Graduação em Biotecnologia Disciplina de Técnicas Instrumentais Prof. Fabricio Rochedo...
Transcript of Graduação em Biotecnologia Disciplina de Técnicas Instrumentais Prof. Fabricio Rochedo...
Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Técnicas Instrumentais
Prof. Fabricio Rochedo Conceiçã[email protected]
11 de maio de 2012
Espectrofotometria
Espectrofotometria visível e ultravioleta
• Método analítico baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética
• Permite identificar e quantificar compostos orgânicos e inorgânicos
• Região ultravioleta – 200 a 400 nm
• Região visível – 400 a 800 nm
Aplicações• Esta técnica é muito usada em laboratórios de
controle de qualidade (indústrias), pesquisa e de análises clínicas e toxicológicas
• Em biotecnologia: - Proteômica - Genômica - Transgenia - Expressão de proteínas recombinantes...
*** Análise de proteínas, DNA e RNA
Absorção de Radiação
• Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou absorção
Absorção de Radiação
• Os comprimentos de onda que uma certa substância absorverá são característicos da sua estrutura, diferindo de substância para substância. Exemplos:
– DNA e RNA = 260 nm – Proteínas = 280 nm– Células bacterianas = 600 nm– Benzeno = 255 nm ...
Lei de Lambert-Beer
• Através dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução
– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei.
– A radiação incidente deve ser monocromática
Lei de Lambert-Beer
• I0 = intensidade da luz incidente
• I1 = é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio
• l = é a distância que a luz atravessa
A = - log10 TA = - log10 T
T = I1 / I0T = I1 / I0
Transmitância• É a intensidade de luz remanescente após passar por
uma amostra de matéria.• 0 a 100%
Absorbância• É a capacidade do material em absorver radiações de
comprimento de onda específico. • 0 a 2
ENFIM, a lei de Lambert-Beer permite determinar a concentração de uma substância em função da absorção de luz
Espectrofotômetro
• É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em função de um comprimento de onda específico.
Diagrama de um espectrofotômetro
Fontes luminosas mais comuns
• Luz UV – Lâmpada de gás hidrogênio ou deutério– Mercúrio
• Luz Visível – Tungstênio
Cubetas
• Espectrofotometria de Luz Visível– Cubeta de Vidro ou Plástico
• Espectrofotometria de Luz Ultravioleta– Cubeta de Quartzo
Dicas• Localização do espectrofotômetro - Bancada estável e exclusiva (se possível) - Longe de fontes eletromagnéticas (rádio, microondas...)
• Ligar 30 mim antes do uso
• Cubetas (tipo e manuseio)
• Calibração
Obrigado!