Gregório Guilherme Almeida - UFMG
Transcript of Gregório Guilherme Almeida - UFMG
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Parasitologia
Programa de Pós-Graduação em Parasitologia
Gregório Guilherme Almeida
Complexo anfifílico de antimônio:
atividade leishmanicida in vitro e eficácia de uma
formulação tópica em modelo murino de leishmaniose
cutânea.
Belo Horizonte 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como pré-requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Parasitologia. Área de concentração: Protozoologia. Orientadora: Profª. Drª.Maria Norma Melo Universidade Federal de Minas Gerais Co-orientador: Frédéric Jean Georges Frézard Universidade Federal de Minas Gerais
Almeida, Gregório Guilherme.
Complexo anfifílico de antimônio: atividade leishmanicida in vitro e eficácia
de uma formulação tópica em modelo murino de leishmaniose cutânea.
[manuscrito] / Gregório Guilherme Almeida. – 2012.
81 f. : il. ; 29,5 cm.
Orientadora: Maria Norma Melo. Co-orientador: Frédéric Jean Georges
Frézard.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento
de Parasitologia.
1. Leishmaniose tegumentar - Teses. 2. Parasitologia – Teses. 3. Protozoologia
- Teses. 4. Administração tópica. 5. Octanoil N-metilglucamida. I. Melo, Maria
Norma. II. Frézard, Frédéric Jean Georges. III. Universidade Federal de Minas
Gerais. Departamento de Parasitologia. IV. Título.
CDU: 576.893.1
Este trabalho foi desenvolvido sob
orientação da Professora Dra. Maria
Norma Melo e a co-orientação do
Professor Dr. Frédéric Jean Georges
Frézard.
Aos meus pais, dedico este trabalho.
“(...)Dizia o livro: ‘As jibóias engolem, sem mastigar, a presa inteira. Em seguida, não podem mover-se e dormem os seis meses da digestão.’ Refleti muito então sobre as aventuras da selva, e fiz, com lápis de cor, o meu primeiro desenho. Meu desenho número 1 era assim:
Mostrei minha obra-prima às pessoas grandes e perguntei se o
meu desenho lhes fazia medo. Responderam-me: ‘Por que é que um chapéu faria medo?’
Meu desenho não representava um chapéu. Representava uma jibóia digerindo um elefante. Desenhei então o interior da jibóia, a fim de que as pessoas grandes pudessem compreender. Elas têm sempre necessidade de explicações. Meu desenho número 2 era assim:
As pessoas grandes aconselharam-me deixar de lado os desenhos
de jibóias abertas ou fechadas, e dedicar-me de preferência à geografia, à história, ao cálculo, à gramática.
Foi assim que abandonei, aos seis anos, uma esplêndida carreira de pintor. Eu fora desencorajado pelo insucesso do meu desenho número 1 e do meu desenho número 2. As pessoas grandes não compreendem nada sozinhas, e é cansativo, para as crianças, estar toda hora explicando.(...)”
Trecho de ‘O pequeno príncipe’, Antoine de Saint-Exupery
Agradecimentos
Pela vida, pela paciência, pelo carinho, pelo exemplo, pelo cuidado, pela
permissão e a negação, pela humilde sabedoria, por me entender nem sempre
me compreendendo, por me amar. Agradeço à minha mãe antes de tudo por
me permitir a vida.
Ao meu pai, irmãos e família, por serem, dentre os muitos exemplos ao
que serve a família, o meu exemplo de tolerância.
À Renata Gomes, por todos os momentos que vivemos, tranquilos ou
ruidosos, mas que nos fizeram chegar onde estamos. Te amo de coração.
A todos os amigos que hoje não estão presentes na minha rotina, mas
que contribuíram para quem eu sou hoje. Mantenho-os no anonimato da minha
memória, sempre com muito carinho. Nas palavras de Milton Nascimento, “o
que foi feito é preciso conhecer para melhor prosseguir.”. Fato.
A todos os amigos presentes, por serem sempre o que se propuseram
a ser. Não exigiria de vocês mais do que isso.
Aos colegas de mestrado, especialmente aqueles que se tornaram
grandes amigos. Agradeço ao Daniel Coscarelli pelos longos papos, pelas
artes, pelas Fissurelisses, mas acima de tudo pela amizade honesta e
profunda. Ao Antonio Mendes, por me fazer acreditar novamente em coisas
que eu julgava mortas e por me fazer ter uma postura mais positiva sobre o
mundo e a ciência. A ambos, sei que nossa amizade vai resistir à ação
corrosiva da rotina, e teremos muitas histórias para contar no futuro,
independente da distância.
Aos amigos do Laboratório de Biologia de Leishmania: à Gabriela
Vogas pela amizade e pela grande ajuda nesse projeto; Ao Sidney Ferreira
(Nino), pela ajuda, por ser exemplo de seriedade e competência; um
agradecimento especial à Soraia, pela ajuda, pelo suporte, e pela força.
Aos amigos do LabNano: Kelly Kato, Ana Paula, Flaviana Ribeiro,
Flávia Pontello, Priscila Gomes, Mariana Albanez, Lígia Souza, Erly
Azevedo e Rubens do Monte, pela ajuda, pela convivência divertidíssima e
por serem sempre fof@s comigo!!
Ao professor Dr. Frédéric Frézard e a professora Dra .Cynthia
Demicheli pela oportunidade de trabalhar com algo totalmente novo e
interessante. Obrigado pelo aprendizado e pelo apoio.
À equipe do Laboratório de Imunologia e Genômica de parasitos, em
especial à Sara e Natasha pelo suporte nos qPCRs, e especialmente ao
Professor Dr. Ricardo Fujiwara pela ajuda na análise estatística e
principalmente pela sua prestatividade, marca registrada da sua personalidade.
Aos Amigos do Centro de Pesquisas René Rachou: Marcelle Rocha
pela paciência e ajuda no projeto. À Paula Monalisa, Izabela Ibraim e Rafael
Assis pela convivência excepcional e aprendizado. Especialmente ao
Professor Dr. Rodrigo Soares, que além de um exemplo de pesquisador é um
grande amigo.
À Bárbara Verçosa pela ajuda essencial na contagem da LDU.
Ao Leonardo Maciel, por ser para mim o grande exemplo que é. Por ser
compreensivo, amigo e paciente.
À professora Dra. Maria Norma, “a chefa”. Não haveria páginas
suficientes nessa dissertação para lhe agradecer à altura do seu mérito. Pela
acolhida, pela gentileza, pelos (muitos) puxões de orelha, pelo carinho
excepcional, por me ensinar, por me permitir... A senhora é, não só um
exemplo, mas alguém muito especial que ficará eternizada por essas páginas,
que descrevem uma etapa da minha vida. À senhora meu sentimento sempre
de muito carinho e respeito. Muitíssimo obrigado!
À força sem nome que sempre me manteve de pé, que sempre encaixou
os momentos para que o caminho turbulento terminasse em um plano calmo.
Sei da sua existência e não ouso lhe dar nomes ou lhe encaixar nos conceitos
da minha limitação humana. Sei da sua essência e me basta. Continue me
guiando por onde for necessário para que eu possa fazer algo de útil para o
mundo. É por isso que estou aqui.
Aos cães, motivo pelo qual me tornei um veterinário e entrei na
empreitada contra a leishmaniose.
Sumário
Lista de Abreviaturas e Siglas 9
Lista de Tabelas e Figuras 10
Resumo 12
Abstract 14
1. Introdução
1.1. Leishmanioses 16
1.2. Ciclo biológico 17
1.3. Leishmaniose Tegumentar Americana 19
1.4. Formas Clínicas da LTA 20
1.5. Epidemiologia e Controle 21
1.6. Modelos experimentais utilizados em testes de novos
fármacos
24
1.7. Tratamento 25
1.8. Mecanismo de Ação dos Antimoniais 28
1.9. Octanoil N-Metilglucamida 29
2. Justificativa 32
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral 35
3.2. Objetivos Específicos 35
4. Material e Métodos
4.1. Síntese dos complexos de alquilmetilglucamidas com
antimônio
36
4.2. Manutenção do parasito 36
4.3. Animais 37
4.4. Estudo da Citotoxicidade in vitro 38
4.4.1. Isolamento de macrófagos peritoneais 38
4.4.2. Ensaio de citotoxicidade em macrófagos murinos
(MTT)
38
4.4.3. Concentração citotóxica in vitro 40
4.5. Estudo da atividade anti-amastigota in vitro. 40
4.5.1. Infecção experimental de macrófagos murinos com
Leishmania amazonensis.
40
4.5.2. Exposição dos macrófagos infectados aos
compostos
41
4.5.3. Concentração inibitória in vitro 42
4.5.4. Índice de Seletividade in vitro 42
4.6. Estudo da atividade anti-Leishmania in vivo 42
4.6.1. Isolamento das promastigotas metacíclicas 42
4.6.2. Infecção e tratamento dos camundongos 43
4.6.3. Quantificação da carga parasitária 44
4.7. Estudo da Permeação Percutânea in vitro 44
4.8. Análises Estatísticas 46
5. Resultados
5.1. Curva de Crescimento de Leishmania (Leishmania)
amazonensis
48
5.2. Citotoxicidade em macrófagos murinos 49
5.3. Atividade anti-amastigota in vitro 51
5.4. Absorção percutânea de Sb 53
5.5. Atividade anti-Leishmania in vivo 56
6. Discussão e Conclusões 60
7. Referências Bibliográficas 67
8. Anexos 80
9
Lista de Abreviaturas e Siglas
AM: Antimoniato de meglumina.
BALB/c: Linhagem isogênica de camundongos susceptíveis à leishmaniose.
CC50: Concentração citotóxica em 50%.
CEBIO: Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG.
CETEA: Comitê de Ética em Experimentação Animal.
CI50: Concentração inibitória em 50%.
DMSO: Dimetilsulfóxido.
GFAAS: Espetroscopia de absorção atômica em forno de grafite.
HSR/J: Linhagem de camundongos glabros.
IS: Índice de seletividade.
LA8: Octanoil N-Metilglucamida.
LA8-Sb: Octanoil N-Metilglucamida complexado ao antimônio pentavalente.
LC: Leishmaniose cutânea.
LCD: Leishmaniose cutânea anérgica difusa ou leishmaniose cutânea difusa.
LCL: Leishmaniose tegumentar localizada.
LCM: Leishmaniose cutâneomucosa.
LD: leishmaniose disseminada.
LDU: Unidades de Leishmania donovani (Leishmania donovani units).
LTA: Leishmaniose tegumentar americana.
LVA: Leishmaniose visceral americana.
MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazólio.
NatAM: Antimoniato de meglumina incorporado em gel de natrosol.
OMS: Organização Mundial de Saúde.
PBS: Tampão fosfato-salino.
PSG: Gel Secretório de Promastigotas.
RPM: Rotações por minuto.
Sb: Stibium, Antimônio.
SbIII: Antimônio trivalente.
SbV: Antimônio pentavalente.
SFB: Soro fetal bovino.
TDR: Programa Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais.
10
Lista de Tabelas e Figuras
Tabela 1: Percentagem média de macrófagos peritoneais viáveis de
BALB/c, com diferentes concentrações de Glucantime, após 24 horas de
exposição.
49
Tabela 2: Percentagem média de macrófagos peritoneais viáveis de
BALB/c, com diferentes concentrações de LA8-Sb, após 24 horas de
exposição.
49
Tabela 3: Percentagem média de macrófagos peritoneais viáveis de
BALB/c, em diferentes concentrações de LA8, após 24 horas de
exposição.
50
Tabela 4: Avaliação do peso médio de camundongos BALB/c infectados
com Leishmania (Leishmania) amazonensis tratados com Glucantime,
LA8 e LA8-Sb.
57
Figura 1: Ciclo de vida de Leishmania spp. 19
Figura 2: Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil –
1990 a 2010.
22
Figura 3: Fórmula estrutural proposta para o Glucantime. 27
Figura 4: Fórmulas estruturais propostas para o octanoil N-
metilglucamida e o complexo LA8-Sb.
30
Figura 5: Representação esquemática de uma Célula de Difusão de
Franz.
45
Figura 6: Curva de crescimento para Leishmania amazonensis (cepa
PH8) em meio -MEM completo.
48
Figura 7: Curvas de CC50 do Glucantime, do LA8 e do LA8-Sb para
macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c.
50
Figura 8: Atividade anti-amastigota in vitro dos compostos LA8, LA8-Sb e
Glucantime em diferentes concentrações no modelo de macrófagos
peritoneais de BALB/c, infectados com formas promastigotas de fase
estacionária de Leishmania amazonensis.
52
11
Figura 9: Imagens de microscopia ótica das lâminas do teste de
atividade anti-amastigota in vitro com as maiores concentrações
utilizadas no teste para cada composto.
52
Figura 10: Curva de CI50 do Glucantime para macrófagos peritoneais de
BALB/c, em diferentes concentrações.
53
Figura 11: Percentual da permeação cutânea de Sb através da pele de
camundongos Hairless, após oito horas de exposição às formulações, na
presença e na ausência de estrato córneo.
54
Figura 12: Permeação percutânea de antimônio através pele de
camundongos Hairless, em função do tempo, na pele íntegra e na
ausência do estrato córneo.
55
Figura 13: Diâmetro médio da lesão em função do tempo de tratamento
de camundongos BALB/c tratados com Glucantime, LA8 e LA8-Sb.
57
Figura 14: Avaliação da eficácia da formulação tópica de LA8-Sb em
camundongos infectados com L. amazonensis.
57
Figura 15: Avaliação do efeito do tratamento em camundongos BALB/c
fêmeas infectadas com L. (L.) amazonensis.
58
12
Resumo
As leishmanioses são consideradas um grande problema de saúde pública em
vários países onde incidem. A OMS as classifica como doenças
negligenciadas, e incentiva a busca de novos fármacos ou formulações que
sejam eficazes e que tenham baixa toxicidade ao homem. O tratamento com as
drogas disponíveis demandam longo tempo de tratamento e apresentam
diversos efeitos colaterais, comprometendo a adesão dos pacientes. Além do
desenvolvimento de novos fármacos, há pesquisas direcionadas a potencializar
a atividade leishmanicida de drogas já utilizadas e diminuindo sua toxicidade. O
LA8 é uma alquilmetilglucamida capaz de se complexar ao antimônio
pentavalente e, devido à sua propriedade anfifílica, o complexo resultante é
potencialmente eficaz contra a leishmaniose quando administrado por vias não
invasivas como a tópica e a oral. O objetivo do presente estudo foi avaliar sua
eficácia in vitro e in vivo em camundongos BALB/c experimentalmente
infectados com Leishmania amazonensis. Os ensaios in vitro mostraram que o
complexo LA8-Sb foi cerca de 100 vezes mais tóxico (CC50 = 0,26mM de Sb)
para macrófagos peritoneais murinos que o Glucantime (CC50 = 26,31mM de
Sb) e 6 vezes mais tóxico que o seu ligante LA8 isoladamente (CC50 = 4,89mM
de LA8). Não foi possível observar atividade anti-amastigota do complexo LA8-
Sb em culturas de macrófagos peritoneais murinos infectados com L.
amazonensis, em concentrações abaixo da concentração citotóxica (CC50). No
estudo da atividade in vivo, camundongos BALB/c infectados na base da cauda
com L. amazonensis, foram tratados duas vezes ao dia, por 21 dias com uma
formulação tópica contendo LA8-Sb. Foi observada uma estabilização no
tamanho da lesão além da diminuição da carga parasitária. A permeação
percutânea do antimônio presente no complexo foi avaliada no modelo de
células de difusão de Franz usando pele de camundongos glabros, mostrando
taxas de permeação de antimônio de 0,008% e 4,27%, respectivamente na
pele íntegra e na pele sem o estrato córneo, após 8 horas. Na ausência de
estrato córneo, o LA8-Sb promoveu uma liberação mais sustentada de
antimônio que o antimoniato de meglumina. O presente estudo permite concluir
que o complexo anfifílico de antimônio LA8-Sb apresenta atividade anti-
13
leishmania após aplicação tópica em modelo murino de leishmaniose cutânea,
apesar da aparente ineficácia em modelo in vitro de macrófagos peritoneais
infectados. Novos estudos são necessários para elucidação do mecanismo de
ação da nova formulação bem como sua otimização.
14
Abstract
Leishmaniasis is considered a major public health problem in 88 countries
worldwide. It is considered a neglect disease by The World Health Organization,
thus reinforcing the need of new effective and less toxic compounds. The
available drugs require long-term treatment and cause several side effects. In
addition to the development of new drugs, another strategy is to enhance the
leishmanicidal activity of available drugs and decrease its toxicity. LA8 is an
amphiphilic alquilmetilglucamida that binds to pentavalent antimony and is a
potentially effective molecule against leishmaniasis. The aim of this study was
to evaluate its in vitro and in vivo efficacy against Leishmania amazonensis
infected BALB/c mice with by a topical formulation. Also, in vitro assays using
mice peritoneal macrophages showed that the complex LA8-Sb was about 100
times more toxic (CC50 = 0.26mM Sb) than Glucantime (CC50 = 26.31mM Sb)
and 6 times more toxic than LA8 and its ligand alone (CC50 = 4.89mM LA8).
There is no anti-amastigote activity after 72 hours of exposure, in
concentrations below the cytotoxic concentration (CC 50), when incubated in
infected with L. amazonensis murine peritoneal macrophages. BALB/c mice
were inoculated at the tail base with L. amazonensis and treated twice a day
for 3 weeks with a topical formulation containing LA8-Sb. This assay resulted in
stabilization of the lesion size and a decrease in parasite burden. The
percutaneous permeation of the antimony present in the complex was
evaluated by the Franz diffusion cell model. The antimony permeations were
about 0.008% and 4.27% in the intact and stripped skin, respectively. The
present study shows that the topical formulation, despite the in vitro results may
present an anti-leishmania activity in vivo. Further studies are needed to
elucidate the potential effectiveness of the LA8-Sb.
15
1.I
ntr
oduçã
o
16
1.1. Leishmanioses
As leishmanioses são doenças infecciosas causadas por várias
espécies de protozoários do gênero Leishmania (Ross,1903), transmitidas
pela picada de diversas espécies de flebotomíneos infectados. A doença
apresenta um grande espectro de manifestações clínicas, usualmente
divididas em leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose cutaneomucosa
(LCM) e leishmaniose visceral (Silveira et al., 2004; Lainson & Shaw, 2005)
Anualmente, são reportados 600.000 novos casos de leishmaniose
no mundo, podendo esse valor chegar a dois milhões de novos casos por
ano, sendo aproximadamente 1,5 milhões, das formas cutânea e
cutaneomucosa, e 500 mil da forma visceral, com um total de 12 milhões de
pessoas infectadas, e uma população de risco de 350 milhões de
indivíduos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) relata a ocorrência de
leishmanioses em 88 países, com notificação compulsória em apenas 32
(WHO, 2010).
Acredita-se que leishmaniose tegumentar americana (LTA) seja
autóctone do continente Americano (Altamirano-Enciso et al., 2003). Figuras
humanas em objetos de cerâmica datadas de 400 a 900 a.C., conhecidas
como huacos, encontradas no Peru e Equador, evidenciam mutilações em
faces humanas sugestivas de LTA. Relatos de lesões faciais em ameríndios
foram encontrados em diversos manuscritos da época da colonização
espanhola (Lainson & Shaw, 2005).
No entanto, somente em 1909, Carini e Paranhos identificaram o que
seriam posteriormente conhecidas como as formas amastigotas, em lesões
tegumentares em pacientes no estado de São Paulo. Em 1911, Gaspar de
Oliveira Vianna, denominou tais parasitos como Leishmania brasiliensis,
sendo essa nomenclatura substituída pelo similar em inglês Leishmania
braziliensis, por Matta em 1916 (Lainson & Shaw, 2005).
Desde então a LTA vem sendo diagnosticada em todos os estados
brasileiros. Em 1985, foram notificados cerda de 13000 casos de LTA,
atualmente estimados em cerca de 30000 casos notificados por ano no país
(Ministério da Saúde, 2007).
17
As leishmanioses são consideradas pela OMS como sendo doenças
negligenciadas pelos sistemas de saúde dos países onde ocorrem. O
Programa Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais
(TDR), que tem como foco doenças negligenciadas que afetam populações
pobres e marginalizadas, coloca as leishmanioses como enfermidades
prioritárias entre as endemias abordadas pelo Programa (WHO, 2010).
1.2. Ciclo Biológico
Leishmania é um protozoário pertencente à família
Trypanosomatidae, parasito intracelular obrigatório das células do sistema
fagocítico mononuclear, com duas formas principais: uma flagelada ou
promastigota, encontrada no tubo digestório do inseto vetor, e outra
aflagelada ou amastigota, observada nos tecidos dos hospedeiros
mamíferos (Bates, 2007).
Há diferentes hipóteses sobre a evolução do gênero Leishmania,
mas os dados atualmente disponíveis sugerem que ele evoluiu em
mamíferos americanos e migraram com seus hospedeiros para o Velho
Mundo, de onde se disseminaram por volta de 24 a 14 milhões de anos
atrás (Shaw, 2011; Kuhls et al., 2011).
O parasito possui um ciclo de vida heteroxeno (Figura 1). São
transmitidos por fêmeas adultas de flebotomíneos que se infectam ao
realizar um repasto sanguíneo em um hospedeiro reservatório, ingerindo as
formas amastigotas presentes na pele (Montoya-Lerma 1992). No trato
digestório do hospedeiro invertebrado elas sofrem uma transformação,
desenvolvendo um flagelo anterior, passando então a se chamar
promastigotas, dentro da matriz peritrófica, uma membrana constituída por
proteínas, glicoproteínas, e microfilamentos de quitina que encerra o
sangue ingerido, formando uma barreira que protege o epitélio intestinal da
abrasão por partículas de alimentos e microrganismos (Pimenta et al., 1997;
Kamhawi, 2006).
Essas formas, especificamente chamadas de promastigotas
procíclicas, se multiplicam e são capazes de se aderir ao epitélio intestinal
do flebotomíneo devido a um conjunto de glicoproteínas de membrana. A
18
adesão propiciada por essas moléculas impede que o parasito seja expelido
com as excretas do flebotomíneo, após a digestão do sangue (Sacks &
Kamhawi, 2001).
As promastigotas procíclicas passam por mudanças morfológicas e
fisiológicas no tubo digestório do vetor, e parte dessa população se
diferencia em formas metacíclicas, através de um processo chamado
metaciclogênese, onde há uma mudança do perfil de moléculas
citoplasmáticas e de membrana do parasito, o que garante sua liberação do
tubo digestório do inseto vetor, tornando-as mais infectantes ao hospedeiro
mamífero (Pimenta et al., 1992; Sacks & Sher, 2002; Soares et al., 2005).
Esse processo ocorre durante o tempo em que o último repasto
sanguíneo-tissular é digerido. Após a metaciclogênese, as promastigotas
metacíclicas migram para a parte anterior do tubo digestório do inseto, onde
produzem uma glicoproteína de consistência gelatinosa chamada PSG
(promastigote secretory gel). Acredita-se que esse gel obstrua a passagem
de alimento, quando do repasto sanguíneo-tissular, obrigando o
flebotomíneo a regurgitar saliva juntamente com as formas promastigotas
metacíclicas, no local da picada (Bates, 2007).
Os parasitos inoculados são fagocitados primeiramente por
neutrófilos, e em seguida perdem o flagelo transformando-se em
amastigotas (Peters et al., 2008). Horas depois são fagocitados por
macrófagos, onde são internalizados no vacúolo parasitóforo, que logo se
liga aos lisossomos, dando origem ao vacúolo fagolisossomal, onde o
parasito permanece em um ambiente hostil, contendo enzimas lisossomais
e metabólitos reativos do oxigênio. No entanto, devido a diversos
mecanismos de evasão à resposta imune do hospedeiro, a Leishmania se
adapta a sobreviver neste ambiente, onde se multiplica por divisão binária,
até levar a ruptura da célula infectada e liberar formas amastigotas que são
fagocitadas por outros macrófagos (Peters et al., 2008; Sacks & Sher,
2002).
19
Figura 1: Ciclo de vida da Leishmania spp. – adaptado de Harhay et al., 2012.
1.3. Leishmaniose Tegumentar Americana
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por diversas
espécies de Leishmania e está amplamente distribuída na América Latina.
A doença tem caráter zoonótico, ocorrendo naturalmente em animais
silvestres podendo acometer o homem (Lainson, 1983).
Nas Américas, são atualmente reconhecidas pelo menos 11 espécies
dermotrópicas de Leishmania causadoras de doença humana e oito
somente em animais. No entanto, no Brasil já foram identificadas oito
espécies, sendo seis do subgênero Viannia e duas do subgênero
Leishmania. As três principais espécies são: L. (V.) braziliensis, L.(V.)
guyanensis e L.(L.) amazonensis, e, mais recentemente, as espécies L. (V.)
lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi, L. (V.) lindenbergi foram identificadas
em estados das regiões Norte e Nordeste (Lainson & Shaw, 2005).
Após a infecção por Leishmania podem ser observados diferentes
graus de susceptibilidade a esses parasitos, sendo alguns indivíduos
naturalmente resistentes (assintomáticos) e outros, apresentando diferentes
graus de susceptibilidade à infecção (sintomáticos) (Silveira et al., 2004).
20
Dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção e da
resposta imune mediada por células do individuo infectado, se desenvolve
um amplo espectro de formas clínicas da doença, convencionalmente
conhecido como leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose
cutâneomucosa-(LCM), leishmaniose cutânea anérgica difusa ou
simplesmente leishmaniose cutânea difusa (LCD) e leishmaniose
disseminada (LD) (Cástes et al., 1983; Carvalho et al., 1985; Lainson &
Shaw, 2005).
1.3.1. Formas clínicas da LTA
Dentre os aspectos clínicos da LTA, destacam-se lesões de pele com
úlceras localizadas (LCL) ou múltiplas, o que representa a forma mais
frequente da doença, tendo como agente etiológico qualquer uma das
espécies dos subgêneros neotropicais. A L.(V.) braziliensis é considerada o
mais prevalente parasito associado a esta forma de doença. Representa o
acometimento primário da pele, sendo a lesão única ou múltipla, geralmente
do tipo ulcerado, com tendência à cura espontânea ou apresentando boa
resposta ao tratamento (Silveira et al., 2004).
Inicialmente a lesão tem aspecto papular e indolor, podendo ou não
ser pruriginosa. Posteriormente a pápula evolui, produzindo uma lesão
inflamada, ulcerada, circular e de bordas elevadas (Gontijo & De Carvalho,
2003). A lesão pode permanecer única, mas em muitos casos macrófagos
infectados podem transportar amastigotas para outras regiões do
organismo, produzindo lesões secundárias (Lainson & Shaw, 2005).
Um parasito em especial, Leishmania (V.) braziliensis, tende a
produzir lesões metastáticas nas mucosas oral, nasal e laringo-faringiana. A
leishmaniose cutaneomucosa manifesta-se por lesões destrutivas
localizadas nas mucosas das vias aéreas superiores (Berman, 1997;
Bittencourt & Barral-Neto, 1995).
Embora muitos pacientes possam apresentar as lesões na pele e nas
mucosas, é observado que a maioria dos casos de LCM registrados na
Amazônia, ocorre em pacientes infectados com L. (L.) braziliensis que
apresentam lesão cutânea crônica não tratada ou de cura espontânea
21
(Silveira et al., 1999). É caracterizada por apresentar metástases nas
mucosas que conduzem a quadros clínicos desfigurantes (Marsden, 1986).
A LCD é uma manifestação relativamente rara caracterizada por
lesões nodulares disseminadas por todo o corpo, ricas em amastigotas. Em
alguns casos ocorrem múltiplas e até centenas de lesões papulares e de
aparência acneiforme, que acometem vários segmentos corporais,
envolvendo com frequência a face e o tronco. É uma forma clínica grave
que ocorre em pacientes com anergia e deficiência específica na resposta
imune celular a antígenos de Leishmania, sendo esses pacientes negativos
no teste de Montenegro (Silveira et al., 2004; Lainson & Shaw, 2005; ).
A forma cutânea difusa é causada por algumas espécies do
subgênero Leishmania, sendo Leishmania (Leishmania) amazonensis a
única espécie considerada responsável pela forma clínica no Brasil
(Lainson, 1983; Lainson & Shaw, 2005). Demonstrou-se que pacientes
acometidos com a LCD, apresentam uma resposta do tipo Th2 exuberante
(Moraes et al., 1999). A gravidade desse quadro se complica quando
observado que os pacientes não apresentam uma resposta satisfatória ao
tratamento com antimoniais (Silveira & Lainson et al., 2004).
1.3.2. Epidemiologia e Controle
Até a década de 1950 a LTA disseminou-se praticamente por todo o
território nacional, coincidindo com o desflorestamento provocado pela
construção de estradas e instalação de aglomerados populacionais, com
maior incidência nos estados de São Paulo, Paraná, Minas Gerais, Ceará e
Pernambuco. A partir daí até a década de 1960, a doença parece ter
entrado em declínio, com o desmatamento já completado nas regiões mais
urbanizadas do país, além da relativa estabilidade das populações rurais
(Furtado, 1994). Desde então, a transmissão da doença vem sendo descrita
em vários municípios de todas as unidades federadas (UF) (Ministério da
Saúde, 2007).
Nas últimas décadas, as análises epidemiológicas da leishmaniose
tegumentar americana têm sugerido mudanças no padrão de transmissão
da doença, inicialmente considerada zoonoses de animais silvestres, que
22
acometia ocasionalmente pessoas em contato com as florestas.
Posteriormente, a doença começou a ocorrer em zonas rurais, já
praticamente desmatadas, e em regiões periurbanas (Passos et al., 1993).
Acredita-se que essa mudança no perfil de transmissão possa estar
relacionada a uma adaptação de algumas espécies de flebotomíneos aos
ambientes modificados pelo homem e os animais domésticos envolvidos no
ciclo de transmissão (Tolezano et al., 1980; Lainson, 1989; Marzochi, 1992).
Em 2010 foram registrados 21981 casos no Brasil, sendo 72,8% dos
casos registrados nas regiões Norte e Nordeste, 14,4% na região Centro-
oeste, 11% na região Sudeste e 1,1% na região Sul do país (Figura 2)
(Sinan/SVS/MS, 2012).
Observa-se a existência de três perfis epidemiológicos:
Segundo o Manual de Vigilância Epidemiológica da LTA, produzido
pelo Ministério da Saúde (MS), podem ser observados três padrões
epidemiológicos da doença no Brasil:
a) Silvestre – em que ocorre a transmissão em áreas de vegetação
primária (zoonose de animais silvestres);
b) Ocupacional ou Lazer – em que a transmissão esta associada à
exploração desordenada da floresta e derrubada de matas para construção
de estradas e usinas hidroelétricas, extrativismo vegetal, desenvolvimento
de atividades agropecuárias e ecoturismo; (antropozoonose);
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
19
90
19
91
19
92
19
93
19
94
19
95
19
96
19
97
19
98
19
99
20
00
20
01
20
02
20
03
20
04
20
05
20
06
20
07
20
08
20
09
20
10
Casos de LTA no Brasil de 1990 a 2010
Casos de LTA
Figura 2 - Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil –1990 a
2010. Adaptado pelo autor de Sinan/SVS/MS, 2012.
23
c) Rural ou periurbana – em áreas de colonização (zoonose de matas
residuais) ou periurbana, em que houve adaptação do vetor ao peridomicílio
(zoonose de matas residuais e/ou antropozoonose).
Em virtude das características epidemiológicas da LTA, as
estratégias de controle devem ser flexíveis, distintas e adequadas a cada
região ou foco em particular. A diversidade de agentes etiológicos, de
reservatórios, de vetores e a situação epidemiológica da LTA, aliada ao
conhecimento ainda insuficiente sobre vários aspectos da sua
epidemiologia, evidenciam a complexidade do controle desta endemia. Para
definir as estratégias e a necessidade das ações de controle para cada área
de LTA a ser trabalhada, deverão ser considerados os aspectos
epidemiológicos, bem como seus determinantes (Ministério da Saúde,
2007).
No Brasil, a vigilância epidemiológica e a metodologia para controle
da LTA é determinada pelo Ministério da Saúde. Todo caso suspeito de LTA
deve ser submetido à investigação clínica e epidemiológica, e a método
auxiliar de diagnóstico. Caso seja confirmado, inicia-se o tratamento
segundo as normas técnicas preconizadas pelo Ministério da Saúde e
acompanha-se mensalmente o paciente, pelos três primeiros meses e, uma
vez curado, bimensalmente, até completar doze meses após o término do
tratamento (Ministério da Saúde, 2007).
Os casos de LTA devem ser obrigatoriamente notificados ao MS em
uma ficha de notificação padronizada pelo Sistema de Informação de
Agravos de Notificação (SINAN). As informações contidas nesses
formulários são essenciais para caracterização da doença em uma região e
apartir deles, serão observadas a necessidade de adoção de medidas de
controle, destacando que o diagnóstico precoce, e o tratamento adequado
dos pacientes, bem como as atividades educativas, devem ser prioridades
em todas as situações (Ministério da Saúde, 2007).
Embora não seja fatal, a leishmaniose cutânea é tratada para
acelerar a cura, reduzir as lesões e prevenir a disseminação do parasito ou
as recaídas, reduzindo assim a morbidade. Vale enfatizar que, mesmo com
o tratamento adequado, a ocorrência de recidivas e/ou comprometimento
24
mucoso é frequente, sendo de 2% nos casos tratados e em torno de 10%
nos casos não tratados (Marsden, 1986).
1.4. Modelos experimentais utilizados em testes de novos fármacos
O estudo da LTA recorre aos modelos experimentais para induzir
infecções experimentais utilizadas na análise de diversos aspectos do
parasitismo por Leishmania e mesmo na avaliação da eficácia de novos
candidatos a vacinas e fármacos (Passero, 2011).
Existem diversos sistemas de teste in vitro e in vivo, com
características específicas para conduzir à uma otimização do teste. Os
ensaios in vitro constituem uma primeira etapa para avaliação da eficácia
de novas drogas e são utilizadas tanto as formas promastigotas quanto as
amastigotas (Gupta & Nishi, 2011).
Dentre os requisitos para esses ensaios podemos citar a utilização
do parasito na sua forma encontrada no hospedeiro mamífero, uma
população de células em divisão, medidas reprodutíveis e quantificáveis da
atividade da nova droga, e a mensuração da atividade de drogas padrão,
como o glucantime, em concentrações compatíveis com o modelo in vivo
(Croft, 1986). Além desses requisitos, é interessante que o sistema utilize
pequenas quantidades do composto, rápida execução e baixo custo (Croft
et al., 2006).
Os modelos in vitro que simulam o ambiente da fase amastigota
intracelular tem sido descritos como mais confiáveis para avaliação das
novas drogas (Croft, 1986). Esses têm utilizados macrófagos primários e
linhagens de células imortalizadas como hospedeiras, incluindo
macrófagos peritoneais de camundongos e sangue humano derivados de
monócitos, macrófagos humanos, células THP-1, promonócitos humanos
U937 e células J774.1(Seifert et al., 2010). Nesses modelos, a atividade da
droga é mensurada através da contagem em microscopia ótica do
percentual de macrófagos infectados e/ou o número de amastigotas por
macrófago (Neal & Croft, 1984).
A atividade de drogas utilizando as formas promastigotas é de fácil
mensuração e rápida execução. No entanto, diferenças observadas em sua
25
susceptibilidade a drogas padrão em comparação com as formas
amastigotas, e as diferenças bioquímicas que existem entre as duas
formas, tornam esse modelo mais útil para determinação da toxicidade de
novas moléculas (Croft et al., 2006). Outros modelos foram descritos
utilizando amastigotas axênicas (Callahan et al., 1997). No entanto, foram
observadas diferenças na sensibilidade a drogas dessas formas em
comparação com as amastigotas intracelulares (Ephros et al., 1999).
Os ensaios in vivo são essenciais para determinar os parâmetros de
absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade de uma nova
droga. O modelo murino é o mais utilizado, pois requer um pequeno
volume do composto e reproduz bem os resultados utilizando apenas 5
animais por grupo (Gupta & Nishi, 2011). Os modelos utilizando
camundongos BALB/c são extensivamente utilizados devido à
susceptibilidade desse camundongo a diversas espécies de Leishmania
causadora de LT, e por ser uma linhagem cuja cura é excepcionalmente
difícil, mesmo utilizando as drogas padrão (Croft et al., 2006).
Nesses modelos a determinação da atividade da formulação é feita
através da mensuração do tamanho da lesão pela quantificação da carga
parasitária in situ. São descritos diversos métodos de quantificação da
carga parasitária da lesão, utilizando o cultivo dos parasitos através de
biópsias das lesões em diluição limitante (Titus et al., 1985), a LDU
(Leishmania donovani Units) que consiste na relação entre número de
amastigotas por células nucleadas do hospedeiro e o peso do órgão
parasitado (Stauber, 1956) e pelo método de PCR em tempo real (Bretagne
et al., 2001).
1.5. Tratamento
Gaspar Vianna, em 1912, foi o primeiro a utilizar o antimônio
trivalente (tártaro emético) no tratamento contra a leishmaniose. Por ser
muito tóxica, sua utilização clínica foi suspensa em decorrência aos seus
efeitos tóxicos. Desde então, esse medicamento sofreu várias modificações
para reduzir esses efeitos. Em 1947 os complexos de antimônio
26
pentavalente (SbV), menos tóxicos, foram introduzidos na quimioterapia das
leishmanioses (Berman, 1997; WHO, 2010).
Devido à sua comprovada eficácia terapêutica, os antimoniais
pentavalentes ainda são os fármacos de primeira escolha, utilizados no
tratamento convencional de ambas as formas de leishmaniose, em muitos
países da América do sul e norte da África, além da Turquia, Bangladesh
Nepal e Índia, excetuando-se o caso especial de Bíhar, norte da Índia
(Marsden et al., 1985; Murray et al., 2005).
Os antimoniais pentavalentes atualmente em uso são o Antimoniato
de N-metil glucamina (Glucantime®, Aventis) e Estibogluconato de sódio
(Pentostan®), administrados por via endovenosa ou intramuscular (Rath et
al., 2003; Herwaldt, 1999). Esses compostos são aplicados em injeções
intramusculares ou intralesionais e frequentemente causam dor no local da
aplicação e às vezes efeitos colaterais sistêmicos, sendo requerida
supervisão médica (Al khawajah et al., 1997). Outra modalidade de
tratamento inclui o uso de vacinas associadas ao tratamento com
antimonias, obtendo resultados promissores no que diz respeito ao volume
de droga administrada e tempo de tratamento, reduzindo, portanto, sua
toxicidade (Mayrink et al., 2006).
Dentre os efeitos colaterais podemos citar náusea, fraqueza, vômito,
mialgia, dor abdominal, nefrotoxicidade, alterações hepáticas e distúrbios
cardiológicos, o que representa um problema na utilização destes
medicamentos (Balaña-Fouce et al., 1998; Marsden, 1985; Masmoudi et al.,
2005; Rodrigues et al., 1999). Ao lado disso, foi relatada resposta
terapêutica variável e falhas no tratamento com antimoniais (Lawn et al.,
2003; Sundar, 2001; Marsden et al.,1985).
A estrutura abaixo é proposta para o Glucantime, medicamento
usado no Brasil para o tratamento de Leishmanioses.
27
Figura 3: Fórmula estrutural proposta para o Glucantime, adaptadas de Frézard et al.,
2008.
Como medicamento de segunda escolha é usado o Desoxicolato
sódico de anfotericina B e suas formulações lipossomais. Esse é um
antibiótico antifúngico, usado para o tratamento de pacientes em estado
grave, gestantes, recidivantes e nos casos de falha terapêutica (Ministério
da saúde, 2007).
Apesar das altas taxas de cura na quimioterapia antimonial, sua
utilização é limitada devido a vários fatores. O tratamento com os
antimoniais é longo, requerendo doses repetidas. O aparecimento de
reações adversas é frequente, sendo a mais grave a cardiotoxicidade. Este
efeito é diretamente relacionado com a dose e com o tempo de utilização do
fármaco. Outras reações adversas frequentes são artralgias, mialgias,
inapetência, náuseas, vômitos, dor abdominal, plenitude gástrica,
epigastralgia, pirose, dor no local da aplicação, febre e elevação de enzimas
hepáticas e pancreáticas. Ocasionalmente observam-se anemia, leucopenia
ou trombocitopenia (Ganier & Croft, 2002; Berman, 2005).
Além das dificuldades de administração desses compostos, um dos
grandes problemas enfrentados atualmente é o crescente número de
relatos de casos de resistência de cepas de Leishmania aos compostos
antimoniais pentavalentes (Sundar, 2001; Croft et al., 2006). No estado de
Bihar, na Índia, mais de 60% dos pacientes com leishmaniose visceral não
respondem ao tratamento com antimoniais pentavalentes (Sundar, 2001).
28
Na América do Sul, a ocorrência de resistência ao Sb é desconhecida (Lima
et al., 2007).
Tendo em foco essas limitações, a organização mundial de saúde
recomenda e apoia pesquisas no desenvolvimento de novas drogas. No
entanto, a falta de apelo comercial para a indústria farmacêutica e a política
pública de muitos países, em se tratando de doenças negligenciadas,
resultam em um suporte insuficiente a tal desenvolvimento. Portanto,
estratégias baseadas na melhoria dos fármacos existentes são mais bem
sucedidas do que o desenvolvimento de novas moléculas, com o objetivo
de reduzir sua toxicidade, melhorando sua eficácia além, de utilizar vias de
administração menos invasivas, como a via oral e a tópica (Frézard &
Demicheli, 2010).
Somente o miltefosine (1-0-hexadecilfosfocolina), originalmente
desenvolvido para o tratamento de metástases cutâneas em carcinomas
mamários, foi lançado no mercado como uma opção racional de fármaco a
ser usado contra as leishmanioses (Hilgard et al., 1993).
Diversos outros fármacos encontram-se em fase clínica de teste,
como as formulações lipossomais de anfotericina B, a sitamaquina, a
buparvaquona e o imiquimod, que apresentaram bons resultados nas fases
pré-clínicas (Croft et al, 2006).
Apenas a paromomicina, um antibiótico aminoglicosídeo identificado
como tendo ação leishmanicida na década de 60, obteve bons resultados
quando administrada por via tópica (El-On et al., 1992). Outras formulações
de paromomicina envolvendo outros veículos foram testadas obtendo
resultados variáveis (Soto et al., 2002; Iraji & Sadeghinia, 2005; Aguiar et
al., 2009).
1.6. Mecanismos de ação dos antimoniais
O mecanismo de ação dos antimoniais pentavalentes não foi
completamente elucidado. No entanto, há dois modelos propostos para
explicar esse mecanismo de ação. De acordo com o primeiro modelo, o
antimônio pentavalente seria uma pró-droga que seria reduzida no
29
organismo a antimônio trivalente (Shaked-Mishan et al., 2001, Goodwin &
Page, 1943)
Estudos recentes indicam que pelo menos quatro diferentes tióis
podem agir como agentes redutores nessa conversão: Glutationa, o tiol
predominante no citosol de células de mamíferos; cisteína e cisteinil-glicina,
os principais tióis presentes em lisossomos, e a tripanotiona, predominante
no citosol de Leishmania (Ferreira et al., 2003). Aparentemente a redução
do antimônio ocorre preferencialmente em amastigotas devido ao pH e
temperatura do ambiente intracelular (Shaked-Mishan et al., 2001). Estudos
recentes sugerem ainda a participação de enzimas específicas do parasito
na redução do antimônio pentavalente para trivalente (Denton et al., 2004;
Zhou et al., 2004).
Um segundo modelo propõe uma atividade intrínseca do antimônio
contra a Leishmania. Foi demonstrado que o antimônio pentavalente pode
formar complexos estáveis com ribonucleosídeos, interferindo no processo
de β-oxidação de ácidos graxos e glicólise do parasito e na depleção dos
níveis de ATP intracelular (Demicheli et al., 2002; Rath et al., 2003).
Recentemente, Ferreira (2010) propôs um grupo de moléculas
anfifílicas complexadas ao antimônio para o tratamento das leishmanioses.
São elas o Octanoil N-metilglucamida (LA8), o Decanoil N-metilglucamida
(LA10) e o Dodecanoil N-metilglucamida (LA12), respectivamente contendo
8, 10 e 12 carbonos na porção apolar da molécula.
Dado que a localização intracelular de Leishmania dificulta a ação
dos fármacos, pela barreira natural representada pela membrana das
células, o uso de compostos anfifílicos apresentaria uma vantagem ao
facilitar a passagem através dessa barreira.
1.7. Octanoil N-metilglucamida
O composto octanoil N-metil-glucamida (LA8), uma
alquilmetilglucamida, apresenta uma extremidade polar, com sítios de
ligação para o SbV, e uma extremidade hidrocarbônica, podendo assim
formar nanossistemas micelares e direcionar sua captação por macrófagos
que alberguem o parasito. Por ser um composto anfifílico, espera-se que ele
30
possa atravessar barreiras biológicas específicas como a membrana
plasmática, o epitélio do trato gastrintestinal e a pele (Ferreira, 2010).
Dados obtidos por microscopia eletrônica de transmissão indicam
que as alquilmetilglucamidas formam nano agregados de diâmetro médio
entre 20 e 200nm. Suas propriedades anfifílicas sugerem que sua
formulação tópica possa ser uma proposta relevante para o tratamento da
LTA (Ferreira, 2010).
Figura 4: Fórmulas estruturais propostas para o octanoil N-metilglucamida (a) e o
complexo LA8-Sb (b), baseado em dados de Espectrometria de massa (ESI-EM)
(Ferreira, 2010).
31
2.Ju
stif
icat
iva
32
Nos últimos anos houve um significativo aumento do número de
casos de leishmaniose, além da expansão geográfica da doença em todo o
mundo, sendo, portanto considerada um grande problema de saúde pública
em vários países onde incide. A OMS classifica a doença como
negligenciada, ocupando lugar de destaque dentre as doenças tropicais e
parasitárias. Isso torna importante o desenvolvimento de pesquisas e de
novas estratégias que possam contribuir com o controle da doença.
O tratamento, sobretudo nas formas tegumentares da doença, cuja
epidemiologia é bastante complexa, é essencial para o controle. Inúmeros
novos compostos têm sido estudados para o tratamento das leishmanioses.
No entanto, existe hoje uma carência de opções terapêuticas ou
tratamentos mais adequados para esta doença. Tal carência é o reflexo de
políticas públicas ineficientes, do escasso investimento da indústria
farmacêutica no desenvolvimento de novas drogas. Além disso, há um
desinteresse do mercado internacional no investimento para o
desenvolvimento de novas drogas eficazes contra doenças negligenciadas
de países em desenvolvimento e subdesenvolvidos.
A OMS sugere a busca de novos compostos que sejam eficazes e
que tenham baixa toxicidade para o homem. É necessário buscar
estratégias para solucionar esta questão, pois apesar dos avanços no
conhecimento das bases moleculares e celulares das patologias, o
desenvolvimento de novas drogas para o tratamento destas doenças
avança a passos lentos (Nwaka, 2003).
Desde o ano 2000, existe uma interação entre grupos de pesquisa do
Instituto de Ciências Exatas / ICEX (Departamento de Química) e do
Instituto de Ciências Biológicas / ICB (Departamentos de Parasitologia e
Fisiologia e Biofísica), no estudo, desenvolvimento e testes pré-clínicos de
drogas leishmanicidas. Além do desenvolvimento racional de novas
moléculas, o grupo desenvolve pesquisas com os fármacos já existentes,
no sentido de potencializar seu efeito leishmanicida e diminuir sua
toxicidade.
A partir da interação desses grupos de pesquisa foi desenvolvida a
molécula LA8-Sb, com características anfifílicas interessantes em
formulações para o tratamento tópico da leishmaniose cutânea. Dessa
33
forma, foi proposto um estudo envolvendo o octanoil N-metilglucamida
(LA8) e o complexo incorporado com antimônio pentavalente (LA8-Sb) in
vitro e in vivo, contra formas cutâneas de leishmaniose, em macrófagos
experimentalmente infectados e camundongos também experimentalmente
inoculados com Leishmania (L.) amazonensis.
34
2. D
3. d
3. O
bje
tivos
35
3.1. Objetivo Geral
Avaliar a eficácia do composto LA8-SbV in vitro e in vivo por via
tópica em camundongos BALB/c experimentalmente infectados com
Leishmania (Leishmania) amazonensis.
3.2. Objetivos Específicos
Avaliar a citotoxicidade in vitro dos compostos LA8 e LA8-SbV em
macrófagos peritoneais murinos.
Avaliar a atividade anti-amastigota in vitro dos compostos LA8 e LA8-SbV
em macrófagos peritoneais murinos experimentalmente infectados com
Leishmania amazonensis.
Avaliar a permeação percutânea de antimônio in vitro a partir do complexo
LA8-SbV, utilizando pele de camundongos Hairless, com e sem o estrato
córneo.
Avaliar a eficácia, através do acompanhamento do tamanho das lesões em
função do tempo e da determinação da carga parasitária por LDU, do
tratamento tópico com o LA8-SbV em camundongos BALB/c
experimentalmente infectados com L. (L.) amazonensis.
36
4. d
4.
Mat
eria
l e
Mét
od
os
37
4.1. Síntese dos complexos de alquilmetilglucamidas com antimônio
(Ferreira, 2010)
A síntese do complexo foi realizada no Departamento de Química da
UFMG e no Laboratório de biofísica de sistemas Nanoestruturados do ICB,
segundo protocolo descrito por Ferreira (2010).
4.2. Manutenção do parasito
Para a realização dos experimentos foi utilizada a cepa de referência
da Organização Mundial de Saúde: Leishmania (L.) amazonensis
(IFLA/BR/1967/PH8). Os parasitos foram isolados em meio de cultura a
partir de lesão de hamsters (Mesocricetus auratus), nos quais são mantidas
as cepas para uso do Laboratório de Biologia de Leishmania. As
promastigotas foram cultivadas em meio MEM suplementado com 10%
de soro fetal bovino, 50μg/mL de estreptomicina e 1000U/mL de penicilina
(MEM completo) e incubadas em estufa a 24±1°C em garrafas plásticas
de cultura celular de 50mL (Sarsted, USA).
4.3. Animais
Foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas de
idade, provenientes do Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO-ICB/UFMG) e
do Biotério do Centro de Pesquisas René Rachou da Fiocruz (CPqRR).
Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de
Parasitologia do ICB-UFMG, sobre condições adequadas de manejo
técnico, de acordo com o Colégio Brasileiro de Medicina Veterinária.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal (CETEA) – protocolo 206/2010 (Anexo 1).
38
4.4. Estudo da citotoxicidade in vitro.
4.4.1. Isolamento de macrófagos peritoneais
O ensaio de citotoxicidade foi realizado com macrófagos peritoneais
de camundongos BALB/c. Os macrófagos foram elicitados com injeção
intraperitoneal de 2mL de tioglicolato 3% (Gibco®
- Grand Island, NY,USA)
para indução de uma resposta inflamatória. Após três dias, os
camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical e foi obtido o
lavado da cavidade peritoneal com injeção de 10mL de meio RPMI 1640
(Cultilab, Brasil) e posterior recuperação do fluido (Zhang et al., 2008).
O lavado foi centrifugado a 2000g por 10 minutos (Centrifuga
HERMLE, modelo 2323 K), o sobrenadante descartado e o “pellet”
ressuspendido em meio RPMI 1640 suplementado 10% SFB, 50μg/mL de
estreptomicina e 1000U/mL de penicilina (RPMI 1640 completo). As células
foram quantificadas em câmara hemocitométrica de Neubauer com o auxílio
do corante vital azul de Trypan (Cascade BiologicalTM-USA) a 0,4%.
Apenas as células viáveis foram consideradas para cálculo do
inóculo. O número de células/mL da amostra foi estimado como a média
aritmética de duas contagens dos quatro quadrantes da câmara,
multiplicado pelo inverso da diluição da amostra e por 104 (fator de correção
da câmara).
4.4.2. Ensaio de citotoxicidade em macrófagos murinos (MTT
assay)
Para o ensaio de citotoxicidade foi utilizado o protocolo descrito por
Denizot & Lang, (1986), com modificações. Os macrófagos isolados
segundo descrito no ítem 3.4.1., foram então, incubados em placa de 96
poços (TPP®, Switzerland), com o volume de células ajustado para 3x105
macrófagos por poço em um volume final de 100μL de meio RPMI 1640
completo. As placas foram incubadas a 37ºC em estufa (Forma Scientific,
39
Inc. modelo 3154 S/N 31433) com atmosfera de 5% de CO2
por 1 hora, para
aderência dos macrófagos aos poços.
Após o período de incubação, as culturas foram visualizadas em
microscópio invertido (Olympus Optical CO – contraste de fase) para
observação dos macrófagos aderidos e, os poços foram então lavados com
meio RPMI 1640 previamente aquecido a 37ºC, para remover possíveis
células não aderentes.
Após as lavagens para retirada das células não aderidas e o
esgotamento dos poços, os macrófagos aderidos à placa foram incubados
na presença dos compostos LA8 (nas concentrações de 10.0, 7.5, 5.0, 2.5 e
1.0mM), LA8-Sb (nas concentrações de 1.0, 0.5, 0.25, 0.1 e 0.05mM de Sb)
e Glucantime® (nas concentrações de 332.6, 110.8, 22.1, 11.0, e 2.2mM de
Sb) diluídos em um volume final de 100μL de meio RPMI 1640 completo.
Como controle positivo do experimento, macrófagos aderidos foram
incubados apenas com RPMI 1640 completo, e como controle negativo,
macrófagos foram expostos à solução fixadora ISOTON (ácido cítrico 0,05
M, NaCl 0,12 M, formaldeído 0,5%, pH 7,2).
As culturas permaneceram expostas aos compostos durante 20
horas, incubadas a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2. Após os períodos
de incubação, foram adicionados aos poços 10μL da solução MTT (brometo
de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)]- 2,5-difeniltetrazólio) (Sigma®Co-USA) a
5mg/mL (50μg/poço). As placas foram novamente incubadas por 4 horas a
37ºC com atmosfera de 5% de CO2. Após incubação, o sobrenadante foi
removido e adicionou-se 100μL de dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma® Co -
USA.), para solubilizar os cristais de formazan formados. Posteriormente, as
placas foram submetidas à leitura em espectrofotômetro, onde a densidade
ótica foi lida em comprimento de onda de 570nm.
O valor final da densidade ótica de cada poço foi subtraído do valor
da densidade ótica de uma triplicata de poços contendo apenas DMSO.
Cada concentração dos compostos foi testada em triplicata em pelo menos
três experimentos independentes. Os resultados foram expressos em
gráficos de porcentagem, sendo os valores do eixo y relativos ao controle,
considerado como apresentando 100% de viabilidade.
40
4.4.3. Concentração citotóxica in vitro
A concentração citotóxica (CC50) foi definida como àquela que gerou
redução de 50% na absorbância, nos ensaios de MTT. Foi calculada por
análise de regressão “Sigmoidal fit”, utilizando o programa Origin® 6.0, a
partir dos dados obtidos em cada experimento.
4.5. Estudo da atividade leishmanicida in vitro.
4.5.1. Infecção experimental de macrófagos murinos com
Leishmania amazonensis.
Foram realizados ensaios da toxicidade in vitro dos compostos
anfifílicos LA8 e LA8-Sb sobre as formas amastigotas de L. amazonensis,
internalizadas em macrófagos peritoneais de camundongos.
Para a realização deste ensaio, os macrófagos murinos obtidos
conforme descrito no item 4.4.1., foram incubados em placas de 24 poços
(TPP®, Switzerland), contendo previamente em cada poço, uma lamínula
estéril, em formato circular, com 13 mm de diâmetro. A população de
células foi ajustada para 2x105
macrófagos por poço, em um volume final de
0,5mL.
As células foram incubadas em estufa a 37ºC, com atmosfera de 5%
de CO2 durante 1 hora, para que ocorresse a aderência dos macrófagos às
lamínulas. Após o período de incubação, com os macrófagos já aderidos, foi
feita a infecção destes com L. amazonensis.
Culturas de promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária
de crescimento foram centrifugadas três vezes em meio RPMI sem soro a
2800g por 10 minutos. O pellet foi ressuspenso em meio RPMI 1640
completo, as promastigotas foram quantificadas em câmara de Neubauer e
ajustadas para uma concentração correspondente a 2x106
células em
0,5mL, a serem incubadas por poço, o que corresponde a uma proporção
de 10 promastigotas por macrófago. O meio de cultura utilizado na
41
incubação dos macrófagos foi então substituído pelo meio de cultura
contendo as formas promastigotas.
A placa foi incubada durante 5 horas, em estufa a 34ºC e atmosfera
de 5% de CO2, para que houvesse a infecção dos macrófagos. Após este
período foram feitas três lavagens dos poços com meio RPMI 1640
completo, aquecido a 34ºC, para remover promastigotas não fagocitadas e
células não aderidas (Berman & Lee, 1984; Neal & Croft, 1984).
4.5.2. Exposição dos macrófagos infectados aos compostos
Os compostos foram previamente diluídos em meio de cultura RPMI
1640 completo, nas concentrações 1.0, 0.5 e 0.1mM para o LA8; 0.2, 0.1 e
0.05mM de Sb, para o LA8-Sb e nas concentrações de 10.0, 5.0, e 1.0mM
de Sb para o Glucantime®,
respeitando os valores de citotoxicidade de cada
droga, obtidos no ensaio de MTT em macrófagos. Cada concentração dos
compostos foi testada em triplicata em pelo menos três experimentos
independentes.
Após a terceira lavagem e o esgotamento completo dos poços que
continham as lamínulas, os compostos nas diferentes concentrações, foram
adicionados sobre as lamínulas com macrófagos infectados, em um volume
final de 500L por poço. Macrófagos não infectados também foram
expostos às mesmas concentrações das drogas.
As placas foram incubadas em estufa a 34ºC com atmosfera de 5%
de CO2 por 24 horas na presença dos compostos e na presença apenas de
RPMI 1640 completo como parâmetro de controle. Após o período de
incubação, as lamínulas foram retiradas dos poços, coradas por Panótico
rápido (Laborclin®) e montadas em lâminas permanentes com Bálsamo do
Canadá (Vetec®
- USA). As lâminas foram analisadas em microscópio ótico
com objetiva de imersão (1000X).
Foi feita a contagem de 300 macrófagos por lamínula da triplicata,
especificando-se o número de macrófagos infectados e número de
macrófagos não infectados. Desta forma, foram estabelecidas as taxas de
infecção dos macrófagos em cada lamínula da triplicata e, por fim, obteve-
se a média da taxa de infecção entre as triplicatas.
42
As médias dos percentuais de infecção de macrófagos, estabelecidas
na presença de cada um dos compostos, foram comparadas com a taxa de
infecção média dos controles sem droga.
4.5.3. Concentração inibitória in vitro
A concentração inibitória (CI50) foi definida como aquela que gerou
redução de 50% na taxa de infecção dos macrófagos in vitro. Foi calculado
por análise de regressão “Sigmoidal fit” utilizando o programa Origin 6.0®, a
partir dos dados obtidos em cada experimento.
4.5.4. Índice de Seletividade in vitro
O índice de seletividade (IS) foi calculado pela razão CC50 / CI50.
4.6. Estudo da atividade leishmanicida in vivo
4.6.1. Isolamento das promastigotas metacíclicas
O protocolo descrito a seguir foi adaptado a partir daquele descrito
por Späth & Beverley (2001).
As promastigotas foram cultivadas como descrito anteriormente. No
sexto dia de incubação, a cultura foi transferida da garrafa para um tubo
cônico de 50mL, lavando a garrafa duas vezes com PBS estéril para
remover os parasitos aderidos. O material transferido foi centrifugado a
2000g por 15 minutos a 4ºC.
Durante a centrifugação foi preparada uma solução de Ficoll 400
(Sigma Aldrich) a 10% (2mL de Ficoll 20% estéril, 1,6mL de água Milli-Q
estéril e 400L de PBS 10X estéril.).
A solução a 10% foi então pipetada sobre uma solução de Ficoll a
20%, ambas em um volume de 2mL cada, em um tubo cônico de 15mL,
montando assim um gradiente de concentração.
43
Após a centrifugação da cultura, o sobrenadante foi descartado e o
pellet ressuspendido e homogeneizado em 2mL de PBS estéril. Esta
solução foi então cuidadosamente aplicada sobre o gradiente de Ficoll e
centrifugada a 1150g por 10 minutos a 4ºC.
Após a centrifugação foi observada a formação de um anel branco
sobre a solução de Ficoll a 10%. Foi coletado o sobrenadante sobre o anel,
rico em promastigotas metacíclicas e ressuspenso para 10mL de PBS.
Após essa etapa o isolado foi lavado três vezes, centrifugando a 2000 g por
15 minutos a 4ºC, descartando o sobrenadante e adicionando-se 10mL de
PBS estéril.
Após a última lavagem, o sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido em 1mL de PBS. As formas metacíclicas foram contadas em
câmara de Neubauer e o volume do inóculo ajustado para 108 parasitos por
mL, equivalente a 106 parasitos em 10L, sendo esse o volume final do
inóculo por camundongo.
4.6.2. Infecção e tratamento dos camundongos
Foram inoculadas 1x106 promastigotas metacíclicas de L. (L.)
amazonensis (cepa IFLA/BR/1967/PH8) cultivadas como descrito no item
4.2 em 20 camundongos BALB/c (fêmeas, 6 a 8 semanas de vida). A
inoculação foi realizada por injeção subcutânea, ajustada a um volume final
de 10L de inócuo em PBS, na base da cauda, previamente tricotomizada.
Os camundongos foram divididos em quatro grupos de cinco animais:
um grupo controle ao qual se administrou apenas PBS. Um grupo controle
ao qual foi administrado Glucantime® por via intra-peritonial na dose de
200mg de SbV/kg uma vez ao dia. Em um dos grupos foi testado o
complexo LA8-SbV na concentração de 170mM (51,7mg de SbV/kg/12h) e
outro grupo ao qual foi testado LA8 na concentração de 510mM,
equivalente à concentração de LA8 no complexo. Nos grupos LA8 e LA8-
Sb, as formulações foram administrados por via tópica sobre toda a lesão
com o auxílio de seringas de 1mL, no volume de 50L/animal duas vezes
ao dia, por 21 dias.
44
O tratamento se iniciou aproximadamente no 45º dia após infecção,
quando as úlceras mediam em média 3mm de diâmetro, sendo esse valor
estimado pela média das maiores medidas da lesão, respectivamente
perpendicular e paralela à coluna vertebral do camundongo.
Os camundongos foram marcados e pesados individualmente
semanalmente, durante a execução do protocolo de tratamento, para avaliar
indícios de toxicidade sistêmica, causada pelas formulações. As lesões
foram medidas semanalmente a partir de uma semana antes do tratamento.
Foi considerado como diâmetro médio da lesão a média das medidas
da maior distância entre as bordas crânio-caudal e a maior medida do seu
eixo perpendicular. Os animais foram eutanasiados 24 horas após o término
do tratamento para quantificação da carga parasitária da lesão.
4.6.3. Quantificação da carga parasitária
A carga parasitária da lesão foi estimada utilizando-se o método descrito
por Stauber (1956).
Após eutanásia dos camundongos, as lesões foram removidas e foram
confeccionadas imprints da lesão. As lâminas foram coradas com corante
Panótico rápido (Laborclin®) e fotografadas em aumento de 40X em um
microscópio ótico. As imagens obtidas foram analisadas por um software de
análises de imagens assistido (Media Cybernetics Image Proplan 4.5).
Foi contado o número de amastigotas em relação a 1000 células do
hospedeiro e o resultado foi multiplicado por um fator de correção (2x104) e
pelo peso da lesão. Os resultados foram expressos como número de
amastigotas na lesão.
4.7. Estudo da permeação percutânea in vitro
Para o estudo da permeação percutânea dos compostos testados
foram utilizadas células de difusão de Franz, constituídas por um
compartimento superior e um inferior com volume aproximado de 6mL
(Figura 5). A membrana utilizada foi a pele do dorso de camundongos sem
pêlo (Hairless, linhagem HSR/J), sendo os experimentos realizados com
45
pele íntegra e na ausência do estrato córneo, representando uma lesão
ulcerada.
Para obtenção das peles, os camundongos sem pêlo (machos de 8
semanas, pesando de 25 a 30g), foram eutanasiados por deslocamento
cervical. O dorso foi limpo com água destilada e a pele retirada. Após
remoção do tecido adiposo subcutâneo com o auxílio de bisturi e inspeção
visual, a pele foi colocada nas células de Franz.
O compartimento receptor foi preenchido com o tampão HEPES 5mM
/NaCl 0,15M pH 7,4, ficando em contato com a pele pelo período de 1 hora
para promover equilíbrio do sistema. Após este período, o tampão foi
retirado e o compartimento receptor novamente preenchido com tampão.
Foram aplicados 100L sobre a superfície da pele de camundongo hairless
os compostos LA8-Sb 0,2M diluído em água destilada estéril e uma
formulação de antimoniato de meglumina (AM) na concentração de 0,35M
previamente incorporado em gel natrosol a 2% (adicionou-se um volume de
gel de natrosol a 4% a um volume igual de AM a 0,7M, à temperatura
ambiente e homogeneizou-se em vórtex por cerca de 20 minutos). As
formulações foram espalhadas com bastão de vidro, garantindo desta forma
homogeneidade da distribuição das formulações sobre a pele.
Durante o procedimento, o fluido receptor foi mantido a 37oC e
agitado continuamente com uma barra magnética. O compartimento doador
foi mantido aberto, permitindo a evaporação da fase aquosa volátil das
formulações mimetizando o processo como ocorreria in vivo (condição não
Figura 5 - Representação esquemática de uma Célula de Difusão de Franz.
46
oclusiva). Em diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6 e 8 horas) após a
aplicação das formulações, o fluido receptor foi coletado e o compartimento
receptor novamente preenchido com um novo tampão.
A concentração de antimônio nos fluidos coletados em diferentes
tempos foi determinada por espectroscopia de absorção atômica, em um
espectrômetro Perkin Elmer® AAnalyst 600 (GFAAS), equipado com
plataforma de aquecimento do tipo forno de grafite e corretor Zeeman de
background, do Laboratório de Biofísica de Nano Sistemas/Departamento
de Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG.
Foram realizados dois estudos de permeação percutânea in vitro, a
partir de formulações do LA8-Sb diluído em água deionizada e de
antimoniato de meglumina incorporado ao gel de natrosol (NatAM). O
primeiro estudo utilizou pele íntegra, e o segundo a pele com o estrato
córneo removido.
4.8. Análises estatísticas
A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa
GraphPad Prism versão 5.0 e Origin versão 6.0.
Para calcular os valores de IC50 e CC50, foram feitas regressões não
lineares das médias dos valores encontrados para cada concentração em,
pelo menos, três experimentos independentes.
Para a análise da evolução da lesão dos camundongos, foi utilizado o
teste Two-way repeated measure ANOVA, seguido pelo teste de Bonferroni.
A média dos pesos dos animais foi avaliada para cada grupo por análise de
variância (ANOVA) com delineamento em parcelas subdivididas.
Para comparar os valores da absorção percutânea in vitro foi usado o
teste One-way ANOVA seguido do teste de Tukey’s.
Em todos os métodos, as diferenças foram consideradas
estatisticamente significativas quando o valor de p obtido fosse menor que
0,05 (p < 0,05). Os testes paramétricos foram utilizados somente quando os
dados apresentavam distribuição gaussiana, determinada pelo teste
Kolmogorov-Smirnov (Soares & Siqueira, 2002; Sampaio, 2007).
47
5. d
5.
Res
ult
ados
48
5.1. Curva de crescimento
As formas promastigotas de Leishmania amazonensis foram cultivadas
como descrito no item 4.2. Para a realização da curva de crescimento foi
utilizada uma cultura na segunda passagem, de um isolado de L. amazonensis
de hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados.
Foi observado um grande aumento do número de parasitos na fase
logarítmica, até o terceiro dia de incubação, estabilizando-se a partir do quarto
dia. No quinto dia foi observado um grande número de formas metacíclicas
(Figura 6).
0 1 2 3 4 5 6 70
1.0107
2.0107
3.0107
4.0107
Tempo (dias)
Nú
mero
de
pro
masti
go
tas/m
L
Figura 6 - Curva de crescimento para Leishmania amazonensis (cepa PH8) em meio
MEM completo. Os desvios padrões estão representados por barras verticais.
Para a infecção dos camundongos do estudo in vivo foi utilizada cultura
no sexto dia de crescimento, rica em formas metacíclicas isoladas conforme
descrito anteriormente.
Para os estudos in vitro foram utilizadas as formas promastigotas
presentes na fase estacionária da curva, especificamente, no quinto dia.
49
5.2. Citotoxicidade em macrófagos murinos
As Tabelas 3, 4 e 5 mostram as médias dos resultados obtidos nos
testes de viabilidade de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c na
presença do ligante LA8, o complexo LA8-Sb e o Glucantime. Os dados foram
expressos em porcentagem de viabilidade celular relativa, tendo como
referência, a média dos resultados obtidos na leitura dos poços controles, onde
não foram aplicadas formulações, considerando as mesmas como 100% de
viabilidade relativa (Tabelas 1 a 3).
O valor da concentração citotóxica para 50% dos macrófagos (CC50) foi
determinado para o ligante LA8, o complexo LA8-Sb e o Glucantime, através
do método citado no item 4.4.2.
O Glucantime apresentou um valor de CC50 de 26,31mM de Sb (tabela 2,
figura 8). O ligante LA8 e o complexo LA8-Sb, por outro lado, mostraram um
valor de CC50 de 4,89mM e 0,26mM de Sb (equivalente a 0,78mM de LA8)
respectivamente (Figura 7).
Tabela 1: Percentagem média de macrófagos peritoneais de BALB/c viáveis, em
diferentes concentrações de Glucantime, após 24 horas de exposição.
Concentração de SbV
(mM de Sb)
Viabilidade Celular (%)
Média Desvio padrão
332,6 43,92 31,40
110,8 41,89 8,65
22,1 76,05 7,96
11 88,43 9,49
2,2 98,29 9,25
Tabela 2: Percentagem média de macrófagos peritoneais de BALB/c viáveis, em
diferentes concentrações de LA8-Sb, após 24 horas de exposição.
Concentração de SbV
(mM de Sb)
Viabilidade Celular (%)
Média Desvio padrão
1 2,53 1,10
0,5 3,49 1,61
0,25 56,21 9,45
0,1 99,24 10,81
0,05 104,84 8,32
50
Tabela 3: Percentagem média de macrófagos peritoneais de BALB/c viáveis, em
diferentes concentrações de LA8, após 24 horas de exposição.
Concentração de LA8
(mM)
Viabilidade Celular (%)
Média Desvio padrão
10 15,35 7,87
7,5 20,87 9,38
5 46,10 7,84
2,5 74,98 13,23
1 86,62 10,84
Figura 7 - Curvas de viabilidade de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c em
função da concentração de Glucantime, LA8 (octanoil-N-metilglucamida) e LA8-Sb
(octanoil-N-metilglucamida+Sb). Os dados mostrados representam a média de 3
experimentos independentes.
Os resultados obtidos indicam que o complexo LA8-Sb é cerca de 6
vezes mais tóxico para macrófagos que o ligante LA8, quando comparamos as
51
concentrações do ligante em ambos os compostos. A atividade citotóxica do
complexo é cerca de 100 vezes maior que atividade obtida para o Glucantime
neste ensaio, quando comparamos as concentrações de antimônio presentes
em ambas as formulações.
5.3. Atividade anti-amastigota in vitro
Procuramos determinar o valor da concentração capaz de reduzir em
50% o número de macrófagos parasitados (CI50) no modelo de macrófagos
infectados com Leishmania amazonensis, para o ligante LA8, o complexo LA8-
Sb e Glucantime, através do método citado no item 4.5.2.
As concentrações utilizadas foram determinadas selecionando-se
valores abaixo daqueles que permitiam uma viabilidade celular acima de 80%,
nos testes de citotoxicidade em macrófagos.
Para um estudo preliminar da atividade leishmanicida do LA8 e do LA8-
Sb foram selecionados apenas três concentrações a serem testadas como
citado no material e métodos. No entanto, como não foi observada atividade
anti-amastigota dos compostos testados, em concentrações muito próximas
daquelas tóxicas para macrófagos, optamos por não realizar um novo teste
com outras concentrações.
O Glucantime apresentou atividade leishmanicida nas concentrações de
10 e 5 mM de Sb, quando comparado ao grupo controle. Os compostos LA8 e
LA8-Sb não apresentaram atividade nas concentrações testadas (Figura 8).
Não foram observados macrófagos viáveis na concentração de 0,2 mM
do complexo LA8-Sb, sendo observadas raras amastigotas ou grumos de
amastigotas, muitas delas não apresentando a morfologia clássica do parasito
(Figura 9).
Devido ao fato das concentrações utilizadas neste teste para o ligante e
o complexo serem muito próximas das concentrações citotóxicas, não foi
possível determinar o índice de seletividade desses compostos.
52
10mM 5mM 1mM 1mM 0,5mM 0,1mM 0,2mM 0,1mM 0,05mM
0
50
100
Glucantime LA8 LA8-Sb
Controle
*
*
Célu
las p
ara
sita
das (
%)
Figura 8 - Atividade leishmanicida in vitro dos compostos LA8, LA8-Sb e Glucantime em
diferentes concentrações no modelo de macrófagos peritoneais de BALB/c, infectados
com formas promastigotas de fase estacionária de Leishmania amazonensis. Os dados
são mostrados como a percentagem média de células parasitadas com relação ao
controle não tratado. Os asteriscos evidenciam diferenças estatisticamente significativas
em comparação ao controle (p<0,001)
Figura 9 - Imagens de microscopia ótica das lâminas do teste de atividade anti-
amastigota in vitro com as maiores concentrações utilizadas no teste para cada
composto. Grupo controle (A), Glucantime 10,0mM (B), LA8-Sb 0,2mM (C) e LA8 1,0mM
(D). Aumento de 40x.
A CI50 calculada para o Glucantime foi de 4,21mM de Sb, (Figura 10), e
o índice de seletividade estimado neste experimento foi de 6,2.
53
Figura 10 - Curva de inibição do número de macrófagos peritoneais infectados em
função da concentração de Glucantime. Os valores são mostrados como a média de 3
experimentos independentes.
5.4. Permeação percutânea de Sb
A permeação média de antimônio a partir da formulação NatAM nestas
condições descritas no item 4,8, após oito horas de exposição foi de 0,33 ±
0,26% e 14,57 ± 1,08%, respectivamente. Para o composto LA8-Sb, estes
valores foram 0,008 ± 0,003% e 4,27 ± 2,49%, respectivamente (Figura 11).
Foi observada uma baixa permeação de antimônio em ambas as
formulações testadas, após oito horas de exposição, quando a pele
apresentava o estrato córneo. Entretanto, a permeação de Sb para ambos as
formulações foi maior na ausência de estrato córneo (p < 0,05) (Figura 12).
54
NatAM LA8-Sb NatAM LA8-Sb
0.010.020.030.200.350.50
5
10
15
Pele íntegra Ausência de estrato córneo
20
**
*
**
% d
e S
b p
erm
eado
Figura 11 - Percentual da permeação cutânea de Sb através da pele de camundongos
Hairless, após oito horas de exposição às formulações na presença e na ausência de
estrato córneo. Os asteriscos representam diferença estatística significante (* = p < 0,05
e ** = p < 0,001) (n=3).
A formulação NatAM apresentou uma taxa de permeação maior que o
LA8-Sb na presença de estrato córneo (p < 0,05) após 8 horas (figura 12-A). O
mesmo foi observado na ausência de estrato córneo (p < 0,001) (Figura 12-B).
Na ausência de estrato córneo, destaca-se a liberação sustentada de Sb a
partir da formulação LA8-Sb, representada pela inclinação da curva
visualmente menor que a de NatAM.
55
0 2 4 6 8 100.0
0.2
0.4
0.6NatAM
LA8-Sb
A
Horas
% d
e S
b p
erm
eado
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20NatAM
LA8-Sb
B
Horas
% d
e S
b p
erm
eado
Figura 12 - Permeação percutânea de antimônio em função do tempo, em células de
difusão de Franz usando pele íntegra de camundongos Hairless (A) ou na ausência do
estrato córneo (B). Os dados representam a média (n=3) e os desvios-padrão são
representados por barras verticais.
56
5.5. Atividade anti-leishmania in vivo
A eficácia in vivo dos compostos LA8 e LA8-Sb foi avaliada em
camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. O tratamento foi
iniciado 45 dias após a infecção através de aplicação tópica das formulações
na lesão conforme descrito no item 4.7.2. Foram determinados dois
parâmetros: diâmetro médio da lesão e carga parasitária estimada pela técnica
de LDU.
O peso dos camundongos foi aferido para avaliação da toxicidade
sistêmica do composto (Tabela 4). Não foi observada alteração nas médias dos
pesos dos camundongos tratados com nenhuma das formulações utilizadas no
ensaio in vivo.
Tabela 4 - Avaliação do peso médio de camundongos BALB/c infectados com L. (L.)
amazonensis tratados com Glucantime, LA8 e LA8-Sb. Os valores apresentados se
referem às médias e desvio padrão de dois experimentos independentes (n=5).
Não foi observada redução do tamanho da lesão dos camundongos
tratados com o ligante, quando comparados com o grupo controle no 21º dia de
tratamento. Entretanto, foi observada diminuição do diâmetro médio da lesão
dos camundongos tratados com o Glucantime, a partir do 14º dia de tratamento
e com o complexo LA8-Sb a partir do 21º dia de tratamento (Figuras 13 e 15).
Quando comparamos a evolução da lesão em cada grupo, é observada
uma diminuição no tamanho da lesão com o passar do tempo no grupo tratado
com Glucantime. Os grupos controle e LA8 apresentaram um aumento do
tamanho da lesão como esperado. Por outro lado, o grupo tratado com o
complexo LA8-Sb não apresentou diferença significativa no tamanho da lesão
com relação ao tempo (Figura 15).
Tempo de tratamento (dias)
Controle Glucantime LA8 LA8-Sb
0 20,94 ± 0,67 20,08 ± 1,40 19,58 ± 2,01 19,32 ± 1,15
7 21,50 ± 0,90 20,84 ± 2,04 20,26 ± 0,90 19,42 ± 1,17
14 21,20 ± 0,92 20,86 ± 2,12 20,52 ± 0,98 20,06 ± 1,06
21 20,38 ± 0,25 20,56 ± 2,13 20,66 ± 1,20 20,06 ± 1,29
57
0 7 14 210.0
0.5
1.0
1.5Controle
Glucantime
LA8
LA8-Sb*
** **
Tempo (dias)
Diâ
metr
o m
éd
io (
mm
)
Figura 13 - Diâmetro médio da lesão em função do tempo de tratamento de
camundongos BALB/c tratados com Glucantime (200mg Sb/Kg/IP/24h por 21 dias), LA8-
Sb (51,7mg Sb/kg/12h) e LA8 (mesma concentração de LA8 no complexo LA8-Sb). Os
desvios padrão estão representados por barras verticais. Os asteriscos representam
diferença significativa com relação ao grupo controle (*p < 0,05 e **p<0,01)(n=5).
Controle Glucantime LA8 LA8-Sb0
2.0109
4.0109
6.0109
8.0109
*
*,a
Carg
a p
ara
sit
ári
a
Figura 14 - Avaliação da eficácia da formulação tópica de LA8-Sb em camundongos
infectados com L. amazonensis. Os dados são mostrados como as cargas parasitárias
médias e os desvios padrão determinados após 21 dias de tratamento pela técnica de
LDU. Camundongos BALB/c foram tratados com Glucantime (200mg Sb/Kg/24h por via
IP), LA8-Sb (51,7mg Sb/kg/12h) e LA8 (mesma concentração de LA8 no complexo LA8-
Sb). Grupos marcados com asterisco diferem do grupo controle pelo teste ANOVA (p
<0,001). O grupo marcado com o “a” difere do Glucantime ao nível de significância de
5% (p < 0,05) (n=5).
58
Os imprints das lesões mostraram a presença de macrófagos, em sua
maioria, infectados por Leishmania, e raros linfócitos, neutrófilos e eosinófilos,
além de inúmeras amastigotas extracelulares.
A carga parasitária estimada pela técnica de LDU mostrou uma
significativa diminuição do número de parasitos nos grupos tratados com
Glucantime e LA8-Sb (p < 0,01) com relação ao grupo controle não tratado.
Também foi observada diferença estatística entre os grupos LA8 e LA8-Sb (p <
0,05).
Figura 15 - Avaliação do efeito do tratamento em camundongos BALB/c fêmeas
infectadas com L. (L.) amazonensis. As imagens representam o mesmo animal em cada
grupo.
Dias de
tratamento Controle Glucantime LA8 LA8-Sb
0
7
14
21
59
6.
Dis
cuss
ão e
Co
ncl
usõ
es
60
A quimioterapia ainda constitui o pilar para o controle de doenças que,
como as leishmanioses, não dispõem de vacinas eficazes (Kouni, 2003). As
leishmanioses são consideradas doenças negligenciadas e foram
caracterizadas pela OMS como doença emergente e de difícil controle. A OMS
propõe a erradicação de leishmaniose no mundo até 2015, dentro do plano
global para o combate de doenças tropicais negligenciadas – 2008 – 2015
(WHO, 2011).
O arsenal quimioterapêutico para o tratamento das leishmanioses é
pequeno, sendo os antimoniais pentavalentes as drogas de primeira escolha
para o tratamento. Além da elevada toxicidade dos fármacos de primeira
escolha, as vias de administração são muito desconfortáveis para os pacientes
e em algumas situações são contraindicados. Além disso, a resistência aos
antimoniais, tem se apresentado como um problema na quimioterapia da
doença, sobretudo no estado de Bíhar, na Índia, mas também em outras partes
do mundo (Farault-Gambarelli et al., 1997; Rojas et al., 2006;Sundar et al.,
2001).
Tendo em foco os problemas ressaltados, existem dificuldades que
ainda devem ser consideradas para o desenvolvimento de novos fármacos: o
parasito se localiza dentro de fagolisossomas de macrófagos, o que dificulta a
ação potencial de fármacos. Novas moléculas devem ter baixa toxicidade e
novas estratégias, particularmente na escolha dos alvos e novas vias de
administração, devem ser consideradas.
Como descrito anteriormente, a proposta de estudar o LA8 complexado
com o antimônio pentavalente, faz parte de um estudo mais amplo do Grupo de
Desenvolvimento de Compostos Leishmanicida e do Grupo Interdisciplinar de
Drogas Leishmanicida da UFMG (ICEX/ICB), que nos últimos anos tem
estudado vários compostos complexados ao SbV.
Um estudo realizado por Ferreira (2010) avaliou o coeficiente de partição
óleo/água do complexo LA8-Sb, demonstrando que o seu balanço
hidrofóbico/hidrofílico caracteriza este novo complexo como sendo anfifílico,
sugerindo uma maior facilidade para atravessar membranas e tecidos
biológicos.
A incorporação de antimônio em macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c foi avaliada pela equipe do Laboratório de Biofísica de
61
Sistemas Nanoestruturados/ Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG,
e mostrou que essas células, quando incubadas por 4 horas com o complexo,
foram capazes de incorporar mais antimônio do que quando se utilizou o
Glucantime ou o antimoniato de potássio (KSb(OH)6) na mesma concentração
de Sb (dados não publicados).
Os nossos resultados mostram que o complexo LA8-Sb apresentou uma
elevada toxicidade (CC50=0,26mM de Sb) para macrófagos murinos, cerca de
100 vezes maior que a do Glucantime quando comparada à concentração de
antimônio em ambos os compostos, e 6 vezes mais tóxico que o ligante,
quando comparada à concentração da molécula LA8.
O conjunto desses dados sugere um papel central do SbV na
citotoxicidade do complexo LA8-Sb. Apesar do antimônio pentavalente ser
menos tóxico que a forma trivalente (Berman et al., 1997), ele pode ser
reduzido à sua forma trivalente no organismo (Burguera et al.,1993; Petit,1990).
Acredita-se que a redução pode estar ligada ao metabolismo dos tióis, uma vez
que a glutationa pode promover a redução do SbV a SbIII no antimoniato de N-
metilglucamina (AM), em condições próximas às fisiológicas (Frézard et al.,,
2001).
Com base nos resultados obtidos nos experimentos citados, foi
levantada a hipótese de que o complexo LA8-Sb poderia atuar como uma “pró-
droga”, sendo ativa contra formas amastigotas após a metabolização no tecido.
Os valores encontrados nos testes de citotoxicidade (figura 8) e de
atividade anti-amastigota para o Glucantime (figuras 9 e 11) no presente
estudo, bem como o índice de seletividade encontrado (IS = 6,2) diferem dos
encontrados na literatura. O modelo utilizado neste trabalho foi o sistema de
macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c infectados com formas
promastigotas em fase estacionária de crescimento, sendo internalizadas e
diferenciadas em formas amastigotas. Este modelo foi utilizado por outros
autores, como Sereno & Lemesre, (1997), Morais-Teixeira et al., (2008) e
Pinheiro et al., (2011).
Nesse trabalho obtivemos um valor de CI50 cerca 22 vezes maior que o
encontrado por Morais-Teixeira et al., (2008), quando utilizado um modelo
experimental semelhante. No entanto, foi observado que no trabalho citado as
temperaturas de incubação foram diferentes das utilizadas nesse trabalho, uma
62
vez que nos nossos experimentos, ocorria morte celular da cepa quando
incubadas a 37ºC.
Em resumo, não há um modelo padronizado para os testes de novas
moléculas. Os trabalhos utilizam desde diferentes cepas do parasito, diferentes
formas evolutivas, crescidas em diferentes meios de cultura, além de diferentes
linhagens de macrófagos, o que inviabiliza em muitos casos, a comparação
entre os índices de seletividade encontrados (Gupta, 2011; Borborema et al.,
2011; Callahan et al., 1997; Morais-Teixeira et al., 2008; Torres-Santos et al.,
2004 ; Grecco et al., 2012). Novos modelos têm sido propostos para screening
de novas moléculas, utilizando parasitos transfectados com genes que
expressam proteínas fluorescentes, mas esses modelos ainda não foram bem
estabelecidos e, portanto, pouco difundidos (Pulido, 2012; Siqueira-Neto et al.,
2010; De Muylder et al., 2011).
Além disso, muitos destes trabalhos utilizam formas promastigotas como
modelo de screening (Tahghighi, 2012; Sanchez-Moreno, 2012; Fouladvand,
2011, Tariku, 2011). No entanto, considerando as diferenças entre as formas
evolutivas de Leishmania, principalmente no que tange as diferenças
proteômicas (Leifso, 2007, Brotherton, 2010), o modelo utilizando parasitos
internalizados em macrófagos pode ser considerado uma metodologia
preferencial (Croft, 1986), embora esse seja trabalhoso, caro, não
automatizável, (Gupta, 2011) e que muitas vezes não reflete a atividade in vivo.
Acreditamos que as diferenças encontradas nos valores de
citotoxicidade desse trabalho, podem estar relacionadas com os diferentes
modelos experimentais e protocolos utilizados pelos vários autores.
Nos experimentos de atividade anti-amastigota in vitro, foi observada
ainda, a morte celular dos macrófagos infectados, expostos à concentração de
0,2mM do complexo por 72 horas. Uma dose menor e relativamente próxima,
0,1mM, apresentou uma menor toxicidade, mas foi incapaz de reduzir a
infecção in vitro (figura 8).
Os resultados indicam que o complexo apresenta uma toxicidade
elevada para macrófagos peritoneais murinos, e não apresenta atividade
seletiva contra as formas amastigotas de Leishmania amazonensis, em
concentrações abaixo da sua concentração citotóxica e no tempo de 72 horas.
63
Com relação ao estudo da atividade in vivo, foi observada diminuição do
diâmetro médio da lesão dos camundongos tratados com o Glucantime IP, a
partir do 14º dia de tratamento e do complexo LA8-Sb no 21º dia de tratamento
(figuras 13 e 15). Por outro lado, não foi observada redução do tamanho da
lesão dos camundongos experimentalmente infectados e tratados com o ligante
LA8, quando comparados com o grupo controle. Não houve indícios de
toxicidade sistêmica durante os tratamentos, quando se utilizou como
parâmetro o peso médio dos camundongos tratados (tabela 4).
A carga parasitária dos camundongos, avaliada pelo método de LDU
(Stauber, 1956), mostrou que houve uma redução significativa no número de
parasitos do grupo tratado com o Glucantime e LA8-Sb, quando comparado
como grupo controle (figura 14). Esses resultados associados com os obtidos
na avaliação do tamanho da lesão, sugerem que a formulação tópica de LA8-
Sb apresenta uma atividade anti-Leishmania in vivo, tal como demonstrado nos
ensaios realizados previamente por via oral.
No presente trabalho, investigamos também a permeação percutânea in
vitro de antimônio a partir da formulação tópica de LA8-Sb, que foi comparada
àquela do antimoniato de meglumina hidrofílico incorporado em gel de natrosol
(Nat-AM). A formulação LA8-Sb promoveu uma taxa de permeação
significativamente menor que o Nat-AM, tanto na presença quanto na ausência
de estrato córneo.
Vale ressaltar que a pele sem estrato córneo representa uma condição
fisiopatológica mais próxima àquela de uma lesão cutânea causada por
Leishmania amazonensis. Nessa condição, a menor taxa de permeação
percutânea de antimônio a partir da formulação LA8-Sb indica uma liberação
mais sustentada do metal, podendo contribuir a uma ação mais prolongada.
O fato da permeação do LA8-Sb estar significativamente aumentada
após retirada do estrato córneo sugere também a retenção do complexo no
estrato córneo quando a formulação é aplicada em pele intata. As propriedades
de barreira do estrato córneo são atribuídas à composição dos lipídeos
presentes, ao arranjo estrutural desta matriz intercelular e ao envelope lipídico
que circunda as células (Moser et al., 2001). A maior retenção do complexo
LA8-Sb no estrato córneo poderia ser explicada por uma interação do
64
complexo com alguns dos constituintes dessa barreira. Entretanto, outras
formulações contendo o complexo podem potencializar a absorção de Sb.
A observação do aumento de permeação percutânea de antimônio a partir do
Nat-AM, após retirada do estrato córneo, está de acordo com os resultados de
Martins et al (2006) que avaliaram a absorção percutânea de AM complexado
ou não à -ciclodextrina (-CO),
Um estudo realizado pela equipe do Laboratório de Biofísica de
Sistemas Nanoestruturados/ Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG,
avaliou a atividade in vivo de LA8-Sb contra Leishmania infantum (cepa BH46),
em camundongos BALB/c fêmeas tratadas por via oral na dose de 200mg
Sb/Kg/12h. Neste estudo, foi observada uma diminuição da carga parasitária
no fígado. Observou-se em um estudo concomitante que uma dose oral de 600
mM do ligante, duas vezes ao dia, foi letal para 50% dos camundongos em 10
dias de tratamento (dados não publicados).
Foi mostrado ainda que o complexo facilita a absorção de antimônio
quando administrado por via oral a camundongos swiss, permitindo uma
absorção até nove vezes maior de Sb, quando comparado à absorção pela
administração oral de AM (Ferreira, 2010).
Os resultados obtidos nesse experimento e nos demais trabalhos dos
grupos de pesquisa reforçam a hipótese de que o LA8-Sb possa atuar como
uma “pró-droga”, sendo ativa após uma metabolização no organismo. Isso
explicaria a diferença entre sua atividade in vitro e in vivo. Novos testes foram
conduzidos para avaliação dessa hipótese.
Como perspectivas para novos ensaios, o grupo pretende testar
novamente a formulação utilizando métodos moleculares para quantificação
mais precisa da carga parasitária, além de um acompanhamento dos animais
tratados após um período de tratamento.
Apesar do tratamento por via tópica com a formulação do complexo LA8-
Sb ter mostrado uma atividade anti-leishmania e uma discreta diminuição do
crescimento da lesão, novos estudos são necessários para melhor avaliação
do complexo, sendo proposta avaliação de novas formulações..
Estudos recentes têm mostrado o potencial terapêutico de associações de
fármacos com eficácia já comprovada. Esses estudos mostraram que as
associações podem acelerar a resolução das lesões e potencializar a eficácia
65
do tratamento diminuindo suas doses e consequentemente sua toxicidade
(Aguiar et al., 2009; Da Silva et al., 2012). Pretende-se também testar as
possíveis associações do complexo com tratamentos convencionais,
diminuindo assim as doses e a toxicidade do tratamento como um todo.
O presente estudo permite concluir que o complexo anfifílico de
antimônio LA8-Sb apresenta atividade anti-leishmania após aplicação tópica
em modelo murino de leishmaniose cutânea causada por L. amazonensis,
apesar da aparente ineficácia em modelo in vitro de macrófagos infectados.
Novos estudos são necessários para elucidação do modo de atuação da nova
formulação bem como sua otimização.
66
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An
exos
80
Anexo 1