Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向截止阀至废液...

UPLC仪器构造与使用维护

1 ©2016 Waters Corporation

Waters Solution Center

郭天

Outline


仪器构造及启动

使用维护注意事项

– 开关机

– 泵

– 进样器

– 紫外检测器

常见问题与故障排除

– 系统压力

– 基线噪音

– 色谱峰形

– 交叉污染

检测器 TUV, PDA， ePDA,

FLR, ELSD

CH-A 高温柱温箱，带

主动预热

SM-FTN 样品管理器流路针设计

QSM 四元溶剂管理器


ACQUITY H-Class 系统

仪器构造及启动


初级泵收集器泵排废液阀 100ul 混合器

2对比例阀低压混合阀脱气包，5个

泵杆密封圈清洗泵

四元溶剂管理器QSM 流路

初级泵 I2Valve 单向阀

收集器泵单向阀


带隔热绝缘层样品室门

进样六通阀及注射器阀

可旋转样品托盘

样品室进样针座及废液槽

R-转轴

转盘校正器


样品管理器-FTN

计量注射器阀

反向截止阀

进样阀

渗漏传感器插口

100ul 计量注射器

ACQUITY FTN样品管理器前面板流路

洗针液入口管路

清除溶剂


2号位，去反向截止阀至废液

1号位，来自针座及延伸管

5号位，来自QSM泵

3号位，去压力传感器及计量注射器

4号位，去进样针头

ACQUITY FTN 样品管理器进样六通阀


To CH-A and Column

6号位，去色谱柱

Wash Solvent

Purge Solvent

ACQUITY FTN 样品管理器流路图-运行中


样品管理器 FTN示意图-载样

连接4号位

样品管理器FTN扩展定量环 50ul


进样体积范围：0～50ul 连接样品进针头

ACQUITY FTN Console 配置更改


ACQUITY Console>>样品管理器FTN>>配置>> 体积，显示如下：

扩展定量环为“0”时，进样体积范围：0～10ul

扩展定量环为“50”时，进样体积范围：0～50ul

样品管理器FTN样品托盘


请确认样品托盘位置，以及放置方向

ANSI-48vail2ml

柱温箱以及APH预加热器

APH预加热器在拆卸时，注意左侧接头，用手即可拧紧，一般不需要借助工具，在线过滤器与色谱柱连接时，先用手拧紧，再使用工具紧1/8~1/4即可，一般先将色谱柱与在线过滤器先做连接，再与APH连接，最后连接色谱柱出口。


立式柱温箱切换注意

横式柱温箱切换到立式柱温箱，需要先将电源关闭，然后拔掉电源，再把横式柱温箱拆除，并连接立式柱温箱，再连电源，开机，方法设置不变。


立式柱温箱切换注意(续)

如果立式柱温箱不使用APH(主动预加热器),需要做如下改动。


氘灯

废液管

250psi 反压器流通池

渗漏传感器

ACQUITY TUV 检测器

序列号

流通池入口管内径 0.0025”或0.004”


ACQUITY H-Class 系统开机程序

1. 首先制备新鲜流动相和清洗溶剂(详见细则)；

2. 打开计算机电源，进入Windows操作系统，待操作系统加载完毕；

3. 打开样品管理器（SM-FTN）、四元溶剂管理器（QSM）电源,待通过自检；

4. 登录Empower软件,进入运行样品界面；

5. 图标)；打开控制台界面Console (右键点击QSM可选，或SM-FTN界面右下角

6. 在控制台系统界面执行启动系统（Start Up）操作 (详见细则)；

7. 设定0.1ml/min--0.2ml/min流速（高比例有机相）,冲洗流通池；

8. 当流通池废液管出口有液体流出后,打开TUV(PDA、FLR)检测器电源；

9. 待检测器通过自检以后，在控制台界面“RESET”检测器；

10. 编辑仪器方法，监视基线，准备开始 UPLC 分析实验.


新鲜流动相和清洗溶剂制备细则


ACQUITY H-Class对流动相的要求

– 有机溶剂要求用色谱纯(推荐进口品牌)；

– 水或缓冲盐溶液要用超纯水(18.2MΩ) 当天制备，并使用0.22μm滤膜过滤；

ACQUITY H-Class对洗针液的要求（以下建议仅适用于反相色谱系统）

– 清除溶剂[水相多]（Purge Solvent）建议使用有机溶剂含量5%~10%的水溶液，以减少气体溶解及微生物生长；

– 清洗溶剂[有机相多]（Wash Solvent）建议使用100%纯甲醇或乙腈，或者含水量在0~20%的有机溶剂；

– 泵杆密封圈清洗溶剂(Seal Wash)建议使用含5%-10%甲醇/乙腈的超纯水；

*特别提示:上溶剂均需用0.22μm的滤膜过滤并脱气;用洁净玻璃容器盛放,避免污染。

QSM的准备(1)


灌注柱塞杆清洗液(Prime Seal wash)

– 以下情况需要做此操作Prime,例如:

o 新安装仪器或泵流路中溶液走干了

o 当泵几小时或更长时间未用

o 用过缓冲液流动相之后

注意:

– 为避免螺线阀座和密封垫的损坏,不要使用非挥发性的缓冲液作为Seal wash的溶剂

– 为避免污染,请勿循环使用Seal wash溶剂

推荐: Seal wash溶剂：10ACN：90H2O 或 10MeOH:90H2O

保证10%的有机溶剂，此浓度可防止微生物生长

Prime Seal wash前请检查溶剂是否足够

Prime Seal wash（灌注密封清洗）的步骤

将Seal wash出口端从废液盘上摘下,连接到注射器上

选择 Control>Prime Sealwash,点击之

缓慢抽回注射器，从系统中抽取密封清洗溶剂

当密封清洗溶液开始流入注射器且没有大的气泡时，断开流路，并重新安装到滴盘

的接头上

停止灌注过程


QSM的准备(2)


灌注四元溶剂管理器

– 用于排除泵头及管路中的气泡

– 用于更换从储液瓶到溶剂管理器之间的溶剂

在下列情况下需要Prime四元溶剂管理器

– 启用新的四元溶剂管理器或新的系统

– 停机4小时后再次开机

– 更换流动相

QSM 湿灌注的步骤

选择A 、B、C、D，时间设定为4分钟，按 start 按钮


SM FTN样品管理器的准备


做过QSM的wet prime之后，要准备样品管理器，

准备样品管理器包括如下步骤(新安装仪器时)：

– 1. 灌注注射器（Purge Solvent）

– 2. 检查确认密封 (Characterizing the seal )

SM FTN样品管理器的准备


灌注SM FTN注射器操作

选择 “ Wash Solvent”，设定时间为15秒

选择 “ Purge Solvent”，设定5-7个循环

单击 OK. 当系统状态是 “Idle(待机)” ,就表示灌注已经完成

提示: 每做一次灌注大约需要2－4分钟


灌注SM注射器和进样针


灌注进样针和样品注射器的目的是:

– 准备样品管理器

– 冲洗里面的进样针

– 排除管路中的气泡

注：在灌注过程中，用溶剂充满进样针，在改变溶剂，或者排除管路中的

气泡时，需进行灌注进样针和样品注射器

提示:

– 确保用于灌注的溶剂有合适的组成,它应该是高纯的,并且几种溶剂是互溶的

– 所有的试剂瓶都要使用滤头, 并确保溶剂体积足够用于做灌注,例如,作5次灌注,

每种溶剂要用去大约20 mL

要求: 在检定密封之前必须先完成对样品管理器的灌注

洗针液的选择取决于样品和所使用的流动相，确保流动相和缓冲液是互溶的

不推荐缓冲盐作为Purge Solvent（清除溶剂）

选择清洗进样针的溶剂


Start up 界面简介（启动系统）


启动TUV(PDA)检测器


确保检测池中充满溶剂并且没有气泡.如果检测池中有气泡,检测器就不能

很好的初始化,并有可能损坏检测池

打开检测器电源. 检测器会发出嘀嘀嘀三声响，并进行一系列自检.电源和

氘灯的指示灯都会不停地闪烁。初始化大概需要2分钟。灯预热大概需要 3

分钟

当指示灯常绿不闪烁时,通过监测控制台来测量和观察信号。要得到好的

数据，需要30分钟的时间平衡检测器和稳定基线

使用维护和注意事项


ACQUITY H-Class 启动系统

A. 首先灌注泵杆密封圈清洗溶剂(Prime Seal wash)

在QSM控制模块右键可选，或登入控制台QSM>> Control>>Prime SealWash,

选中即开始，直至出口管有液体滴出即可停止灌注；

*提示:为避免污染,请勿循环使用Seal wash清洗溶剂。

B. 第二步灌注(Prime)四元溶剂管理器(QSM)

选择 Control>>Prime，选择需要灌注的管路A/B/C/D，默认时间2分钟，

若更换流动相，建议改为5分钟；Prime时的流速默认4ml/min，A、B、C、D分

别灌注，无需改动；

右键


ACQUITY H-Class 启动系统（续）

C. 做过QSM的Prime的同时，也可以灌注样品管理器FTN清除溶剂和清洗溶剂；

选择Sample Manager,单击 Control > 灌注Prime；

选择 “清洗溶剂30秒，清除溶剂5个循环”(若系统干燥，清洗溶剂60秒，清除40个循环）；

当系统状态是 “Idle(待机),” 就表示灌注已完成。

D. 样品制备

用流动相溶解样品；用0.22um样品过滤膜过滤；放入Waters UPLC 适用的样品瓶；

*提示: 不要使用非Waters指定的样品瓶,以免损坏进样针。

右键


ACQUITY H-Class 关机操作


用超纯水置换缓冲盐流动相管路，清洗色谱柱及系统(100倍柱体积)；

待系统中缓冲盐冲洗干净，用乙腈/水冲洗系统；

用纯有机溶剂(乙腈或甲醇)充满系统；

缓慢降低流速至零，关闭TUV/PDA检测器电源，关闭SM-FTN、QSM电

源；

退出Empower软件，关计算机。


--- 泵


使用泵的一般建议


保持全部溶剂管路全都灌注过 (未使用的管路用10-20% 有机溶剂的水溶液

灌注)

保持柱塞清洗管路是灌注过的(90-95% 水)

启动仪器之前重新灌注溶剂管路

查看废液瓶是否已满

运行梯度最好从 0.1% - 99.9% (最大值)

UPLC流速的选用


根据van Deemter 曲线,亚2微小颗粒填料最佳线速度应在3-6mm/sec之

间

对于一般小分子的分离,2.1mm内径的色谱柱可采用0.45-0.8ml/min的体

积流速

对于蛋白和小肽的分离,应适当降低流速至0.2-0.3ml/min左右 (考虑到大

分子的传质效应)

容器使用通则


总是使用清洁的玻璃器皿(瓶子, 量筒或溶剂过滤装置),并在用前冲洗干净

尽量保持一组溶剂瓶和玻璃器皿专用于ACQUITY UPLC 系统

决不要用其他实验室(例如微生物实验室等)的玻璃器具来冲洗UPLC的玻璃

容器

溶剂瓶要贴上注明流动相配制日期的标签

不要往系统上的流动相瓶中“添加”流动相

每24-48小时制备新鲜的水相流动相,尤其是100% 含水流动相

系统上的溶剂瓶要用合适的瓶盖盖好

– 用铝箔密封溶剂瓶口

– 注意: 不要使用 PARAFILM® (石蜡膜)或其它塑料膜来密封溶剂瓶口

推荐使用的流动相


UPLC流动相过滤膜的选用

避免使用:尼龙材料的膜和聚醚砜材料的膜,例如:Supor-200 filter

– 使用Supor-200 filter过滤流动相,可能会对UPLC色谱柱造成污染. 对污

染的UPLC色谱柱入口出口筛板进行分析发现, 入口筛板处被一层主要含N,

S, O的物质所覆盖, 经红外显微鉴定该物质为聚砜. 而Supor-200 filter正

是由聚醚砜构成的.


用适当的柱体积数(CV)平衡

我们推荐 8 -10 倍柱体积的流动相用于柱平衡或梯度再生平衡

例如：色谱柱: 2.1 x 100mm; 1.7m, 流速 200 L/min

柱体积 = r2L x (10) 平衡所用的柱体积倍数

= (1.05mm)2(10cm)(10) = 0.78mL

平衡时间 = 柱体积/流速

= 0.78mL/(0.2mL/min) = 3.9 分钟


色谱柱平衡时间的计算

对于2.1×50mm 的BEH色谱柱,柱体积为0.17ml,

BSM UPLC 系统体积为120μl，如果流速为0.5ml/min，进样循环时间为

0.75min

平衡时间约需要

(3X0.12+5X0.17)ml/(0.5ml/min)-0.75min=1.65min


平衡不足对色谱的影响


这张色谱图就显示了没有正确

平衡所带来的结果. 仅仅在梯度

后延迟1.5 -2.0 分钟重复进样

结果清楚地表明开始时有机相

的增加引起了RT 的漂移. 尽管

肉眼看来是细微的变化,但峰形

和面积的不一致导致了很不好

的%RSDs.


--- 进样器


使用进样器的一般建议


当循环周期成为一个问题时,使用提前进样(Load Ahead)方式

当更换过定量环和进样针时,要重新校正针和定量环体积

对于样品板上覆盖有盖垫(capmat) 时,使用带不锈钢针尖的针

总是使用柱热稳定器(即使不使用柱温)

选择合适的样品瓶


样品瓶是LC分析中易被忽视的地方

使用不当往往会使进样器出现进样针故障

是造成定量不准的重要因素

是色谱图质量不佳的影响因素

提示:

– 测试样品与样品瓶的兼容性

– 某些化合物可能会与样品瓶作用，或者吸附在样品瓶表面

选择适合的瓶盖－减小污染

螺纹盖

– 传统型

o 盖与垫分离(安装时可能带来污染)

– LectraBondTM

o 盖垫一体，不使用化学剂和粘合剂（电子焊接法）

－更小的污染可能

o 有预开口设计



--- 紫外检测器


启动紫外检测器


确保检测池中充满溶剂并且没有气泡.如果检测池中有气泡,检测器就不能很

好的初始化,并有可能损坏检测池

建议在泵灌注后,用流动相冲洗流通池10分钟后再打开检测器电源

检测器初始化大概需要2分钟,灯预热大概需要3分钟

当指示灯常绿不闪烁时,通过控制台做”Reset”来连接检测器

要得到好的数据，需要30分钟的时间平衡检测器和稳定基线

检测器需要注意的事项


如果检测器放在流路最末端，总是确保已安装反压调节器

选择数据采集速率要保证峰上有25-50 个数据点

根据方法需要选择初始的数字滤波常数. 假如速度更重要则从 FAST开始.

假如灵敏度更重要,则从NORMAL开始

方法开发完毕再来优化数字滤波常数以兼顾灵敏度和分离度

检测器的使用保养


如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)

– 仅在4小时以上不用时,才需关灯

– 频繁开关灯也会影响灯寿命

不要让缓冲液长期停滞在检测池内

– 用纯水冲洗

– 保存在纯甲醇中

示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在

其它检测器的后面

不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗

光导流通池使用注意事项


如果是长期保存, 用纯的有机相冲洗流通池，用堵头将进口和出口堵住。请查考下表中额外的关机条件。

当没有流通相通过流通池或者流通池是干的情况下不要打开，操作检测器，或者点亮检测器的灯。

新柱子冲洗15分钟后再连接流通池，以降低污染物附着在流通池的玻璃璧内

采样速率的重要性


必须确保一个色谱峰上有足够的数据点以便充分地定义峰形

峰检测算法需要一个峰的最低采样点数以便与基线噪音相区别,以及测量峰

的起点和终点

不具有足够数据点的峰积分会很困难,而且峰面积和峰高的重现性也会不好

采样速率对峰形的影响

AU

0.034

0.032

0.030

0.028

0.026

0.024

0.022

0.020

0.018

0.016

0.014

0.012

0.010

0.008

0.006

0.004

0.002

0.000

0.565 0.570 0.575 0.580 0.585 0.590 0.595 0.600

Minutes 0.605 0.610 0.615 0.620 0.625 0.630

1 pt/s

2 pts/s

5 pts/s

10 pts/s

20 pts/s

40 pts/s


采样速率对重现性的影响


采样速率峰内的数据点峰面积

%RSD

峰高

%RSD

1 pt/s 2 2.436 15.515

2 pts/s 4 1.790 13.455

5 pts/s 7 0.971 3.962

10 pts/s 13 1.129 1.015

20 pts/s 25 0.603 1.156

40 pts/s 49 0.284 1.127

采样速率不是越快越好 A

U

-0.00008

-0.00006

-0.00004

-0.00002

0.00000

0.00002

0.00004

0.00006

0.00008

0.00010

0.00012

0.054 0.056 0.058 0.060 0.062 0.064 0.066

Minutes

0.068 0.070 0.072 0.074 0.076 0.078

2 Hz

5 Hz

20 Hz

80 Hz

40 Hz

1 Hz


什么是数字滤波?


数字滤波是去除高频噪音的数学运算方法

理想结果是降低基线噪音，同时又不影响色谱峰的强度，以达到提高信噪

比的目的

滤波的程度(时间常数)是最为关键的：太多的滤波会严重影响色谱峰形和

分辨率

滤波常数对色谱的影响 A

U

0.040

0.030

0.020

0.010

0.000

0.050

0.060

0.070

0.080

0.78 0.80

― No Filtering

― 0.1s

― 0.3s

― 0.5s

― 1.0s


0.50 0.52 0.54 0.56 0.58 0.60 0.62 0.64 0.66 0.68 0.70 0.72 0.74 0.76

Minutes

5个组分镇痛药混合物,2.1x50mm ACQUITY UPLC 柱, 30秒梯度

常见问题与故障排除


机械因素

解决色谱问题的策略

泵进样器检测器数据采集谱带展宽/连接

观察色谱图 -- 尝试对问题进行分类简

化问题 -- 最先对最容易的部分进行故障排除

问题


化学因素色谱柱保护柱流动相样品/样品瓶问题

判断故障与故障排除的原则


规则一：

– 确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实是问题

规则二：

– 从最简单的因素入手

规则三：

– 一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联

判断故障与故障排除的原则


规则四：

– 恢复原状

o 如果使用更换组件方法来查找问题之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。否

则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费

规则五：

– 养成记录的好习惯

o 一个完整的好记录是成功地进行故障排除的关键

Questions ?

Questions ?

Questions ?

Questions ?

Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向截止阀至废液...

Documents

Transcript of Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向截止阀至废液...

Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向 截止阀至废液...

Documents

Transcript of Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向 截止阀至废液...

Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向截止阀至废液...

Transcript of Headline Goes Here - Waters Corporation · 2017-09-27 · 2号位，去反向截止阀至废液...