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HELENA GABRIELA TURANO
ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS PARA O
TRATAMENTO DE INFECÇÕES POR Pseudomonas
aeruginosa MULTIRRESISTENTES ENDÊMICAS NO
BRASIL
São Paulo 2012
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Microbiologia
do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
Área de Concentração: Microbiologia
Orientador: Prof. Dr. Nilton Ebert
Lincopan Huenuman
Versão corrigida. Versão original
eletrônica encontra-se disponível tanto
na Biblioteca do ICB quanto na
Biblioteca de Teses e Dissertações da
USP (BDTD).
RESUMO
Turano HG. Alternativas terapêuticas para o tratamento de infecções por Pseudomonas aeruginosa multirresistentes endêmicas no Brasil. [dissertação (Mestrado em Microbiologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2012. Pseudomonas aeruginosa é um dos principais agentes de infecção hospitalar que tem adquirido um caráter endêmico decorrente a sua resistência intrínseca e/ou adquirida aos antibacterianos comercialmente disponíveis. O objetivo do estudo foi avaliar, “in vitro”, opções terapêuticas baseadas na atividade sinérgica. Dez cepas de P. aeruginosa clonalmente não relacionadas, previamente caracterizadas como produtoras de metalo-beta-lactamase (MβL) do tipo SPM-1, VIM-1 e GIM-1, foram avaliadas. O efeito sinérgico foi investigado por “Checkerboard” e “Time-Kill”. As combinações [Piperacilina/Tazobactam x Aztreonam] e [Tigeciclina x nanofragmentos de bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA)] mostraram atividade sinérgica para 90 e 100% das cepas, respectivamente. Os resultados respaldam o uso terapêutico combinado de [Piperacilina/Tazobactam x Aztreonam], contra infecções produzidas por cepas de P. aeruginosa multirresistentes produtoras de MβLs, além disso, [DDA/Tigeciclina] pode constituir a base para consolidar uma nova forma farmacêutica de uso clínico.
Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa. Multirresistência. Infecção hospitalar.
Metalo-beta-lactamase. SPM-1. Sinergismo. DDA.
ABSTRACT
Turano HG. Alternative therapies for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa strains endemic in Brazil. [dissertation (Microbiology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2012.
Pseudomonas aeruginosa is a leading cause of nosocomial infections, which it has acquired an endemic status due to their intrinsic or acquired resistance to antibacterial agents commercially available. The aim of the study was to evaluate "in vitro" therapeutic options based on the synergistic activity. Ten clonally unrelated strains of P. aeruginosa, previously characterized as metallo-beta-lactamase (MβL) producers (i.e., SPM-1, VIM-1 and GIM-1) were evaluated. The synergistic effect was investigated by checkerboard” and Time-Kill assays. The combinations [Piperacillin/Tazobactam x Aztreonam] and [Tigecycline x bilayer fragments of dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA)] showed synergistic activity for 90 and 100% of the strains, respectively. The results support the use of combined therapy by using [Piperacillin/Tazobactam x Aztreonam] against infections produced by strains of P. aeruginosa producing MβLs, moreover, [DDA / Tigecycline] may be the basis for build a new pharmaceutical form for clinical use.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa. Multiresistance. Nosocomial infection.
Metallo-beta-lactamase. SPM-1. Synergism. DDA.
1 INTRODUÇÃO
A descoberta dos antimicrobianos revolucionou a medicina, salvando
inúmeras vidas, passando a ser altamente utilizados nos tratamentos terapêuticos.
Diante desse elevado uso, várias melhorias nas produções desses medicamentos
proporcionaram redução nos custos, tornando-os mais acessíveis e incentivando o
uso sem prescrição médica (Davies, Davies, 2010).
Milhões de toneladas de antimicrobianos são produzidos para diversas
finalidades, desde tratamentos terapêuticos curativos na medicina humana e animal;
no tratamento profilático, como aditivos nas rações de animais; na agricultura, entre
outros usos. Adicionalmente, diversas atividades antropogênicas, acabam por
contaminar o meio-ambiente (córregos, rios, mares, oceanos e terra). Estes, por sua
vez, têm sido constantemente alterados por influências humanas, com os descartes
de resíduos de processos industriais, resíduos tóxicos, desinfetantes e agentes
antimicrobianos, criando grandes reservas ambientais de resistência.
Outro ambiente extremamente rico em diversidade microbiológica é o esgoto,
que também favorece a seleção de organismos resistentes (Davies, Davies, 2010;
Fontes et al., 2011; Moura et al., 2010). Na Figura 1 podem ser observadas algumas
das principais vias de transmissão de agentes patogênicos.
Para sobreviver a essas condições, várias adaptações moleculares foram
desenvolvidas pelas bactérias, como adquirindo DNA exógeno, através de
plasmídeos, transposons ou por captação direta e incorporação por recombinação
homóloga, obtendo genes que codificam novas vias metabólicas, através da
transferência gênica horizontal, contribuindo para a evolução dessas espécies e
sendo um importante alvo de investigação devido a sua significância médica, pois
mutantes espontâneos de resistência podem espalhar em uma população bacteriana
os genes de resistência, conduzindo a uma potencial pandemia (Frost et al., 2005;
Moura et al., 2010; Norman et al., 2009).
Figura 1 - Algumas vias de transmissão de agentes patogênicos ou da microbiota, entre animais, ecossistemas e seres humanos.
Nota: * Uso de antibióticos, selecionando resistência. Fonte: Adaptado de Phillips et al. (2004).
1.1 O uso excessivo de antibióticos e a Infecção Hospitalar
São denominados microrganismos multirresistentes aqueles que são
resistentes a pelo menos três antibióticos de classes diferentes (Magiorakos et al.,
2012). Antibióticos de amplo espectro têm sido usados excessivamente, de forma
empírica, favorecendo a seleção de bactérias multirresistentes (MR), à
endemicidade das cepas, as quais são associadas às infecções hospitalares (IH) ou
nosocomiais e, aos altos índices de morbidade e mortalidade (Gales et al., 2003a;
Moura, 2007; Theuretzbacher, 2012).
A correlação entre o uso de antibióticos e aparecimento da resistência é
especialmente aparente na classe de β-lactâmicos, os quais são inativados pelas
enzimas β-lactamases. Como exemplo representante dessa classe temos a
penicilina que, posteriormente a sua descoberta, passou a ser produzida em larga
escala, tornou-se disponível para uso geral e veio a ser amplamente utilizada.
Concomitantemente ao seu uso, surgiram os isolados apresentando resistência,
como pode ser observado na Figura 2 (Davies, Davies, 2010).
De acordo com o Ministério da Saúde (Brasil, 1998) temos como definição de
IH qualquer infecção adquirida (48 – 72 h) após a entrada do paciente, que se revele
enquanto internado, ou até mesmo após a alta, se for relacionada com os
procedimentos hospitalares ou internação.
Estudos têm mostrado que as principais espécies Gram-negativas
relacionadas às infecções hospitalares são: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii e Enterobacter spp (Gales et
al., 2012; Girão et al., 2008; Kiffer et al., 2005; Lincopan et al., 2005; 2006; Pavez et
al., 2009; Rossi, 2011; Sader et al., 2001; Theuretzbacher, 2012).
Figura 2 - Números de enzimas β-lactamases identificadas desde a introdução dos primeiros β-lactâmicos
Nota: Enzimas β-lactamases identificadas durante a era dos antibióticos. Fonte: Adaptado de Davies e Davies (2010).
O tratamento de pacientes com infecções hospitalares graves utilizando
antibióticos de amplo espectro de atividade, como os carbapenêmicos, deve-se a
sua boa permeabilidade através da membrana externa bacteriana e estabilidade
frente a muitas β-lactamases (Franco et al., 2010; Fritsche et al., 2005; Gales et al.,
2003). No entanto, essa escolha acaba exercendo maior pressão seletiva sobre a
microbiota hospitalar, ocasionando a seleção natural de bactérias resistentes ao
imipenem e disseminação dos clones (Davies, Davies, 2010; Rodloff et al., 2006).
Um estudo de Rahal et al. (1998) avaliou a restrição de cefalosporinas para
infecções por Klebsiella produtoras de ESBL. O estudo indicou que a restrição levou
a uma redução na frequência de isolados produtores de ESBL, porém também
originou um aumento de 140% no uso de carbapenêmicos, como o imipenem, que
por sua vez ocasionou a um aumento de 69% na frequência de P. aeruginosa
resistente ao imipenem e na emergência de espécies de Acinetobacter resistentes.
Essas escolhas, portanto, apontam para a necessidade do controle de infecção dos
hospitais (Rodloff et al., 2006).
De acordo com Sader e Jones (2005) é de extrema importância buscar
alternativas para reduzir o desenvolvimento a resistência e usar de maneira eficaz
os antimicrobianos já existentes.
Devido à resistência aos carbapenêmicos e a dificuldade no desenvolvimento
de novas drogas (Tillotson, 2008), muitos autores têm previsto um retorno à era pré-
antibiótica, postulando a volta de antibióticos abdicados atualmente (Levin, Oliveira,
2008; Paterson, Lipman, 2007; Schurek et al., 2009; Theuretzbacher, 2012;
Timurkaynak et al., 2006), porém, uma alternativa mais sustentável é o estudo de
combinações de antibióticos que alcancem efeitos sinérgicos (Choi et al., 2004;
Tripodi et al., 2007; Zhanel et al., 2006).
Segundo Lyczak et al. (2002) a monoterapia pode ser utilizada para cepas
suscetíveis de P. aeruginosa, porém o estudo de combinações permite a
identificação de combinações de antibióticos sinérgicos e, essa combinação é mais
efetiva contra cepas que podem desenvolver a resistência, sendo, portanto mais
indicado.
De acordo com Yim et al. (2011) a combinação de antimicrobianos com
imipenem pode proporcionar uma opção de tratamento para infecções complicadas
ocasionadas por Enterobacteriaceae produtoras de ESBL ou AmpC e que, a
combinação de antimicrobianos pode reduzir o surgimento de resistência e elevar o
espectro de atividade.
Para os casos de pneumonia nosocomial, o tratamento através de
combinações de antimicrobianos pode ser uma opção, se for ocasionada por P.
aeruginosa, Serratia, Enterobacter e Acinetobacter (Bouza, Muñoz, 2000).
1.2 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é um organismo Gram-negativo aeróbio e ubíquo,
que dificilmente causa doenças em pessoas saudáveis (Hancock, Speert, 2000),
porém é uma das principais espécies bacterianas que ocasionam infecção em
pacientes hospitalizados (Goldberg, 2010).
Na América Latina Pseudomonas spp. é responsável por 7,5% das infecções
de corrente sanguínea, por 31,2% dos casos de pneumonia e, por 13,8% das
infecções da pele e dos tecidos moles (Gales et al., 2012).
Sua importância se deve pela expressão de múltiplos mecanismos de
resistência, dificultando a ação de antibacterianos, ocasionando elevados índices de
morbidade e mortalidade (Gales et al., 2004; Lambert et al., 2011; Pellegrino et al.,
2002; Poole, 2011; Sader et al., 2001).
Dentre os múltiplos mecanismos de resistência ressaltam-se: enzimas
modificadoras de aminoglicosídeos, super expressão de bombas de efluxo, perda de
porina, alterações no sítio alvo (Kanj, Kanafani, 2011; Muller et al., 2011; Poole,
2011; Strateva, Yordanov, 2009; Zavascki et al., 2010).
Esse microrganismo pode apresentar resistência natural ou adquirida a um
grande número de antibióticos utilizados na prática clínica, como cefalosporinas de
primeira e segunda geração, tetraciclinas, cloranfenicol e macrolídeos (Strateva,
Yordanov, 2009; Yoneda et al., 2005). De acordo com Bouza e Muñoz (2000)
mesmo as drogas com boa atividade contra P. aeruginosa não são sempre 100%
eficientes contra ela.
P. aeruginosa pode co-produzir mecanismos de resistência para outra classe
de antibióticos, como por exemplo, a proteína RmtD, uma metilase 16S RNAr (Doi et
al., 2007) que confere um nível elevado de resistência a aminoglicosídeos utilizados
clinicamente, como Amicacina, Tobramicina e Gentamicina. As metilases 16S RNAr
favorecem a disseminação entre as espécies, uma vez que são associadas com
elementos genéticos móveis, como os transposons (Doi et al., 2007; Yamane et al.,
2007).
Outro mecanismo descreve a super expressão de bombas de efluxo, as quais
têm como função exportar metabólitos secundários e substâncias tóxicas (incluindo
os antibióticos), além de excretar moléculas sinalizadoras para a comunicação
celular (Pearson et al., 1999; Poole, 2011; Strateva, Yordanov, 2009). A habilidade
do efluxo favorece a sobrevivência da bactéria na presença de desinfetantes e de
antibióticos (Poole, 2005). Além disso, P. aeruginosa pode ser intrinsecamente
resistente a diversos antimicrobianos devido à expressão constitutiva de genes
codificadores de bombas de efluxo para os mesmos (Neves et al., 2011; ; Poole,
2011; Strateva, Yordanov, 2009).
P. aeruginosa é produtora de biofilme, este é uma associação de bactérias
em uma matriz polímera de polissacarídeos, DNA extracelular e proteínas. Seu
biofilme permite o estabelecimento de comunicação entre as bactérias para a
coordenação de atividades metabólicas, produção de fatores de virulência em
recíproco benefício, protege contra o sistema de defesa do hospedeiro, dificulta a
difusão de antibióticos e desinfetantes, além de permitir a troca de material genético
(Lincopan, Trabulsi, 2008).
Segundo Hauser e Ozer (2011) as principais doenças clínicas relacionadas à
Pseudomonas aeruginosa são: Infecções oculares, otológicas, respiratórias
(acometendo também pacientes portadores de fibrose cística), do trato urinário,
sanguíneas e de peles e tecidos moles (incluindo as feridas de pacientes com
queimaduras).
1.2.1 Pseudomonas aeruginosa e infecções em pacientes com queimaduras
A queimadura é uma grave lesão, que acomete indivíduos, independente de
sexo e de faixa etária, estando entre as principais causas de morbidade, devido ao
desenvolvimento e sequelas, como a incapacidade funcional e deformidades
estéticas; e a mortalidade, ocasionada pelas infecções, podendo progredir para
septicemia, sendo de elevado grau de complexidade e de dificuldade de tratamento.
As mais comuns causas de queimaduras são por escaldaduras, exposição às
chamas, substâncias químicas, elétricas e radioativas, devido a atividades
profissionais e/ou acidentes domésticos (De-Souza et al., 1998; Lacerda et al., 2010;
Montes et al., 2011; Souza et al., 2009).
O ambiente hospitalar proporciona um grande número de fatores de riscos
para os pacientes com queimaduras, possibilitando a infecção por microrganismos,
que podem vir a se espalharem pela via linfática ou sanguínea, uma vez que a
barreira mecânica que a pele oferece foi destruída. Ao mesmo tempo a lesão dos
vasos sanguíneos na área afetada torna mais difícil a penetração de antibióticos e a
chegada de células do sistema imune. Em 75% dos casos de óbitos de pacientes
queimados, as infecções foram a grande responsável (Hammond et al., 2011;
Macedo et al., 2005; Pruitt, McManus, 1992; Rempel et al., 2011).
Dependendo da localização das queimaduras podem acontecer variados tipos
de complicações, como oftalmológicas, neurológicas e geniturinárias, além disso, a
inalação dos produtos da combustão, como gases tóxicos, causam inflamação com
edema da mucosa traqueobrônquica, levando a lesões graves, piorando o
prognóstico, aumentando assim a mortalidade (Vale, 2005). A incidência de
complicações no tratamento das queimaduras geralmente é proporcional a extensão
da área afetada (Macedo et al., 2005). O comprometimento da pele, a barreira física
de proteção, interfere entre a microbiota normal e o tecido sadio, deixando o
paciente suscetível a invasão de microrganismos patogênicos (Rempel et al., 2011).
Sendo assim, as queimaduras devem ser protegidas por agentes
antimicrobianos de uso tópico para evitar a proliferação e migração dos
microrganismos do tecido necrosado para as regiões sadias (Hammond et al., 2011;
Pruitt, McManus, 1992).
Conforme Vale (2005), as queimaduras podem ser classificadas de acordo
com a gravidade da lesão, como de primeiro grau, segundo grau ou terceiro grau. As
características de cada grau podem ser observadas no Quadro 1. De acordo com
Pruitt e McManus (1992), o patologista pode interpretar o estado da infecção por
microrganismos através de um esquema, apresentado no Quadro 2. O aumento da
mortalidade pode ser observado conforme o aumento do estágio.
Quadro 1 – Classificação das queimaduras segundo a profundidade
Fonte: Adaptado de Vale (2005).
Quadro 2 – Critérios para os estágios microbianos nas queimaduras
Fonte: Adaptado de Pruitt e McManus (1992).
Devido à complexidade de tratamento das lesões ocasionadas pelas
queimaduras, um elevado gasto do Sistema Único de Saúde (SUS) é necessário por
paciente queimado internado. De acordo com Mello-Jorge e Koizumi (2004), o gasto
médio diário por paciente queimado internado é de R$ 650,00 (casos não fatais), e
de R$ 1.620,00 diários para os casos que vão a óbito.
De acordo com os dados do SUS (2009), no Brasil, as queimaduras
representam cerca de 1,6% do total de mortes decorrentes de causas externas, já
em relação aos casos não fatais, representam cerca de 9% (80.607 pessoas) das
internações no sistema público de saúde brasileiro, do grupo das causas externas.
Os patógenos mais encontrados em pacientes hospitalizados com
queimaduras são: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter
spp. e Candida spp. (Branski et al., 2009; Rempel et al., 2011). As infecções por
Pseudomonas aeruginosa em pacientes queimados vai de pneumonias até
bacteremias, tendo como fontes de origem a água, superfícies das grades das
camas, o colchão do paciente, além de poder ocorrer através do contato pessoal,
entre outras fontes (Rempel et al., 2011).
1.2.2 Pseudomonas aeruginosa e fibrose cística
A fibrose cística (ou mucoviscidose) é uma doença genética autossômica
recessiva, que apresenta maior incidência em populações caucasianas de
descendência europeia. Ela atinge vários sistemas do organismo e caracteriza-se
por uma ampla disfunção das glândulas exócrinas. O paciente portador dessa
doença possui secreções mucosas espessas e viscosas que, acabam por bloquear
os canais das glândulas exócrinas. Essa obstrução contribui para o aparecimento de
altos níveis de eletrólitos no suor, insuficiência pancreática (ocasionando um quadro
secundário de desnutrição), diabetes mellitus, má absorção intestinal de gordura,
comprometimento dos sistemas reprodutores e, doenças pulmonares obstrutivas
crônicas (Fiates et al., 2001; Firmida, Lopes, 2011; Rosa et al., 2008).
Cerca de 70.000 pessoas no mundo são afetados pela fibrose cística (Cystic
Fibrosis Foundation, 2012). De acordo com WHO (2004), a incidência de fibrose
cística no Brasil é de 1 caso a cada 6.902 nascimentos. Um estudo de Raskin et al.
(2008) indica que há um decréscimo na incidência de fibrocísticos da região Sul para
a Sudeste do Brasil, uma vez que há mais pessoas com ascendência europeia no
Sul.
As alterações do transporte iônico ocasionam um aumento das secreções
mucosas, a hiperviscosidade dessas secreções e a consequente redução da
atividade mucociliar nos pulmões, levando a uma diminuição da depuração das vias
aéreas. Na fibrose cística as complicações respiratórias são as causas mais comuns
de morbidade e mortalidade (Nichols et al., 2008).
Os microrganismos que mais acometem os pacientes com fibrose cística são:
Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Complexo Burkholderia Cepacia e
Pseudomonas aeruginosa (Hauser et al., 2011; Lyczak et al., 2002).
Pseudomonas aeruginosa infecta tanto a zona respiratória quanto a zona
condutora, além disso, ela pode acarretar em infecção crônica em pacientes com
fibrose cística devido às mudanças adaptativas em seu modo de crescimento de não
mucoide para mucoide (ocasionado por mutações), tornando-a mais resistente a
fagocitose, reduzindo a função pulmonar, podendo levar a insuficiência respiratória e
aumentando a mortalidade. Esse patógeno ocasiona lesões no epitélio, bloqueando
progressivamente as vias aéreas (Doring et al., 2000; Lyczak et al., 2002; Perez et
al., 2012).
O tratamento de infecções por P. aeruginosa é dificultado inicialmente por sua
resistência intrínseca a muitos antibióticos e, tem-se especulado que parte de sua
resistência seria devido à estrutura da sua parede celular, juntamente com a
formação de biofilme, que oferece proteção contra o sistema imune e, a falta de
eliminação da secreção espessa por pacientes com fibrose cística (Doring et al.,
2000; Lyczak et al., 2002; Perez et al., 2012).
Devido a dificuldade de penetração e, algumas vezes do mau rendimento das
drogas, seja por via oral, ou sistêmica, para o tratamento de doenças brônquicas e
pulmonares, é necessário um novo método de administração, como a instituição de
tratamento por via inalatória, o que pode ocasionar um maior efeito terapêutico e
possivelmente diminuir os efeitos colaterais (Mariné, 2009).
A inalação, através de nebulizadores ou através de pó seco (“dry powder”),
oferece diversos benefícios quando comparada aos métodos comuns de
administração dos antimicrobianos, pois pode produzir altas concentrações dos
antibióticos no sítio da infecção, sem o risco de toxicidade sistêmica, além disso, a
inalação é menos incômoda aos pacientes, abrindo possibilidades para a utilização
de drogas abandonadas por causarem elevada toxicidade, como a Polimixina B, e
trazendo novas formas de uso de antibióticos, como Aztreonam, Levofloxacina e
Fosfomicina (Labiris et al., 1999; Van Westreenen, Tiddens, 2010).
1.3 Metalo-beta-lactamases (MβL)
As MβLs pertencem à classe molecular B, de acordo com a classificação
proposta por Ambler (1980). Esta classe de ß-lactamases é caracterizada pela
capacidade de hidrolisar carbapenêmicos e por sua resistência aos inibidores
comercialmente disponíveis, como o ácido clavulânico, mas são inibidas por agentes
ou compostos quelantes de íons de metal (Queenan, Bush, 2007).
A primeira metalo-β-lactamase codificada cromossomicamente foi descrita em
1966 (Sabath, Abraham, 1966), em uma amostra de Bacillus cereus. A segunda MβL
foi descrita em 1982 em Stenotrophomonas maltophilia (Saino et al., 1982).
Osano et al. (1994) relatou o primeiro caso de MßL adquirida, descrevendo
IMP-1 como uma nova subclasse. Essa enzima foi isolada no Japão, em uma cepa
de Serratia marcescens, apresentando resistência ao imipenem.
No Brasil, os genes que codificam as MβL móveis já foram observados em
vários patógenos clinicamente importantes, tais como os bacilos não fermentadores
P. aeruginosa (Gales et al., 2003a; Lincopan et al., 2010) e Acinetobacter spp.
(Gales et al., 2003b), e em várias espécies da família Enterobacteriaceae, como
Klebsiella pneumoniae (Lincopan et al., 2005; 2006).
Pellegrino et al. (2002) relatou a primeira MßL adquirida no Brasil, entretanto
o determinante da resistência não foi caracterizado. Em 2003 foi isolada uma cepa
de A. baumannii produtora de IMP-1, em São Paulo (Gales et al., 2003b).
Genes que codificam a MßL foram encontrados inseridos em estruturas
genéticas que fornecem mobilidade ao gene. Seis grandes importantes grupos de
MßL foram identificados: IMP (imipenemase) (Watanabe et al., 1991), VIM (Verona
imipenemase) (Lauretti et al., 1999), SPM (São Paulo metalo-ß-lactamase) (Toleman
et al., 2002), GIM (German imipenemase) (Castanheira et al., 2004), SIM (Seoul
imipenemase) (Lee et al., 2005) e NDM (New Delhi metalo-β-lactamase) (Yong et al.,
2009).
A primeira identificação do gene que codifica para a enzima SPM-1 ocorreu
na cidade de São Paulo, Brasil (Toleman et al., 2002). Desde o seu primeiro relato,
em clones de Pseudomonas aeruginosa produtora de SPM-1, ocorreu elevada
mortalidade entre os pacientes hospitalizados (Furtado et al., 2011; Gales et al.,
2003a; Queenan, Bush, 2007; Santos Filho et al., 2002; Zavascki et al., 2006). O
gene desta enzima apresentou conteúdo GC na ordem de 47%, indicando que ele
tem uma procedência não intrínseca a P. aeruginosa (Toleman et al., 2002).
Atualmente apenas a enzima SPM-1 é codificada por um gene localizado em
plasmídeo de aproximadamente 180 kb (Walsh et al., 2005), as demais enzimas
MßL ficam em integrons da classe 1 (Mendes et al., 2006; Toleman et al., 2002).
A enzima SPM-1 hidrolisa todos os antimicrobianos β-lactâmicos,
preferencialmente cefalosporinas, sendo incapaz de hidrolisar Aztreonam (Murphy et
al., 2003). Até o presente período, SPM-1 só foi encontrada em P. aeruginosa e sua
disseminação epidêmica já foi evidenciada em vários estados brasileiros (Gales et
al., 2003a; Poirel et al., 2004; Zavascki et al., 2005). Salabi et al. (2010) publicou o
primeiro caso de P. aeruginosa produtora de SPM-1 na Europa, de um paciente
suíço que recebeu o primeiro atendimento em um hospital em Recife.
1.4 Principais antimicrobianos utilizados no estudo
1.4.1 DDA - brometo de dioctadecildimetilamônio
O brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) (Sigma-Aldrich, Saint Louis,
EUA) é um lipídio catiônico, com duas longas cadeias hidrocarbonadas (C18)
altamente hidrofóbica e uma cabeça polar catiônica hidrofílica com um contra-ión
monovalente (Br-), Figura 3A. Suas cadeias hidrofóbicas lhe permitem formar
bicamadas em solução aquosa, o método de preparação determina as propriedades
físicas e funcionais das vesículas ou dos fragmentos de bicamada formados.
Mediante o uso da metodologia de sonicação com sonda (Tip) formam-se vesículas
unilamelares pequenas ou fragmentos de bicamada assim como também vesículas
interrompidas. Fragmentos de bicamada oferecem convenientemente uma grande
área de nano superfícies hidrofóbicas adequadas para a solubilização de
substâncias hidrofóbicas ou fármacos (Lincopan et al., 2004).
Vesículas de bicamadas de DDA têm sido usadas de diversas maneiras, seja
como agentes de interface e imunoadjuvantes, como agentes biocidas contra
bactérias e fungos. Estas características são atribuídas ao fato delas possuírem uma
região altamente hidrofóbica que lhe permite interagir com diversos compostos
(Lincopan et al., 2003).
Figura 3 - Estrutura química do DDA (A) e Tigeciclina (B).
Fonte: Adaptado de Lincopan e Carmona (2006); Livermore (2005).
1.4.2 Tigeciclina
A Tigeciclina é o primeiro antibiótico da nova classe das glicilciclinas (Figura
3B). As glicilciclinas tem estrutura semelhante às tetraciclinas, possuindo alterações
estruturais. Apresenta atividade contra gram-positivos, gram-negativos, espécies
anaeróbias, incluindo cepas multirresistentes (Rose, Rybak, 2006). Ela é alvo das
bombas de efluxo cromossomicamente codificadas, como em Proteeae e
Pseudomonas aeruginosa. Sua função é de inibir a síntese proteica através da união
à subunidade do ribossomo bacteriano 30S. A Tigeciclina é considerada um
A
B
antibiótico bacteriostático (Livermore, 2005), tem um grande potencial de utilidade,
mas nem sempre é eficaz em monoterapia (Yim et al., 2011). As indicações
permitidas pelo FDA são infecções de pele e tecidos moles complicadas e infecções
intrabdominais complicadas (Rodvold et al., 2006).
A estrutura química da Tigeciclina é demonstrada na figura 3B. A Tigeciclina é
um composto altamente solúvel em uma ampla faixa de pH devido sua estrutura
química apresentar diversos grupos ionizáveis com diferentes valores de pKa. No
interior da molécula, existem três grupamentos básicos e dois acídicos. Os valores
de pKa de cada um desses grupamentos variam de 2.8 à 9.5. Portanto, a
solubilidade da Tigeciclina é independente do pH devido sua estrutura química
apresentar grupamentos químicos que se ionizam em uma ampla faixa de pH (FDA,
2005). Esta característica é de interesse uma vez que, dependendo da faixa de pH,
a molécula pode estar protonada ou desprotonada favorecendo interações
eletrostáticas com biomoléculas que podem ser carregadoras de drogas,
favorecendo possíveis efeitos sinérgicos.
1.4.3 Piperacilina-Tazobactam
A Piperacilina é uma Penicilina semi-sintética da classe ureidopenicilina, com
atividade bactericida pela inibição da formação do septo e síntese da parede celular,
que possui amplo espectro de ação contra infecções ocasionadas por anaeróbios,
Gram positivos e Gram negativos, incluindo isolados de Pseudomonas aeruginosa
(Lister, 2000). Segundo Noguchi et al. (1979), a Piperacilina tem alta afinidade pela
PBP-3 tanto em E. coli quanto em P. aeruginosa.
A Piperacilina foi diminuindo sua utilidade conforme bactérias produtoras de β-
lactamase foram surgindo. O Tazobactam, um poderoso inibidor de várias enzimas
β-lactamases cromossomais ou mediadas por plasmídeos, é um triazolilmetil
penicilânico sulfônico. Ele foi associado à Piperacilina para aumentar sua atividade,
passando a cobrir um número maior de bactérias produtoras de β-lactamase que,
sem essa associação, seriam resistentes a Piperacilina (Drawz, Bonomo, 2010;
Fass, Prior, 1989; Lister, 2000; Strayer et al., 1994).
Devido a sua ampla cobertura, Piperacilina/Tazobactam é altamente
recomendado para infecções intra-abdominais, pneumonia hospitalar e infecções de
pele e tecidos moles (Mah et al., 2012).
1.4.4 Aztreonam
Aztreonam é um antibiótico sintético bactericida, pertencente à classe dos
monobactâmicos, que possui atividade contra uma grande variedade de bactérias
Gram-negativas, incluindo membros da família Enterobacteriaceae e Pseudomonas
aeruginosa, mas possui pouca atividade contra anaeróbios ou aeróbios Gram-
positivos (Fleiss et al., 1985; Ng et al., 1985; Romero-Vivaz et al., 1985). Além do
uso sistêmico, novas formulações têm sido aprovadas para o Aztreonam, como o
Aztreonam lisina para inalação (Zeitler et al., 2012).
O mecanismo de ação desse antibiótico é devido a grande afinidade de
ligação com a PBP-3, ocasionando o efeito bactericida em enterobactérias e
Pseudomonas aeruginosa (Georgopapadakou et al., 1982).
Adicionalmente, o Aztreonam é bastante resistente as principais β-lactamases
(cromossomais e plasmidiais) estudadas e, reduz distúrbios gastrointestinais, uma
vez que pouco interfere com a microbiota normal de Gram-positivos e anaeróbios
(Sykes et al., 1982).
1.5 Justificativa
São múltiplos os mecanismos de resistência que podem ser expressos por
Pseudomonas aeruginosa: super expressão de bombas de efluxo, perda de porina,
enzimas modificadoras de drogas, alterações no sítio alvo e produção de biofilme.
Dentre as enzimas modificadoras encontram-se: enzimas modificadoras de
aminoglicosídeos e diferentes beta-lactamases, entre elas, a Metalo-beta-lactamase.
Esses mecanismos conferem uma resistência natural ou adquirida a um grande
número de antibióticos utilizados na prática clínica para esse microrganismo,
dificultando o tratamento de suas mais diversas infecções e reduzindo
consideravelmente as opções terapêuticas. Considerando as poucas opções de
tratamento nos casos de infecções por P. aeruginosa MR, esse trabalho estudou
combinações de antimicrobianos que pudessem alcançar efeitos sinérgicos, para
permitir possíveis alternativos esquemas terapêuticos.
6 CONCLUSÕES
1. A resistência a pelo menos três antibacterianos de classes diferentes foi
confirmada em 9 de 10 cepas;
2. Todas as cepas foram sensíveis a Polimixina B e a Colistina;
3. O uso combinado de [Piperacilina/Tazobactam x Aztreonam] revelou atividade
sinérgica contra as cepas clínicos MR de P. aeruginosa produtora de MβL
SPM-1, GIM-1 e VIM-1, com potencial clínico e terapêutico, considerando
aspectos farmacocinéticos;
4. O uso de DDA potencializa a atividade de Tigeciclina contra P. aeruginosa
MR, cuja combinação exibe efeito sinérgico com atividade bactericida em
poucas horas de interação;
5. Tigeciclina pode ser incorporada às bordas hidrofóbicas dos nanofragmentos
de DDA, o que resulta na monomerização da Tigeciclina, com preservação da
estrutura primária, favorecendo o efeito sinérgico de ambas drogas;
6. O uso combinado de DDA pode estender o potencial clínico da Tigeciclina
para P. aeruginosa.
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