐7.0 β‐talasemi taşıyıcılık, Sβ+

• 3.5‐4.5 Hb AS, AC, SC, SS, CC• 6.5‐14.0 Hb Lepore• 25‐30 Hb E taşıyıcı

– AZALMIŞ (<%2)• 1.3‐1.7 Ağır demir eksikliği anemisi• 1.5‐2.3  α zincir varyantları

HPLC’de A2 ile yürüyen Hb’ler

• HbE• Hb G‐Accra• Hb Spanish Town• Hb Lepore• Hb Kenya

BETA TALASEMİ

ALFA TALASEMİ

Retikülosit boyasında Hb H 

Alfa Beta Gama Hibrid Toplam

Stabil 9 18 1 2 30Unstabil 4 4 - - 8

Talasemik - 3 - - 3Elonge 1 - - - 1Del/ins - 1 - - 1Toplam 14 26 1 2 42

Türkiye’den bildirilen Hemoglobin Varyantları

Altay C. Abnormal Hemoglobins in Turkey. Turk J Haematol. 2002;19:63‐74.

1‐HbS                      6  Glu‐>Val (GAG‐>GTG)

2‐Hb Los Angeles(D‐Punjab) 121 Glu‐>Gln(GAA‐>CAA)

3‐HbE 26 Glu‐>Lys(GAG‐>AAG)

4‐Hb O‐Arab 121  Glu‐>Lys(GAA‐>AAA)

Türkiye’de Anormal Hemoglobinlerin Görülme Sıklığı

SS, Orak hücreli anemi hastasıHb A YOKHb F %0.5‐8 (KLİNİK ŞİDDETİ BELİRLER)

AS, Orak hücreli anemi taşıyıcıHb A > Hb S (%40)MCV N

A2 >3.5

Hb A2

• Hemoglobin A2– ARTMIŞ (>%3.5)

• 3.5‐7.0 β‐talasemi taşıyıcılık, Sβ+

• 3.5‐4.5 Hb AS, AC, SC, SS, CC• 6.5‐14.0 Hb Lepore• 25‐30 Hb E

– AZALMIŞ (<%2)• 1.3‐1.7 Demir eksikliği • 1.5‐2.3  α zincir varyantları

Sβ+ talasemi

Hb S > Hb AMikrositozSplenomegali

Ebeveynlerin biri S taşıyıcı, diğeri β taşıyıcı

Sβ0 talasemi

HbS: %75-100HbF: %0-20HbA2: %4-6

A YOK

MCV düşükAnne baba çalışılması önemli

SS DEN AYIRD ETMEK ÖNEMLİ !

S taşıyıcı + α talasemi

ASHb S < %35Mikrositoz

HB D Los Angeles in a Brazilian familyRev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.23 no.3 SãoJosé do Rio Preto Sept./Dec. 2001

• Homozigot HbDGenelde asemptomatik ya daHafif hemolitik anemiHafif splenomegaliAğrılı kriz yokMCV düşük

• Hemoglobin D/Beta (β)‐thalassemia:Beta + mutasyon ise hafif anemi, genelde smg yokBeta 0 mutasyon ise sıklıkla ağır anemi, ciddi splenomegali

• Hemoglobin D/SAğır ağrılı krizlerle gidebilir

Tanı yaşı 1‐10 yaş

HbE(26 Glu->Lys(GAG->AAG)

Prof. Muzaffer Aksoy• Prof Aksoy ülkemizde (Mersin) Hb E’nin bulunduğunu ilk kez

göstermiştir

• Aksoy M, Bird GWG, Lehmann H., Mourant AE, Thein H and Wickremasinghe RLJ.:Hb A and E in a subject from Southern Turkey J Physiol 180:55,1955.

• Uzak Doğu, Tayland

• Çukurova %1.3

Heterozigot HbE(trait)

• HbE %25‐30 (HPLC’deA2)

• Normal RBC morfolojisi

Homozigot HbE

• HbE %98, F %2, A yok• Asemptomatik• Hafif anemi• Hipokrom, mikrositer, targethc.

E + BetaHbE HbF HbA

Beta 0 mutasyon %30‐70 Kalanı  ‐

Beta + mutasyon + (%50‐60) + (%30‐35) + (%5)

•Klinik çok heterojen•Talasemi major gibi seyir vs hiç transfuzyon almayanlar•Hsmg %80‐90•Büyüme geriliği %75

HbO-Arab121 Glu->Lys(GAA->AAA)

Hb Egypt de denirHeterozigotlarda

hematoloji normal (%30-40Hb O Arab)

Homozigotlarda hafif anemi, mikrositoz

Gypsy, Balkan Ülkeleri, Arabistan , Mısır

Homozigot Bulgaristan , Yugoslavya , Türkiye

O Arab tanısı için elektroforez gerekliO Arab tanısı için elektroforez gerekli

Olgu

• 12 Y, E, rutin incelemede PY’ de target hücreler görülmesi  üzerine hematolojiye danışılıyor.

• Hgb: 15.0• Hct: 42.5• MCV: 87.8• MCH: 31.0• RDW: 12.6

HPLC

HbF: %0.6; HbA2: %2.9; HbA: %56.3, HbC: %40 

SS           CC          C trait S trait

Homozigot CC• Mikrositoz• Splenomegali• Hafif genelde• MCHC yüksek• Hemolitik anemi• Target hc• Kristal formasyonu

Homozigot CC

A2<3.5İzmir %41‐45Hemogram N

Beta Talasemi taşıyıcılarının çoğunda

• MCV düşük, <80 fl• MCH düşük, <27 pg• HbA2 3.5‐6.5

ANCAK İSTİSNALAR VAR

Promotor

EXON

IVS=INTRON Enhancer

Cap site 

TranslationInitiationCodon

Poly A signal bölgesi

β talasemi nokta mutasyonlar; ancak sadece β globin genini etkileyen delesyonel β talasemi’ler de var

Heterozigot

HomozigotTransfusion independent

Promotor bölge nokta mutasyonları

• Heterozigot durumda >> Sessiz taşıyıcı olabilir(MCV MCH HbA2 normal)  

EVLİLİK TARAMALARINDA !

• Homozigot durumda etnisiteye göre klinik değişebiliyor

Tamamı β+

‐29 A>G Homozigotları

• Afrikalı çok hafif fenotip (Antonarakis et al, 1984; Safaya et al, 1989)

• Çin’de talasemi major fenotipinde (Huang et al, 1986)

• Xmn‐I polimorfizmleri

Translation Initiation Codon ATG  Mutasyonları

Waye et al, 1997

N=35 taşıyıcıHb 7,7‐12.9 g/dl(ortalama 10.4)

MCV 48.5‐76 fl(ortalama 56.4)

β Talassemi _ α Talasemi birlikteliği

• Daha hafif hematolojik bulgular• α / β globin zincir dengesizliği azaldığından 

‐‐SEA/ α α

**

Alfa triplikasyon ya da kuadriplikasyon ve beta talasemi taşıyıcısı

MLPAMisalignment & Unequal cross‐over

ANNE BABA ÇOCUK

RBC 3,8 4,7 3

MCV 66 77,4 69

MCH 23,5 26,5 19,4

Hgb 10,8 12,7 7,8

HbA2 4,5 2,7 5,3

HbF 6,1

normalBeta tal. taşıyıcı

Sınırda HbA2• Genelde B‐talasemi taşıyıcılarında HbA2 %3.8‐6

• Sınırda HbA2: %3.3‐3.8 kastediliyor

• Bu durum değişik serilerde %2.2  ‐ 3  ‐ 16.7 arasında değişiyor.

• TARAMA PROGRAMLARINDA SIKINTI !

Sınırda HbA2’si olan 145 hasta 

ANNE BABA ÇOCUK

Hgb 10,5 BETA 

MCV 68,9 TALASEMI

MCH 22,3 MAJOR

HbA2 1,6 KLINIK

Genetik HBB c.126‐129DelCTTT HBB c. 52A>T HBB c.126‐129DelCTTTHBB c. 52A>T

TARAMA PROGRAMLARINDA SIKINTI !

ANNE BABA ÇOCUK

Hgb 10,5 BETA 

MCV 68,9 TALASEMI

MCH 22,3 MAJOR

HbA2 1,6 KLINIK

Genetik HBB c.126‐129DelCTTT

HBD c.89G>A (HbA2 Hong Kong)

HBB c. 52A>T HBB c.126‐129DelCTTTHBB c. 52A>THBD c.89G>A (HbA2 Hong Kong)

TARAMA PROGRAMLARINDA SIKINTI !

AJH; 2011

AĞIR ANEMILIVAKALAR

ALINMAMIŞ

• Inklüzyon cisimcikleri• Orta ya da ağır klinik• Splenektomi olanlarda tromboz komplikasyonları sık 

• De novo sık 

• Genelde çok «unstable» Hb olduklarından Varyant Hb yakalanamıyor.

Masif splenomegaliTalasemik yüz

İrlandalı aile !

HOMOZIGOT HETEROZIGOT

Delta‐beta Hgb 8‐10Hb A2 yokHb F %100

MCV düşükHb A2 N/düşükHb F %5‐15

HPHF Hgb NHbA2 yokHb F %100

MCV NHb A2 <%1.5Hb F %10‐30

D.B. (Hacettepe)

BABA ANNE  HASTA (11 yaş)

Hb 11.5 10 9.1

MCV 65 68 70

HbA 92 81 ‐

HbA2 4.5 2.1 1.3

HbF 2.4 13.5 99

Genetik HBB’de Heterozigot codon39 CAG>TAG 

β0 mutasyon 

Heterozigot Türk/Makedon (ϫβ)0 talasemidelesyon/inversiyon

İkisi de kalıtılmış

Hasta talasemi intermedia fenotipinde hiç kan almamış.

HASTA  BABA ANNE

HbA 71 NORMAL

HbF 25 NORMAL

HbA2 4 5.1 NORMAL

MCV Düşük NORMAL

HBB geni Cd39C>T (BTT) NORMAL

Lancet, 2002

17 yaş, erkekHiç Transfüzyon almamışHSM +Talasemik yüz +

Periferik kandan eritroid koloniler

6 koloni heterozigot20 koloni hemizigot

Somatik delesyon sonucu 11p15.5LOHNormal Beta globin allelinin delesyonu

sonucu

MOZAİSİZM (Bazı EH’de 1 beta glbgeni var; bazılarında hiç Beta glb geni yok)

Periferik kan lökositlerinden Restriksiyon analizi

ANNE GERÇEKTEN NORMAL