Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje...
Transcript of Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje...
![Page 1: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/1.jpg)
HbA1c_2014 1
Glykovaný hemoglobin A1c
(HbA1c)
Petr Breinek
![Page 2: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/2.jpg)
2
Rutinní a efektivní nástroj sledování
průběhu DM (diabetes mellitus)
• Ukazatel dlouhodobé hodnoty
koncentrace glukózy v krvi (kompenzace
diabetu)
• Diagnostické kritérium DM
• Kontrola terapie
• Včasné odhalení hrozících komplikací
Klinický význam stanovení HbA1c
![Page 3: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/3.jpg)
3
Glykace
Glykace je neenzymové navázání
(adice) cukru na proteiny za vzniku
fruktosaminu.
Glykovaný albumin vzniká navázáním cukru
na albumin
![Page 4: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/4.jpg)
4
Faktory ovlivňující
neenzymovou glykaci proteinů
• Koncentrace sacharidů a proteinů a
jejich kolísání
(koncentrace proteinů v krvi relativně
konstantní, rychlost glykace je úměrná
koncentraci sacharidů)
• Doba expozice
• Biologický poločas daného proteinu
• Teplota
![Page 5: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/5.jpg)
5
Glykace hemoglobinu
- rychlá tvorba labilní Schiffovy báze (aldimin)
-- pomalý Amadoriho přesmyk za vzniku stabilního
ketoaminu (ireversibilní)
-- koncentrace závisí na koncentraci glukózy a
poločasu života erytrocytů
- H 2 O
Glukosa Aldimin (Schiffova báze)
Amadoriho přesmyk
Ketoamin
Hb-N C H
C
C
C
C
C H 2 OH
H
OH
OH
H
H
HO
H
2
O
Hb-N C H
C
C
C
C
C H 2 OH
OH
H
OH
OH
H
H
H
HO
Hb-NH 2 + O C H
C
C
C
C
C H 2 OH
OH
H
OH
OH
H
H
H
HO
![Page 6: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/6.jpg)
6
Názvosloví
HbA1c
βN-1-deoxyfruktosyl hemoglobin
DOF hemoglobin
Hemoglobin beta chain(Blood)-N-(1-
deoxyfructos-1-yl)hemoglobin beta chain
![Page 7: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/7.jpg)
Hemoglobin (Hb) Složená bílkovina – hemoprotein
• Bílkovina (globin)
• Hem
Tato transportní molekula plynů tvoří 95% objemu
krvinky
N
N
N
N
Fe2+
Složen ze 4 podjednotek:
2 α + 2 ß = Hb A (95%)
2 α + 2 = Hb A2 (2-3%)
2 α + 2 = Hb F (<2%)
![Page 8: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/8.jpg)
8
Hemoglobiny
Hb
HbA0 HbA1
HbA1a HbA1b HbA1c
HbA (ßß)
HbA2 ()
HbF ()
95% <2% 2-3%
Normální
Hb u dospělých Fetální Hb
Neglykovaný Glykovaný
94%
• hlavní glykovaný Hb
• > 20 let využíván pro
kontrolu glykémie
5%
![Page 9: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/9.jpg)
9
HbA0
HbA1c
Val His Leu Thr Pro Glu
Glu Val His Leu Thr Pro Glu
Glu Lys Ser . . . .
Glu Lys Ser . . . .
HbA1c vzniká glykací na N-konci ß-řetězce
hemoglobinu
Glykována je
první AK - Val
ß-chain
![Page 10: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/10.jpg)
10
• Není třeba konzervovat krev (větší stabilita)
• Menší intraindividuální variabilita (CV<2%)
• HbA1c není ovlivněn krátkodobou
glykémií
• Nemocný nemusí být lačný
• Využití pro diagnostiku i kontrolu léčby
Výhody proti glykémii
![Page 11: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/11.jpg)
11
Vyjadřování výsledků
od 1.1. 2012
mmol/mol (např.45 mmolHbA1c/mol Hb)
%DCCT (převážně v USA)
(Diabetes Control and Complication Trial)
2010, konsensus ADA, IFCC, IFD, EASD, ISPAP
![Page 12: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/12.jpg)
12
Rozhodovací meze
Referenční interval 20 – 42 mmol/mol
Rozhodovací meze
Kompenzovaný diabetes
(dospělí, negravidní)
43 – 60 mmol/mol
![Page 13: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/13.jpg)
14
Preanalytické podmínky
• Krev (B) - odběr do EDTA
• Stabilita: 2d (+20 až +25°C)
1týden (+4 až +8°C)
1rok (<-20°C lépe při -80°C)
Poznámky:
- snížená hodnota doby života erytrocytů
- Hemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti),…..
![Page 14: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/14.jpg)
15
Mezilehlá preciznost* CV < 1,0 %
Pravdivost (bias)* b < 1,5 %
Celková chyba* TE < 3,1 %
Metrologická návaznost na referenční metodu LC-ESI/MS
Požadavky na analytickou
kvalitu měření
Intraindividuální biologická variabilita 1,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 1,0
Interindividuální biologická variabilita 5,7 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 1,5
Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických variabilit 3,1
www.westgard.com
![Page 15: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/15.jpg)
16
Nejistota výsledků měření
Na základě kombinace dílčích nejistot
odpovídajících preciznosti, hodnotě bias a
hodnotě Cvi lze odhadnout výslednou
kombinovanou nejistotu výsledků měření
(Uc) 6 až 9% (95% interval spolehlivosti)
![Page 16: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/16.jpg)
17
Metody stanovení
1. Referenční metody
• Izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c)
• Enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C)
• Analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů)
a) LC/ESI /MS
b) CE/ESI/MS
![Page 17: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/17.jpg)
18
2. Doporučené metody
a) Chromatografické
HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie)
LC (nízkotlaká kapalinová chromatografie)
• Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová)
• IEC (kapalinová chromatografie s výměnou
iontů)
![Page 18: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/18.jpg)
Tosoh G8 System
Eluční pufry
Hemolyzační a
promývací roztok
Software
Podavač vzorků
Kolona
Statimová pozice
![Page 19: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/19.jpg)
20
![Page 20: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/20.jpg)
Premier Hb 9210
![Page 21: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/21.jpg)
Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel
Hemolyzovaný vzorek je dávkován do kolony v mobilní fázi – pufr A
Glykovaná složka se váže na boronát, neglykovaná složka prochází kolonou na
detektor
Glykovaná složka je eluována pufrem B
LC:Boronátová afinitní chromatografie
G
Hb
G
Hb
Hb
Hb Hb
Hb
Hb
Hb
Hb
Kolona Detektor
Reagent B: Reagent A:
Dávkování vzorku
Hb
G
Hb
Hemoglobin
Glykovaný hemoglobin
![Page 22: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/22.jpg)
23
Doba života erytrocytů (120 ± 10 d) !
Přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu
(1165 variant Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD)
Hemolýza, Ikterus
Těžké krvácení
Věk, rasa, terapie,…
Co může ovlivnit hodnocení
vyšetření HbA1c
![Page 23: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/23.jpg)
24
b) Elektroforetické
ELFO (elektroforéza)
IEF (izoelektrická fokusace)
CE a HPCE (kapilární elektroforéza)
![Page 24: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/24.jpg)
25
c) Imunoanalytické
IT (imunoturbidimetrie)
TINIA (Turbidimetric Inhibition Immunoassay)
(Imunoinhibiční turbidimetrie)
IN (imunonefelometrie)
CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na
mikročásticích)
![Page 25: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/25.jpg)
26
CMIA (např. Abbott Architect i2000 SR)
Hemolýza erytrocytů, uvolnění HbA1c
Inkubace s magnetickými mikročásticemi, navázání antigenu
(HbA1c)
Promytí, odstranění nenavázaného antigenu
Přidání Anti-HbA1c mab (konjugát) značený akridiniem
Vazba konjugátu na mikročástice
Promytí, odstranění nenavázaného konjugátu
Chemiluminiscence (po změně pH a přidání peroxidu)
![Page 26: Glykovaný hemoglobin A1c (HbA1c - Masaryk University...Premier Hb 9210 Kolona obsahuje aminofenylboronovou kyselinu navázanou na porézní gel Hemolyzovaný vzorek je dávkován](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081601/612177465de3bd2ad53e9439/html5/thumbnails/26.jpg)
27
d) Spektrofotometrické
Enzymové