GENERACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS CLAUDIA MACHICADO RIVERO, Ph.D. Asesora científica de F....
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GENERACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS
CLAUDIA MACHICADO RIVERO, Ph.D.
Asesora científica de F. Hoffmann-La Roche
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RESUMEN
• Introducción
• Herramientas y métodos bioinformáticos
• Diseño de cavidades en el interior de proteínas
• Acoplamiento molecular proteína-ligando
• Screening masivo y automático de librerías de fármacos
RESUMEN
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Creación de sitios de unión
+
-Estabilizar proteínas-Modular la actividad (interruptor)-Albergar y vehiculizar fármacos
INTRODUCCIÓN
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Estrategia para el diseño de sitios de unión y vehiculización de ligandos in vivo
1) Construcción del sitio de unión de ligando
¿COMO METER UN LIGANDO EN UNA PROTEINA DETERMINADA?
• Elegimos una proteína modelo y creamos agujeros virtuales.• Seleccionamos los que no colapsan.• Hacemos acoplamiento masivo de bases de datos de ligandos a los agujeros.• Comprobamos que el ligando seleccionado se une al mutante con agujero.
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2) Vehiculización
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Diseño de proteínas terapéuticas
1. Elegir residuos grandes e hidrófobos enterrados en la proteína.
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Diseño de proteínas terapéuticas
2. Mutaciones truncantes
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Diseño de proteínas terapéuticas
3. Creación de una cavidad
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Diseño de proteínas terapéuticas
4. Estudio de la unión de pequeñas moléculas
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Proteína
Elegir residuos
Mutación in silico
Minimización/ Análisisde cavidades
Acoplamiento automático
Proteínas concavidad
Acoplamiento interactivo
Energíasinteracción Análisis de
dG de unión
Buscar residuosvoluminosos
Acoplamiento P-L
EnergéticaEnergías de
desolvatación
Proteínas huecudas
Creación de cavidades
Ligandos
Esquema general del trabajo
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Flavodoxina de Anabæna como modelo de estudio
Dominio de unión a FMN
Estabilidad y plegamiento
Clonada
Cristalizada
FMN
Trp 57
Tyr 94
+
Holoproteína
FMNApoproteína
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Ligando
Cavidad
2. Docking Flexible+Screening masivo y automático
Complejo modelado
3. Evaluación energética
Software Affinity + Catalyst (Accelrys Inc.)
Proteína
1. Diseño in silico de
cavidad
Herramientas y métodos bioinformáticos
Software InsightII (Accelrys Inc.)
Programas varios: Linux
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Objetivos
• Diseñar proteínas con cavidad: analizar su estructura y estabilidad y evaluar su capacidad de unir moléculas específicas.
• Determinar teóricamente la afinidad y complementariedad de las cavidades creadas por pequeñas moléculas orgánicas.
• Seleccionar y evaluar automáticamente la energética de los ligandos más prometedores de unirse en una cavidad, partiendo de una librería de miles de compuestos.
• Comprobar experimentalmente la fiabilidad de los métodos bioinformáticos desarrollados.
Desarrollar un procedimiento teórico de diseño de proteínas portadoras que
eventualmente puedan emplearse en el campo de la Medicina.
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PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO
CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS
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Diseño de un método para predecir la formación de cavidades en proteínas
Modelos de estudio: Mutantes truncadas
Mutaciones truncantes in silico
Minimización de energía
Análisis de los modelos: dimensiones de la cavidad y estructura global
Lisozima T4 Barnasa Citocromo c peroxidasa
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Modelización de proteínas con cavidad
Identificación dela mutante
Volúmenes y reducción de lacavidad teórica y cristal
Modelo deSteepest descents
Proteína Mutante Volumencavidadteórica
(Å3)
Volumencavidadcristal
(Å3)
Reducciónvolumencavidadcristal
(%)
Volumencavidadmodelo
(Å3)
Reducciónvolumencavidadmodelo
(%)
RMScadenaslaterales
superficiecavidad
T4L M102AM106A 0 0 Na 0 Na 0,48I29A 40 42 -5 31 23 0,23I17A 34 0 100 0 100 0,16L99A 155 174 -12 162 -5 0,24
M102A 121 94 22 105 13 0,44L133G 191 182 5 177 7 0,31L133A 171 150 12 147 14 0,34F153A 161 110 32 149 7 0,28
L99A/F153A 275 265 4 268 3 0,29L46A 51 32 37 43 16 0,23I100A 19 36 -89 31 -63 0,38V87A 32 45 -41 40 -25 0,22V111A 57 46 19 50 12 0,22V149A 40 47 -18 0 100 0,23M6A 74 58 22 52 30 0,23
V103A 14 14 0 0 100 0,23F67A 40 40 0 83 -108 0,39I58A 92 67 27 40 57 0,32
L121A 172 50 71 148 14 1,46Barnasa I76A 32 0 100 0 100 0,19
I88A 23 21 9 15 35 0,30I96A 39 40 -3 48 -23 0,32
Cit. c R48A 0 0 Na 0 Na 0,31perox. W191G 164 184 -12 204 -24 0,19
19 mutantes de lisozima T4
3 mutantes barnasa
2 mutantes cit. c perox.
Ampliación
Reducción
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Predicción del porcentaje de reducción de la cavidad
Steepest descents reprodujo con mayor precisión el porcentaje de
reducción de las cavidades: ligeros cambios en la estructura
Steepest descents Conjugate gradients
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Predicción de la estructura de las proteínas con cavidad
Bajos valores de rmsd entre la estructura cristalizada y modelada
Reducción
Teórico CristalModelo
Alta precisión en la predicción de la forma y tamaño de las cavidades y de la estructura
global de la proteína
ExpansiónTeórico Cristal
Modelo
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Diseño de cavidades en el núcleo hidrófobo de la flavodoxina de Anabæna
Trp66
Leu44Ile52Ile109
Leu105
Mutaciones in silico truncantes a Ala (Phe)
Método de modelización
Análisis de los modelos de flavodoxina con
cavidad
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Mutante* Estructurasecundaria
Accesibilidadsolvente
cadena lateral(%)
Volumencavidadteórica
Volumencavidadmodelo
Reduciónvolumencavidad
(%)
W66F/L44A Hélice 0 251 232 8
W66F/L105A Hélice 0 255 217 15
W66F/I109A Hélice 0 205 210 -2
W66F Hélice 0 173 140 19
L44A Hélice 0 151 137 9
L105A/L44A Hélice 0 151 137 9
I109A Hélice 0 111 116 -5
I52A Lámina 0 97 91 6
L105A Hélice 0 52 61 -17
* modelos sobre la holoflavodoxina
Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad
• Muy ligeros rearreglos en la estructura de la proteína
• Ningún colapso fue observado
Flexibilidad reducida del núcleo hidrófobo
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Machicado C., Bueno M. & Sancho J. 2002. Predicting the structure of protein cavities created by mutation. Protein Engineering. 2002 Aug;15(8):669-75.
W66F/L44AW66F/L105A
Cavidad: 185 Å3 Cavidad: 204 Å3
Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad
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Estudio experimental del plegamiento de las mutantes de flavodoxina con cavidad
Dicroísmo circular en el UV-lejano
Dicroísmo circular en el UV-cercano
La creación de cavidades fue crítica para 2 mutantes (I109A y
W66F/I109A): parcialmente desplegadas
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Estudio experimental de la estabilidad térmica de las mutantes de flavodoxina con cavidad
La creación de cavidades generó una importante desestabilización térmica
en todas las mutantes:-Pérdida de contactos de vdw-Pérdida de la fuerza hidrófoba
Proteína Tm (K EE) Tm (K)
Silvestre W66F -3.7 W66F/L105A -10.6 W66F/L44A -9.3
I109A -15.3 W66F/I109A -21.3
FLUORESCENCIA
322.9 0.2319.2 0.3312.3 0.3313.6 0.1307.6 0.4301.6 0.8
329.1 0.1327.3 0.1318.9 0.1318.2 0.2306.8 0.6303.9 1.4
Tm (K EE) Tm (K)
CD EN EL UV-LEJANO
-1.8-10.2-10.9-22.3-25.2
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Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: anti-HBsAg scFv fragment
Pedroso I, Irun MP, Machicado C, Sancho J. Biochemistry. 2002 Aug 6;41(31):9873-84.
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Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: COX-I
Rebeca Acın-Perez, Marıa Pilar Bayona-Bafaluy{, Marta Bueno, Claudia Machicado, Patricio Fernandez-Silva, Acisclo Pe´rez-Martos, Julio Montoya, M.J. Lo´pez-Perez, Javier Sancho and Jose´ Antonio Enrıquez* Hum Mol Genet. 2003 Feb 1;12(3):329-39.
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C. Machicado, S. Castillo, M. Bueno, M. Pocoví y J. Sancho. Clin Invest Arterioscl 2003;15(2):59-65
Método de modelización de cavidades aplicadoa otras proteínas: receptor de LDL
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PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO
CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS A CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS
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Implementación de un método para modelar complejos proteína-ligando
Lisozima L99A
• Estructuras cristalizadas (9)
• Gunión experimentales (15)
+ 17 ligandos 23 moléculas no unidoras
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Unión Proteína-Proteína Unión Proteína-Ligando
Efecto hidrofóbico
EntalpíaEntropía
Desolvatación
El método de docking moleculardebe reproducir la unión proteína-ligando
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Simulaciones computacionales de la unión proteína-ligando
Proteína Ligando
3. Ordena conformaciones de acuerdo a la energía obtenida.
1. Explora conformaciones que favorezcan la interacción proteína-ligando
2. Minimiza la energía potencial de los complejos.
Algoritmo de acoplamiento
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Etapas del acoplamiento molecular proteína-ligando
∆Gunión= ∆GPL + ∆GP + ∆GL + ∆Gdesol
2. Evaluación de la energía potencial de los complejos y elección del más estable
3. Energía libre de unión teórica de los ligandos
1. Acoplamiento flexible• Monte Carlo y minimización
de energía, en un campo de fuerza CVFF
• 30 conformaciones distintas
• Selección de complejos: Metropolis
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Variables definidas
FLEXIBILIDAD DEL SITIOFLEXIBILIDAD DEL SITIO • Átomos flexibles: Sitio de unión (cavidad) y ligando
• Átomos rígidos: Resto de proteína
• Campo de fuerza: CVFF
• Dimensiones de la cuadrícula
CÁLCULOS ENERGÉTICOSCÁLCULOS ENERGÉTICOS
• Método de minimización y número de pasos
• Prueba de selección
• Temperatura de Metrópolis
Sitio de unión: residuos en la superficie de la cavidadSitio de unión: residuos en la superficie de la cavidad
CUADRÍCULAS DE DOCKING CUADRÍCULAS DE DOCKING
SIMULACIÓN (5-6 HORAS) SIMULACIÓN (5-6 HORAS)
30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO
30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO
ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO
ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO
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Predicción de la estructura de complejos Lisozima L99A-ligandos
Complejos modelados son casi idénticos a los cristalizados Método de acoplamiento reproduce con alta precisión la estructura de los complejos proteína-ligando
CristalModelo
DESVIACIÓN CUADRÁTICA MEDIA
(RMSD) DE LOS COMPLEJOS
MODELADOS Y CRISTALIZADOS
PDB Ligando RMSD (Å)
181L benceno 0.22
182L benzofurano 0.34
183L indeno 0.35
184L iso-butilbenceno 0.45
185L indol 0.35
186L n-butilbenceno 0.31
187L p-xileno 0.29
188L o-xileno 0.39
1NHB etilbenceno 0.25
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DISCRIMINACIÓN DE LIGANDOS QUE NO SE UNEN
Ácido benzoico (NO UNIÓN)
Benzofurano (UNIÓN)
Claudia Machicado, Jon López-Llano, Santiago Cuesta-Bueno & Javier Sancho. Journal of Computer-Aided Molecular Design (2005) 19 (6):
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Predicción de la unión moléculas a la Lisozima L99A
2. Unión del 100% de los ligandos verdaderos de la cavidad: NO HUBIERON FALSOS NEGATIVOS
1. Éxito en el 74 % de casos de moléculas no afines a la cavidad: POCOS CASOS DE FALSOS POSITIVOS
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• Las moléculas de agua aumentan su entropía (efecto hidrófobo)
• Aparecen interacciones entre la proteína y el ligando
• Proteína y ligando pierden grados de libertad
G = H -TSG = H -TS
Cambio de la energía libre durante la unión de una proteína y un ligando
Proteína
Ligando
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Gu = Hsu + HI + HI:p - TSI - TSw - TSp - TSpl - Hl:w
GGuu = = HH -- TTSS
PARAMETRIZACIÓN DE LA ENERGÉTICA
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∆Gunión = ∆Htotal - T∆Sconf - T∆SW
Implementación de una ecuación para calcular el cambio de energía libre de
unión de un complejo proteína-ligando
∆Gunión = ∆GP +∆GL+ ∆GPL+ ∆Gdesol
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CAMBIO DE ENTROPÍA CONFORMACIONAL DEL LIGANDO (Sl) Y LA PROTEÍNA (dSp)
Novotny et al., 1987
Krystek et al., 1993
-TS = 0,52N * 298 kcal mol-1
CAMBIO DE ENTROPÍA DEL
AGUA (Sw)
-TSw = 0,45(ASAnp) * ln(T/384.15) - 0.26(ASAp) * ln(T/335.15) * 298
cal K-1 mol-1
Luque & Freire, 2000
ENTROPÍA TRASLACIONAL Y
ROTACIONAL (Spl)
-TSPL = 11 kcal mol-1
Krystek et al., 1993
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Predicción del cambio de energía libre de unión de los complejos proteína-ligando
Ecuación 1
∆Gu = 0.18∆Htotal - 0.02T∆Sconf - 0.8T∆Sw
∆Gu = 0.07∆GP + 0.28∆GL + 0.19∆GPL + 1.64∆Gdesol
Ecuación 2
Parametrización del Gu experimental (15)
con datos teóricos
Grupo de entrenamientoOtros complejos
Grupo de entrenamientoOtros complejos
Grupo de entrenamiento: 6 complejos
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RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS
RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS
LIGANDOS dHsu dHl Hl:p (-)TdSl (-)TdSw (-)TdSp (-)TdSpl Hl:w Predicted dG Actual dGp-cresol -16,56 2,00 -20,48 0 6,8576 - 2,08 11 -31,69 -3,827 N.d.
benzylalcohol -19,63 1,52 -21,20 0 6,6000 - 2,08 11 -34,83 -3,600 N.d.octanol -10,45 5,39 -11,38 3,12 9,9427 - 2,08 11 -28,34 -3,056 N.d.azulene -13,64 10,78 -19,89 0 10,8000 - 2,08 11 -30,64 -3,754 N.d.
t-buthylbenzene -7,61 5,17 0,80 0,52 10,1230 - 2,08 11 -24,82 -0,202 N.d.cyclohexane -15,39 -3,11 -6,54 0 7,7626 - 2,08 11 -15,17 -2,446 N.d.
1-phenylheptane -14 11,82 3,57 3,12 -13,8718 2,08 11 -37,34 1,151 N.d.fenol N.d.
metanol N.d.etanol N.d.
propanol N.d.heptanol N.d.quinolina N.d.aniline N.d.
benzaldehido N.d.acido benzoico N.d.
mesitileno N.d.camfeno N.d.camfor N.d.piridina N.d.
trans-cinmaldehido N.d.
LIGANDOS QUE QUEDAN FUERA DE LA PROTEÍNA DESPUÉS DEL
DOCKING MOLECULAR
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PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD
PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO
CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS PREDICHOS
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Método de cribado virtual de bibliotecas de ligandos en cavidades de proteínas
ACOPLAMIENTO INICIAL
Puntuación y lista de candidatos
Filtro de volumen
Ligandos potenciales
NCI-DB250251 moléculas
Filtros de polaridad
ACOPLAMIENTO FINO
(II) CERIUS2
(I) CATALYST y VEGA (Awk)
(III) AFFINITY
Evaluación del Gu
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Cribado masivo de la NCI-DB frente a la lisozima L99A: Enriquecimiento de la lista de candidatos
1. Filtros iniciales• Volumen• SASp
• Lipolo
0
100
200
300
400
500
600
Vol/Polar ConsScore SumScore
Vol/PolarConsScoreSumScore
2. Consensus Score Ligandos que puntuan bien considerando 5 funciones de energía
3. Puntuación global Sumatoria de 8 funciones de energía (SumScore)
CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO*
1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51
3. SumScore 0.17 469 534
-20
-10
0
10
20
30
40
50
Ligandos
Su
mS
core
SumScore = 0.1(vdW + LS2 + 0.3*BuryPol2 + 1.5*Cpol)
+ 0.2(PLP1 + PLP2 + Jain + PMF)
NO UNIDORES U NIDORES
2. Consensus score 1.5 3824 65
NºLigEnc*NºBD
NºLigTot*NºCandidatos*TE=
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Búsqueda de ligandos de la flavodoxina mutante con cavidad W66F/L44A
Holoflavodoxina mutante W66F/L44A
Acoplamiento masivo y puntutación
Acoplamiento fino
y cálculo del Gu
2% de NCI-DB
9 ligandos con gran afinidad por la cavidad
3 moléculas poco afinesa la cavidad
CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO
1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51 2. Consensus score 1.4 3690 68 3. SumScore 0.2 585 428
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Vol/Polar ConsScore SumScore
Vol/PolarConsScoreSumScore
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Complejos modelados flavodoxina W66F/L44A-ligando y energía de unión del complejo
LIGANDO PUESTO EN Gu (Kcal mol-1)
LA LISTA
UNIDORES
Bencilamina 66 -7.4
Piridina 324 -7.6
Benceno 355 -8.4
Furano 435 -6.6
Tolueno 585 -8.3
NO UNIDORES
Butanol 2312 -3.0
Colina 2803 N.a.ii
2-fenil-propanol N.a.i -3.5
N.a.i Fue excluido con el Consensus Scoring
N.a.ii Salió expelida de la cavidad luego del docking
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Detección experimental de la unión flavodoxina-ligando: Medición de la Tm
UNIDORES PREDICHOS
NO UNIDORES PREDICHOS
COMPUESTOS Tm ± EE
Bencilamina 2,20 ± 0,82Benceno 2,20 ± 0,56Furano 1,90 ± 0,66Piridina 1,60 ± 0,47Tolueno 1,05 ± 0,60
COMPUESTOS Tm ± EE
Butanol 0,60 ± 0,48Colina -0,75 ± 0,422-fenilpropanol 0,60 ± 0,61
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Detección experimental de la unión flavodoxina W66F/L44A-ligando: Titulaciones del ligando
BencilaminaG = -2.8 kcal mol-1
FuranoG = -1.8 kcal mol-1
BencenoG = -2.0 kcal mol-1
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FUTUROS ESTUDIOS
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GENÓMICA
• Identificación del blanco
• Validación del blanco
COLECCIONES DE COMPUESTOS
• Bibliotecas de compuestos existentes
• Química combinatorial
• Productos naturales
Cribado experimental a gran escala (HTS)
Selección y optimización de compuestos cabecera
Diseño del fármaco
Ensayos celulares
Candidato a pruebas clínicas
APLICACIÓN BIOMÉDICA: VEHICULIZACIÓN DE FÁRMACOS
Cribado virtual a gran escalaSelección compuestos candidatos
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APLICACIÓN BIOMÉDICA: ENSAYOS CELULARES CON PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS
DE LIGANDOS
Especifidad
?
Liberación?
Ingreso?
Acción intracelular
?
Transporte plasmático?