Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer ... mit... · Pankreatitis Dissertation zur...
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Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer
Pankreatitis
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von: Max Herms, geboren am 17.03.1984 in Erlenbach am Main
angefertigt am: Department für Innere Medizin, Neurologie und Dermatologie,
Klinik und Poliklinik für Gastroenterologie und Rheumatologie,
Universitätsklinikum Leipzig, AöR
Klinikdirektor Prof. Dr. med. Joachim Mössner
Betreuer: Prof. Dr. med. Joachim Mössner / Dr. med. Jonas Rosendahl
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 19.06.2012
Inhaltsverzeichnis
Bibliographische Beschreibung .......................................................................... 4
Abkürzungen ......................................................................................................... 5
Abbildungen .......................................................................................................... 7
Tabellen ................................................................................................................. 7
1 Einleitung ....................................................................................................... 8
1.1 Chronische Pankreatitis ............................................................................. 8
1.2 Ätiologie der chronischen Pankreatitis ....................................................... 9
1.3 Genetische Aspekte bei chronischer Pankreatitis .................................... 10
1.4 Cathepsine bei Pankreatitis ..................................................................... 12
1.4.1 Die Rolle des Cathepsin B bei der Pankreatitis ................................. 13
1.4.2 Die Rolle des Cathepsin-L bei der Pankreatitis ................................. 14
2 Fragestellung ............................................................................................... 16
3 Studienteilnehmer ....................................................................................... 17
3.1 Patienten ................................................................................................. 17
3.2 Kontrollgruppe ......................................................................................... 18
4 Materialien und Methoden .......................................................................... 18
4.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ................................................. 18
4.2 Laborgeräte ............................................................................................. 19
4.3 DNA-Extraktion ........................................................................................ 19
4.4 Polymerasekettenreaktion ....................................................................... 19
4.5 Agarose-Gelelektrophorese ..................................................................... 20
4.5.1 Herstellung der Agarose-Gelplatten .................................................. 20
4.5.2 Gelelektrophorese des PCR-Produktes ............................................ 21
4.6 Aufreinigung des PCR-Produktes ............................................................ 22
4.7 Sequenzierung ........................................................................................ 22
4.8 Statistik .................................................................................................... 24
5 Ergebnisse ................................................................................................... 24
5.1 Sequenzierung des CTSL1 – Seltene Varianten ..................................... 24
5.2 Häufige CTSL1- Varianten....................................................................... 26
5.3 Allelfrequenz der häufigen CTSL1-Varianten .......................................... 28
5.4 Haplotypenanalyse des CTSL1 ............................................................... 29
6 Diskussion ................................................................................................... 31
6.1 Seltene nicht-synonyme und synonyme Varianten des CTSL1 ............... 31
6.2 Häufige Varianten des CTSL1 ................................................................. 33
6.3 Hardy-Weinberg Gleichgewicht ............................................................... 34
6.4 Haplotypen-Analyse ................................................................................ 35
6.5 Promoter-Varianten des CTSL1 und deren funktionelle Konsequenz ..... 35
6.6 Ausblick ................................................................................................... 36
7 Zusammenfassung ...................................................................................... 40
8 Literaturverzeichnis .................................................................................... 43
9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit ........................ 51
10 Lebenslauf ................................................................................................. 52
11 Danksagung .............................................................................................. 53
4
Bibliographische Beschreibung
Herms, Max Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer Pankreatitis Universität Leipzig, Dissertation 52 S., 74 Lit., 5 Abb., 5 Tab. Referat
Die chronische Pankreatitis (CP) ist eine wiederkehrende, entzündliche Erkrankung
des Pankreas. In den letzten Jahren wurden mehrere Kandidatengene, die zur
Entstehung einer CP prädisponieren, identifiziert. Zu diesen Genen gehören PRSS1,
PRSS2, SPINK1, CFTR und CTRC. Der Pathogenese der genetisch bedingten CP
scheint dabei eine frühzeitige, intrapankreatische Aktivierung von Trypsin zugrunde
zu liegen.
Cathepsin B (CTSB), eine in Lysosomen vorkommenden Protease, ist in der Lage
Trypsinogen zu aktivieren. Genetisch zeigte sich eine Assoziation der p.L26V
Variante bei tropisch-kalzifizierender CP, welche bei idiopathischer CP nicht bestätigt
wurde. Neben CTSB ist CTSL die am zweithäufigsten vorkommende lysosomale
Protease. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass CTSL ein inaktives Trypsin
freisetzt. Im Mausmodell zeigten sich bei Ctsl-/- Tieren bei experimentell induzierter
Pankreatitis zwei Effekte. Zum einen war die Trypsinaktivität erhöht, zum anderen
verlief die Pankreatitis milder, da vermehrt Apoptose anstelle von Nekrose der
Azinuszellen auftrat.
In dieser Studie wurde mittels uni-direktionaler DNA-Sequenzierung das gesamte
CTSL1 untersucht. Dabei fanden wir insgesamt drei seltene nicht-synonyme
Varianten. Die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750) fanden wir bei einem
Patienten, wobei diese Variante bereits bei Kontrollen beschrieben wurde. Die
Varianten c.126+1G>A und c.915A>C (p.E305D) lagen bei jeweils einer Kontrolle
vor. Sowohl seltene als auch häufige Varianten und die berechneten Haplotypen
zeigten keinen signifikanten Verteilungsunterschied zwischen Patienten und
Kontrollen. Demnach besteht keine Assoziation von Varianten des CTSL1 und CP.
5
Abkürzungen
°C Grad Celsius
µl Mikroliter
A Adenin
aqua dest. Destilliertes Wasser
BL Basenleiter
bp Basenpaare
C Cytosin
CF Zystische Fibrose
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
CI Konfidenzintervall
CP Chronische Pankreatitis
CTRC Chymotrypsin C, Caldecrin
CTSB Cathepsin B
Ctsb-/- Cathepsin knock-out
CTSL Cathepsin L
Ctsl-/- Cathepsin L knock-out
CTSL1 Cathepsin L-Gen
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dCTP Desoxycytidintriphosphat
ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat
dGTP Desoxyguanosintriphosphat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
dNTPs Desoxynukleosidtriphosphate
dTTP Desoxythimidintriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
ER endoplasmatisches Retikulum
F vorwärts
g Gramm
G Guanin
Kb Kilo-Basenpaare
KV kondensierende Vakuolen
6
LYS Lysosomen
M Molar
mg Milligramm
MgCl2 Magnesiumchlorid
mild milde
min Minute
ml Milliliter
mM millimol
N Nukleus
n.s. nicht signifikant
NaAc Natriumacetat
OR Odds ratio
P PCR
p P-Wert
PCR Polymerasekettenreaktion
Poly Polymorphismen
PRSS1 Kationisches Trypsinogen
PRSS2 Anionisches Trypsinogen
PRSS3 Mesotrypsinogen
R rückwärts
RV rupturierte Vakuole
S Sequenzierung
sek Sekunde
sev harte
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SPINK1 Serinproteaseinhibitor Kazal Typ 1
T Thymin
TAP Trypsinogen Aktivierungspeptid
TAP-IVG verlängertes Trypsinogen Aktivierungspeptid
TBE-Puffer TRIS-Borat-EDTA-Puffer
TCP tropische kalzifizierende Pankreatitis
UTR untranslated region
WT Wildtyp
ZG Zymogengranula
7
Abbildungen
Abb. 1: Ursachen der CP S.10
Abb. 2: Schema der genetischen und umweltbedingten S.12
Einflüsse auf die Pathogenese der CP
Abb. 3: Agarose-Gel Elektrophorese des CTSL1 Exon 5-6 S.22
Abb. 4: Elektropherogramm der c.5A>C (p.N2T) Variante und S.24
einer Wildtyp-Probe
Abb. 5: Schematische Darstellung einer Azinuszelle mit S.38
physiologischen und pathologischen Mechanismen
der Kolokalisation von Zymogenen und Proteasen
Tabellen
Tab. 1: Oligonukleotid-Sequenzen der Primer für die PCR S.20
und Sequenzierung
Tab. 2: Darstellung der seltenen nicht-synonymen, synonymen S.26
und in nicht kodierenden Abschnitten gelegenen Varianten
des CTSL1.
Tab. 3: Darstellung der Gentoyp Verteilung häufiger Varianten S.27
Tab. 4: Darstellung der Allelfrequenzen häufiger Varianten S.28
Tab. 5: Darstellung der Ergebnisse der Haplotypen-Berechnung S.30
mittels PHASE v.2.1
8
1 Einleitung
1.1 Chronische Pankreatitis
Als chronische Pankreatitis (CP) wird eine entzündliche Erkrankung des Pankreas
bezeichnet, die durch wiederkehrende Pankreatitisattacken als auch durch
permanente Schmerzen gekennzeichnet sein kann. Im Verlauf der Erkrankung
resultiert in vielen Fällen eine Fibrose des Pankreas. Durch den Verlust des
Pankreasparenchyms kann eine endokrine und/oder exokrine Pankreasinsuffizienz
mit konsekutivem Diabetes mellitus entstehen. Ebenso kann es zu einer
Mangelernährung kommen (Singer et al., 1985).
Die Inzidenz der CP wird in der industrialisierten westlichen Welt im
Erwachsenenalter mit 3,5 bis 10 Neuerkrankungen auf 100.000 Einwohner und Jahr
angegeben (Secknus et al., 2000). Ähnliche Zahlen konnten in einer räumlich stark
umschriebenen epidemiologischen Studie in Lüneburg mit einer Inzidenz von 6,4 pro
100.000 Einwohnern/Jahr ermittelt werden (Lankisch et al., 2002). Für das
Kindesalter liegen keine genauen Daten bezüglich der Häufigkeit der CP vor.
Der Schweregrad des akuten Schubs einer CP kann von einer leichten, interstitiell-
ödematösen bis zu einer schweren, hämorrhagisch-nekrotisierenden Entzündung
variieren. Das Hauptsymptom der CP ist meist der Schmerz, der attackenartig
ähnlich eines akuten Schubes (Typ A) oder dumpf und dauerhaft (Typ B) auftreten
kann (Hoffmeister et al., 2008). Nur ein kleiner Teil der Patienten (10%-15%) leidet
nicht unter Schmerzen, wobei dies häufig ältere Patienten mit idiopathischer CP sind
(Ammann, 2006). Im Endstadium der Erkrankung kann eine Schmerzlinderung
auftreten, die oft von einer endokrinen und exokrinen Insuffizienz begleitet wird und
unabhängig von der Ätiologie und vorangegangenen chirurgischen Interventionen ist
(Müllhaupt et al., 2005). Leitsymptom der CP im Kindesalter ist der rezidivierende
akut auftretende abdominelle Schmerz, der meistens mit Übelkeit und Erbrechen
einhergeht. Im Gegensatz zum Erwachsenenalter bestehen selten permanente
Schmerzzustände (Lal et al., 2010)
Morphologisch führt eine CP zu unregelmäßigen Sklerosierungen des Pankreas mit
fokaler, segmentaler oder diffuser Zerstörung des exokrinen Gewebes und
Veränderungen des Pankreasgangsystems wie Dilatationen, Strikturen sowie
intraduktalen Konkrementen in Form von Protein-ausfällungen oder Verkalkungen.
Eine exokrine Insuffizienz äußert sich im Auftreten von Meteorismus und Diarrhö und
9
einer Steatorrhö welche im Verlauf auftreten kann (Hoffmeister et al., 2008). Häufig
entwickelt sich die endokrine Insuffizienz mit Ausbildung eines Insulinmangeldiabetes
erst nach Manifestation der exokrinen Insuffizienz (Ammann et al., 1987).
Neben einer stark erhöhten Mortalitätsrate, circa 50% der Patienten versterben
innerhalb von 20-25 Jahren nach Krankheitsbeginn, ist das Risiko an einem
Pankreaskarzinom zu erkranken erhöht (Ammann, 2006, Secknus et al., 2000,
Raimondi et al., 2010).
1.2 Ätiologie der chronischen Pankreatitis
Die häufigste Ursache der CP ist in den industrialisierten westlichen Ländern der
Alkoholabusus (Thrower et al., 2010, Lowenfels et al., 2005). Während Alkohol vor
allem in älteren Studien in bis zu 90% der Fälle als Ursache angegeben wurde,
konnte in einer kürzlich veröffentlichten italienischen und amerikanischen Studie ein
Rückgang der Ätiologie auf 50% nachgewiesen werden (Frulloni et al., 2008, Yadav
et al ., 2010). Als Grenzwert für eine alkoholische CP gelten 60-80g reinen Alkohols
pro Tag über einen Zeitraum von mehr als zwei Jahren, wobei diese Definition nicht
generell akzeptiert wird und nicht durch Studien validiert wurde (Ammann, 1997).
Aufgrund des erhöhten Alkoholmissbrauchs bei Männern verwundert es nicht, dass
die Mehrheit der Patienten männlich ist (70%-75%) (Lankisch et al., 2002). Das
mittlere Erkrankungsalter der alkoholischen CP liegt zwischen dem 40. und 60.
Lebensjahr (Yadav, 2011) und die Erkrankung schreitet bei diesen Patienten
schneller voran als bei anderen CP Formen (Ammann et al., 1987, Müllhaupt et al.,
2005, Ammann, 2006).
Neben dem Alkoholabusus scheint das Rauchen ein Risikofaktor für die Entwicklung
einer CP zu sein (Maisonneuve et al., 2005). Zudem beeinflusst das Rauchen den
Krankheitsverlauf der CP negativ und führt früher zur Ausprägung von Kalzifikationen
und zur Manifestation eines Diabetes mellitus (Maisonneuve et al., 2005).
Bei der CP unterscheidet man zwei Verlaufsformen: Zum einen die „juvenile“ oder
„early onset“-Form welche sich mit einem mittlerem Erkrankungsalter von etwa 20
Jahren manifestiert, zum anderen die seltenere „senile“ oder „late onset“-Form
welche zwischen dem sechsten und achten Lebensjahrzehnt auftritt (Ammann,
2006). Im Vergleich zur alkoholischen CP zeigt sich bei beiden Formen eine
ausgeglichene Geschlechterverteilung, ein milderer Krankheitsverlauf mit später
10
einsetzender endokriner und exokriner Insuffizienz, eine verminderte
Kalzifizierungsrate sowie eine bessere Lebenserwartung (Layer et al., 1994,
Müllhaupt et al., 2005, Amman et al., 1987). Interessanterweise kann in bis zu einem
Drittel aller CP Fälle kein ätiologischer Faktor oder eine positive Familienanamnese
ermittelt werden (Witt et al., 2000).
Neben den genannten Ursachen spielt möglicherweise auch die Ernährung bei der
Entstehung einer CP eine Rolle. Andere Ursachen, wie beispielsweise anatomische
Anomalien, eine Hypertriglyzeridämie, Medikamente und eine traumatische Genese
sind selten (siehe Abbildung 1). Auf die genetischen Ursachen der CP wird im
folgenden Abschnitt eingegangen.
Abbildung 1: Ursachen der CP adaptiert von Rosendahl et Mössner (Die Medizinische Welt 2010). Neben dem häufigsten Umweltfaktor Alkohol können weitere Ursachen der Erkrankung zugrunde liegen. Ein Nikotinabusus scheint ebenfalls zur CP zu prädisponieren. Genetische Einflüsse können bei immer mehr Patienten identifiziert werden. Die Darstellung ist schematisch und die Schnittflächen der Kreise stellen nicht das wahre Verteilungsverhältnis der Ursachen der CP dar. Es besteht kein Anspruch auf Vollständigkeit.
1.3 Genetische Aspekte bei chronischer Pankreatitis
Ein Familienstammbaum mit genetisch bedingter CP wurde erstmals 1952 von
Comfort und Steinberg beschrieben (Comfort et Steinberg, 1952). Diese hereditäre
Form der CP mit autosomal dominantem Erbgang und unvollständiger Penetranz
manifestiert sich typischerweise im Kindesalter. Verkalkungen des Pankreas sowie
ein Diabetes mellitus treten erst nach längerem Krankheitsverlauf auf (Teich et al.,
11
2008, Keim, 2003). Als genetische Ursache konnte 1996 eine Mutation (p.R122H)
des kationischen Trypsinogen (PRSS1) identifiziert werden (Whitcomb et al, 1996).
Bei den Trypsinogenen werden drei verschiedene Isoformen unterschieden, die
entsprechend ihres Wanderungsverhaltens in der isoelektrischen Fokussierung als
kationisches (PRSS1) und anionisches Trypsinogen (PRSS2) sowie
Mesotrypsinogen (PRSS3) bezeichnet werden.
Nach Beschreibung der p.R122H Mutation sind mittlerweise viele weitere Mutationen
im PRSS1 nachgewiesen worden. PRSS1-Mutationen scheinen zu einer erhöhten
Trypsinogen-Aktivierung und/oder Trypsin-Stabilisierung und somit zu einer erhöhten
intrapankreatischen Trypsinaktivität zu führen (Teich et al., 2006).
Bei gleicher enzymatischer Aktivität wie das PRSS1 besitzt das PRSS2 eine
gesteigerte Selbstaktivierung und eine geringere Inaktivierungstendenz (Colomb et
al. 1978, Colomb et al. 1979). Anhand der p.G191R Variante des PRSS2 konnte
erstmalig eine protektive Variante bei CP nachgewiesen werden, die zu einer
vermehrten Degradierung von anionischem Trypsinogen führt (Witt et al., 2006).
Der Serin-Protease Inhibitor Kazal, Typ 1 (SPINK1) ist ein Protease-Inhibitor, welcher
intrapankreatisch aktiviertes Trypsin deaktiviert (Lal et al., 2010, Teich et al., 2008).
Eine p.N34S Variante des SPINK1 konnte mit verschiedenen Formen der CP
assoziiert werden (Witt et al., 2000, Witt et al., 2001, Drenth et al., 2002, Chandak et
al., 2002, Hassan et al., 2002, Bhatia et al., 2002, Schneider et al., 2002).
Interessanterweise zeigte eine funktionelle Analyse von rekombinantem SPINK1 mit
p.N34S Mutation eine unveränderte Funktion des Proteins (Kuwata et al., 2002). Da
diese Variante auch bei Kontrollen gefunden wurde, ist bis heute nicht verstanden,
auf welche Art und Weise sie zur Pathogenese der CP beiträgt.
Da 1-2% der Patienten mit Zystischer Fibrose (CF) an einer CP erkranken schien es
wahrscheinlich, daß Veränderungen im CFTR zur Entwicklung einer CP
prädisponieren (Shwachman et al., 1975, Atlas et al., 1993). Dieser Zusammenhang
konnte erstmals 1998 in zwei unabhängigen Studien nachgewiesen werden (Sharer
et al., 1998, Cohn et al., 1998). Im Verlauf der letzten Jahre wurde das CFTR bei CP
umfangreich untersucht. Die Ergebnisse der Studien bestätigten die Assoziation zur
CP und relativierten die Bedeutung von CFTR Varianten bei der Pathogenese der
CP (Audrezet et al., 2002; Weiss et al., 2005; Rosendahl et al., unveröffentlichte
Daten).
12
Im Jahr 1988 beschrieb Heinrich Rinderknecht erstmals in humanem Pankreassekret
eine Protein, welches er als Enzym Y bezeichnete, und das abhängig von der
vorliegenden Calciumkonzentration alle Trysinogen-Isoformen spalten konnte
(Rinderknecht et al., 1988). Nach weiteren 20 Jahren wurde Chymotrypsin C (CTRC)
als Enzym Y identifiziert. (Szmola et al., 2007). Kurze Zeit später konnten zwei
unabhängige Forschungsgruppen nachweisen, dass „loss-of-function“-Varianten des
CTRC mit der CP asoziiert sind (Masson et al., 2008, Rosendahl et al., 2007). In der
nachfolgenden Abbildung ist das pathogenetische Konzept der Entstehung der CP
schematisch dargestellt (Abbildung 2), welches zum einen auf der Charakterisierung
von genetischen Ursachen und zum anderen auf Einfüssen durch Umweltfaktoren
beruht. Umso schwerwiegender vorliegende CFTR Varianten sind umso häufiger
entsteht eine exokrine Insuffizienz, wobei die Cl--Kanal-Funktion abnimmt. Vor allem
bei Vorliegen milder Varianten der verschiedenen Gene (komplex bedingte CP)
scheinen Veränderungen auf mehreren Genen notwendig zu sein, damit eine CP
entsteht.
Abbildung 2: Schema der genetischen und umweltbedingten Einflüsse auf die Pathogenese der CP. Es gibt zwei Endpunkte (Zystische Fibrose und hereditäre CP) bei denen die Entstehung der Erkrankung wahrscheinlich wenig bis gar keine Umwelteinflüsse benötigt und vorwiegend genetisch determiniert wird. Zwischen diesen Endpunkten liegt in den meisten Fällen eine komplexe Interaktion von genetischen Faktoren und Umweltfaktoren vor. Abbkürzungen: CF=CFTR Varianten, mild=milde Varianten, Poly=Polymorphismen, sev=harte Varianten, SPINK1=Serin-Protease Inhibitor Kazal, Typ 1, CTRC=Chymotrypsinogen C, PRSS1=kationisches Trypsinogen, WT=Wildtyp.
1.4 Cathepsine bei Pankreatitis
Cathepsine sind Proteasen die an der Verstoffwechselung von Proteinen in
Lysosomen beteiligt sind. Über Endozytose oder Autophagozytose werden Proteine
13
in Lysosmen aufgenommen und degradiert. Im vergangenen Jahrzehnt wurden
weitere Lokalisationen und Funktionen der Cathepsine entdeckt. So können
Cathepsine sowohl extrazellulär als auch andernorts innerhalb der Zelle wie in
sekretorischen Vesikelen (Wartmann et al., 2010, Puri et al., 2008), dem Zytosol
(Sever et al., 2007, Faul et al., 2008, Reiser et al., 2004), und im Nucleus (Goulet et
al., 2004, Alcalay et al., 2008) gefunden werden. Interessanterweise sind Cathepsine
an der Antigen-Präsentation (Honey et al., 2003), dem Kollagen-Umsatz in Knochen
und Knorpel (Stoch et al., 2008, Deal, 2009) und an der Neuropeptid- und
Hormonbildung (Friedrichs et al., 2003, Funkelstein et al., 2008) beteiligt. Eine
übermässige oder ektope Expression von Cathepsinen kann bei der Entwicklung von
Krankheiten, wie beispielsweise einer Arthritis, als auch bei der Malignomentstehung
von Bedeutung sein (Reiser et al., 2010).
Heutzutage werden Cathepsine je nach Struktur und katalytischer Aktivität in Serin-,
Asparagin- und Cystein-Cathepsine unterteilt. Letztere werden auch als Papain-
ähnliche Proteasen bezeichnet, da sie Papain, der wichtigsten Protease der Papaya-
Frucht, ähneln (Reiser et al., 2010). Die Cystein-Cathepsine stellen die größte
Cathepsin-Familie dar, zu denen unter anderem Cathepsin B (CTSB) und Cathepsin
L (CTSL), zählen. (Rawlings et al., 2008) Ursprünglich wurden Cathepsine als
Proteasen in sauren zellulären Kompartimenten wie Lysosomen und Endosomen
identifiziert (Reiser et al., 2010). Eine Cathepsin-Aktivität wurde in den 20er Jahren
zum ersten Mal im Magensaft beschrieben. (Willstätter et al., 1929).
1.4.1 Die Rolle des Cathepsin B bei der Pankreatitis
Das CTSB (OMIM *116810) umfasst zwölf Exone und ist auf dem kurzen Arm des
Chromosom acht lokalisiert (8p22). CTSB ist in vitro in der Lage das Trypsinogen des
Menschen und von Rindern zu aktivieren (Greenbaum et al., 1959, Figarella et al.,
1988). Dabei spaltet CTSB das N-terminale Hexapeptid, welches auch als
„trypsinogen activation peptide” (TAP) bezeichnet wird, ab. Dieser Schritt entspricht
der Funktion der Enteropeptidase, dem physiologischen Trypsinaktivator im
Dünndarm. Da scheinbar die intrapankreatische Aktivierung von Trypsin bei der
Entstehung einer Pankreatitis entscheidend ist, wurde vermutet das CTSB an der
Pathogenese der CP beteiligt ist.
14
In Ctsb-/- Mäusen wurde in Modellen der experimentell induzierten Pankreatitis ein
milderer Verlauf der akuten Pankreatitis gezeigt. Weiterhin wurde bei der
Behandlung von Mäusen und Ratten in verschiedenen in vivo Modellen der
experimentellen Pankreatitis durch die Gabe eines CTSB Inhibitor (CA-074me) vor
Induktion der Pankreatitis, der Schweregrad der Pankreatitis substantiell vermindert.
(van Acker et al., 2002, van Acker et al., 2006, Halangk et al., 2000). Aufgrund dieser
Daten stellte das CTSB ein spannendes Kandidatengen der CP dar.
In einer Arbeit von Marhurkar und Mitarbeitern konnte bei indischen Patienten mit
tropischer kalzifizierender CP (TCP) eine Leucin zu Valin Variante an Position 26 des
CTSB (p.L26V) mit der Erkrankung assoziiert werden (P-Wert=0,009, Odds Ratio
2,15, 95% CI 1,6-2,9). Die Assoziation wurde in einem zweiten Kollektiv von
Patienten mit TCP bestätigt. (Mahurkar et al., 2006). In einer weiteren Arbeit konnte
die vorbeschriebene genetische Assoziation der p.L26V Variante bei kaukasischen
Patienten mit idiopathischer CP jedoch nicht bestätigt werden. (Weiss et al., 2007).
Auch in weiteren Untersuchungen kaukasischer Patienten zeigte sich keine
Assoziation (Professor Witt, persönliche Kommunikation). Möglicherweise erklären
sich die verschiedenen Ergebnisse durch Unterschiede des genetischen
Hintergrundes der untersuchten Kollektive oder durch einen anderen genetischen
Hintergrund der indischen Kontrollen (im Vergleich zu den TCP Patienten).
1.4.2 Die Rolle des Cathepsin-L bei der Pankreatitis
Das Cathepsin L (CTSL1, OMIM *116880) umfasst acht Exone und erstreckt sich
über 5,1 kb auf dem langen Arm des Chromosom neun (9q21-q22). Die Translation
beginnt in Exon 2. Wegen ihres teilweise überlappenden Substrat-Repertoires hatte
man angenommen, dass auch andere Cystein Cathepsine als CTSB an der
Trypsinogen-Aktivierung beteiligt sind, die möglicherweise zur Ausbildung einer
Pankreatitis führt. Da CTSL eine wesentlich stärkere proteolytische Wirkung aufweist
als CTSB (Kirschke et al., 1985), schien es ebenfalls ein wichtiger Regulator der
Trypsinogen-Aktivierung zu sein.
In einer interessanten Arbeit von Wartmann und Kollegen wurde festgestellt, dass
CTSL und CTSB sowohl in den Lysosomen als auch in Kolokalisation mit
Zymogenen in sekretorischen Vesikeln vorkommen können. (Wartmann et al., 2010)
Diese Kolokalisation nimmt bei Pankreatitis zu und kann sich sogar ins Cytosol
15
ausbreiten. Zudem zeigten Untersuchungen mit menschlichem und bovinem
Trypsinogen eine spezifische CTSL-Spaltungsstelle an Position G26-G27. Eine
Spaltung durch CTSL in diesem Bereich führt zur Bildung eines inaktiven Trypsins.
Da diese Spaltungsstelle drei Aminosäuren vor der Spaltungsstelle des
physiologischen Trypsinaktivators Enteropeptidase liegt, wird ein längeres Propeptid
(TAP) gebildet. Dieses verlängerte TAP-Molekül (TAP-IVG) wird zwar nicht durch
TAP-spezifische „enzyme-linked immunosorbent assays“ (ELISA) detektiert, durch
CTSB jedoch in ein immunoreaktives TAP konvertiert. Damit konnte gezeigt werden,
dass das TAP-Level nicht mit dem Schweregrad der Krankheit sowie der Menge an
aktivem Trypsin assoziiert ist.
Der Verlauf einer experimentell induzierten Pankreatitis wurde in Ctsl-/- Mäusen
untersucht. Hier zeigte sich, dass die intrapankreatische Trypsinaktivität stark erhöht
war, da CTSL als „Antagonist“ der CTSB vermittelten Trypsinogenaktivierung fehlte.
Der Schweregrad der Pankreatitis war als Ergebnis einer weniger starken
Entzündungsreaktion reduziert, da die Azinuszellen vermehrt der Apoptose zugeführt
wurden anstatt durch Nekrose unterzugehen. Zusammengefasst scheint CTSL vor
der Entstehung einer Pankreatitis zu schützen (weniger Trypsinaktivität), wobei in
Ctsl-/- Mäusen der Schweregrad einer experimentell induzierten Pankreatitis aufgrund
von vermehrter Apoptose geringer war.
16
2 Fragestellung
Für die Pathogenese der CP scheint eine Störung des Gleichgewichts von Proteasen
und Anti-Proteasen von Bedeutung zu sein. In den letzten Jahren wurden genetische
Assoziationen beschrieben, die dieses Gleichgewicht scheinbar zu Gunsten der
Proteasen verschieben. Bei vielen Patienten (ca. 30 Prozent) wurde bisher keine
genetische Veränderung detektiert.
Unter physiologischen Bedingungen werden Verdauungsenzyme als
Vorläuferenzyme sezerniert und in Zymogengranula gespeichert. Eine Aktivierung
erfolgt erst im Duodenum. Die in Lysosomen lokalisierten Cathepsine können die
Aktivierung und den Abbau von Trypsinogen beeinflussen. CTSB ist in der Lage
intrapankreatisch Trypsinogen zu aktivieren und könnte somit eine Pankreatitis
auslösen. Genetische Untersuchungen wiesen keine Assoziation zur CP nach.
Im Gegensatz zu CTSB degradiert CTSL Trypsinogen und könnte somit die
Entstehung einer CP verhindern. Eine Arbeit zeigte im Modell mit Ctsl-/--Mäusen nach
caeruleininduzierter Pankreatitis eine Reduktion des Schweregrades der Pankreatitis.
Dabei war die intrapankreatische Trypsinaktivität und die Apoptoserate der
Pankreasazinuszellen gesteigert.
Aus diesem Grund stellt CTSL ein vielversprechendes Kandidatengen der CP dar.
Entsprechend der Ergebnisse bei Ctsl-/--Mäusen könnten protektive Varianten bei
Kontrollen vorliegen, die über einen Funktionsverlust vor einer CP schützen. Ebenso
könnten bei Kontrollen oder bei Patienten Varianten vorliegen, die den
intrapankreatischen Abbau von Trypsinogen vermindern (oder bei Patienten
erhöhen). In dieser Arbeit soll geklärt werden, inwieweit Varianten des CTSL die
Pathogenese der CP beeinflussen. Hierfür werden die kodierenden Abschnitte und
die Übergänge zu nicht-kodierenden Abschnitten bei Patienten und Kontrollen mittels
uni-direktionaler Sequenzierung analysiert. Varianten mit einer Frequenz von über
einem Prozent werden mittels PHASE (Haplotypen-Analyse) ausgewertet.
17
3 Studienteilnehmer
3.1 Patienten
Die vorgelegte Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Leipzig
genehmigt (Registrierungsnummer 818 der Ethikkommission der Universität Leipzig).
Die Patienten wurden ausführlich über die Studienbedingungen und
molekulargenetischen Untersuchungen sowie über die wissenschaftliche
Verwendung ihres Blutes aufgeklärt. Nach Einwilligung der Patienten in schriftlicher
Form erfolgte die venöse Blutentnahme. Bei minderjährigen Patienten willigte ein
Elternteil schriftlich ein.
Die Diagnose einer CP wurde bei Patienten gestellt, wenn folgende Kriterien
vorlagen: mindestens zwei eindeutig voneinander unabhängige Episoden von
Oberbauchbeschwerden (normalerweise epigastrisch lokalisiert) mit einem über 3-
fach erhöhtem Lipase-Wert im Serum oder chronische Oberbauchbeschwerden
(chronisches Schmerzsyndrom). Gleichzeitig musste der Nachweis von
charakteristischen Zeichen einer CP in bildgebenden Befunden (z.B.
Abdomensonographie, Endosonographie, Computertomographie, Magnet-Resonanz-
Tomographie, Endoskopisch-retrograde-Cholangiopankreatikographie) vorliegen. Zu
diesen bildgebenden Zeichen zählten beispielsweise der Nachweis von
Verkalkungen, Konkrementen, Pseudozysten oder Pankreasgangveränderungen.
Eine hereditäre CP wurde bei positiver Familienanamnese mit mindestens einem
betroffenen Verwandten ersten Grades oder mindestens zwei Verwandten zweiten
Grades diagnostiziert, wenn keine weiteren offensichtlichen Risikofaktoren
vorhanden waren. Eine idiopathische CP wurde bei Patienten diagnostiziert, bei
denen prädisponierende Risikofaktoren wie beispielsweise Alkoholabusus, Trauma,
Medikamenteneinnahme, Infektionen, metabolische Störungen oder eine positive
Familienanamnese fehlten.
Insgesamt wurden im Rahmen der Studie 218 Patienten (110 weiblich, 108 männlich;
Altersspanne 3-75 Jahre, Median 29,5 Jahre, Mittelwert 31,4 Jahre), von denen 175
eine idiopthische und 43 eine hereditäre CP aufwiesen, untersucht. Die Patienten
wurden in ganz Deutschland rekrutiert. Im Rahmen eines genetischen Screening für
zur CP prädisponierende Veränderungen wurde bei allen Patienten das Exon 2 und
3 des PRSS1 und das Exon 3 des SPINK1 sowie das Exon 2, 3 und 7 des CTRC
mittels uni-direktionaler Sequenzierung untersucht. Innerhalb der Studie wurde bei
18
allen Patienten eine vollständige uni-direktionale Sequenzierung aller Exone des
CTSL1 und der Exon-Intron Übergänge durchgeführt.
3.2 Kontrollgruppe
Die Kontrollgruppe umfasste insgesamt 230 gesunde Blutspender (163 weiblich, 67
männlich; Altersspanne 20-81 Jahre, Median 47 Jahre, Mittelwert 47,2 Jahre),
welche in Leipzig rekrutiert wurden. Die Kontrollen wurden, ebenso wie die Patienten,
vollständig auf genetische Veränderungen des CTSL1 untersucht (siehe 2.1).
4 Materialien und Methoden
4.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
DNeasy Blood &Tissue kit
dNTPs
Oligonukleotid-Primer
MgCl2
GeneAmp 10 x PCR-Puffer II
AmpliTaq DNA-Polymerase
Agarose
Trisbase
Borsäure
0,5M EDTA Lösung pH 8,0
Ethidiumbromid 10 mg/ml
Bench Top 100bp DNA Leiter
Exonuklease I
Shrimp Alkaline Phosphatase
Big Dye Terminator v.3.1
NaAc (3M)
96 well Mikroplatte
Qiagen, Hilden
Epicentre Biotechnologies, Madison, USA
TIB MOLBIOL, Berlin
Applied Biosystem, Weiterstadt
Applied Biosystem, Weiterstadt
Applied Biosystem, Weiterstadt
Serva, Heidelberg
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Serva, Heidelberg
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Promega, Madison, Wisconsin, USA
USB, High Wycombe, UK
USB, High Wycombe, UK
Applied Biosystem, Weiterstadt
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Greiner, Frickenhausen
19
4.2 Laborgeräte
MSZ Minishaker (Vortex)
Thermomixer Compact
Biofuge pico (DNA-Extraktion)
Flex Cycler (PCR, Cycle Sequencing)
EPS 350 1XL (Gelelektrophorese)
Whatman, Gelelektrophoresekammern
Multimage II (Gelelektrophorese)
Centrifuge 5430R (Sequenzierung)
ABI 3100 Genetic Analyzer
IKA, Staufen
Eppendorf, Köln
Hereaus Instruments, Hanau
analytikjena, Jena
Amersham Pharmacia, Nümbrecht
Biometra, Göttingen
Alpha Innotech, Santa Clara, USA
Eppendorf, Köln
Applied Biosystem, Weiterstadt
4.3 DNA-Extraktion
Die Extraktion der DNA aus EDTA-Blut erfolgt entsprechend des Protokolls der Firma
Quiagen (Hilden). Die Lagerung des EDTA-Blutes wurde bei -20°C durchgeführt.
Aliquots der DNA Proben wurden für die Analysen aufgetaut und bei +4°C gelagert.
4.4 Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) dient der Vervielfältigung eines definierten
DNA-Abschnitts. Durch eine Temperaturerhöhung wird hierbei die DNA in-vitro in
Einzelstränge getrennt (denaturiert). Der Startpunkt der DNA-Synthese wird durch
einsträngige Primer, die sich der Original-DNA am 3`-Ende anlagern (Annealing),
markiert. Die Replizierung erfolgt durch temperaturbeständige DNA-Polymerasen
(Extension). Durch wiederholte Denaturierung und Extension kann eine exponentielle
Vermehrung des DNA-Produkts erreicht werden. Die beschriebene Methode wurde
von Mullis und Kollegen entwickelt (Mullis er al., 1986). Für die Herstellung eines
PCR-Reaktionsansatzes wurden 1,8 µl dNTPs (je 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), 2,5 µl MgCl2, 3 µl Puffer (GeneAmp10 x PCR-Puffer II), 0,15 µl AmpliTaq
DNA-Polymerase, 16 µl aqua dest. und je 0,3 µl Primer (vorwärts, rückwärts)
eingesetzt, so dass ein Gesamtvolumen von 25 µl erreicht wurde. Nach Zugabe der
DNA erfolgte die PCR in einem FlexCycler (analytikjena, Jena) mit folgendem
Programm: Initialisierung zur vollständigen Trennung der DNA-Stränge für 6 min bei
95°C. Anschließend 48 Zyklen mit: 20 sek Denaturierung bei 95°C, 40 sek Annealing
20
bei 62°C (primerspezifische Annealing-Temperaturen, siehe Tabelle 1) und 90 sek
Extension bei 72°C. Nach den 48 Zyklen wurde eine einmalige Extension für 6 min
bei 72°C durchgeführt. Anschließend wurden die Proben auf 10°C gekühlt.
Exon Primer F Primer R Temperatur
1-4 P 5’-CGCATAAACTGTTTCAGCTCCT-’3 5’-GCCGGCTAATTTTCGTTGTATT-’3 62
5-6 P 5’-TAGCCTTTGCACAATCCTGTGA-’3 5’-ATGTCTTTGCAGCCAGATATGC-’3 62
7 P 5’-TGCCCTTAGGCATACTTCTGAAA-’3 5’-TGCTGCAATCAAGGATTGGTTA-’3 62
1 S 5’-ACTGTTTCAGCTCCTACAGCTC-’3 62
2-3 S 5’-TGTCTCAGTTTGGAGAACAGCA-’3 62
4 S 5’-TGATAGAGTCAAGGTTTCACCT-’3 62
5 S 5’-TGGAAGTAAACCCAGAGGTCTCA-’3 62
6 S 5’-TCCCTGGCCTTCTTATTGTTGT-’3 62
7 S 5’-GCATATCTGGCTGCAAAGACAT-’3 62
Tabelle 1: Oligonukleotid-Sequenzen der Primer, die für die PCR (P) (oberer Teil der Tabelle) und für die Sequenzierung (S) (unterer Teil der Tabelle) verwendet wurden. Die jeweilige Annealing-Temperatur (letzte Spalte) ist in °C angegeben. Abbkürzungen: P=PCR, S=Sequenzierung, F=vorwärts, R=rückwärts.
4.5 Agarose-Gelelektrophorese
Das PCR-Produkt kann, aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA,
in einem elektrischen Feld aufgetrennt werden. Dabei wandern die Moleküle,
entsprechend ihrer Größe und Ladung, mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in
Richtung Pluspol. Durch Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente
bekannter Größe enthält und parallel im Agarose-Gel mitläuft, kann die Größe des
PCR-Produktes bestimmt werden. Die DNA Leiter bestand aus 4 µl Marker, 8 µl
DNA-Probenpuffer und 36 µl TBE-Puffer. Von dieser Lösung wurden 5 µl eingesetzt.
Mit dieser Methode wurde kontrolliert, ob das amplifizierte PCR-Produkt die richtige
Größe (in Basenpaaren) aufwies und ob die Amplifikation erfolgreich war. Hierfür
wurden von jeder 96 well Mikroplatte nach der PCR 16 Proben auf ein Agarose-Gel
aufgetragen. Bei entsprechend guter Amplifikation wurden die PCR-Produkte weiter
verarbeitet.
4.5.1 Herstellung der Agarose-Gelplatten
Das Agarose-Gel für eine Biometra-Platte beinhaltete 60 mg Agarose und 60 ml
1%igen TBE-Puffer. Zur Herstellung eines 10%igen TBE-Puffers wurden 108 g
21
Trisbase, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) vermengt und auf einen
Liter Reagenz mit aqua dest. aufgefüllt. Dann wurde der 10%ige TBE-Puffer mit aqua
dest. auf eine 1%ige Konzentration verdünnt. Die Flüssigkeit (Agarose und TBE-
Puffer) wurde für wenige Sekunden in einer Mikrowelle zum Kochen gebracht und
anschließend unter kaltem Wasser abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurden 2 µl
Ethidiumbromid beigefügt. Die Flüssigkeit wurde in die Platte, welche abgedichtet
und mit Kämmen zur Bildung von 18 Aussparungen in zwei Reihen versehen war,
eingefüllt. Anschließend fixierte das Agarose-Gel beim Auskühlen.
4.5.2 Gelelektrophorese des PCR-Produktes
Die verfestigten Gelplatten wurden nach Entfernung der Kämme in mit 1%igem TBE-
Puffer gefüllte Elektrophoresekammern (Biometra, Göttingen) eingebracht. In die
erste Aussparung wurden 3 µl Bench Top 100bp DNA Leiter als Kontrolle, in die
folgenden 5 µl angefärbtes PCR-Produkt pipettiert. In die beiden letzten
Aussparungen jeder Reihe wurde H2O als Negativkontrolle eingefüllt.
Die Färbung des PCR-Produkts wurde mit 1 µl DNA Probenpuffer gewährleistet. Die
Herstellung dieses Puffers erfolgte aus 4 g Sucrose, 400 µl 0,5 M EDTA-Lösung (pH
8,0), 500 µl 10% Sodiumdodecylsulfat und 0,005 g Bromphenolblau, welche auf die
Gesamtmenge von 10 ml mit aqua dest. aufgefüllt wurden. Die Elektrophorese
erfolgte bei 110 Volt und 100 Watt über 30 min. Das Ergebnis der Elektrophorese
wurde im Multimage II (Alpha Innotech, Santa Clara, USA) ausgewertet (siehe
Abbildung 4).
22
Abbildung 3: Agarose-Gel Elektrophorese des CTSL1 Exon 5-6. In der ersten Aussparung ist jeweils die als Referenz verwendete Basenleiter (BL) und in der letzten Aussparung die Wasserkontrolle (H2O) erkennbar. In den 16 Aussparungen zwischen den Basenleitern sind ingesamt 32 Proben von zwei 96 well Mikroplatten zur Kontrolle der PCR aufgetragen.
4.6 Aufreinigung des PCR-Produktes
Zur Entfernung von überschüssigen dNTPs, kurzen oligo-Fragmenten, Enzymen und
anderen Proteinen wurde das PCR-Produkt mit Exonuklease I und alkalischer
Phosphatase (shrimp alkaline phosphatase) aufgereinigt. Hierfür wurde im folgenden
Verhältnis eine Stammlösung hergestellt: 0,25 µl Exonuklease I, 0,25 µl alkalischer
Phosphatase und 0,5 µl aqua dest.. Zu 20 µl PCR-Produkt wurden 2 µl der
Stammlösung hinzugegeben. Anschließend wurden die Platten zentrifugiert um eine
ausreichende Durchmischung zu gewährleisten (Eppendorf Zentrifuge, Centrifuge
5430R). Die Aufreinigung erfolgte in einem FlexCycler (analytikjena, Jena) mit
folgendem Programm: 40 min bei 37°C (Aufreinigung) und 20 min bei 80°C
(Denaturierung der Enzyme).
4.7 Sequenzierung
Die Sequenzierung wurde nach der Didesoxymethode nach Sanger durchgeführt
(Sanger et al., 1977). Hierbei wurde ein DNA-Segment mittels PCR amplifiziert.
Anschließend wurde mit Hilfe von dNTPs, fluoreszensmarkierten ddNTPs, Primern
BL
BL
H2O
H2O
23
(beide Richtungen; bei unidirektionaler Sequenzierung lediglich eine Richtung) und
einer DNA-Polymerase das aufgereinigte PCR-Produkt linear vervielfältigt (cycle
sequencing). Während des cycle sequencing wird anstelle eines dNTP ein ddNTP
mit fehlender Hydroxygruppe am 3`-C-Atom eingebaut. Dies geschieht mit gleicher
Wahrscheinlichkeit in jedem Abschnitt des PCR-Produkts. An dieser Stelle bricht die
Kettenverlängerung ab. So entstehen fluoreszensmarkierte Fragmente jeder Länge,
deren endständige Basen mittels Photodetektion erkannt werden können. So kann
die vorhandene Basenabfolge in ihrer Sequenz dargestellt werden.
Die Zusammensetzung eines 20 µl-Ansatzes beinhaltete 3 µl PCR-Produkt (DNA-
template) (in Abhängigkeit von der Bandendicke in der Gelelektrophorese wurden
teilweise bis zu 6 µl eingesetzt), 14 µl aqua dest. (abhängig von der Menge des
eingesetzten PCR Produkt teilweise weniger), 1 µl Primer sowie 2 µl Big Dye
Termiator v.3.1. Das cycle sequencing wurde in einem FlexCycler (analytikjena,
Jena, Deutschland) mit nachstehendem Programm durchgeführt: Initialisierung für 3
min bei 95°C, anschließend 30 Zyklen mit 30 sek Denaturierung bei 95°C und 4 min
Annealing und Extension (Temperatur der Primer siehe Tabelle 1). Nach den Zyklen
wurde einmalig für 5 min bei 60°C extendiert und anschließend das Produkt auf 15°C
abgekühlt.
Zur Reinigung des cycle sequencing Produkts wurde eine Natriumacetat-Fällung
angesetzt. Hierbei wurden zum 20 µl-Ansatz 2 µl NaAc und 60 µl 96%iges Ethanol
pipettiert. Nach kurzem Vortexen wurde das Reagenz für 15 min bei
Raumtemperatur inkubiert und hinterher zentrifugiert. Abhängig, ob der Ansatz in
einzelnen Pipettiergefäßen oder in einer Platte (96 well Mikroplatte) angesetzt
worden war, erfolgte die Zentrifugation für 15 min bei 13.000/min (Biofuge pico,
Heraeus Instruments) bzw. 30 min bei 4.500/min (Centrifuge 5430R, Eppendorf). Der
Überstand wurde abpipettiert, 100 µl 70%iges Ethanol beigefügt und erneut für 5 min
bei 13.000/min bzw. 10 min bei 4.500/min zentrifugiert. Nach Entfernung des
Überstandes wurde das Pellet mittels Kapillar-Sequenzierung (ABI 3100 Genetic
Analyzer, Applied Biosystems, Weiterstadt) analyziert. Die Sequenzen wurden mit
dem Chromas Lite 2.01 Programm ausgedruckt und visuell von zwei Personen
ausgewertet. Ein Beispiel einer Sequenzierung (Elektropherogram) ist für eine
veränderte und eine Wildtyp-Sequenz in Abbildung 5 hiernach aufgeführt.
24
Abbildung 4: Elektropherogramm der c.5A>C (p.N2T) Variante (A) und einer Wildtyp-Probe. Mit dem Pfeil ist die Variante in der linken Abbildung (Austausch von Adenin (A) zu Cytosin (C) gekennzeichnet. In der rechten Abbildung ist die Wildtyp-Sequenz (Adenin) durch den Pfeil gekennzeichnet.
4.8 Statistik
Die statistischen Auswertungen wurden mit dem Fisher-Exakt-Test durchgeführt. P-
Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Berechnungen
erfolgten mit GraphPad Prism v4.03. Wenn angebracht, wurde eine Korrektur nach
Bonferroni durchgeführt. Haplotypen wurden mit PHASE v. 2.1 berechnet (Stephens
et al., 2001, Stephens et Scheet, 2005).
5 Ergebnisse
5.1 Sequenzierung des CTSL1 – Seltene Varianten
Bei 218 Patienten und 230 Kontrollen wurde eine komplette Sequenzierung der
kodierenden und nicht kodierenden Abschnitte des CTSL1 mittels uni-direktionaler
Sequenzierung durchgeführt.
Als selten wurde das Vorkommen von Varianten dann eingestuft, wenn sie bei
weniger als 1% der Patienten/Kontrollen nachgewiesen wurden. Hierbei wurden
Varianten der kodierenden als auch von nicht kodierenden Abschnitten
zusammengefasst. Insgesamt wurden elf Varianten detektiert. Die Varianten c.-
160C>T, c.5A>C (p.N2T, rs112682750), c.120C>T ((p.(=))), c.849C>T ((p.(=))),
c.993C>T ((p.(=))) und c.*11G>C wurden jeweils bei nur einem Patienten (1/218,
0,5%) nachgewiesen wohingegen die Varianten c.126+1G>A, c.785-215G>A,
c.852A>C ((p.(=))) und c.915A>C (p.E305D) bei jeweils nur einer Kontrollperson
(1/230, 0,4%) vorlagen. Die Variante c.785-250G>A in Intron 5 konnte sowohl bei
25
zwei Patienten (2/218, 0,9%) sowie einer Kontrolle (1/230, 0,4%) gefunden werden.
Vier der gefunden Varianten (c.120C>T, c.849C>T, c.993C>T, c.852A>C) führen auf
Proteinebene zu keinem Aminosäureaustausch und haben damit
höchstwahrscheinlich keine funktionelle Relevanz.
Die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750), welche bei einem Patienten gefunden
wurde, führt zu einem Austausch der Aminosäure Asparagin zu Threonin an Position
fünf des Proteins. Diese Variante ist in der NCBI-Datenbank (National Center for
Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov) hinterlegt und wurde somit bereits
bei gesunden Probanden nachgewiesen.
Die bei einer Kontrolle nachgewiesene Variante c.126+1G>A, liegt im Bereich der
Splice-Site des Intron 1. Im 5’-Bereich des Introns ist die konservierte Basenabfolge
GT für das „splicen“ durch das Spliceosom wichtig. Daher können Mutationen in
diesem Bereich die Expression des Gens beeinflussen. Eine weitere Variante
(c.915A>C, p.E305D), welche ebenfalls bei nur einer Kontrolle gefunden wurde,
bedingt an Position 305 des CTSL1 einen Aminosäureaustausch von Glutamin- zu
Asparaginsäure. In diesem Fall liegt also ein Austausch von chemisch sehr ähnlichen
Aminosäuren vor.
Insgesamt wurden in der Summe acht seltene Varianten bei Patienten (8/218, 3,7%)
und fünf bei Kontrollen (5/230, 2,2%) identifiziert. Somit kann für keine der einzelnen
Varianten eine statistisch signifikanter Unterschied in der Verteilung zwischen
Patienten und Kontrollen berechnet werden. Die gleiche Aussage gilt für den
Vergleich der Summe aller seltenen Varianten bei Patienten und Kontrollen. Die
Ergebnisse für die seltenen Varianten die bei den Analysen identifiziert wurden sind
in der nachfolgenden Tabelle (Tabelle 2) zusammengefasst.
26
Variante Position Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio
c.-160C>T Promoter 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -
c.5A>C p.N2T rs112682750
Exon1 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -
c.120C>T (p.(=))
Exon1 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -
c.126+1G>A Intron 1 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -
c.785-250G>A Intron 5 2/218 (0,9%) 1/230 (0,4%) n.s. -
c.785-215G>A Intron 5 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -
c.849C>T (p.(=))
Exon 6 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -
c.852A>C (p.(=))
Exon 6 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -
c.915A>C p.E305D
Exon 7 0/218 1/230 (0,4%) n.s. -
c.993C>T (p.(=))
Exon 7 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -
c.*11G>C 3’-UTR 1/218 (0,5%) 0/230 n.s. -
Summe 8/218 (3,7%) 5/230 (2,2%) n.s. -
Tabelle 2: Darstellung der seltenen nicht-synonymen, synonymen und in nicht kodierenden Abschnitten gelegenen Varianten des CTSL1. Die Nomenklatur der Varianten erfolgt nach Vorgabe der „Human Genome Variation Society“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Wenn vorhanden sind die „reference SNP“ Nummern (rs) angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test im dominanten und rezessiven Modell. Abbkürzungen: n.s.=nicht signifikant, UTR=untranslated region.
5.2 Häufige CTSL1- Varianten
Neben den bereits beschriebenen seltenen CTSL1-Varianten wurden häufige
Sequenzalterationen im Bereich der sequenzierten Region untersucht. Als häufig
wurden Frequenzen des selteneren Allels von >1% angesehen. Insgesamt wurden
anhand dieser Kriterien acht verschiedene CTSL1-Varianten gefunden.
Für die Varianten c.126+31C>T (rs2274611; Intron 1) und c.902+195A>C
(rs3128510; Intron 6) zeigte sich bei der Genotyp-Verteilung ein Unterschied
zwischen Patienten und Kontrollen. Der Genotyp CT der Variante c.126+31C>T
wurde bei 51,8% der Patienten (113/218) im Vergleich zu 40,9% bei Kontrollen
(94/230) nachgewiesen, wohingegen der Genotyp TT bei 19,7% der Patienten
(43/218) und bei 28,7% der Kontrollen (66/230) vorlag. Bei der Kalkulation der p-
Werte mittels Fisher-Exact Test resultierte im rezessiven Modell ein signifikanter p-
Wert (p=0,03, OR 1,6, 95% CI 1,1-2,5). Nach Bonferroni-Korrektur konnte der
signifikante p-Wert nicht aufrecht erhalten werden (p=0,24). Der Genotyp AC der
c.902+195A>C Variante wurde bei 51,7% der Patienten (104/201) und bei 40,5% der
27
Kontrollen (85/210) nachgewiesen. Der Genotyp CC zeigte sich bei 20,9% der
Patienten (42/201) und bei 30% der Kontrollen (63/210). Hier ergab sich im
rezessiven Modell ebenfalls ein statistisch signifikanter p-Wert (p=0,04, OR 1,6, 95%
CI 1,0-2,6) der nach Korrektur keinen Bestand hatte (pc=0,32).
Für alle häufigen Varianten führten wir eine Berechnung nach Hardy-Weinberg
durch. Dabei zeigten sich Abweichungen vom diesem Gleichgewicht (p<0,05) bei
den Kontrollen in Variante c.126+31C>T (rs2274611) und c.402G>A ((p(.=))) mit
Werten von p= 0,0057 und p=0,0074. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle (Tabelle 3) zusammengefasst.
Variante Genotyp Position Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio
c.-43C>G rs10123692
CC
Promoter
204/218 (93,6%) 217/230 (94,3%)
n.s. - CG 14/218 (6,4%) 13/230 (5,7%)
GG 0 0
c.126+31C>T
rs2274611
CC
Intron 1
62/218 (28,4%) 70/230 (30,4%)
n.s.* - CT 113/218 (51,8%) 94/230 (40,9%)
TT 43/218 (19,7%) 66/230 (28,7%)
c.402G>A (p(.=))
GG
Exon 4
203/217 (93,5%) 213/230 (92,6%)
n.s. - GA 14/217 (6,5%) 15/230 (6,5%)
AA 0 2/230 (0,9%)
c.621+56A>C
rs2378757
AA
Intron 4
88/217 (40,6%) 102/229 (44,5%)
n.s. - AC 108/217 (49,8%) 93/229 (40,6%)
CC 21/217 (9,7%) 34/229 (14,8%)
c.621+62T>G
TT
Intron 4
203/217 (93,6%) 216/229 (94,3%)
n.s. - TG 14/217 (6,4%) 13/229 (5,7%)
GG 0 0
c.621+79G>A
GG
Intron 4
203/217 (93,6%) 216/229 (94,3%)
n.s. - GA 14/217 (6,4%) 13/229 (5,7%)
AA 0 0
c.622-172T>C rs2296958
TT
Intron 4
202/217 (93,8%) 162/171 (94,7%)
n.s. - TC 15/217 (6,9%) 9/171 (5,3%)
CC 0 0
c.902+195A>C rs3128510
AA
Intron 6
55/201 (27,4%) 62/210 (29,5%)
n.s.& - AC 104/201 (51,7%) 85/210 (40,5%)
CC 42/201 (20,9%) 63/210 (30%)
Tabelle 3: Darstellung der Gentoyp Verteilung häufiger Varianten (Frequenz des selteneren Allels größer als 1%) des CTSL1. Die Nomenklatur der Varianten erfolgt nach Vorgabe der „Human Genome Variation Society“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Wenn vorhanden sind die „reference SNP“ Nummern (rs) angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test im dominanten und rezessiven Modell. Für die Varianten c.126+31C>T und c.902+195A>C zeigt sich bei der Berechnung des p-Wertes im rezessiven Model eine statistische Signifikanz (p=0,03, OR 1,6, 95% CI 1,1-2,5; p=0,04, OR 1,6, 95% CI 1,0-2,6). Nach Bonferroni Korrektur konnte die statistische Signifikanz nicht aufrecht erhalten werden (pc=0,24; pc=0,32).Abbkürzungen: n.s.=nicht signifikant.
Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Varianten wurden sechs Varianten c.-
43C>G (rs10123692), c.402G>A ((p(.=))), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G,
c.621+79G>A und c.622-172T>C (rs2296958) detektiert, von denen keine zu einer
28
Änderung der Aminosäuresequenz des CTSL führt. Diese Varianten zeigten in ihrem
Genotypverteilungsmuster nicht signifikante Unterschiede zwischen Patienten und
Kontrollen. Die Varianten c.621+62T>G und c.621+79G>A werden gekoppelt vererbt
und wiesen in unseren Kollektiven einen Korrelationskoeffizient von 1 auf (r=1). Auch
der in der Promotorregion gelegene SNP c.-43C>G (rs10123692) wurde bei
Patienten und Kontrollen mit vergleichbarer Frequenz nachgewiesen.
5.3 Allelfrequenz der häufigen CTSL1-Varianten
Zusätzlich zur Analyse der Genotypen führten wir bei den häufigen Varianten eine
Analyse der Allelfrequenzen durch.
Hierbei zeigten sich bei allen untersuchten Varianten (c.-43C>G (rs10123692),
c.402G>A ((p(.=))), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A, c.622-
172T>C (rs2296958, c.126+31C>T (rs2274611) c.902+195A>C (rs3128510)) im
Vergleich zwischen Patienten und Kontrollen keine signifikanten Unterschiede. Die
Kalkulationen wurden mittels Fisher-Exact Test durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 4 aufgelistet.
Variante Allelfrequenz Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio
c.-43C>G rs10123692
C 422/436 (96,8%) 447/460 (94,3%) n.s. -
G 14/436 (3,2%) 13/460 (5,7%)
c.126+31C>T rs2274611
C 237/436 (54,4%) 234/460 (50,9%) n.s. -
T 199/436 (45,6%) 226/460 (49,1%)
c.402G>A (p.(=))
G 420/434 (96,8%) 441/458 (95,9%) n.s. -
A 14/434 (3,2%) 19/458 (4,1%)
c.621+56A>C rs2378757
A 284/434 (65,4%) 297/458 (64,8%) n.s. -
C 150/434 (34,6%) 161/458 (35,2%)
c.621+62T>G T 420/434 (96,8%) 445/458 (97,2%)
n.s. - G 14/434 (3,2%) 13/458 (2,8%)
c.621+79G>A G 420/434 (96,8%) 445/458 (97,2%)
n.s. - A 14/434 (3,2%) 13/458 (2,8%)
c.622-172T>C rs2296958
T 419/434 (96,5%) 333/342 (97,4%) n.s. -
C 15/434 (3,5%) 9/342 (2,6%)
c.902+195A>C rs3128510
A 214/402 (53,2%) 209/420 (49,8%) n.s. -
C 188/402 (46,8%) 211/420 (50,2%)
Tabelle 4: Darstellung der Allelfrequenzen häufiger Varianten (Frequenz des selteneren Allels größer als 1%) des CTSL1. Die Nomenklatur der Varianten erfolgt nach Vorgabe der „Human Genome Variation Society“ (http://www.hgvs.org/mutnomen/). Wenn vorhanden sind die „reference SNP“ Nummern (rs) angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test. Abbkürzungen: n.s.=nicht signifikant.
29
Für die Varianten c.126+31C>T (rs2274611) und c.902+195A>C (rs3128510) zeigte
sich, ähnlich wie bei den Genotypen, ein Unterschied in der Verteilung der
Allelfrequenzen, welcher jedoch statistisch nicht signifikant war (c.126+31C>T:
Patienten: C-Allel 237/436, 54,4%; T-Allel 199/436 (45,6%); Kontrollen: C-Allel
234/460 (50,9%), T-Allel 226/460 (49,1%)) (c.902+195A>C: Patienten: A-Allel
214/402 (53,2%), C-Allel 188/402 (46,8%); Kontrollen: A-Allel 209/420 (49,8%), C-
Allel 211/420 (50,2%).
5.4 Haplotypenanalyse des CTSL1
Unter Einbeziehung der CTSL1 Varianten mit einer Allelfrequenz von mehr als einem
Prozent (siehe Tabelle 3 und 4) führten wir eine Haplotypenanalyse mittels PHASE v.
2.1 durch.
Bei der Haplotypenberechnung wurden folgende Varianten berücksichtigt: c.-43C>G
(rs10123692), c.126+31C>T (rs2274611), c.402G>A ((p.(=))), c.621+56A>C
(rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A, c.622-172T>C (rs2296958),
c.902+195A>C (rs3128510). Die Abfolge der Basensequenz der Haplotypen
entspricht der Abfolge der aufgeführten Varianten (beispielsweise Position 1
innerhalb eines Haplotyps wird durch die Variante c.-43C>G definiert usw.).
Insgesamt wurden 13 verschiedene Haplotypen identifiziert, wobei bei Patienten
neun und bei Kontrollen zwölf verschiedene Haplotypen ermittelt wurden. Acht dieser
Haplotypen wurden sowohl bei Patienten als auch bei Kontrollen gefunden. In der
Summation entsprechen diese acht Haplotypen einem Prozentanteil von 99,8% bei
Patienten und 98,5% bei Kontrollen.
Einzeln hatten diese acht Haplotypen, aufgelistet in der absteigenden Häufigkeit
ihres Auftretens, folgende Nukleotidreihenfolge und Verteilung: Haplotyp 11: C-T-G-
C-T-G-T-C (Patienten: 195/436 (44,7%), Kontrollen: 219/460 (47,6%)), Haplotyp 1:
C-C-G-A-T-G-T-A (Patienten: 149/436 (34,2%), Kontrollen: 155/460 (33,7%)),
Haplotyp 3: C-C-G-C-T-G-T-A (Patienten: 55/436 (12,6%), Kontrollen: 40/460
(8,7%)), Haplotyp 6: C-C-A-C-T-G-T-A (Patienten: 14/436 (3,2%), Kontrollen: 17/460
(3,7%)), Haplotyp 12: G-C-G-C-G-A-C-A (Patienten: 14/436 (3,2%), Kontrollen:
12/460 (2,6%)), Haplotyp 4: C-C-G-C-T-G-T-C. (Patienten: 4/436 (0,9%), Kontrollen:
5/460 (1,1%)), Haplotyp 10: C-T-G-C-T-G-T-A (Patienten: 2/436 (0,5%), Kontrollen:
30
3/460 (0,7%)) und Haplotyp 8: C-T-G-A-T-G-T-A (Patienten: 2/436 (0,5%),
Kontrollen: 2/460 (0,4%)).
Die restlichen Haplotypen fanden sich jeweils entweder nur bei Patienten oder
Kontrollen und wiesen eine Frequenz von unter einem Prozent auf. Der Haplotyp fünf
(Haplotyp 5: C-C-G-C-T-G-C-A) konnte bei ausschließlich einem Patienten (1/436
(0,2%)) nachgewiesen werden. Die Haplotypen zwei, sieben, neun und dreizehn
(Haplotyp 2: C-C-G-A-T-G-T-C (2/460 (0,4%)), Haplotyp 7: C-C-A-C-T-G-T-C (2/460
(0,4%)), Haplotyp 9: C-T-G-A-T-G-T-C (2/460 (0,4%)) und Haplotyp 13: G-C-G-C-G-
A-C-C (1/460 (0,2%)) traten ausschließlich bei Kontrollen auf. Die Ergebnisse der
Analysen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Haplotyp Nukleotidreihenfolge Patienten Kontrollen P-Wert Odds-ratio
1 C-C-G-A-T-G-T-A 149/436 (34,2%) 155/460(33,7%) n.s. -
2 C-C-G-A-T-G-T-C 0 2/460 (0,4%) n.s. -
3 C-C-G-C-T-G-T-A 55/436 (12,6%) 40/460 (8,7%) n.s. -
4 C-C-G-C-T-G-T-C 4/436 (0,9%) 5/460 (1,1%) n.s. -
5 C-C-G-C-T-G-C-A 1/436 (0,2%) 0 n.s. -
6 C-C-A-C-T-G-T-A 14/436 (3,2%) 17/460 (3,7%) n.s. -
7 C-C-A-C-T-G-T-C 0 2/460 (0,4%) n.s. -
8 C-T-G-A-T-G-T-A 2/436 (0,5%) 2/460 (0,4%) n.s. -
9 C-T-G-A-T-G-T-C 0 2/460 (0,4%) n.s. -
10 C-T-G-C-T-G-T-A 2/436 (0,5%) 3/460 (0,7%) n.s. -
11 C-T-G-C-T-G-T-C 195/436(44,7%) 219/460(47,6%) n.s. -
12 G-C-G-C-G-A-C-A 14/436 (3,2%) 12/460 (2,6%) n.s. -
13 G-C-G-C-G-A-C-C 0 1/460 (0,2%) n.s. -
Tabelle 5: Darstellung der Ergebnisse der Haplotypen-Berechnung mittels PHASE v.2.1. Für die Berechnungen wurden nur Varianten mit einer Allelfrequenz von >1% des selteneren Allels berücksichtigt (Darstellung in den Haplotypen erfolgte in der Reihenfolge: c.-43C>G (rs10123692), c.126+31C>T (rs2274611), c.402G>A (p.(=)), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A, c.622-172T>C (rs2296958), c.902+195A>C (rs3128510)). In Tabelle 4 ist die Verteilung der Varianten bei Patienten und Kontrollen ersichtilich. Insgesamt wurden 13 Haplotypen identifiziert. Die Reihenfolge der Nukleotide ist hinter dem jeweiligen Haplotyp angegeben. Die statistischen Berechnungen erfolgten mittels Fisher-Exact-Test. Abkürzungen: n.s.=nicht signifikant.
31
6 Diskussion
6.1 Seltene nicht-synonyme und synonyme Varianten des CTSL1
Bei unserer umfangreichen genetischen Analyse des CTSL1 mittels uni-direktionaler
Sequenzierung der kodierenden Abschnitte und der Exon-Intron Übergänge konnten
wir drei seltene nicht-synonyme Varianten, die eine funktionelle Beeinträchtigung der
CTSL-Funktion bewirken könnten, nachweisen.
So führt die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750) im Exon 1 zu einem
Aminosäureaustausch von Asparagin zu Threonin an Position zwei des Proteins.
Diese Variante wurde ausschließlich bei einem Patienten nachgewiesen und könnte
aufgrund des Aminosäureaustauschs zu einer Funktionsänderung des CTSL führen.
Ob dieser Austausch zu einer Zunahme oder einer Abnahme der CTSL Funktion
führt ist unklar. Nennenswert ist, dass diese Variante in der NCBI-Datenbank
(National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov) hinterlegt ist,
und somit im Rahmen der Genomanalyse auch bereits bei einem gesunden
europäischen Probanden nachgewiesen wurde. Daher ist ein krankheitsauslösender
Effekt für diese Variante unwahrscheinlich.
Eine weitere möglicherweise mit einem Funktionsverlust einhergehende Variante
könnte c.126+1G>A darstellen. Diese liegt im Bereich der Splice-Site des Exon 1,
welche beim Splicen die Grenze zwischen Exon und Intron darstellt. Die Sequenzen
von Splice-Sites werden vom Spliceosom spezifisch erkannt und entfernt. Dabei ist
die hochkonservierte Basenabfolge GT im 5’-Bereich des Introns für die
ordnungsgemäße Funktion des Spliceosoms wichtig. Da die Variante c.126+1G>A in
jenem GT-Basenbereich liegt, ist es möglich, dass der Austausch von Guanin zu
Adenosin zu einem inkorrekten Splicevorgang führt. Hierdurch könnte der „splice“-
Vorgang gestört werden, was wiederum zu einer mangelnden Synthese von CTSL1
oder zu einer Synthese von in seiner Funktion eingeschränktem CTSL1 führen
könnte. Insgesamt wurde diese Variante jedoch nur bei einer Kontrollperson (0,4%;
1/230) nachgewiesen. Daher müsste diese Variante vor CP schützen, jedoch scheint
der Effekt dieser Variante für den Schutz vor CP eher vernachlässigbar.
Darüberhinaus kann diskutiert werden ob die Variante c.126+1G>A trotz ihrer Lage
keinen Funktionsverlust von CTSL bedingt, oder der Funktionsverlust von CTSL
phänotypisch keine pathologischen Konsequenzen hat.
32
Die dritte identifizierte nicht-synonyme Variante (c.915A>C, p.E305D) bedingt an
Position 305 des CTSL1 einen Aminosäureaustausch von Glutamin- zu
Asparaginsäure. Dieser Austausch könnte ebenfalls zu einem Funktionsverlust von
CTSL führen. Da diese Variante nur bei einer Kontrolle gefunden wurde und es sich
in diesem Fall um einen Austausch von chemisch sehr ähnlichen Aminosäuren
handelt, scheint ein relevanter Ausfall der CTSL-Funktion eher unwahrscheinlich.
Auch diese Variante müsste vor CP schützen, da sie lediglich bei einer Kontrolle
gefunden wurde.
Summiert man die nicht-synonymen Varianten bei Kontrollen (0,9%, 2/230) und bei
Patienten (0,5%, 1/218) zeigt sich kein statistisch signifikanter Unterschied in der
Verteilung der Varianten bei Patienten und Kontrollen. Ebenso wird die Schwierigkeit
der Interpretation der im Tiermodell erhobenen Daten verdeutlicht, da nicht-
synonyme Varianten bei Kontrollen und Patienten gefunden wurden. Bei
experimentell induzierter Pankreatitis zeigte sich im Tiermodell bei Ctsl-/- Mäusen ein
milderer Verlauf der Pankreatitis bei erhöhter Trypsinaktivität. Dieser Effekt wurde
durch eine vermehrte Apoptose anstelle von Nekrose erklärt. Demzufolge könnten
Varianten, die zu einem Funktionsverlust des CTSL (wie möglicherweise
c.126+1G>A oder p.E305D) führen, vor der Entstehung einer CP schützen
beziehungsweise den Verlauf einer akuten Pankreatitis mildern. Andererseits
müssten Varianten, die eine Funktionszunahme bedingen (wie möglicherweise
p.N2T) zur CP prädisponieren oder den Verlauf einer akuten Pankreatitis negativ
beeinflussen. Kompliziert wird diese Modellvorstellung durch die Tatsache, dass
möglicherweise Varianten mit einem Funktionsverlust nur bis zu einem bestimmten
Schwellenwert schützend wirken, da die fehlende Trypsin Inaktivierung zu vermehrter
Apoptose anstelle von Nekrose führt. Wird diese Schwelle jedoch überschritten,
sprich zu viel Trypsin aktiv, könnte es zu einer CP oder einer schwer verlaufenden
akuten Pankreatitis kommen.
Trotz der schwierigen Datenlage bezüglich der möglichen funktionellen
Konsequenzen der gefundenen nicht-synonymen Varianten, scheint eine genetische
Assoziation von CTSL1-Varianten zur CP unwahrscheinlich. Selbst eine Ausdehnung
des untersuchten Kollektivs wird, aus unserer Sicht, keinen zusätzlichen Nutzen
bringen, da die Datenlage gegen eine Rolle von CTSL1 Varianten bei CP spricht.
Neben den nicht-synonymen Varianten wurden noch weitere synonyme und im
Promoter bzw. Intron lokalisierte seltene Varianten detektiert.
33
Summiert man diese Varianten bei Patienten (3,2%, 7/218) und bei Kontrollen (1,3%,
3/230) sind diese häufiger bei Patienten zu finden, jedoch ist der Unterschied in der
Verteilung nicht statistisch signifikant. Aufgrund der Häufigkeit und der Lage der
Varianten im CTSL1 scheint es unwahrscheinlich, dass eine funktionelle Relevanz
besteht. Auch die Summation aller seltenen Varianten bei Patienten (3,7%, 8/218)
und bei Kontrollen (2,2%, 5/230) erbrachte keinen statistisch signifikanten
Unterschied in der Verteilung.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse keine Assoziation von seltenen nicht-
synonymen und/oder synonymen CTSL1-Varianten mit der CP.
6.2 Häufige Varianten des CTSL1
Neben den seltenen Varianten konnten im untersuchten Bereich acht weitere
Varianten mit einer Allelfrequenz des selteneren Allels von über einem Prozent
nachgewiesen werden. Diese Varianten wurden als häufige CTSL1-Varianten
bezeichnet. Bei zwei dieser Varianten (c.126+31C>T, rs2274611; c.902+195A>C,
rs3128510) fiel ein Unterschied in der Verteilung bei Patienten und Kontrollen auf.
Bei der c.126+31C>T Variante war der CT-Genotyp häufiger bei Patienten (51,8%,
113/218) als bei Kontrollen (40,9%, 94/230) zu finden, wohingegen der TT-Genotyp
häufiger bei Kontrollen (28,7%, 66/230) als bei Patienten (19,7%, 43/218) zu finden
war. Für diese Variante konnte in der Berechnung mittels Fisher-Exact Test in einem
rezessiven Modell (CC+CT vs. TT) ein signifikanter p-Wert berechnet werden
(p=0,03). Da insgesamt acht Varianten untersucht wurden, ist eine Korrektur
notwendig, welche wir nach Bonferroni durchführten. Hiernach ergab sich kein
signifikanter p-Wert. Ähnliches zeigte sich für die Variante c.902+195A>C. Hier
wurde der AC-Genotyp häufiger bei Patienten (51,7%, 104/201) als bei Kontrollen
(40,5%, 85/210) gefunden, wohingegen der CC-Genotyp häufiger bei Kontrollen
(30%, 63/210) als bei Patienten (20,9%, 42/201) nachgewiesen wurde. Auch hier
zeigte sich im rezessiven Modell (AA+AC vs. CC) ein signifikanter p-Wert (p=0,04),
der nach Bonferroni Korrektur keinen Bestand hatte. Betrachtet man die
ursprünglichen p-Werte für beide Varianten (p=0,03; p=0,04) erkennt man, dass die
initial beschriebene Signifikanz schwach war. Dies bestätigt aus unserer Sicht die
nach der Korrektur fehlende Assoziation zur CP. Alle übrigen Varianten zeigten eine
34
ähnliche Verteilung bei Patienten und Kontrollen. Ebenso waren in den statistischen
Auswertungen keine signifikanten p-Werte zu berechnen.
Zur weiteren Abklärung einer Assoziation eines Allels der häufigen Varianten wurde
eine Analyse der Allelfrequenzen durchgeführt. Hier zeigte ebenfalls keine der
Varianten einen signifikanten Unterschied in der Verteilung. Dies galt auch für die
Varianten c.126+31C>T und c.902+195A>C.
6.3 Hardy-Weinberg Gleichgewicht
Bei der Berechnung des Hardy-Weinberg-Equillibrium stellten wir bei den Kontrollen
für die Varianten c.126+31C>T (rs2274611) und c.402G>A ((p(.=))) eine
Abweichung des Gleichgewichts (p<0,05) fest. Bei der c.126+31C>T Variante
errechnete sich dabei aus den Genotypvarianten (CC: 70/230, 30,4%; CT: 94/230,
40,9% und TT: 66/230, 28,7%) ein Wert von p=0,0057. Dieser SNP ist bereits in der
HapMap Datenbank hinterlegt. Aus der Genotypverteilung dieses SNPs, welcher
bereits bei 113 Europäern aus der Population HapMap-CEU, ss52074640 (National
Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov) (CC: 35,4%, CT: 40,7%
und TT: 23,9%) nachgewiesen wurde, errechnete sich für dieses Kollektiv in Bezug
auf das Hardy-Weinberg-Equilibrium ein p-Wert von 0,0597. Somit zeigte sich auch
in diesem Kollektiv nur ein grenzwertig eingehaltenes Hardy-Weinberg-Equilibrium
und die angegebenen Prozentzahlen wichen nur geringfügig von den von uns
erhobenen Werten ab.
Die zweite Variante die nicht im Hardy-Weinberg Gleichgewicht lag (c.402G>A)
zeigte einen p-Wert von 0,0074. Diese Abweichung wird durch die zufällig
aufgetretene, doppelte Detektierung des homozygoten Genotyps (c.402AA) für die
Variante erklärt. Dieser Fehler ist ebenfalls in der geringen Anzahl der Kontrollen zu
suchen.
Um methodische Fehler gering zu halten, haben wir eine ständige Qualitätskontrolle
bei unseren genetischen Analysen implementiert. Hierzu werden je 96er Platte
neben sechs Wasserkontrollen an fünf Positionen Qualitätskontrollen auf die Platten
pipettiert. Hierbei handelt es sich um Proben die an anderer Stelle ein zweites Mal
auf der jeweiligen Platte zu finden sind. Somit überprüfen wir bei 5,6% der Proben
(5/90) ob das Ergebnis der Genotypisierung stimmt. Bei der Analyse des CTSL1
zeigte sich für alle Qualitätskontrollen ein identisches Ergebnis im Vergleich zur
35
Vergleichsprobe. Daher ist davon auszugehen, dass bei den Varianten, die nicht im
Hardy-Weinberg Gleichgewicht sind die Probengröße zu klein war und somit ein
zufälliger Fehler besteht. Da die Aussage der Ergebnisse durch eine Ausdehnung
der analysierten Kontrollen für diese Varianten (c.126+31C>T, c.402G>A) mit hoher
Wahrscheinlichkeit nicht verändert werden, wurde von weiteren Analysen
abgesehen.
6.4 Haplotypen-Analyse
Unter Einbeziehung der häufigen Varianten wurden Haplotypen berechnet.
Insgesamt konnten 13 Haplotypen identifiziert werden. Fünf der identifizierten
Haplotypen machen über 96% der gesamten identifizierten Haplotypen aus. Bei der
Verteilung der Haplotypen zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen Patienten und Kontrollen. Da die Haplotypen aus den häufigen Varianten
berechnet wurden und sich bei diesen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede
zwischen Patienten und Kontrollen zeigten, konnte dieses Ergebnis erwartet werden.
Dennoch ist die Berechnung der Haplotypen sinnvoll, weil durch sie zusätzliche
Informationen über die Vererbung des Genabschnitts auf dem CTSL1 lokalisiert ist,
erhalten werden. Im menschlichen Genom findet sich alle 100-300 Basenpaare ein
Austausch von Basen. Diese sind in den meisten Fällen ohne funktionelle Relevanz.
Da das menschliche Genom in sogenannten Haplotyp-Blöcken vererbt wird, kann die
Information dieser SNPs genutzt werden Hinweise auf mögliche funktionell relevante
Varianten innerhalb einer Region zu bekommen. Die von uns untersuchten
Haplotypen umfassten vom Promoter des CTSL1 bis hin zur 3’-Region Varianten, so
dass die Region umfangreich abgebildet wurde. Dementsprechend konnte auch
durch dieses Verfahren keine Assoziation von Varianten des CTSL1 mit der CP
beschrieben werden.
6.5 Promoter-Varianten des CTSL1 und deren funktionelle Konsequenz
In den letzten Jahren wurde in mehreren Studien die Regulation der Transkription
des CTSL1 untersucht. In einer 2001 veröffentlichten Arbeit wurden drei
verschiedene menschliche Cathepsin L Formen nachgewiesen, die sich in der Länge
des Exons 1 unterscheiden (hCTSL1-A 278 Nukleotide; hCTSL1-A2 188 Nukleotide;
hCTSL1-A3 132 Nukleotide), wobei die kürzeste Variante am häufigsten gefunden
36
wird (Abudula et al., 2001). Ebenso zeigte sich bei dieser Variante die höchste CTSL
Aktivität. Unsere Analysen deckten diese Variante ab, wohingegen wir die UTR-
Region („untranslated region“) im 5’-Bereich nicht untersuchten. Daher ist es möglich,
dass in diesem Bereich der 5’-Region regulatorische Varianten vorliegen, die die
Expression des CTSL1 beeinflussen und mit der CP assoziiert sind. Da unsere
Haplotypen Analyse zu einem Teil die 5’-Region mit abdeckt, scheint dies jedoch
unwahrscheinlich. Ebenso sind in der Literatur bisher keine Varianten in dieser
Region beschrieben, die mit Erkrankungen assoziiert sind.
Regulatorische Elemente im Promoter des CTSL1 scheinen im Bereich -1489 bis -
1646 „upstream“ des Translationsbeginns zu liegen (Jean et al., 2002). Hier konnten
in einer Arbeit zwei „GC-Boxen“ und ein „CCAAT-Motiv“ nachgewiesen werden, die
Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren darstellten (Sp1, Sp3, Nuclear factor Y).
Wie bereits erwähnt, könnten auch in diesem Bereich genetische Veränderungen die
Transkription des CTSL1 beeinflussen. Aus unserer Sicht scheint dies aber
unwahrscheinlich.
6.6 Ausblick
Als Mechanismus, welcher der Pankreatitis zugrunde liegt, wird eine
Selbstverdauung durch intrapankreatisch aktivierte Verdauungsenzyme
angenommen. Unter physiologischen Bedingungen ist das Pankreas durch eine
Vielzahl von Mechanismen geschützt. Dazu gehört beispielsweise die separate
Speicherung von Verdauungsenzymen als inaktive Zymogene in Vesikeln, das
Vorkommen von Proteaseinhibitoren wie SPINK1 oder die lokale Trennung des im
Duodenum vorkommenden, physiologischen Trypsinaktivator Enterokinase vom
Pankreas.
Eine besondere Rolle bei der Entstehung einer CP wird der Aktivierung von
Trypsinogen beigemessen, da es in der Lage ist, auch andere proteolytisch wirksame
Enzyme zu aktivieren. Wichtige Gene, die bereits in Zusammenhang mit CP und
erhöhter intrapankreatischer Trypsinaktivität gebracht werden konnten, sind PRSS1, ,
SPINK1 und CTRC.
Ein weiterer Mechanismus scheint die Aktivierung von Trypsinogen durch das
lysosomale Enzym CTSB zu sein. Dieser konnte sowohl in vitro als auch in vivo
37
bestätigt werden und soll bei Ctsb-/- Mäusen zu einem verminderten Schweregrad
der Pankreatitis führen.
Eine Voraussetzung für die Trypsinogenaktivierung ist eine Kolokalisation von in
Vesikeln befindlichen Zymogenen und lysosomalen CTSB. In der Theorie geht man
davon aus, dass die Kolokalisation als krankheitsauslösender Effekt gelten könnte,
welcher in der Frühphase der Pankreatitis zur Zymogenaktivierung und Schädigung
der Azinuszellen führt. Dieser Vorgang ist beim Menschen leider nicht zu
untersuchen, da beim Patienten mit akuter Pankreatitis erst nach dieser frühen
Phase, in welcher die Kolokalisation stattfinden sollte, Symptome auftreten. Die
Kolokalisation wurde daher in vielen Studien anhand von Tiermodellen untersucht.
Sie konnte dabei in unterschiedlichen Tiermodellen unabhängig von der induzierten
Pankreatitisart in der Frühphase, noch bevor eine Zellverletzung/Nekrose auftrat,
nachgewiesen werden. In diesen Studien konnte man drei wesentliche Mechanismen
identifizieren, die zu einer Kolokalisation führten: (1) Verschmelzung von
Zymogengranula mit Lysosomen und (2) defekte Sortierung von lysosmalen
Proteasen und Zymogenen im Golgi-Apparat sowie (3) Wiederaufnahme von bereits
sezernierten Verdauungsenzymen über Endozytose in die Azinuszelle und
anschließender Verschmelzung mit Lysosomen.
Das Zustandekommen der Kolokalisation ist in Abbildung 5 schematisch dargestellt
und zeigt somit neue Möglichkeiten auf, die die Entstehung einer Pankreatitis
erklären könnten.
38
Abbildung 5: Schematische Darstellung einer Azinuszelle mit physiologischen und pathologischen Mechanismen der Kolokalisation von Zymogenen und Proteasen. Kolokalisation kann zustande kommen durch eine (1) Falschverteilung von Zymogenen und lysosomalen Proteasen im Golgi-Apparat und durch (2) Fusion von Zymogengranula und Lysosomen sowie durch (3) Wiederaufnahme von bereits sezernierten Zymogenen in Lysosomen. Im Zentrum der Darstellung befindet sich die rupturierte Vakuole (RV) mit freigesetzten, aktivierten Verdauungsenzymen. (ER=endoplasmatisches Retikulum, N=Nukleus, LYS=Lysosomen, KV=kondensierende Vakuolen und ZG=Zymogengranula) Die Abbildung wurde nach Vorlage von Acker et al. modifiziert (van Acker et al., 2006).
Für CTSB konnte in genetischen Studien keine Assoziation nachgewiesen werden.
Daher war es naheliegend die am zweithäufigsten vorkommende Protease CTSL
genetisch näher zu charakterisieren, da interessante funktionelle Daten vorlagen.
Unsere umfangreiche Analyse spricht gegen eine Rolle von CTSL1 Varianten bei der
Pathogenese der CP.
Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre mit Entwicklung der Ko-
Lokalisationstheorie zeigen eindrucksvoll auf, dass die Entstehung einer Pankreatitis
möglicherweise auf vielen Wegen erfolgen kann. Andererseits ist es denkbar, dass
manche Mechanismen, die in den letzten Jahren untersucht wurden, für die
Krankheitsentstehung nicht relevant sind, weil sie möglicherweise durch andere
Mechanismen kompensiert werden können.
Interessanterweise zeigte sich im Tiermodell bei Mäusen mit erhöhter
intrapankreatischer Trypsinaktivität keine CP, sondern eine vermehrte Apoptose und
Zeichen einer akuten Pankreatits (Gaiser et al., 2011). Auch wenn die genetischen
39
Daten des Menschen auf eine zentrale Rolle des Trypsin und den Abbau frühzeitig
aktivierten Trypsin hindeuten, könnten andere Mechanismen die Entstehung der
Erkrankung mit beeinflussen. So könnte es beispielsweise zur fehlerhaften Bildung
von Zymogengranula kommen, die zu einer intrapankreatischen Freisetzung und
Aktivierung von Trypsinogen führt. Auch die verschiedenen an der Ko-Lokalisation
von Zymogenen und Proteasen beteiligten Proteine stellen interessante Kandidaten
dar. In der Zukunft wird die größte Schwierigkeit sicherlich weiterhin darin liegen,
dass nahezu alle funktionellen Daten nur in artifiziellen in vitro oder in in vivo
Modellen erhoben werden können, weil eine Untersuchung am Menschen oder an
menschlichem Gewebe kaum möglich ist.
Zusammengefasst wurden in unserer Studie keine signifikanten Unterschiede in der
Genotypverteilung von CTSL1-Varianten zwischen Patienten mit idiopathischer oder
hereditärer Pankreatitis im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen nachgewiesen.
Die Arbeit konnte somit keine Assoziation zwischen einem Funktionsverlust des
CTSL1 und der CP unterschiedlicher Ätiologie herstellen.
40
7 Zusammenfassung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
Genetische Analyse des Cathepsin L bei chronischer Pankreatitis
eingereicht von: Max Herms
angefertigt am: Department für Innere Medizin, Neurologie und Dermatologie,
Klinik und Poliklinik für Gastroenterologie und Rheumatologie
Universitätsklinikum Leipzig AöR
Klinikdirektor Prof. Dr. med. Joachim Mössner
betreut von: Prof. Dr. med. Joachim Mössner
mitbetreut von: Dr. med. Jonas Rosendahl
eingereicht: 10/2011
Als chronische Pankreatitis (CP) bezeichnet man eine wiederkehrende, entzündliche
Erkrankung des Pankreas, welche in eine endokrine und/oder exokrine Insuffizienz
münden kann. Häufigster Auslöser einer CP ist in den westlichen Industriestaaten die
toxische Wirkung des Alkoholabusus, wobei der Pathomechanismus der
Krankheitsentstehung nicht verstanden ist. Neben den Umwelteinflüssen konnten in
den letzten Jahrzehnten mehrere Kandidatengene, die zur Entstehung einer CP
prädisponieren, identifiziert werden. Zu diesen Genen zählen das PRSS1, SPINK1,
CFTR und CTRC. Eine protektive Variante wurde im PRSS2 beschrieben. Bei der
Entstehung einer genetisch bedingten CP scheint eine frühzeitige, intrapankreatische
Aktivierung von Trypsin entscheidend zu sein. Diese führt zu einer Verschiebung des
Gleichgewichts von Proteasen und Anti-Proteasen zu Gunsten der Proteasen,
woraus eine Selbstverdauung des Organs resultiert.
Auch das Cathepsin B (CTSB), eine in Lysosomen vorkommende Protease, kann
Trypsinogen zu Trypsin aktivieren. Eine genetische Assoziation mit einer CTSB-
Variante (p.L26V) wurde lediglich bei Patienten mit tropisch-kalzifizierender CP
beschrieben und konnte bei kaukasischen Patienten mit idiopathischer CP nicht
41
bestätigt werden. Bei der Analyse der neben CTSB am zweithäufigsten
vorkommenden lysosomalen Protease Cathepsin L (CTSL) zeigte sich, dass diese
durch Spaltung des Trypsinogens ein inaktives Trypsin freisetzt. Im Mausmodell
wurden bei Ctsl-/- Tieren bei experimentell induzierter Pankreatitis zwei wesentliche
Effekte nachgewiesen. Zum einen resultierte eine erhöhte Trypsinaktivität, zum
anderen verlief die Pankreatitis, aufgrund einer vermehrt auftretenden Apoptose der
Azinuszellen und fehlender Nekrose, milder. Aufgrund der funktionellen Daten stellte
das CTSL1 ein interessantes Kandidatengen dar, welches potentiell protektive
Varianten bei Kontrollen („loss of function“) oder schädigende Varianten bei
Patienten („loss of function“) aufweisen könnte. Bei Patienten müssten Varianten, die
mit einer Abnahme der Funktion einhergehen, zu einer Überschreitung eines
Schwellenwertes von Trypsin führen. Diese könnte dann durch andere Mechanismen
nicht mehr ausreichend „gepuffert“ werden. Andererseits könnten Varianten bei
Patienten, die zu einer Zunahme der Funktion des CTSL führen („gain of function“)
vor CP schützen (vermehrter Trypsinogen Abbau zu inaktivem Trypsin).
In dieser Arbeit wurde mittels uni-direktionaler DNA-Sequenzierung der gesamte
kodierende Bereich als auch die Exon-Intron Übergänge des CTSL1 untersucht.
Dabei wurden insgesamt drei seltene nicht-synonyme Varianten mit möglicher
funktioneller Relevanz nachgewiesen. Die Variante c.5A>C (p.N2T, rs112682750)
fanden wir bei einem Patienten. Sie führt zu einem Aminosäureaustausch von
Asparagin zu Threonin an der zweiten Position von CTSL. Da diese Variante bereits
bei Kontrollen beschrieben wurde (rs112682750) dürfte sie für die Entstehung einer
CP keine Relevanz haben. Die Varianten c.126+1G>A und c.915A>C (p.E305D)
konnten wir bei jeweils einer Kontrolle nachweisen. Erstere befindet sich im Bereich
einer hochkonservierten Splice-Site und könnte somit auf die korrekte Prozessierung
der mRNA Einfluss haben. Die c.915A>C Variante führt zu einem
Aminosäureaustausch von Glutamin- zu Asparaginsäure an Position 305 des CTSL.
Hierdurch erfolgt ein Austausch chemisch sehr ähnlicher Aminosäuren, so dass
diese Variante wahrscheinlich keine funktionelle Relevanz aufweist. Neben den
seltenen nicht-synonymen Varianten wurden acht seltene synonyme oder im nicht
kodierenden Bereich gelegene Varianten identifiziert. Keine der seltenen Varianten
wies einen statistisch signifikanten Unterschied in der Verteilung zwischen Patienten
und Kontrollen auf. Auch der Vergleich der aufsummierten seltenen Varianten war
statistisch in beiden Gruppen nicht unterschiedlich.
42
Bei den Varianten mit einer Allelfrequenz des selteneren Allels von mehr als einem
Prozent zeigten sich bei den acht identifizierten Varianten (c.126+31C>T
(rs2274611), c.902+195A>C (rs3128510), c.-43C>G (rs10123692), c.402G>A
((p(.=))), c.621+56A>C (rs2378757), c.621+62T>G, c.621+79G>A , c.622-172T>C
(rs2296958)) sowohl für die Genotypverteilung, die Allelfrequenz, als auch für die
anhand dieser Varianten berechneten Haplotypen keine signifikanten
Verteilungsunterschiede zwischen Patienten und Kontrollen.
Somit können wir schlussfolgern, dass unsere umfangreiche genetische Analyse von
Varianten des CTSL1 keine Assoziation mit der Entstehung einer CP zeigt.
43
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51
9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland
noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde
zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt
wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene
Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen
wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
…………………………… ……………………………
Datum Unterschrift
52
10 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Max Herms
Geburtsdatum 17. März 1984
Geburtsort Erlenbach am Main
Familienstand ledig
Schulausbildung
1990 – 1994 Besuch der Grundschule in Erlenbach am Main
1994 – 2001 Besuch des Julius-Echter-Gymnasiums in
Elsenfeld, mehrjährige Arbeit im Schülerrat,
Schulsprecher während eines Schuljahres
2001 – 2003 Besuch der Ernst-Göbel-Schule in Höchst im
Odenwald
11.06.2003 Abitur an der Ernst-Göbel-Schule in Höchst im
Odenwald (Durchschnittsnote 1,8)
Wehrersatzdienst
01.09.2003 - Zivildienst am Universitätsklinikum in Ulm,
30.06.2004 Chirurgische Intensivabteilung
Hochschulausbildung
10/2004 – 05/2011 Studium der Humanmedizin an der Universität
Leipzig
04.09.2006 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Note 3,0)
03.05.2011 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Note 2,5)
53
11 Danksagung
Für meine Doktorarbeit schulde ich sehr vielen Menschen einen herzlichen Dank!
Zuallererst gilt der größte Dank meinem Betreuer Dr. med. Jonas Rosendahl für sein
unermüdliches Engagement mir und gegenüber seinen anderen Doktoranden, seiner
ständigen Motivation sowie gewissenhaften Korrektur. Auch seine Unterstützung
bezüglich anderen, nicht medizinischen Themen macht ihn zu einem Freund und
Mentor, wie man ihn sich nur wünschen kann.
Ein ganz besonderer Dank gilt Frau Claudia Ruffert für ihre geduldige Einweisung in
die medizinische Laborarbeit, konstruktive Kritik und unentwegte Hilfe. Auch für die
angenehme Arbeitsatmosphäre möchte ich ihr, den übrigen Mitarbeiten des Labors
sowie meinen Mitdoktoranden Moritz Jesinghaus und Robert Schober danken.
Herrn Prof. Dr. med. Joachim Mössner, Klinikdirektor der Klinik und Poliklinik für
Gastroenterologie und Rheumatologie, in dessen Abteilung diese Promotion
durchgeführt wurde, danke ich für die freundliche Unterstützung.
Nicht zuletzt gilt ein ganz großer Dank meiner gesamten Familie, insbesondere
meinen Eltern Andrea Herms (geb. Pfaff) und Prof. Dr. med. Volker Herms. Für die
stetige Unterstützung und dafür, dass sie mir immer ein Vorbild waren und sind,
möchte ich ihnen diese Arbeit als Dank widmen. Auch meiner Schwester Lena
Herms und meiner Freundin Caroline Michalski danke ich für ihre Hilfe und die vielen
anregenden und aufmunternden Gespräche.