Haltbestämning av persistenta organiska miljöföroreningar i fisk

Henrik Carlsson, MMK 2013

Kromatogram

Efter injektion av prov på gaskromatograf fås ett s.k. kromatogram där de föreningar provet innehåller har separerats och ses som enskildatoppar.

x-axeln visar den tid de olika föreningarna detekteras

1918.51817.51716.51615.51514.51413.51312.51211.511

9,500,000

9,000,000

8,500,000

8,000,000

7,500,000

7,000,000

6,500,000

6,000,000

5,500,000

5,000,000

4,500,000

4,000,000

3,500,000

3,000,000

2,500,000

2,000,000

1,500,000

1,000,000

500,000

0

HC

B CB

-101

tran

snon

aklo

r

p,p'

-DD

E

CB

-118

p,p'

-DD

DC

B-1

46C

B-1

53C

B-1

05p,

p'-D

DT

CB

-138

CB

-187

CB

-183

CB

-128

CB

-156 CB

-180

CB

-170

CB

-189

RT [min]

µV krc-a4.DATA

y-axeln visar signalstyrkan

Externstandard

Cl

ClCl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

ClCl

ClCl

En lösning som innehåller kända mängder av de analyter vi vill titta på.

CB-138

ClCl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

CB-153

DDE

HCB

CB-189 Internstandard

m.fl...

Kromatogram från externstandard

1,300,000

1,200,000

1,100,000

1,000,000

-100,000

-200,000

1918.51817.51716.51615.51514.51413.51312.51211.511

900,000

800,000

700,000

600,000

500,000

400,000

300,000

200,000

100,000

0

a-H

CH

HC

B

B-H

CH

G-H

CH

CB

-28

CB

-52

CB

-101

tran

snon

aklo

rp,

p'-D

DE

CB

-118

p,p'

-DD

DC

B-1

46 CB

-153 C

B-1

05p,

p'-D

DT

CB

-138

CB

-187 C

B-1

83 CB

-128

CB

-156

CB

-180

CB

-199

CB

-170

CB

-189

RT [min]

µV krc_a3.DATA

Identifiering av föreningar i prov genom jämförelse med externstandard (kvalitativ analys)

18.218.11817.917.817.717.617.517.417.317.217.11716.916.816.716.616.516.416.316.2

6,500,000

6,000,000

5,500,000

5,000,000

4,500,000

4,000,000

3,500,000

3,000,000

2,500,000

2,000,000

1,500,000

1,000,000

500,000

0

-500,000

CB

-146

CB

-153

CB

-105

p,p'

-DD

T

CB

-138

CB

-187

CB

-183

CB

-128

CB

-156

CB

-180

CB

-170

CB

-189

RT [min]

µV krc-a4.DATA

18.218.11817.917.817.717.617.517.417.317.217.11716.916.816.716.616.516.416.316.2

1,000,000

950,000

900,000

850,000

800,000

750,000

700,000

650,000

600,000

550,000

500,000

450,000

400,000

350,000

300,000

250,000

200,000

150,000

100,000

50,000

0

-50,000

-100,000

-150,000

CB

-146

CB

-153 C

B-1

05

p,p'

-DD

T

CB

-138

CB

-187 C

B-1

83

CB

-128

CB

-156

CB

-180 CB

-199

CB

-170 CB

-189

RT [min]

µV krc_a3.DATA

Matcha toppar genom attjämföra retentionstider i prov och externstandard.

Haltbestämning

Haltbestämning benämns kvantifiering eller kvantitativ analys.

Signalen för en viss förening är proportionell mot dess mängd i provet.

För att utföra haltbestämningen ska vi återigen jämföra

kromatogrammet för provet med det från externstandarden.

Innan haltbestämningen kan göras måste två begrepp förklaras:

Internstandard och Responsfaktor

Syftet med internstandarden

Internstandarden kompenserar för förluster av analyter i de olika stegen.

Ingen uppreningsmetod är perfekt och efter varje steg kan vi förvänta oss förluster.

Internstandarden beter sig på samma sätt som analyterna och förlusterna bör varade samma.

Vi vet hur mycket av internstandarden som fanns i provet från början.

I haltbestämningen relaterar vi därför alla analyter till halten tillsatt internstandard.

Tillsats av IS

1918.51817.51716.51615.51514.51413.51312.51211.511

9,500,000

9,000,000

8,500,000

8,000,000

7,500,000

7,000,000

6,500,000

6,000,000

5,500,000

5,000,000

4,500,000

4,000,000

3,500,000

3,000,000

2,500,000

2,000,000

1,500,000

1,000,000

500,000

0

HC

B

CB

-101

tran

snon

aklo

r

p,p'

-DD

E

CB

-118

p,p'

-DD

D

CB

-146

CB

-153

CB

-105

p,p'

-DD

TC

B-1

38

CB

-187

CB

-183

CB

-128

CB

-156

CB

-180

CB

-170

CB

-189

RT [min]

µV krc-a4.DATA

Internstandarden i kromatogrammet

18.218.11817.917.817.717.617.517.417.317.217.11716.916.816.716.616.516.416.316.2

6,500,000

6,000,000

5,500,000

5,000,000

4,500,000

4,000,000

3,500,000

3,000,000

2,500,000

2,000,000

1,500,000

1,000,000

500,000

0

-500,000

CB

-146

CB

-153

CB

-105

p,p'

-DD

T

CB

-138

CB

-187

CB

-183

CB

-128

CB

-156

CB

-180

CB

-170

CB

-189

RT [min]

µV krc-a4.DATA

Internstandarden!

Responsfaktor

18.218.11817.917.817.717.617.517.417.317.217.11716.916.816.716.616.516.416.316.2

1,000,000

950,000

900,000

850,000

800,000

750,000

700,000

650,000

600,000

550,000

500,000

450,000

400,000

350,000

300,000

250,000

200,000

150,000

100,000

50,000

0

-50,000

-100,000

-150,000

CB

-146

CB

-153 C

B-1

05

p,p'

-DD

T

CB

-138

CB

-187 C

B-1

83

CB

-128

CB

-156

CB

-180 CB

-199

CB

-170 CB

-189

RT [min]

µV krc_a3.DATA

Olika föreningar detekteras olika bra av detektorn i gaskromatografen, dehar olika respons.

Samma koncentration, olika respons.

Kromatogram från externstandard.

Måste kompensera för detta vid haltbestämningen. Beräkna responsfaktorer för varje enskild förening!

isx

isxx

am

maf

Beräkning av responsfaktor

ax = Arean av POM i standardais = Arean av IS i standardmx = Koncentration av POM i standard (ng/ml)mis = Koncentration av IS i standard (ng/ml)fx = Responsfaktor

Beräknas från externstandarden enligt:

Exempel (CB-138): fx= (ax x mis)/(mx x ais) = = (12674 µVxmin x 5 ng/ml)/(5 ng/ml x 16436 µVxmin) == 0,77

Responsfaktorn för CB-138 är 0,77. Detta upprepas för samtliga identifierade föreningar i provet som ska haltbestämmas.

isx

isxx

Af

MAM

Ax = Arean av POM i provAis = Arean av IS i provMx = Mängd av POM i prov (ng)Mis = Mängd av IS i prov (ng)fx = Responsfaktor TIDIGARE BERÄKNAD!

Haltbestämning av förening i prov

Exempel (CB-138): Mx = (Ax x Mis)/(fx x Ais) == (91558 µVxmin x 4 ng)/(0,77 x 10850 µVxmin) == 44 ng

Halten CB-138 i vårt prov är 44 ng.Upprepa för varje förening som ska haltbestämmas!

Rapportering av resultat

När resultat rapporteras behöver man ofta relalatera mängden till något.

I detta fall är det mest lämpligt att ge resultatet som mängden av föreningarna per milligram extraherat fett.

I detta fall har vi 60 mg fett.

Exempel: 44 ng/60 mg fett = 0,73 ng/mg fett

Anges resultatet på detta sätt är det lättare att tolka siffrorna och jämföramed värden från andra studier.