GEENI- JA SOLUHOIDOT SILMÄN TAKAOSAN SAIRAUKSIEN HOIDOSSA

Lauri Elsilä Helsingin yliopisto Farmasian tiedekunta Farmaseuttisten biotieteiden osasto Biofarmasia

Huhtikuu 2014

2

SISÄLLYS 1 JOHDANTO .................................................................................................................. 1 

2 SILMÄN TAKAOSAN RAKENNE JA FARMAKOKINETIIKKAA ........................ 2 

3 GEENIHOIDOT ............................................................................................................ 4 

3.1. Yleistä geeniterapioista .......................................................................................... 4 

3.1.1. Vektorit ........................................................................................................... 4 

3.1.2. Geneettisen materiaalin muodot ..................................................................... 7 

3.2. Silmän geenihoidot ................................................................................................ 8 

3.2.1. Geenikorvaushoito .......................................................................................... 8 

3.2.2. Neuroprotektiivinen vaikutus ....................................................................... 11 

3.2.3. Optogeneettinen hoito ................................................................................... 12 

4 SOLUHOIDOT ............................................................................................................ 14 

4.1. Yleistä kantasoluhoidoista ................................................................................... 15 

4.1.1. Hoidoissa käytettäviä kantasolutyyppejä ...................................................... 15 

4.1.2. Solujen annostelusta ..................................................................................... 16 

4.2. Kantasoluterapiat verkkokalvon sairauksissa ...................................................... 17 

5 POHDINTA ................................................................................................................. 18 

6 YHTEENVETO ........................................................................................................... 21 

KIRJALLISUUSLUETTELO ........................................................................................ 22 

1

1 JOHDANTO

Silmän takaosassa, erityisesti verkkokalvossa, mutta myös suonikalvossa, esiintyvät

sairaudet aiheuttavat usein selvää näön huononemista tai kokonaan näkökyvyn

menettämisen ja ovatkin yleisimpien sokeutta aiheuttavien sairauksien joukossa (Zhang

ym. 2012). Näiden sairauksien joukossa on muun muassa diabeettinen retinopatia,

silmänpohjan rappeuma, verkkokalvon rappeuma sekä glaukooma. Ihmisen tärkeimmän

aistin, näkökyvyn menettäminen ei ole ainoastaan subjektiivisesti pelätty ongelma, vaan

aiheuttaa esimerkiksi Yhdysvalloissa kymmenien miljardien dollarien edestä

terveydenhuoltomenoja (Rein ym. 2006; Zhang ym. 2012).

Ongelmalliseksi silmän takaosan sairauksien hoidon tekee alueen vaikea saavutettavuus

(Urtti 2006; del Amo ja Urtti 2008; Zhang ym. 2012). Silmän rakenteessa ja

fysiologiassa on useita esteitä, jotka vaikeuttavat lääkeaineen kulkeutumista hoitoa

vaativaan kudokseen. Systeemisesti annostelluissa lääkkeissä vaadittava lääkeainemäärä

on hyvin korkea altistaen lääkkeen haittavaikutuksille eikä silmän pinnalle annosteltu

lääke saavuta juuri koskaan silmän posteriorista osaa. Ongelma on pyritty ratkaisemaan

erilaisilla annostelumetodeilla, kuten lasiaisinjektiolla, mutta invansiiviset hoidot

sisältävät omat riskinsä eivätkä ole hoitomyöntyvyyden näkökulmasta paras vaihtoehto.

Pyrkimys pitkävaikutteisiin lääkemuotoihin on siksi nykypäivän

silmälääketutkimuksessa vallitseva suunta ja erilaiset geeni- ja kantasoluhoidot ovat

lupaavia tekniikoita, minkä lisäksi hoitojen on lisäksi teoreettisesti mahdollista olla

parantavia, mikä lisää entisestään kiinnostusta uusia hoitomuotoja kohtaan (del Amo ja

Urtti 2008; Zhang ym. 2012).

Seuraavassa esitellään sekä geeni- että kantasoluterapioita niiden perusajatuksien ja jo

tutkittujen sovellutusten kautta sekä pohditaan jo havaittuja ongelmia tutkimuksessa

sekä vaikutusta nykyiseen tutkimukseen ja tulevaan farmaseuttiseen työhön.

2

2 SILMÄN TAKAOSAN RAKENNE JA FARMAKOKINETIIKKAA

Silmän lääkinnän periaatteiden ymmärtämiseksi on ymmärrettävä silmän rakennetta ja

toimintaa, erityisesti vierasaineiden kuljetusmekanismeja. Seuraavaksi esitellään

lyhyesti silmän takaosan rakennetta ja silmän takaosan lääkehoidon kannalta oleellista

farmakokinetiikkaa.

Kuva 1. Kaavakuva silmän takaosasta sekä retinan soluista ja rakenteesta. Sulkeisiin on

merkitty kyseisiin rakenteisiin vaikuttavia sairauksia.

3

Silmän posteriorinen osa eli takaosa vastaa silmään tulevan valon muuttamisesta

hermoimpulssiksi ja tämän informaation siirtämisestä aivoihin. Silmän takaosassa

sijaitsee verkkokalvo eli retina, joka koostuu valon tulosuunnasta katsottuna proteiinien

muodostamasta sisemmästä rajoittavasta kerroksesta, gangliosoluista ja niiden

näköhermoon kulkevista aksoneista, kaksisuuntaisia poikittaisyhteyksiä muodostavista

amakriinisoluista, valoreseptorisoulilta signaalia kuljettavista bipolaarisoluista,

horisontaalisoluista, valoherkistä tappi- ja sauvasoluista sekä pigmenttiepiteelistä

(Dowling 1970). Rakenne on havainnollistettu kuvassa 1. Verkkokalvon alla on

suonikalvo, joka vastaa retinan verenkierrosta. Ainoastaan pigmenttisolut on yhteydessä

verenkiertoon, joten epiteelikudos vastaa muiden retinan solujen aineenvaihdunnasta

transsytoosilla.

Veri-aivoesteen tavoin silmän ja verenkierron välissä on kudoksen muodostamia esteitä:

silmän etuosassa veri-vesieste sekä takaosan veri-retinaeste (Urtti 2006). Ensin mainittu

muodostuu suonikalvon epiteelisoluista ja estää pääasiassa plasman albumiinin

siirtymisen kammionesteeseen, mutta toimii esteenä myös hydrofiilisille

lääkemolekyyleille. Veri-retinaesteen muodostavat yhdessä verkkokalvon

pigmenttiepiteelin (retinal pigment epithelium, RPE) solut sekä retinan kapillaarien

tiiviit seinämät. Veri-retinaesteen soluissa on havaittu olevan aktiivista

kuljetustoimintaa, joka poistaa potentiaalisesti haitallisia aineita lasiaisesta ja retinan

solun ulkoisesta nesteestä (Cunha-Vaz 2003). RPE-solut kuljettavat muun muassa

ioneja ja glukoosia veren ja retinan solujen välillä ja muuttavat sauva- ja tappisolujen

valoa absorboineen retinaalin all-trans-tilasta valoaktiiviseen 11-cis-muotoon ollen näin

tärkeässä osassa valoreseptorisolujen aistitoiminnoissa (Strauss 2005). RPE-solut myös

fagosytoivat valoreseptorisolujen uloimpia osia ja kierrättävät näiden osien tärkeät

aineet, kuten retinaalin, uusiokäyttöön sekä erittävät immunosuppressiivisia aineita,

millä voi molemmilla olla vaikutuksia lääkehoitoihin silmän takaosassa.

Lasiaisen ja retinan välillä on myös immunosytokemiallisesti havaittava,

proteiinimatriiseista muodostuva tyvikalvo, jota kutsutaan sisemmäksi rajoittavaksi

kalvoksi (Inner limiting membrane, ILM) (Halfter ym. 2008). Kalvo ei vaikuta

pienimolekyylisten lääkeaineiden kulkeutumiseen, mutta estää suurempien

4

molekyylien, kuten proteiinien ja virusten, siirtymistä lasiaisesta verkkokalvoon, mikä

voi vaikuttaa esimerkiksi biologisten lääkehoitojen onnistumiseen (Dalkara ym. 2009).

3 GEENIHOIDOT

Geenihoito terminä sisältää joukon hyvin erilaisia tekniikoita, joita yhdistää

perintömateriaalin käyttö ja sen siirtäminen. Seuraavassa esitellään geenitekniikoiden ja

-terapioiden pääpiirteitä siirroissa käytettävistä kuljettimista geneettisen materiaalin

muotoihin ja myöhemmin geenihoitoja esimerkkitutkimusten kautta.

3.1. Yleistä geeniterapioista

3.1.1. Vektorit

Virukset ovat yleisimmin käytetty geenimateriaalin kuljetusmekanismi eli vektori

kliinisten kokeiden tasolla olevissa geenihoitotutkimuksissa (Walther ja Stein 2000).

Virusvektorin perimmäinen ajatus on hyödyntää viruksille ominaista infektioreittiä

aiheuttamatta kuitenkaan virusinfektiota itsessään (Thomas ym. 2003). Vektorina

käytettävistä viruksista poistetaan kaikki tai lähes kaikki viruksen oma perimäaines ja

korvataan se halutulla, siirrettävällä geenillä. Jäljelle jätetään yleensä koodaamattomat,

virusten kapseloitumista ohjaavat osat virusgenomin päissä. Mikäli kaikki viruksen

geneettinen materiaali joudutaan poistamaan, lisätään usein kapseloitumista ja

kopioitumista ohjaavat osuudet siirrettävän geenin lisäksi virukseen erillisenä

plasmidina. Virus siirretään valmistuksessa bioreaktorina toimivalle solualustalle

monistumaan. Näin tuotetaan rekombinanttiviruksia, jotka ovat puhdistamisen jälkeen

valmiita geeninsiirtokäyttöön (Kuva 2).

Virusvektorien suurimpia etuja on niiden kyky transfektoida kohdesoluja, eli siirtää

sisältämänsä trangeeninen materiaali kohdesolujen genomiin, hyvin tehokkaasti (Patil

ym. 2005). Laajempaa käyttöä estää kuitenkin virusten toksisuusriski, jota havaitaan

edelleen useissa eläinmalleissa. Ongelma on havaittu myös kliinisissä kokeissa

5

adenovirusvektorin aikaansaaman tulehdusreaktion aiheutettua potilaan kuoleman

vuonna 1999 (NIH 2002). Virukset ovat myös rajallisen kokoisia, mistä aiheutuu niiden

rajoitettu kyky kantaa siirrettävää geneettistä materiaalia (Taulukko 1) (Patil ym. 2005)

Vektoreina käytetään useita erilaisia viruksia. Eri virusvektoreita ja niiden

ominaisuuksia on tarkasteltu tarkemmin taulukossa 1. Silmän geenihoidoissa

yleisimmin käytettyjä vektoreita ovat lentivirukset, adenovirukset sekä parvoviruksiin

kuuluva AAV (adeno-associated virus), joista viimeisin on yleisesti geenitutkimuksessa

suurta mielenkiintoa herättävä useiden hyvien ominaisuuksiensa ja vähäisen

patogeenisyytensä vuoksi (Colella ja Auricchio 2012).

Taulukko 1. Erilaisten virusvektoreiden hyötyjä ja haittoja. Taulukossa mainitulla kantokyvyllä tarkoitetaan paljonko geenimateriaalia vektorin sisälle mahtuu (kb, kilo-base pair, 1000 emäsparia). AAV = adeno-associated virus (Walther ja Stein 2000). Vektori Edut Haasteet

Retrovirus Suurehko kantokyky (7–8 kb), helppo muokattavuus

Vaikea kohdentaa, epävakaa, satunnainen genomi-integraatio kohdesolussa

Lentivirus Laaja transfektiokyky, vakaa geeniekspressio, hyvä kantokyky (10 kb)

Geneettisen materiaalin pakkaaminen vaikeaa, mutageeninen

Adenovirus Korkea ekspression taso, melko suuri kantokyky (7–8 kb)

Aiheuttaa herkästi immuunivasteita, geeniekspressio ohimenevää, ei integroidu kohdesolun genomiin

AAV

Laaja transfektiokyky, ohjattavuus, ei patogeeninen, hyvin vähän immuunivasteita

Pieni kantokyky (4 kb), vaikea tuottaa

Herpesvirus

Korkea kantokyky (50 kb), transfektoi laajasti erilaisia solutyyppejä, luonnollinen tarttumisominaisuus hermosoluihin

Toksisuusriski korkea, ei integroitumista kohdesolun DNA:han

6

Virusvektoreiden ongelmia on pyritty kiertämään valmistamalla kemiallisesti ei-

viraalisia vektoreita (Abdallah ym. 1995). Lähtökohtana on ollut välttää patogeenisyys

ja virusten kapsidista johtuva rajallinen kantokyky samalla säilyttäen virusten

ohjautuvuus haluttuun kohdekudokseen ja geeninsiirtokyky. Yleisimmin käytetyt

kemialliset vektorit voidaan jakaa kahteen pääryhmään: polymeerirakenteisiin ja

liposomaalisiin vektoreihin (Patil ym. 2005).

Lipidipohjaiset vektorit rakennetaan usein kationisista lipideistä, jolloin negatiivinen

DNA muodostaa lipidien kanssa yhtenäisen kompleksin, niin sanotun lipopleksin (Li ja

Huang 2000; Patil ym. 2005). DNA voidaan myös sijoittaa liposomin ytimeen.

Kationisten liposomien on kuitenkin useammissakin kokeissa havaittu oleva

sytotoksisia ja aiheuttavan kudostoksisia reaktioita, mikä vähentää terapeuttisia

mahdollisuuksia (Lappalainen ym. 1994; Filion ja Phillips 1997; Dokka ym. 2000).

Kationisten liposomien transfektiokyky on myös virusvektoreihin verrattuna hyvin

heikko ja niiden kulkeutuminen haluttuihin retinan soluihin estyy usein, mikä tekee

liposomivektoreista toistaiseksi tehottomia geeninsiirrossa (Pitkänen ym. 2003; Patil

ym. 2005). Korvaavaksi tekniikaksi on kaavailtu anionisia liposomeja, joiden kohdalla

kationisten vastineiden kaltaista toksisuutta ei ole havaittu (Dokka ym. 2000).

Negatiivisesti varautuneen DNA:n ja negatiivisten lipidien yhteenliittämisessä on

kuitenkin havaittu vaikeuksia. Voimakkaasti transfektoivasta ja toksisesta näkökulmasta

turvallisesta anionisesta lipopleksista on raportoitu tutkimuksissa, mikä takaa

mielenkiintoa jatkotutkimuksiin lipidi-DNA-interaktion haasteista huolimatta (Patil ym.

2004).

Polymeerivektorien perusidea on hyvin samankaltainen kuin liposomeissa: kationisen

polymeerirungon ja negatiivisen DNA:n elektrostaattisen vuorovaikutuksen kautta

muodostuu kompleksi, polymeerien tapauksessa polypleksi (Patil ym. 2005).

Polypleksin positiivinen varaus auttaa myös soluunotossa negatiivisesti varautuneella

solun pinnalla. Polymeerivalinnalla voidaan vaikuttaa monipuolisesti polypleksin

fysikokemiallisiin ominaisuuksiin, ja siten DNA:n sitoutumiseen ja soluunottoon. Myös

polymeereihin kiinnitettävillä sokeriosilla ja vasta-aineilla voidaan vaikuttaa

polypleksin kohdentamiseen haluttuun kudokseen. Liposomien tavoin heikko

7

transfektiokyky sekä haasteet laadunvarmistuksessa, kuten tasakokoisten partikkelien

syntetisoimisessa, ja kulkeutumisessa ovat toistaiseksi esteitä polymeerivektorien

tehokkaalle käytölle geenisiirtovektoreina. (Pitkänen ym. 2003; Patil ym. 2005)

Myös pelkän suolaliuokseen sekoitetun DNA:n annostelua geenisiirtomenetelmänä on

tutkittu ja se on havaittu toimivaksi erityisesti lihaskudoksissa (Abdallah ym. 1995).

Tutkimuksissa on havaittu paljaan DNA:n transfektoivan myös hermokudosta ja

plasmidina silmään injisoituna toimivan uveiitin hoidossa (Schwartz ym 1996; Lee ym.

2009).

3.1.2. Geneettisen materiaalin muodot

Siirrettävä geenimateriaali on usein vektorin sisällä plasmidina, joka on tiettyä

proteiinia koodaava kaksijaosteinen DNA-molekyyli (Patil ym. 2005). Plasmidi siirtyy

solun sisällä endosomista tumaan, jossa se solun transkriptio- ja translaatiomekanismeja

hyväksikäyttäen saa aikaan transgeenisen proteiinin tuotannon. Juuri tumaan

siirtyminen on plasmidien kannalta hoidollisesti haastavin osa, sillä tumaan siirtymätön

plasmidi ei saa aikaan minkäänlaista vastetta solussa (Brunner ym. 2000). Plasimidien

avulla voidaan korjata mutaation vaurioittamia tai korvata kokonaan puuttuvia geenejä

sekä saada solu valmistamaan haluttua proteiinia (Patil ym. 2005).

Oligonukleotidit ovat lyhyitä, yksijuosteisia DNA-jaksoja, jotka solun sisällä

muodostavat mRNA:n kanssa dupleksin estäen proteiinin biosynteesin (Patil ym. 2005).

Oligonukleotidit voivat myös siirtyä solun tumaan ja muodostaa vastaavan DNA-

juosteen kanssa tripleksirakenteen estäen näin jo mRNA:n muodostumisen, jolloin

hiljennettäviä kohteita on jokaisessa solussa vähemmän. Muokkaamalla

oligonukleotidin pituutta, emäsjärjestystä ja konformaatiota voidaan toiminta kohdentaa

hyvinkin tarkasti haluttuun geeniin.

Samankaltaisella toimintaperiaatteella käytetään siRNA:ta (small interfering RNA),

kaksijuosteista RNA-ketjua, joka sitoutumalla RISC-kompleksin (RNA Induced

Silencing Complex) kanssa pilkkoo kohde-RNA:n pieniksi palasiksi estäen translaation

8

(Kaiser ym. 2010). siRNA:n on myös havaittu estävän kromosomitasolla

proteiinisynteesiä metyloimalla DNA:ta, vaikuttamalla inertin heterokromatiinin

muodostumiseen tai suoraan DNA:n eliminaatiolla (Agrawal ym. 2003). Mielenkiintoa

jatkotutkimuksille on herättänyt siRNA:n toiminta solunesteessä tuman sijaan, mikä

vähentää vektorin kohdennusominaisuuksien tarvetta, sekä molekyylin pieni koko,

jolloin useamman siRNA:n pakkaamalla yhteen vektoriin voisi mahdollisesti hiljentää

useita geenejä samanaikaisesti (Patil ym. 2005). siRNA on myös spesifisempi kuin

oligonukleotidit eivätkä aiheuta immuunivastetta, mikä tekee tekniikasta suhteellisesti

turvallisen.

Muita käytettyjä menetelmiä ovat geenihiljentämiseen käytetty RNA-juosteinen

ribotsyymi, sekä sen biologisesti kestävämpi DNA-versio DNAtsyymi (Patil ym. 2005).

Silmälääkintään FDA:n markkinoillekin hyväksymä menetelmä on hiljentää jo

muodostuneiden proteiinien toimintaa lyhyillä nukleotidijuosteilla, aptameereilla (Patil

ym. 2005; FDA 2004). Kohdennus voidaan tehdä suoraan sairauden ilmentämiin

proteiineihin tai kyseisten proteiinien translaatiossa ja transkriptiossa mukana oleviin

entsyymeihin ja muihin proteiineihin.

3.2. Silmän geenihoidot

3.2.1. Geenikorvaushoito

Geenikorvaushoito on kliinisten kokeiden tasolla yleisin silmän sairauksiin kohdennettu

geenihoito (NIH 2014). Geenikorvaushoidot tulevat kyseeseen mutaatiosta

riippuvaisissa, usein perinnöllisissä sairauksissa (Boye ym. 2013; Sahel ja Roska 2013).

Mutaatiosta johtuva verkkokalvon solujen toimintahäiriö aikaansaa rappeumaan

johtavan tapahtumaketjun, johon pyritään puuttumaan palauttamalla mutatoitumattoman

geenin siirrolla solujen normaali toimintakyky.

Leberin synnynnäisessä amauroosissa on havaittu retinan pigmenttiepiteelisolujen

RPE65-geenin mutaatio (Redmond ym. 2005). RPE65 ekspressoituu nimensä

9

Kuva 2. Geenihoidon perusperiaate virusvektorilla. (1) Viruksesta poistetaan viruksen oma geneettinen materiaali ja se korvataan halutulla geenillä. (2) Viruksella transfektoidaan kasvatusalustan solut, jotka tuottavat uutta, rekombinanttivirusta. (3) Rekombinanttivirus siirretään elimistöön, jossa se siirtyy kohdesolun sisälle. (4) Vektoriin pakattu geeni siirtyy solun tumaan tai reagoi muuten proteiinisynteesiin osallistuvan mekanismin kanssa. Valmistuva proteiini voi toimia solukalvolla kalvoproteiinina (optogenetiikka, 5A), osallistua solun sisällä erilaisiin metabolia reaktiohin tai solun tukirankaan (geenikorvaushoito, 5B) tai solu voi erittää muodostuneen proteiinin, esimerkiksi kasvutekijän (neuroprotektio, 5C).

mukaisesti RPE-soluissa retinoidi-isomeraasientsyyminä, joka on mukana all-trans-

retinoidin palauttamisessa valoaktiiviseen 11-cis-muotoon (Moiseyev ym. 2005).

Mutaatio RPE65:ssä aiheuttaa entsyymin toimintavirheen, jonka seurauksena retinoidi

jää inerttiin all-trans-muotoonsa, valoreseptorisolut eivät aktivoidu valon kautta

10

normaalisti ja kertyvä trans-retinoidi johtaa retinan kudosrappeumaan (Redmond ym.

2005). Retinan toimintakyvyn palauttamista luonnollisen RPE56-geenin siirrolla on

tutkittu useilla eläinmalleilla ja tutkimuksissa on saatu hyvin lupaavia ja

pitkäaikaisiakin tuloksia (Boye ym. 2013). Acland ryhmineen (2001, 2005) siirsivät

Leberin amauroosin koiramalliin AAV-vektorilla rekombinantti-RPE65-geeniä

subretinaalitilaan injektoimalla ja saivat palautettua verkkokalvon valoaktiivisuutta 23

koeläimessä 26:sta. Toisessa kokeessaan he seurasivat samalla tavalla hoidettuja koiria

kolme vuotta ja havaitsivat 11-cis-retinoidia muodostuvan normaalia vastaavalla tavalla

koko seuranta-ajan, joskin ainoastaan alueella, johon vektoria oli injisoitu.

Lupaavien eläinkokeiden tulosten jälkeen RPE65-hoitoja on viety useisiin kliinisiin

kokeisiin, joista yhdessä faasi I kokeessa AAV-RPE65-hoidolla hoidettuja potilaita

seurattiin kolmen vuoden ajan (Jacobson ym. 2012). Tuloksissa havaittiin

eläinkokeissakin esiin tullut hoidon vaikutus ainoastaan injektioalueella. Seuranta-

aikana potilaiden sauva- ja tappisoluaktiivisuus parani eikä toksisuutta havaittu.

Kokeessa todettiin myös, ettei tarkan näkemisen alueelle foveaan annettu injektio

juurikaan parantanut alueen valoaktiivisuutta, mutta aiheutti usein fovean solujen

vaurioitumista. Tarkkaa näkökykyä ei siis ainakaan nykyisellä metodilla voida palauttaa

suoralla foveaan geenisiirrolla. Vuoden 2014 tammikuussa aloitettiin ensimmäinen

faasin III kliininen koe RPE65-hoidolla (NIH 2014, NCT00999609).

Usherin syndroomaksi kutsutaan joukkoa oireyhtymiä, jotka aiheuttavat kuuroutta ja

verkkokalvorappeuman myötä sokeutta (Boye ym. 2013). Oireyhtymä jaetaan kolmeen

alaluokkaan oireiden alkamisajankohdan ja vaikeuden mukaan ja näistä vaikeimpaan

muotoon, USH1:een, on tutkittu myös geeninsiirtohoitoja. Tutkimuksissa on havaittu

poikkeama aktiinipohjaista moottoriproteiinia koodittavassa geenissä myosinVIIa

(MYO7A), jonka ekpressoimat proteiinit toimivat retinan epiteelisoluissa ja

valoreseptorisoluissa solun sisäisessä kuljetuksessa ja solujen adheesiossa (Weil 1996,

Wolfrum 2003). Geeninsiirtohoidon konseptin todistaneissa hiirikokeissa havaittiin

hoidetun retinan RPE-solujen sijainnin kudoksessa ja opsiinin kuljetusmekanismien

vastaavan normaaleja fysiologisia malleja. Tulosten myötä käynnistettiin faasin 1

kliininen koe, jossa ajatuksena oli käyttää eläinkokeiden tapaan lentivirusvektoria

11

(Hashimoto ym. 2007; NIH 2014, NCT01505062). Yhdysvaltalaisen Oxford

BioMedican UshStat-valmisteellaan suorittamat kliiniset kokeet ovat kuitenkin edelleen

kesken eikä muille kokeille vielä toistaiseksi ole annettu lupia.

Kliinisissä kokeissa on useita silmän geeninsiirtohoitoja. Oxford BioMedicalla on

kehitteillä lentivirusvektoriin pohjautuva geenisiirtotekniikka resessiivisesti periytyvään

Stargardtin tautiin faasin I/II kokeissa Kongin ryhmineen (2008) toteutettua vastaava

hoito ensin onnistuneesti hiirillä. Hoitoja tutkitaan ja on tutkittu kliinisesti myös

silmänpohjan rappeumaan ja koroidermiaan (Boye ym. 2013)

3.2.2. Neuroprotektiivinen vaikutus

Geeninsiirrolla voidaan myös suojata vielä toimintakykyistä kudosta degeneraatiolta ja

näin ylläpitää olemassa olevaa näkökykyä (Sahel ja Roska 2013). Erilaisten

kasvutekijöiden kautta toteutettavaa tekniikkaa kutsutaan neuroprotektiiviseksi

vaikutukseksi. Tekniikan perusajatus on siirtää vektorin avulla haluttu kasvutekijägeeni

kohdesoluihin, jotka tämän jälkeen alkavat tuottaa ja erittää kyseistä proteiinia

ylläpitäen ympäröivää kudosta (Kuva 2). Yleisimmin silmäsairauksien hoitokäyttöön

tutkittuja kasvutekijöitä ovat CNF (ciliary neurotrophic factor), BDNF (brain derived

neurotrophic factor), FGF (fibroblast growth factor) ja GDNF (glial-cell derived

neurotrophic factor).

GDNF:n on todettu viivästyttävän retinan toimintakyvyn laskua ja edesauttavan

valoreseptorisolujen selviämistä eläinmallilla (Touchard ym. 2012). Kokeessa

verkkokalvorappeumaa mallintavan Royal College of Surgeons -rotan verkkokalvoon

siirrettiin elektroporaation avulla GDNF-plasmidi, mikä aikaansai GDNF:n tuotannon.

Tulokset olivat kahtiajakoisia: GDNF:n todettiin toisaalta hyvin selkeästi ylläpitävän

retinan soluja, mutta samalla havaittiin suurten GDNF-annosten nopeuttavan

rappeutumista, mikä herättää kysymyksen kasvutekijän toksisuudesta ja mahdollisesta

kapeasta terapeuttisesta leveydestä. Toisessa, GDNF:n pitkäaikaista turvallisuutta

tarkastelleessa tutkimuksessa ei transfektoiduissa koe-eläimissä havaittu retinan soluissa

morfologisia poikkeamia (Wu ym. 2005). Kokeessa vuoden ajan vapautuneen GDNF:n

12

taso pysyi kuitenkin tasaisena, mikä edelleenkin viittaa GDNF:n toksisuuteen

ainoastaan suurilla annoksilla. Tämä tuo haasteita GDNF:ää hyödyntävien

neuroprotektiivisten geenihoitojen suunnitteluun, sillä muiden kapean terapeuttisen

leveyden omaavien lääkehoitojen, kuten digoksiinin, annostusta voidaan pienentää,

mutta kertaalleen hermokasvutekijää ylimäärin tuottamaan transfektoitua kudosta on

vaikeampi saada pienentämään eritystään.

Koska oksidatiivisen stressin ja metaboliareittien häiriöiden on todettu olevan osa

retinan rappeumasairauksia, terveissä metaboliareiteissä mukana olevien

kasvutekijöiden ja proteiinien erittäminen sairaassa silmässä on mielenkiintoinen uusi

tutkimussuunta (Punzo ym. 2012). Sauvasoluista peräisin oleva kasvutekijä RdCVF

(rod-derived cone viability factor) on herättänyt suurta mielenkiintoa rappeutuvan

verkkokalvon toimintakyvyn ylläpidossa (Yang ym. 2009). Geeni, joka koodittaa

RdCVF:ää, ekspressoituu myös toisena proteiinina, entsyyminä, joka on mukana

valoreseptorisolujen metaboliassa ja oksidatiivisen stressin aiheuttamassa

solukuolemassa (Fridlich ym. 2009). Tutkimustulosten myötä on nähty potentiaalia

kehittää metaboliareitteihin kohdistuvia hoitoja silmän rappeumasairauksiin, joskin

tutkimus on vasta aluillaan.

3.2.3. Optogeneettinen hoito

Niin kutsuttu optogeneettinen hoito perustuu ajatukseen, jossa hyödynnetään

verkkokalvon ehjänä säilyneitä hermoverkkoja ja tuhoutuneiden valoreseptorisolujen

sijaan retinan muista soluista tehdään valoaktiivisia (Busskamp ym. 2011).

Geenitekniikan avulla retinan solut saadaan ilmentämään valoaktiivisia proteiineja,

kuten kanavarodopsiini-2:a (channelrhodopsin, ChR2) ja halorodopsiinia

(Natronobacterium pharaonis halorhodopsin, NpHR). Halorodopsiini on solukalvon

kloridipumppuproteiini, joka aktivoituu valon avulla ja aikaansaa solun

hyperpolarisaation (Schobert ja Lanyi 1982). ChR2 puolestaan toimii epäselektiivisenä

kationikanavana ja aktivoiduttuaan aikaansaa siis solun depolarisaation (Nagel ym.

2003). Hyperpolarisaation ja depolarisaation vaihteluihin perustuu myös terveen

verkkokalvon soluissa tapahtuva hermoimpulssin syntyminen: bipolaarisoluissa ja

13

amakriinisoluissa on valoreseptorin aktivaatiosta hyperpolarisoituvia OFF-mallisia

soluja ja depolarisoituvia ON-soluja (Kolb 1994; Busskamp ym. 2011).

Valoaktiivisten proteiinien ilmentäminen voidaan kohdentaa tiettyihin soluihin tai

vaihtoehtoisesti voidaan pyrkiä saamaan aikaan mahdollisimman laaja valoherkkä alue

vaurioituneeseen retinaan, jolloin siirrettävään geeniin sijoitetaan niin kutsuttuja

promoottorijaksoja (Sahel ja Roska 2013). Busskamp ryhmineen (2010) käyttivät AAV-

vektoria siirtämään NpHR-geeniä kahteen verkkokalvorappeuman (Retinitis

pigmentosa, RP) eläinmalliin käyttäen soluspesifisiä promoottoreita - ihmisen

rodopsiinia, ihmisen punaopsiinia ja hiiren tappisolujen arrestiini-3:a. Knock-out-hiiret

mallinsivat verkkokalvorappeumaa, jossa sauvasolut tuhoutuvat ja tappisolut jäävät

jäljelle menettäen kuitenkin ajan myötä valoherkkyyttään. Promoottoreilla pystyttiin

kohdistamaan haluttu geeniekspressio nimenomaisesti jäljellä oleviin tappisoluihin.

Eläinmalleissa havaittiin retinan toiminnan palautumista, aktiivisuutta aivojen

näköalueilla sekä käytösmuutoksia valoherkkyyskokeissa. Ryhmä totesi onnistuneen

transfektion myös ex vivo ihmissilmissä ja näkee potentiaalia verkkokalvorappeuman

hoidossa. Soluihin kohdennettaessa tulee kuitenkin tuntea hoitoa saavan potilaan retinan

solujen tila ja osata kohdentaa ilmennettävät proteiinit oikeanlaisiin soluihin, mikä tekee

kohdennetun hoidon kliinisestä sovelluksesta toistaiseksi hyvin haastavaa.

Ivanova ja hänen tutkimusryhmänsä (2010) puolestaan käyttivät kokeessaan

silkkiapinamallia. Tutkimuksessa apinoiden lasiaiseen injisoitiin serotyypin 2

rekombintantti AAV-vektorilla (rAAV2) ChR2-geeniä kahden yleispromoottorin,

CMV:n (human cytomegalovirus immediate-early gene promoter) ja CAG:n (hybridi

CMV/kanan B-aktiini promoottori), kanssa. Tuloksissa transfektoituneita soluja

havaittiin lähes jokaisessa osassa retinaa, mutta transfektio oli voimakkainta foveassa ja

silmän periferiassa - alueilla, joissa sisempi rajoittava kalvo on ohuimmillaan. Ryhmä

päätteli yleispromoottoreilla ja rAAV-vektorilla saavutettavan hyvä transfektio

valoaktiiviselle ChR2:lle, mutta havaitsi samalla sisemmän rajoittavan kalvon olevan

hyvin voimakas este rAAV-geenihoidolle.

14

Tilanteessa, jossa sekä tappi- että sauvasolut ovat tuhoutuneet, on todistetusti pystytty

palauttamaan valoaktiivisuutta transfektoimalla retinan soluja sekä ChR2:lla että

NpHR:llä (Zhang ym. 2009). Ryhmä injisoi kahden eri knock-out-hiiriryhmän

lasiaiseen rAAV2-vektorilla ChR2-NpHR-värileima-hybridigeeniä käyttäen

yleispromoottoreita. Kokeessa todettiin transfektoidun retinan soluissa muodostuvan

valoa projisoitaessa fysiologisesti normaalin kaltaisia ON-, OFF- ja ON-OFF-vasteita.

Vasteet kuitenkin vaihtelivat voimakkaasti valon aallonpituuden vaihdellessa. Ryhmä

totesi tekniikan olevan sopimaton sellaisenaan ilman erillisiä laitteita kliinisiin

sovelluksiin, koska käytettyjen proteiinien valoaktivaatiokynnys on huomattavasti

korkeampi verrattuna luonnollisiin valoreseptorisoluihin.

4 SOLUHOIDOT

Kantasoluhoidossa pääajatuksena on korvata ja korjata toimimattomia retinan soluja

(Ong ja da Cruz 2012). Erilaistumiskykyisiä kantasoluja siirretään vaurioituneelle

alueelle ja ne erikoistuvat halutuiksi soluiksi ympäristön kasvutekijöiden avustamana

muodostaen uutta, toimivaa kudosta vaurioituneen tilalle. Myös kantasoluista in vitro

muokattua, hoidettavan kudoksen kaltaista solumateriaalia voidaan siirtää sairaan

kudoksen tilalle. Korjausmekanismin lisäksi on olemassa mahdollisuus hyödyntää jo

aikaisemmin kuvattua neuroprotektiivista vaikutusta myös kantasolujen avulla.

Seuraavassa käsitellään lyhyesti retinan hoidossa käytettyjä kantasolu- ja

annosteluvaihtoehtoja ja myöhemmin erilaisia hoitomenetelmiä esimerkkitapauksien

avulla.

15

4.1. Yleistä kantasoluhoidoista

4.1.1. Hoidoissa käytettäviä kantasolutyyppejä

Hoidoissa ja niiden tutkimuksissa käytettäviä kantasoluja on pääasiassa kolmenlaisia:

embryonaaliset kantasolut, mesenkymaaliset kantasolut sekä indusoidut pluripotentit

kantasolut (Ong ja da Cruz 2012). Embryonaaliset eli alkion kantasolut (ESC,

embryonic stem cell), ovat blastokystivaiheessa olevan alkion sisemmästä solumassasta

eristettäviä, hyvin laajan erikoistumiskyvyn omaavia soluja. Blastokystivaihe

saavutetaan alkionkehityksessä viisi päivää hedelmöityksen jälkeen, mistä aiheutuu

embryonaalisten kantasolujen ympärillä käytävä eettinen keskustelu, johon liittyy usein

uskonnollisia lähtökohtia (Sandel 2004; Nisbet 2005). Ongelmalliseksi on myös

havaittu tietyksi solutyypiksi erikoistumiseen vaadittavien, hyvin spesifisten

kasvuympäristöjen tarve, ihmisestä eristettyjen embryonaalisten kantasolujen taipumus

aiheuttaa teratoomia ja muita kasvaimia sekä usein havaittava, immunosuppressiota

vaativa hylkimisreaktio (Brickman ja Burdon 2002; Hentze ym. 2006).

Embryonaalisten kantasolujen eettiset ongelmat sekä kasvainmuodostus pystytään

välttämään aikuisen luuytimestä ja keskushermostosta sekä napanuorasta ja silmän

sädelihaksen alueelta eristettävillä mesenkymaalisilla kantasoluilla (MSC, mesenchymal

stem cell) (Tropepe ym. 2000; Ong ja da Cruz 2012). Mesenkymaalisten kantasolujen

erikoistumiskyky ei ole yhtä laaja kuin embryonaalisilla kantasoluilla, mutta niiden

jakautumis- eli proliferaatiokyky on hyvä ja ratkaisevien kehitysaskeleiden ylittäneiden

mesenkymaalisten kantasolujen saattaa olla jopa helpompi erikoistua halutuiksi

kudoksiksi. Mesenkymaaliset kantasolut mahdollistavat myös solujen siirron potilaasta

itsestään, mikä vähentää hylkimisreaktioita ja näin ollen tarvetta immunosuppressiolle.

Kolmantena vaihtoehtona ovat indusoidut pluripotentit kantasolut (iPSC, induced

pluripotent stem cell) eli somaattisista soluista soluteknologisesti embryonaalisen

kantasolun kaltaisiksi muokatut solut (Ong ja da Cruz 2012). Indusoidut kantasolut ovat

erikoitumiskyvyltään embryonaalisten kantasolujen tavoin monipuolisia (Taulukko 2),

16

mutta haittapuolena on havaittu alkiokantasolujen kaltaista tuumorigeneesiä.

Ongelmaan on kuitenkin pystytty puuttumaan geeniteknologian avulla (Nakagawa ym.

2008).

Taulukko 2. Kantasolujen ominaisuuksia (Porkka 2004).

Nimeke Määritelmä

Totipotentti Pystyy muodostamaan koko yksilön. Pluripotentti Pystyy muodostamaan kaikkia kudoksia,

rajaton uusiutumiskyky. Multipotentti Voi tuottaa useita solutyyppejä ja uusiutua

koko yksilön eliniän. Progenitorisolu Voi tuottaa rajallisen määrän

solutyyppejä, rajallinen uusiutumiskyky.

4.1.2. Solujen annostelusta

Kantasolujen annostelussa helpoin tapa on soluista ja suolaliuoksesta muodostetun

suspension injisointi lasiaiseen (Ong ja da Cruz 2012). Sisempi rajoittava kalvo

aiheuttaa kuitenkin myös kantasoluannostelulle esteen lasiaisen ja retinan välillä ja vain

noin 1 % injisoiduista kantasoluista pääsee vapaasti verkkokalvolle asti, loput jäävät

bolukseksi lasiaiseen (Nishida ym. 2000; Ong ja da Cruz 2012). Kalvon hajoaminen

sairauden myötä tai kuoriminen annostelun yhteydessä parantaa solujen kulkeutumista

(Nishida ym. 2000; Johnson ym. 2010).

Kantasoluja voidaan myös siirtää kirurgisesti suoraan subretinaalitilaan (Ong ja da Cruz

2012). Invansiivinen toimenpide on kuitenkin huomattavasti injektiota haastavampi

toimenpide ja sisältää suurempia riskejä, kuten verkkokalvon vaurioituminen ja

tulehdusreaktiot, joista pyritään silmän takaosan sairauksien hoidoissa pääsemään

eroon. Hyvänä puolena tekniikassa on siirrettyjen kantasolujen saaminen lähelle retinaa,

jolloin solujen kulkeutuminen ja integraatio tapahtuvat lasiaisinjektiota helpommin.

Kolmantena vaihtoehtona on systeeminen annostelu esimerkiksi suonensisäisellä

injektiolla (Wang ym. 2010; Ong ja da Cruz 2012). Systeemisen annostelun hyvinä

puolina on pidetty mahdollisuutta hoitaa koko retinaa suppean injektio- tai

17

siirroskohdan sijaan sekä annostelun uusimisen helppous. Ongelmiksi muodostuvat

kuitenkin samat haasteet kuin retinan systeemilääkinnässä pienmolekyylisilläkin

lääkkeillä: silmän suonikalvoon kulkeutuva verimäärä on suhteessa hyvin pieni, jolloin

kohdekudokseen kulkeutuvien kantasolujen määrä on pieni, ja ympäri elimistöä

kulkevat kantasolut voivat integroitua muihin kudoksiin, mikä ei ole tavoiteltavaa.

4.2. Kantasoluterapiat verkkokalvon sairauksissa

Kantasoluhoidoilla on silmässä tähän asti ollut kolme pääkohdetta: retinan

pigmenttiepiteeli, valoreseptorisolut ja gangliosolut (Ong ja Cruz 2012). RPE-solut ovat

jatkuvana yksikerroksisena kudoksena helpohko korjattava kohde ja epiteelikudoksen

osallistuessa monipuolisesti verkkokalvon metaboliaan ja näkemiselle oleellisiin

prosesseihin sitä on pidetty tärkeänä tutkimus- ja hoitokohteena. Useammankin ryhmän

on onnistunut muodostaa ihmisen embryonaalisista kantasoluista aikuisen RPE-

kudoksen kaltaisia solukerroksia (Lund ym. 2006; Vugler ym. 2008; Subrizi ym 2012).

Solut ovat morfologisesti samanlaisia kuin terveet aikuisen RPE-solut, mutta myös

niiden toiminta, kuten valoreseptorifagosytoosi, vastaa normaalia fysiologista toimintaa.

Royal College of Surgeons -mallirotille on useissa tutkimuksissa siirretty

subretinaalitilaan ihmisperäisistä embryonaalisista kantasoluista muokattuja RPE-soluja

ja tuloksena eläinmallien näkökykyä pystyttiin palauttamaan, valoreseptorisoluja

pelastamaan eikä tuumorigeneesiä havaittu (Whitley ym. 1996; Sauvé ym. 2002; Lu

ym. 2009). Hoidoille on myös myönnetty lupia kliinisiin kokeisiin: Stargardtin taudin

hoitoa tutkivia faasin I/II kokeita on kaksi samoin kuin silmänpohjan rappeumaa

tutkivia faasin I/II tutkimuksia (NIH 2014; NCT01344993, NCT01674829,

NCT01469832, NCT01345006). Myös indusoiduista pluripotenteista kantasoluista on

saatu muodostettua toimivia RPE-soluja, mutta koe-eläimissä aiheutuneiden

immuunivasteiden vuoksi kliinisiä kokeita ei ole vielä aloitettu ihmisillä (Buchholz ym.

2009; Carr ym. 2009).

Myös valoreseptorisolun korvaaminen on teoreettisesti helppo toimenpide, sillä

kyseessä on yksisuuntainen reseptorisolu, jossa on vain yksi, hyvin lyhyt synaptinen

yhteys (Ong ja da Cruz 2012). Keskushermostosta eristettyjä neuraalisia

18

progenitorisoluja on siirretty onnistuneesti eläinmalleille, mutta havaitusta integraatiosta

huolimatta erilaistumista verkkokalvon soluiksi ei tapahtunut, minkä uskotaan johtuvan

aikuisen silmän epäedullisesta kasvuympäristöstä (Young ym. 2000; Van Hoffelen ym.

2003; MacLaren ym. 2006). MacLarenin onnistui kuitenkin ryhmineen (2006)

muodostaa toimivia sauvasoluja silmästä eristetyistä valoreseptorien progenitorisoluista.

Vastaavanlaisia progenitorisoluja on myös pystytty valmistamaan embryonaalisista

kantasoluista (Ikeda ym. 2005).

Kolmas kohdesolu, gangliosolu, vaurioituu erityisesti glaukoomassa (Osborne ym.

1999). Silmän sisäisen paineen kasvu vaurioittaa näköhermon gangliosoluja, mikä

johtaa näkökyvyn heikkenemiseen. Nykyiset hoidot perustuvat pitkälti silmänpaineen

alentamiseen eivätkä pysäytä gangliosolujen rappeutumista tai korvaa jo vaurioitunutta

kudosta (Ong ja da Cruz 2012). Gangliosolujen korvaaminen kantasoluilla tai in vitro

erilaistetuilla gangliosoluilla on erityisen haastavaa niiden hyvin haaroittuneen

rakenteen ja pitkien, näköhermon kautta aivoihin projisoituvien hermoyhteyksien

vuoksi. Useammassa tutkimuksessa on kuitenkin onnistuneesti käytetty kantasoluja

neuroprotektiivisen vaikutuksen aikaansaamiseksi (Bull ym. 2009; Johnson ym. 2010).

Bullin ryhmä käytti kokeessaan mesenkymaalisia kantasoluja kun taas Johnsonin ryhmä

siirsi koe-eläinten lasiaiseen oligodendrosyyttien prekursorisoluja (OPC,

oligodendrocyte prceursor cell). Molempien kokeiden tuloksissa havaittiin selvästi

kontrolliryhmiä parempaa gangliosolujen aksonien selviämistä, muttei kuitenkaan

siirrettyjen solujen integraatiota vaurioituneeseen kudokseen, mikä viittaa vaikutuksen

välittyvän erittyvien kasvutekijöiden kautta. Sekä mesenkymaalisten kantasolujen että

OPC:n on myös aikaisemmin todistettu tuottavan hermokasvutekijöitä, kuten GDNF:a

(Labouyrie ym. 1999; Yu ym. 2006).

5 POHDINTA

Lupaavien konseptiensa myötä geeni- ja kantasoluhoitoja on tutkittu hyvin paljon, mutta

arkipäivän kliinisiin hoitosovelluksiin on vielä matkaa eikä näkökykyä täysin

palauttavia tai parantavia hoitoja ole vielä kuvattu eläinmalleissakaan. Useissa

19

tutkimuksissa on pystytty todistamaan hoitojen onnistuminen teoreettisella tasolla,

mutta useat pienet yksityiskohdat aiheuttavat edelleen päänvaivaa.

Kaksi merkittävää ongelmaa, hoitojen kohdennus sekä silmän rakenteelliset ja

fysiologiset esteet, nivoutuvat tietyissä määrin yhteen ja ratkaisua voidaan hakea

farmaseuttisesta tutkimuksesta. Kuten aikaisemmin tutkielmassa todettiin,

useammassakin tutkimuksessa on todettu sisemmän rajoittavan kalvon olevan

merkittävä este solujen ja viruksien kulkeutumiselle lasiaisesta verkkokalvolle (Nishida

ym. 2000; Ivanova ym 2010). Tämän kiertämiseksi on esitetty kalvon kirurgista

kuorintaa annostelun yhteydessä, entsymaattista hajottamista, mikä voisi onnistua sekä

entsyymiä että haluttua hoitomuotoa sisältävällä valmisteella, sekä Müllerin solujen

toiminnan hiljentämistä, mikä voitaisiin saada myös aikaan yhdistelmävalmisteella

(Johnson ym. 2010). Sisempi rajoittava kalvo pystyttäisiin myös kiertämään

systeemisellä annostelulla, mikäli solut ja vektorit pystyttäisiin kohdentamaan vain

retinaan. Farmaseuttisessa tutkimuksessa liposomeja ja polymeerirakenteita on

päällystetty erilaisilla vasta-aineilla ja proteiineilla, polymeereillä, kuten

polyetyleeniglykolilla sekä hiilihydraateilla lääkevalmisteiden kohdentamiseksi jo

vuosia (Hornof ym. 2008; Lehtinen ym. 2012; Hu ym. 2013). Kohdentaminen

pohjautuu kohdesolun- tai kudoksen mikroympäristön ja sen erityispiirteiden

tuntemukseen: ainoastaan solun pinnalla oleva reseptori laukaisee soluunoton,

kasvaimen hapan ympäristö hajottaa kantajan tai kudoksen tuottama proteiini saa

kantajapartikkelin hajoamaan. Ymmärtämällä paremmin retinan mikroympäristöä ja sen

muutoksia erilaisten sairauksien myötä ja sen erityispiirteitä hyväksikäyttäen

muokkaamalla kantasoluja ja geenivektoreita voidaan hoito ohjata haluttuihin soluihin.

Uutena mielenkiintoisena kohdennusmenetelmänä lääkealalla on niin kutsuttu DNA-

tietokone, jossa nukleiinihappoja ei käytetä perimäaineksena vaan

rakennusmateriaalina, joka pystyy havaitsemaan muutoksia ympäristössään (Kahan ym.

2008; Andersen ym. 2009). Tämä saattaa olla tulevaisuuden mahdollisuus myös solujen

ja geenivektoreiden ohjauksessa.

Koska geeni- ja kantasoluhoitojen tarkoitus on mahdollistaa parantava hoito silmän

takaosan sokeuttaviin sairauksiin, avohoidon apteekkityössä ei välttämättä

20

tulevaisuudessakaan tulla näkemään monia geeni- tai kantasoluvalmisteita vaan hoito

toteutetaan lääkärin vastaanotolla tai klinikassa. Tällaisten lääkkeiden käyttö kuitenkin

tulee varmasti lisääntymään, vaikka hoitoja annettaisiinkin sairaalaolosuhteissa, minkä

vuoksi myös apteekkityössä olevan farmasistin tulee ymmärtää perusteet geeni- ja

kantasolumuotoisista hoitotekniikoista antaakseen potilasneuvontaa ja ymmärtääkseen

mahdolliset vaikutukset muiden lääkehoitojen kanssa. Virus- ja liposomivektoreiden

taloudellisesti tehokas tuottaminen ja erityisesti kantasolujen erilaistumiseen liittyvien

ympäristöolosuhteiden ja kasvutekijöiden huono tuntemus ovat paitsi ongelma

perustutkimuksessa, myös este tehokkaalle teollisen mittakaavan lääkevalmistukselle,

mikä varmasti lisää viivettä aktiivisten hoitorutiinien alkamiseen ja avohoidon

apteekkityössä näkymiseen (Andreadis ym. 1999; Prather ym. 2003; Wagner ja

Vorauer-Uhl 2011).

Myös immuunivasteet ja toksiset reaktiot rajoittavat tällä hetkellä sekä geeni- että

soluterapioiden kehittämistä. Kantasoluhoidoissa immuunivasteen todennäköisyys on

havaittu olevan huomattavasti pienempi, mikäli hoidossa voidaan käyttää potilaasta

itsestään peräisin olevia kantasoluja (Levin ym. 2004). Potilaasta itsestään siirrettävät

kantasolut saattavat kuitenkin kantaa mutatoitunutta geeniä, joka on alun perinkin ollut

syy tai osasyy silmäsairauteen, jolloin tavoiteltua hoidollista hyötyä ei saavuteta.

Toisesta ihmisestä tai eläimestä siirretyissä kantasoluissa voidaan varmistua

mutatoitumattoman geenin olemassaolosta, mutta erityisesti toisesta eläinlajista siirretyt

solut aiheuttavat helposti hylkimisreaktion elimistössä, ja vaikka niiden hillintä on

mahdollista immunosuppressiivisilla lääkeaineilla, immunosuppressio altistaa

infektioille ja mahdollisuus haittavaikutuksille kasvaa kasvavan lääkemäärän myötä

(Swijnenburg ym. 2008). Geenihoidoissa immuunivaste on helpompi välttää

kehittämällä entisestään sekä kemiallisia vektoreita että ei-patogeenista AAV-vektoria

(Abdallah ym. 1995; Walther ja Stein 2000; Colella ja Aurichio 2012).

Tutkimustulosten valossa sekä geenihoidot että soluterapiat ovat lupaavia, parantavia

hoitomuotoja silmän takaosan sokeuttaviin sairauksiin. Kantasoluhoidot vaativat vielä

perustutkimustietoa erilaisten solujen erilaistumisprosessien ymmärtämiseksi, mutta

myös soveltavammalla tutkimuksella, kuten farmaseuttisella materiaalitutkimuksella ja

21

biotekniikalla on paljon annettavaa alan kehittymisessä. Herättelevä ajatus on myös

nostettava eläinkokeiden ja ihmisillä toteutettavien kliinisten kokeiden vastaavuudesta:

koe-eläinten ja ihmisen fysiologia eroavat lopulta merkittävästi toisistaan ja eläimillä

saavutetut hoitovasteet eivät välttämättä toteudu ihmisillä tai osoittautuvatkin

vaarallisiksi (Perel ym. 2006; Hackam ja Redelmeier 2006; Shuaib ym. 2007). Tästä

syystä kliinisten kokeiden tuloksia vailla olevien tekniikoiden kohdalla tulee myös olla

hieman varovainen odotuksien suhteen.

6 YHTEENVETO

Sokeuttaviin silmän takaosan sairauksiin on ollut jo pidempään tarve kehittää

lääkehoitoja ja geeniteknologiat ja kantasolut ovat tuoneet tähän mielenkiintoisen

mahdollisuuden. Sekä kantasoluihin että geenitekniikoihin pohjautuvia hoitomenetelmiä

on kehitetty monia ja niiden tulokset in vitro ja eläinkokeissa ovat olleet lupaavia.

Ihmisillä tehdyistä kliinisistä kokeista ei kuitenkaan ole vielä kovin monia tuloksia ja

molemmissa tekniikoissa on useita kehittämiskohteita ennen yleiseen kliiniseen

käyttöön ottamista. Näiden ongelmakohtien ratkaisussa on oma paikkansa sekä

perustutkimuksella koskien esimerkiksi kantasolujen erikoistumista ja geneettisen

materiaalin muokkaamista että soveltavammalla, farmaseuttisellakin tutkimuksella

esimerkiksi biotekniikan ja materiaalitieteen aloilla. Tällä hetkellä käynnissä olevien ja

tulevien kliinisten tutkimusten tulokset vaikuttavat hyvin paljon geeni- ja

soluteknologioiden tutkimuksen suuntaan.

22

KIRJALLISUUSLUETTELO

Abdallah B, Sachs L, Demeneix BA: Non-viral gene transfer: Applications in developmental biology and gene therapy. Biol Cell 85: 1 – 7, 1995 Acland GM, Aguirre GD, Ray J, Zhang Q, Aleman TS, Cideciyan AV, Pearce-Kelling SE, Anand V, Zeng Y, Maguire AM, Jacobson SG, Hauswirth WW, Bennet J: Gene therapy restores visioin in a canine model of childhood blindness. Nat Gene 28: 92 – 95, 2001 Acland GM, Aguirre GD, Bennet J, Aleman TS, Cideciyan AV, Bennicelli J, Dejneka NS, Pearce-Kelling SE, Maguire AM, Palczewski K, Hauswirth WW, Jacobson SG: Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Mol Ther 12(6): 1072 – 1082, 2005 Agrawal N, Dasarandhi PVN, Mohammed A, Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK: RNA interference: biology, mechanism and applications. Microbiol Mol Biol R 67(4): 657 – 685, 2003 Andersen ES, Dong M, Nielsen MM, Jahn K, Subramani R, Mmdouh W, Golas MM, Sander B, Stark H, Oliviera CLP, Pedersen JS, Birkedal V, Besenbacher F, Gothelf KV, Kjems J: Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature 459: 73 – 77, 2009 Andreadis ST, Roth CM, Le Doux JM, Morgan JR, Yarmush ML: Large-scale processing of recombinant retroviruses for gene therapy. Biotechnol Prog 15: 1 – 11, 1999 Boye SE, Boye SL, Lewin AS, Hauswirth WW: A comprehensive review of retinal gene therapy. Mol Ther 21(3): 509 – 519, 2013

Brickman JM, Burdon TG: Pluripotency and tumorigenecy. Nat Gen 32: 557 – 558, 2002 Brunner S, Sauer T, Carotta S, Cotton M, Altik M, Wagner E: Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Ther 7: 401 – 407, 2000 Buchholz DE, Hikita ST, Rowland TJ, Friedrich AM, Hinman CR, Johnson LV, Clegg DO: Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27: 2427 – 2434, 2009 Bull ND, Irvine K-A, Franklin RJ, Martin KR: Transplanted oligodendrocyte precursor cells reduce neurodegeneration in a model of glaucoma. Invest Ophth Vis Sci 50(9): 4244 – 4253, 2009

23

Busskamp V, Duebel J, Balaya D, Fradot M, Viney TJ, Siegert S, Groner AC,Cabuy E, Forester V, Seeliger M, Biel M, Humphries P, Paques M, Mohand-Said S, Trono D, Deisseroth K, Sahel J-A, Picaud S, Roska B: Genetic reactivation of cone photoreceptors restores visual responses in retinitis pigmentosa. Science 329: 413 – 417, 2010 Busskamp V, Picaud S, Sahel J-A, Roska B: Optogenetic therapy for retinitis pigmentosa. Gene Ther 19(2): 169 – 175, 2011 Carr A-J, Vugler AA, Hikita ST, Lawrence JM, Gias C, Chen LL, Buchholz DE, Ahmando A, Semo M, Smart MJK, Hasan S, da Cruz L, Johnson LV, Clegg DO, Coffey PJ: Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PloS ONE 4(12): 1 – 12, 2009 Colella P, Auricchio A: Gene therapy of inherited retinopathies: a long and successful road from viral vectors to patients. Hum Gene Ther 23: 796 – 807, 2012 Cunha-Vaz JG: The blood–retinal barriers system: Basic concepts and clinical evaluation. Exp Eye Res 78: 715 – 721, 2004 Dalkara D, Kolstad KD, Caporale N, Visel M, Klimczak RR, Schaffer DV, Flannery JG: Inner Limiting Membrane Barriers to AAV-mediated Retinal Transduction From the Vitreous, Mol Ther 17(12): 2096 – 2102, 2009 del Amo EM, Urtti A: Current and future ophthalmic drug delivery systems: A shift to the posterior segment. Drug Discov Today 13 (3/4): 135 – 143 Dokka S, Toledo D, Shi X, Castranova V, Rojanasakul Y: Oxygen radical-mediated pulmonary toxicity induced by some cationic liposomes. Pharm Res 17(5): 521 – 525, 2000 Dowling JE: Organization of vertebrate retinas. Invest Ophth Visual 9:655 – 680, 1970 FDA – Food and Drug Administration: Highlights of prescribing information: Macugen. NDA 21-756/S018: 3-12, 2004 Filion MC, Phillips NC: Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochim Biophys Acta 1329: 345 – 365, 1997 Fridlich R, Delelande F, Jaillard C, Lu J, Poidevin L, CroninT, Perrocheau L, Millet-Puel G, Niepon M-L, Poch O, Holmgren A, van Dorsselaer A, Sahel J-A, Léveillard T: The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics 8: 1026 – 1218, 2009 Hackman DG, Redelmeier DA: Translation of research evidence from animals to humans. J Am Med Assoc 296(14): 1731 – 1732, 2006

24

Halfter W, Dong S, Eller AW, Nischt R: Origin and turnover of ECM proteins from the inner limiting membrane and vitreous body. Eye 22: 107 – 1213, 2008 Hashimoto T, Gibbs D, Lillo C, Azarian SM, Legacki E, Zhang X-M, Yan X-J Williams DS: Lentiviral gene replacement therapy of retinas in a mouse model for Usher syndrome type 1B. Gene Ther 14: 584 – 594, 2007 Hentze H, Graichen R, Coman A: Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol 25(1): 24 – 32, 2006 Hornof M, de la Fuente M, Hallikainen M, Tammi RH, Urtti A: Low molecular weight hyaluronan shielding of DNA/PEI polyplexes facilitates CD44 receptor mediated uptake in human corneal epithelial cells. J Gene Med 10: 70 – 80, 2008 Hu Q, Gao X, Kang T, Feng X, Jiang D, Tu Y, Song Q, Yao Lei, Jiang X, Chen H, Chen J: CGKRK-modified nanoparticles for dual-targeting drug delivery to tumor cells and angiogenic blood vessels. Biomaterials 34: 9496 – 9508, 2013 Ikeda H, Osakada F, Watanabe K, Mizuseki K, Haraguchi T, Miyoshi H, Kamlya D, Honda Y, Sasai N, Yoshimura N, Takahashi M, Sasai Y: Generation of Rx/Pax6 neural retinal precursors from embryonic stem cells. P Natl Acad Sci-Biol 102(32): 11331 – 11336, 2005 Ivanova E, Hwang G-S, Pan Z-H, Troilo D: Evaluation of AAV-mediated expression of Chop2-GFP in the marmoset retina. Invest Ophth Vis Sci 51(10): 5288 – 5295, 2010 Jacobson SG, Cideciyan AV, Ratnakaram R, Heon E, Schwartz SB, Roman AJ, Peden MC, Aleman TS, Boye SL, Sumaroka A, Conlon TJ, Calcedo R, Pang J, Erger KE, Oliveras MB, Mullins CL, Swider M, Kaushal S, Feuer WJ, Iannaccone A, Fishman GA, Stone EM, Byrne BJ, Hauswirth WW: Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in fifteen children and adults followed up to three years. Arch Opthalmol 10(1): 9 – 24, 2012 Johnson TV, Bull ND, Martin KR: Identification of barriers to retinal engraftment of transplanted stem cells. Invest Ophth Vis Sci 51(2): 960 – 970, 2010 Kahan M, Gil B, Adar R, Shapiro E: Towards molecular computers that operate in a biological environment. Physica D 237: 1165 – 1172, 2008 Kaiser PK, Symons RCA, Shah SM, Quinlan EJ, Tabaneh H, Do DV, Reisen G, Lockridge JA, Short B, Guerciolini R, Nguyen QD: RNAi-based treatment for neovascular age-related macular degeneration by Sirna-027. Am J Ophthalmol 150: 33 – 9, 2010 Kolb H: The architecture of functional neural circuits in the vertebrate retina. Invest Ophth Vis Sci 35(5): 2385 – 2404, 1994

25

Labouyrie E, Dubus P, Groppi A, Maihon FX, Ferrer J, Parrens M, Reiffers J, de Mascarel A, Merlio JP: Expression of neurotrophins and their receptors in human bone marrow. Am J Physiol 154(2): 405 – 415, 1999 Lappalainen K, Urtti A, Söderling E, Jääskeläinen I, Syrjänen K, Syrjänen S: Cationic liposomes improve stability and intracellular delivery of antisense oligonucleotides into CaSki cells. Biochim Biophys Acta 1196(2): 201 – 208, 1994 Lee DJ, Biros DJ, Taylor AW: Injection of an alpha-melanocyte stimulating hormone expression plasmid is effective in suppressing experimental autoimmune uveitis. Int Immunopharmacol 9: 1079 – 1086, 2009 Lehtinen J, Raki M, Bergstöm K, Uutela P, Lehtinen K, Hiltunen A, Pikkarainen J, Liang H, Pitkänen S, Määttä A-M, Ketola RA, Yliperttula M, Wirth T, Urtti A: Pre-targeting and direct immunotargeting of liposomal drug carriers to ovarian carcinoma. PloS ONE 7(7): 1 – 10, 2012 Levin LA, Ritch R, Richards JE, Borrâs T: Stem cell therapy for ocular disorders. Arch Ophthalmol 22: 621 – 627, 2004 Li S, Huang L: Nonviral gene therapy: promises and challenges. Gene Ther 7: 31 – 34, 2000 Lu B, Malcut C, Wang S, Girman S, Francis P, Lemieux L, Lanza R, Lund R: Long-term safety and function of rpe from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells 27: 2126 – 2135, 2009 Lund RD, Wang S, Klimanskaya I, Holmes T, Ramos-KLsey R, Lu B, Girman S, Bischoff N, Sauvé Y, Lanza R: Human embryonic stem cell–derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells 8(3): 189 – 199, 2006 MacLaren RE, Pearson RA, MacNeil A, Douglas RH, Salt TE, Akimoto M, Saroop A, Sowden JC, Ali RR: Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature 44(9): 203 – 207, 2006 Nagel G, Szellas T, Huhn W, Kateriya S, Adeishvili N, Beerthold P, Ollig D, Hegmann P, Bamberg E: Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. P Natl Acad Sci-Biol 100(24): 13940 – 13945, 2003 NIH - National Institutes of Health: Assessment of adenoviral vector safety and toxicity: report of the national institutes of health recombinant DNA advisory committee. Hum Gene Ther 13: 3 – 13, 2002 NIH – National Institutes of Health, www.clinicaltrials.gov, (viitattu 30.4.2014), 2014 Nisbet MC: The competition for worldviews: values, information, and public support for stem cell research. Int J Public Opin R 17(1): 90 – 112, 2005

26

Nishida A, Takahashi M, Tanibara H, Nakamo I, Takahashi JB, Mizoguchi A, Ide C, Honda Y: Incorporation and differentiation of hippocampus- derived neural stem cells transplanted in injured adult rat retina. Invest Ophth Vis Sci 41(13): 4268 – 4274, 2000 Ong JM, da Cruz L: A review and update on the current status of stem cell therapy and the retina. Brit Med Bull 102: 133 – 146, 2012 Osborne NN, Wood JPM, Childlow G, Bae J-H, Melena J, Nash MS: Ganglion cell death in glaucoma: what do we really know? Br J Ophthalmol 83: 980 – 986, 1999 Patil SD, Rhodes DG, Burgess DJ: Anionic liposomal delivery system for DNA transfection. AAPS J 6(4): 1 – 10, 2004 Patil SD, Rhodes DG, Burges DJ: DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: A Comprehensive Review. AAPS J 7(1): 61 – 77, 2005 Perel P, Sena E, Wheble P, Briscoe C, Sandercock P, Macleod M, Mignini LE, Jayara P, Khan KS: Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. Brit Med J 334: 1 – 6, 2006 Pitkänen L, Ruponen M, Nieminen J, Urtti A: Vitreous is a barrier in noviral gene transfer by cationic lipids and polymers. Prharm Res 20(4): 576 – 583, 2003 Porkka K, Kantasolujensiirrot. Duodecim 120: 1391 – 1399, 2004 Prather KJ, Sagar S, Murphy J, Chartrain M: Industrial scale production of plasmid DNA for vaccine and gene therapy: plasmid design, production, and purification. Enzyme Microb Tech 33: 865 – 883, 2003 Punzo C, Xiong W, Cepko CL: Loss of daylight vision in retinal degeneration: are oxidative stress and metabolic dysregulation to blame? J Biol Chem 287(3): 1642 – 1648, 2012 Redmond MT, Poliakov E, Yu S, Tsai J-Y, Lu Z, Gentleman S: Mutation of key residues of RPE65 abolishes its enzymatic role as isomerohydrolase in the visual cycle. P Natl Acad Sci-Biol 102(38): 13658 – 13663, 2005 Rein DB, Zhang P, Wirth KE, Lee PP, Hoerger TJ, McCall N, Klein R, Tielsch JM, Vijan S, Saaddine J: The Economic Burde of Major Adult Visual Disorders in the united States. Arch Ophthalmol 124:1754–1760, 2006 Sahel J-A, Roska B: Gene theraoy for blindness. Annu Rev Neurosci 36: 467 – 488, 2013 Sandek MJ: Embryo ethics – the moral logic of stem-cell research. N Engl J Med 351(3): 207 – 209, 2004

27

Sauvé Y, Girman SV, Wang S, Keegan DJ, Lund RD: Preservation of visual responsiveness in the superior colliculus of RCS rats after retinal pigment epithelium cell transplantation. Neuroscience 114(2): 389 – 401, 2002 Schobert B, Lanyi JK: Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. J Biol Chem 257(17): 10306 – 10313, 1982 Schwartz B, Benoist C, Abdallah B, Rangara R, Hassan A, Scherman D, Demeneix BA: Gene transfer by naked DNA into adult mouse brain. Gene Ther 3(5): 405 – 411, 1996 Shuaib A, Lees K, Lyden, P, Grotta J, Davalos A, Davis SM, Diener H-C, Ashwood T, Wasiewski WW, Emeribe U: NXY-059 for the treatment of acute ischemic stroke. New Engl J Med 357: 562 – 571, 2007 Strauss O: The Retinal Pigment Epithelium in Visual Function. Physiol Rev 85: 845 – 881, 2005 Subrizi A, Hiidenmaa H, Ilmarinen T, Nymark S, Dubruel P, Uusitalo H, Yliperttula M, Urtti A, Skottman H: Generation of hESC-derived retinal pigment epithelium on biopolymer coated polyimide membranes. Biomaterials 33: 8047 – 8054, 2012 Swijnenburg R-J, Schrepfer S, Govaert JA, Cao F, Ranshoff K, Selkh A, Haddad M, Connolly AJ, Davis MM, Robbins RC, Wu JC: Immunosuppressive therapy mitigates immunological rejection of human embryonic stem cell xenografts. P Natl Acad Sci-Biol 105(35): 12991 – 12996, 2008 Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA: Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Gen 4:246 – 258, 2003 Touchard E, Heiduschka P, Berduugo M, Kowalczuk L, Bigey P, Chahory S, Gandolphe C, Jeanny J-C, Behar-Cohen F: Non-viral gene therapy for GDNF production in RCS rat: the crucial role of the plasmid dose. Gene Ther 19: 886 – 898, 2012 Tropepe V, Coles BLK, Chiasson BJ, Horsford DJ, Elia AJ, Mcinnes R, van der Kooy D: Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science 287, 20132 – 2036, 2000 Urtti A: Challenges and obstacles of ocular pharmacokinetics and drug delivery. Adv Drug Deliver Rev 58, 111 – 1135, 2006 Wagner A, Vorauer-Uhl K: Liposome technology for industrial purposes. J Drug Deliv 2011: ID 591325 s. 1 – 9, 2011 Walther W, Stein U: Viral Vectors for Gene Transfer: A Review of Their Use in the Treatment of Human Diseases. Drugs 60(2): 249 – 271, 2000

28

Van Hoffelen SJ, Young MJ, Shatos A, Sakaguchi DS: Incorporation of murine brain progenitor cells into the developing mammalian retina. Invest Ophth Vis Sci 44(1): 426 – 434, 2003 Wang S, Lu b; Girman S, Duan J, McFarland T, Zhang Q-S, Grompe M, Adamus G, Appukuttan B, Lund R: Non-invasive stem cell therapy in a rat model for retinal degeneration and vascular pathology. PLoS ONE5(2): 1 – 9, 2010 Weil D, Lévy G, Sahly I, Lévi-Acobas F, Blanchard S, El-Amraoui A, Crozet F, Philippe H, Abitbol M, Pett C: Human myosin VIIA responsible for the Usher 1B syndrome: A predicted membrane-associated motor protein expressed in developing sensory epithelia. P Natl Acad Sci-Biol 93: 3232 – 3237, 1996 Whitley SJO, Litchfield TM, Coffey PJ, Lund RD: Improvement of the pupillary light reflex of Royal College of Surgeons rats following RPE cell grafts. Exp Nurol 140: 100 – 104, 1996 Wlfrum U: The cellular function of the Usher gene product myosin VIIA is specified by its ligands. Kirjassa: Retinal Degeneration: Mechanisms and Experimental Therapy. s. 133 – 142 Toim. LaVail M, Hollyfield JG, Andersson RE. Kluwer Academic, Plenum Publishers, New York, 2003 Wu W-C, Lai C-C, Chen S-L, Sun M-H, Xiao X, Chen T-L, Lin K-K, Kuo S-W, Tsao Y-P: Long-term safety of GDNF gene delivery in the retina. Curr Eye Res 30: 715 – 722, 2005 Vugler A, Carr A-J, Lawrenve J, Chen LL, Burell K, Wright A, Lundh P, Semo M, Ahmado A, Gias C, da Cruz L, Moore H, Andrews P, Walsh J, Coffey P: Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: Anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol 214: 347 – 361, 2008 Yang Y, Mohand-Said S, Danan A, Simonutti M, Fontaine V, Clerin E, Picaud S, Lévellard T, Sahel J-A: Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther 17(5): 787 – 795, 2009 Young MJ, Ray J, Whiteley SJO, Klassen H, Gage FH: Neuronal differentiation and morphological integration of hippocampal progenitor cells transplanted to the retina of immature and mature dystrophic rats. Mol Cell Neurosci 16: 197 – 205, 2000 Yu S, Tanabe T, Dezawa M, Ishikawa H, Yoshimura N: Effects of bone marrow stromal cell injection in an experimental glaucoma model. Biochem Bioph Res Co 344: 1071 – 1079, 2006 Zhang K, Zhang L, Weinreb RN: Ophthalmic drug discovery: novel targets and mechanisms for retinal diseases and glaucoma. Nat Rev Drug Discov 11:541–559, 2012

29

Zhang Y, Ivanova E, Bi A, Pan Z-H: Ectopic expression of multiple microbial rhodopsins restores ON and OFF light responses in retinas with photoreceptor degeneration. J Neurosci 29(29): 9186 – 9196, 2009