Grundlagen der Durchflusszytometrie. Gliederung -Was ist ein Durchflusszytometer? -Teile eines...
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Grundlagen der Durchflusszytometrie
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Gliederung
-Was ist ein Durchflusszytometer?-Teile eines Durchflusszytometers
- Flüssigkeitssystem - Optik- Elektronik- Computer
-Instrumentsettings-Beispielsmessung
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Diese Partikel haben etwas gemeinsam
Algae
ChromosomesBlood cells
Protozoa
Einige ihrer Eigenschaften können mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden.
.
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Was ist ein Durchflusszytometer?
Grundlegend ist ein Durchflusszytometer ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop.
(Erste Prototypen sahen auch so aus)
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Das automatisierte Mikroskop
Waste
Detector& Counter
Sample
Diese einfache Darstellung zeigt das Grundprinzip eines Durchflusszytometers: Zellen werden in einer Durchflussküvette an einer Mikroskopoptik vorbei geführt.
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Das Durchflusszytometer
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Welche Parameter können gemessen werden?
die relative Zellgrösse (Forward Scatter - FSC)
die Granularität oder innere Komplexität
(Side Scatter - SSC)
die Fluoreszenzintensität (FL1, FL2, up to FL X)
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Teile eines Durchflusszytometers
• Flüssigkeitssystem– Liefert einen konstanten Hüllflüssigkeitsstrom– Transportiert die Probe in die Küvette– Fokussiert die Zellen im LASER-Strahl
• Optik– Fokussiert das Anregungslicht– Sammelt das emittierte Licht
• Elektronik– Wandelt Lichtsignale in elektrische Signale um– Sendet die Signale zum Auswerterechner
• Computer– Stellt Daten graphisch dar– Kontrolliert die „Instrument Settings“
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Charakteristiken von FSC und SSC
Coherent lightsource (488 nm)
Forward scatter Cell size (488 nm)
Side scatter Granularity (488 nm)
Forward scatter (FSC)
gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes
proportional zur Zellgrösse / Zelloberfläche (nur bei runden Zellen)
Side scatter (SSC)
gemessen im 90° Winkel zum einfallenden Licht
proportional zur Zellkomplexität und Granularität
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Beispiel: Blut
Forward scatter
Sid
e sc
atte
rGranulozyten
Debris Lymphozyten
Monozyten
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Fluoreszenz
=488 nm
Excitation light
=530 nm
Emission light
Die Fluorochrome absorbieren die Energie des Anregungslichtes.
Die absorbierte Energie wird abgegeben als:
Schwingungsenergie und Wärme
Emission eines Photons mit grösserer Wellenlänge ( = geringere Energie)
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Fluoreszenzintensität
FITC
FIT
C
101 104103102
Relative fluorescence intensity
Nu
mb
er o
f E
ven
ts
FITC
FIT
CFITC
FITC
FITC
FITC
FIT
C
FITC
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Hydrodynamische Fokussierung
SheathSample
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Optische Filter
460 500 540460 500 540 460 500 540
SP 500SP 500LP 500LP 500 BP500/80BP500/80
Longpass Shortpass Bandpass
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Octagon Detection System
SSC
PE PE-Cy7
FITC
PerCP-Cy5.5
695/40
655 LP
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Elektronik
Wandelt optische Signale (Photonen) in elektronische Signale (Spannungspulse) um
Digitalisiert die Signale
Analysiert die -Höhe [Height (H)], -Weite [Width (W)]
und die -Fläche [Area (A)] des Spannungspulses
Übermittelt die Daten an den Auswerterechner
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Entstehung eines Spannungspulses
Voltage
LaserLaser
LaserLaser
LaserLaser
t
t
t
Voltage
Voltage
1.
2.
3.
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Auswertung eines Spannungspulses
Time (µs)
Volt
age
Pulse Area (A)
Puls
e H
eig
ht
(H)
Pulse Width (W)
400
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Schwellenwert (Threshold)
Der Schwellenwert gibt die minimale Signalintensität an, die an dem jeweiligen Kanal erreicht werden muss. Alle Signale mit geringerer Intensität werden nicht dargestellt.
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Zusammenfassung
Während die Zellen den LASER-Strahl passieren, werden Spannungspulse am Photomultiplier generiert
Das Signal wird verstärkt Die Elektronik digitalisiert das Signal mit einer Frequenz
von 10MHz Nur Signale, die den gewünschten Schwellenwert
überschreiten, werden analysiert und aufgezeichnet Die Daten werden letztlich zum Analyserechner
übermittelt, der mit dem Zytometer verbunden ist
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Instrumentsettings
Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von
der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem
jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab
Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der
Regel durch die Anwendung bedingt
Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von
der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem
jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab
Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der
Regel durch die Anwendung bedingt
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Datenspeicherung
Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank
gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden
Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der
Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv
waren.
Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der
Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet.
Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte
Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen
wurde.
Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank
gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden
Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der
Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv
waren.
Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der
Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet.
Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte
Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen
wurde.
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Darstellung der Daten 1
1) Histogramm - ein Parameter, der die Fluoreszensintensität als Häufigkeitsverteilung dargestellt
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Event 1
Event 2
Event 3
FSC SSC FL1 FL2
30 60 638 840
100 160 245 85
300 650 160 720
Listmode file
400 800 10000
840
85
245 638FL1-H
FL2-H
0
200
400
600
800
1000
200 600
Darstellung der Daten 2
2) Dotplot (Punktwolkendarstellung) - zwei Parameter werden auf der x- und y-Achse dargestellt
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Enough theory of flow!
Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:
Enough theory of flow!
Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:
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Aufgabe: Bestimmung des prozentualen Anteils an CD4+, CD3+ und CD8+ Zellen im Vollblut
Material•Milzzellen aus der Maus
Methode• Drei-Farben-Immunfluoreszenz
Preparation• Färben von frisch isolierten Milzzellen
Färbung• Ungefärbte Kontrolle• Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen
Material•Milzzellen aus der Maus
Methode• Drei-Farben-Immunfluoreszenz
Preparation• Färben von frisch isolierten Milzzellen
Färbung• Ungefärbte Kontrolle• Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen
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Einstellung der FSC- und SSC-Spannung
• FSC und SSC sind optimal
eingestellt, wenn die zu
untersuchende Population (z.B.
Lymphozyten) von allen anderen
Populationen zu unterscheiden ist
• Der Schwellenwert des FSC
wird so eingestellt, dass Debris
überwiegend von der
Datenauswertung
ausgeschlossen wird
• FSC und SSC sind optimal
eingestellt, wenn die zu
untersuchende Population (z.B.
Lymphozyten) von allen anderen
Populationen zu unterscheiden ist
• Der Schwellenwert des FSC
wird so eingestellt, dass Debris
überwiegend von der
Datenauswertung
ausgeschlossen wird
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Parameter (I)
• FSC und SSC
Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)
Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll,
Fixierungsmethode)
Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende
Population für weitere Untersuchungen zu definieren
• FSC und SSC
Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)
Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll,
Fixierungsmethode)
Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende
Population für weitere Untersuchungen zu definieren
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Parameter (II)
• Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)
Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper,
Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.)
Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die
statistische Analyse
• Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)
Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper,
Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.)
Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die
statistische Analyse
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„Gating“:Bestimmen der gewünschten Population
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„Gating“
• Selektive Analyse definierter Zellpopulationen
• Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt
werden
• Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen
• Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen
• Selektive Analyse definierter Zellpopulationen
• Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt
werden
• Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen
• Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen
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Einstellung der Fluoreszenzsettings
A) Einstellen der PMT-SpannungProbe: ungefärbte Kontrolle
• Die gemessene Fluoreszenz wird als unspezifische Autofluoreszenz betrachtet. •Die Lymphozytenpopulation wurde vorher im FSC und SSC „gegated“.
B) “Quadrantengating”
Traditionell werden Quadranten benutzt um die 4 möglichen Populationen in einem 2-Farben-Experiment zu definieren. Bei Vielfarbenexperimenten ist diese Art des „Gatings“ nicht die optimale Lösung.
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„Quadrantengating“
FL1-H
FL2-H
FITC+
PE
FITC
PE
negative
Q2
Q4Q3
Q1
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Fluoreszenzüberstrahlung
650nm 700nm500nm 550nm 600nm
Rel
ativ
e In
ten
sitä
t
Wellenlänge (nm)
FL1530/30
FL2585/42
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FITC-Kompensation
Detektor - … % Signal
650nm 700nm500nm
550nm 600nm
Rel
ativ
e In
ten
sitä
t
Wellenlänge (nm)
FL1
530/30
FL2585/42
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Lowering the FITC-population is achieved by...
... Subtracting a percentage of FITC-intensity from the affected PE-channel ...
650nm 700nm500nm 550nm 600nm
FL1530/30
FL2
585/42R
ela
tive I
nte
nsit
y
… because 25% of the FITC-signal are actually detected in the PE channel ...
Wavelength (nm)
FITC-Kompensation
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Zusammenfassung
• FSC und SSC werden so eingestellt, dass die Population gut von anderen Populationen zu unterscheiden ist
• Die gewünschte Population wird „gegatet“• Die PMT Spannungen der Fluoreszenzkanäle werden mit
der ungefärbten Kontrolle eingestellt• Einzelfärbungen werden eingemessen um
Fluoreszezüberstrahlungen zu kompensieren