Cap. 5 Espressione genica: la trascrizione pp.115-143

Sintesi 05

• La sintesi proteica avviene in due fasi, trascrizione e traduzione

• Il DNA viene trascritto in una molecola di RNAm• Il messaggero viene tradotto in un peptide• Per la traduzione sono indispensabili RNAr ed RNAt• Sequenze particolari segnalano i punti di inizio e termine di

trascrizione e traduzione• Esperimento di Chambon sull’ovoalbumina di pollo• Molti geni eucarioti sono interrotti da sequenze trascritte ma

non tradotte: introni. Le parti tradotte prendono il nome di esoni

• Negli Eucarioti il trascritto iniziale matura attraverso l’eliminazione degli introni e altre modifiche biochimiche.

Cellula pro- ed Eu-cariote

L’RNA è chimicamente simile al DNA, ma:

E’ a filamento singolo, non a doppia elicaContiene ribosio, non desossiribosioOltre ad adenina, citosina e guanina, contiene non timina, ma uracile

Perciò:•Vale il principio della complementarietà delle basi: la molecola di RNA viene sintetizzata sulla base di un tratto di DNA•Esistono geni che codificano per proteine; dalla loro trascrizione origina l’RNAm; esistono geni che codificano per RNAt e l’RNAr.

Schema della trascrizione

non

Schema della trascrizione

Nei procarioti, un’unica proteina complessa, l’RNA polimerasi o RNA P, catalizza la trascrizione

In E. coli, RNA P è costituita da 2 subunità , 2 subunità e una subunità . La subunità può dissociarsi, separandosi dal core o nucleo dell’enzima. Diversi fattori indirizzano la RNA P verso geni diversi.

Schematicamente, tre fasi:1. Inizio. I siti del DNA che contengono i segnali d’inizio della

trascrizione si chiamano promotori. La subunità riconosce una regione del promotore, a cui si attacca. La doppia elica si denatura e si stacca dal core della RNA P.

Schema della trascrizione

2. Allungamento. Il core della RNA P comincia a scorrere lungo l’elica “senso” del DNA; ribonucleotidi trifosfati vengono legati all’estremità 3’ libera della catena; l’energia di legame proviene dalla rottura dei legami fosforici.

3. Terminazione. Sequenze di terminazione, o terminatori, sono presenti alla fine di ogni messaggero. In certi casi una proteina, fattore , li riconosce, vi si lega e provoca il distacco dell’RNAm. In altri casi è la RNA P stessa che li riconosce e si stacca

Quindi, schematicamente, un gene comprende:

Elica stampo

Promotori in vari geni di E. coli: TATA box e regione –35 (sequenze consenso)

Come la replicazione, la trascrizione procede in direzione 5’-3’

Trascrizione in E. coli: inizio ed allungamento

Trascrizione in E. coli: terminazione

Inverted repeats

Le RNA polimerasi

• Nei procarioti, una sola RNA P si occupa della trascrizione di tutti i geni

• Negli Eucarioti, diverse RNA P catalizzano la sintesi di:

1. mRNA, che in seguito verrà tradotto in polipeptide (RNA P II)

2. rRNA, in segmenti di varie lunghezze che alla fine si aggregano a formare ribosomi (RNA P I)

3. tRNA, che riconoscono la sequenza dell’mRNA e allineano gli amminoacidi corrispondenti (RNA P III)

• Ridondanza genica per RNA P I e RNA P III.

Inizio trascrizione negli Eucarioti (RNA P

II, fattori d’inizio, enhancers)

Schema generale di mRNA al termine della trascrizione (Eu- e pro-carioti)

AUG UGA

Sequenza leader Sequenza codificante Sequenza terminale(non tradotta) (non tradotta)

5’ 3’

L’esperimento di Chambon

Scopo: isolare un geneProblema: avere tante copie dello stesso tratto di DNAMetodo: isolare un mRNA, copiarlo con una trascrittasi inversa: cDNA.

mRNA in una cellula Eucariotica specializzata e non specializzata

L’esperimento di Chambon

Profilo degli RNA in una cellula EucarioticaOvidutto di pollo, albumina

messaggeri

L’esperimento di Chambon: ibridazione mRNA-DNA

1. mRNA prelevato dal citoplasma2. cDNA3. Anse nell’ibrido mRNA-cDNA4. Il gene dell’ovalbumina è interrotto da introni

Il gene dell’ovalbumina e la maturazione (splicing) del suo messaggero

Maturazione dell’mRNA

• Aggiunta di un cappuccio (G e 2 gruppi metilici) in 5’ (“capping”)

• Rimozione enzimatica degli introni• Poliadenilazione in 3’ (aggiunta di poliA, 10-30 basi a

valle della sequenza-consenso AAUAAA.

Maturazione (splicing) del messaggero

Meccanismo della rimozione di un intronenei complessi di splicing

N=qualunque baseR=purinaY=pirimidina

Maturazione (splicing) del messaggero:in una fase transitoria,

un’Adenina forma tre legami fosfodiesterei

Splicing alternativi

Splicing alternativi: un gene fa tante proteine

Splicing alternativi: α-tropomiosina (ratto)

esoni costanti

Evoluzione degli introni: due ipotesiPrecoceGli introni erano una caratteristica essenziale dei primi organismi. La loro assenza nei batteri sarebbe dovuta ai tempi più brevi di divisione cellulare, e dunque al maggior numero di generazioni durante le quali il genoma batterico si è evoluto, perdendo (quasi) tutti gli introni ancestrali. TardivaGli introni non erano presenti nei primi organismi. Sarebbero arrivati di recente negli Eucarioti, nel corso dell’aumento di complessità che ha creato la necessità di sviluppare meccanismi di controllo coordinato dell’espressione genica.

Editing del messaggero

•Inserzione o delezione post-trascrizionale di nucleotidi, conversione chimica di una base in un’altra

•Risultato: Il messaggero maturo ha una sequenza di basi che non corrisponde esattamente a quella del DNA che la codifica

•Dove si osserva: in Tripanosoma; nei genomi mitocondriale e plastidiale di molte piante superiori; nei Mammiferi, in vari tessuti dove sono possibili splicing alternativi

Maturazione (splicing) nella

cellula Eucariote

Confronto fra pro- ed Eu-carioti

Trascrizione ai geni per l’RNA in E. coli:unità di trascrizione, ridondanza genica

Sette regioni rrnMaturazione!

Trascrizione ai geni per l’RNA in Eucarioti:unità di trascrizione, ridondanza genica

1250 serie di geniMaturazione

tRNA: basi modificate,

regioni funzionali

gradiente di saccarosio

tRNA: basi modificate, regioni funzionali

tRNA: maturazione

Riassunto 05• Il DNA viene trascritto in una molecola di RNAm• Il messaggero viene tradotto in un peptide• Nei procarioti una sola RNA P catalizza la trascrizione, negli

Eucarioti intervengono diverse RNA P specializzate in mRNA, rRNA e tRNA

• Sequenze particolari segnalano i punti di inizio e termine di trascrizione e traduzione

• Molti geni eucarioti sono interrotti da sequenze trascritte ma non tradotte: introni. Le parti tradotte prendono il nome di esoni

• Negli Eucarioti il trascritto iniziale matura attraverso l’eliminazione degli introni e altre modifiche biochimiche.

• Sia in Eucarioti che in procarioti, gli rRNA e tRNA subiscono un processo di maturazione

Farmacogenetica e farmacogenomica

Le discipline che studiano come individui con diverse caratteristiche genetiche rispondono ai farmaci

1. Farmacogenetica: individuazione di geni candidati, loro caratterizzazione molecolare2. Farmacogenomica: tipizzazione di centinaia o migliaia di geni e 2.1. Studio funzionale o 2.2. Studio associazione fenotipo/variante allelica

sull’RNA sul DNA

• Quali varianti alleliche sono associate ai diversi fenotipi (risposta e non-risposta al farmaco)?

Stessa diagnosi

Scopo della Farmacogenetica:individuare la componente genetica delle

diverse risposte ai farmaci e comprenderne il

funzionamento

Prevista risposta al farmaco :

scarsa o nulla

Previsto rischio

di tossicità del farmaco

diminuire la dose o usare un farmaco

differente

usare un farmaco differente

Prevista risposta al farmaco : buona

geni target

geni DME (Drug-Metabolising Enzymes)

geni per le proteine di trasporto

Tre classi di geni

trascrizione mRNA traduzione

P450 CYP2D6 (debrisochina idrossilasi)

Substrati del P450 Cyp2D6

•β-bloccanti•Antiaritmici•Antidepressivi triciclici•Antipsicotici•Analgesici•Antistaminici•… •MPTP (Parkinson inducing neurotoxin)

Attività enzimatica

RH+O2+NADPH + H+

ROH + H2O + NADP+

• 3 geni altamente omologhi- CYP2D8P pseudogene (~ 5.1 Kb)- CYP2D7P pseudogene (~ 4.2 Kb)- CYP2D6 gene funzionale (~ 4.3 Kb)

• similarita’ fra 2D6 e 2D7 : 97% circa• similarita’ fra 2D6 e 2D8 : 92% circa

~ 31 Kb

2D8 2D7 2D6tel cen

I II III IV V VI VII VIII IX

2D8 2D7

12Kb del

2D8 2D7 2D6

2D62D8 2D7 2D6

12Kb dup

macroriarrangiamenti

*5 = delezione genica

*?xN = duplicazione genica

Diversità globale al gene CYP2D6

(Sistonen et al. 2006)

Frequenze genotipiche al locus CYP2D6 in Asiatici ed Europei (Shimizu et al. 2003)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

I/I I/N I/D I/0 N/N N/D N/0 D/D D/0 0/0

Genotypes

Gen

oty

pe

freq

uen

cies