GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation.
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GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation
1- Présentation de la galerieGalerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.
Cupule
La galerie API 20 E
Microtube contenant le milieu déshydraté
1- GALERIE API 20E :
son ensemencement
1- Présentation de la galerieGalerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.
Cupule
La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés.
La galerie API 20 E
Microtube contenant le milieu déshydraté
2- Préparation de l’inoculum
Prélèvement d’une souche pure
sur GNI
1 seule colonie sur GO
5 mL d’eau distillée stérile
isolement
Souche pure sur GNI
5 mL d’eau distillée stérile
Préparation de l’inoculum pour ensemencer la galerie API 20 E
3- Ensemencement de la galerie API 20 EIntroduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ouverte, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles
Pour certains caractères:
Remplir le tube de suspension puis Recouvrir d’huile de paraffinePour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE
Ensemencement de la galerie API 20E
Remplir de suspension le tube et la cupulePour les tests :
CIT VP GEL
2- GALERIE API 20E :
sa lecture
2-1- Les réactifs à ajouter pour la lecture
4- Lecture de la galerie API 20 E
Après 24h d’incubation à 37°C, cupules ans lesquelles on doit rajouter des réactifs
Napht-1-ol Naphtyl-1-amine
Chlorure de fer III
2-2- Aspect des résultats positifs et négatifs
4- Lecture de la galerie API 20 E
Les 10 premiers tests
+ Réactif TDA
+ Réactif Kovacs
+ Réactifs VP 1 et 2
+ Réactif TDA
+ Réactif Kovacs
+ Réactifs VP 1 et 2
Tests négatifs
Tests positifs après ajout des réactifs utiles
Tests négatifs
Tests positifs
Après ajout des réactifs Nit 1 et Nit 2 : lecture de la NR (ici NR +)
Les 10 derniers tests
2-3- Explication des résultats positifs
ONPG
Mise en évidence de la béta-galactosidase
Substrat : ONPG
Réaction : ONPG + eau
Galactose + orthonitrophénol jaune
ADH, LDC, ODCMise en évidence de :- l'arginine désaminase- lysine décarboxylase- ornithine décarboxylase
Substrats : - arginine (dans ADH),- lysine (dans LDC) - ornithine (dans ODC)
Réactions : dégradations libérant des produits basiques
Révélateur : rouge de phénol
Rouge/Rose = +Jaune/Orangé = -
Rouge/Orangé = +Jaune = -
Citrate
Mise en évidence de la dégradation du citrate comme seule source de carbone.
Réaction : dégradation consommant des H+, donc responsable d’une alcalinisation.
Substrat : citrate
Révélateur : BBT
Mise en évidence de production de sulfure
Substrat : thiosulfate de sodium
Révélateur : Fe3+
Résultat positif : présence d’un précipité noir de sulfure de fer
H2S
Mise en évidence de la présence d'une uréase
Substrat : urée
Réaction : urée + eau CO2 + 2 NH3, d’où alcalinisation.
Révélateur : Rouge de phénol
Lecture : attention un orange clair sera -, un orange foncé sera considéré comme +
Urée
Mise en évidence d'une tryptophane désaminase
Substrat : Tryptophane
Produit obtenu : Acide indol pyruvique
Révélateur : -
Réactif ajouté : Chlorure de fer III donnant un produit marron foncé en présence d’acide indol pyruvique
TDA
Indole
Mise en évidence d'une tryptophanase
Substrat : Tryptophane
Produit : Indole
Révélateur : -
Réactif ajouté : Kovacs (ou James)
Voges Proskauer
Mise en évidence de la production d'acétoïne, de 2,3 butane diol et de butane dione
Substrat : Pyruvate
Révélateur : -
Réactifs ajoutés : VP1 et VP2
(1- naphtol et KOH)
TABLEAU DE LECTURE DE LA GALERIE MINIATURISÉE API 20E
Microtube Substrat : Caractère recherché RévélateurLecture directe ou
indirecteTest (si nécessaire)
Résultat-
Résultat +
ONPGONPG = Ortho-Nitro-Phényl-Galactoside
ADHLDCODC
ArginineLysineOrnithine
Rouge de phénol
CIT Citrate
H2SThiosulfate de sodium
Fe III
URÉ Urée
TDA Tryptophane
IND Tryptophane
VPPyruvate de sodium
GEL GélatineParticules de charbon
GLU à ARA
= zymogramme
Substrat carboné (glucide)
NO2- / N2 Nitrates (NO3
-)
Béta galactosidase
Lecture directe
Arginine DihydrolaseLysine DécarboxylaseOrnithine Décarboxylase
BBT
Lecture directe
Lecture directe
Lecture directe
Lecture directe
Lecture directe
Utilisation du citrate
Production d’H2S
Uréase Rouge de Phénol
Tryptophane désaminase
Tryptophanase ou production d’indole
production d’acétoïne (3-hydroxybutanone
gélatinase
Utilisation de substrats carbonés (glucides)
Nitrate réductase
BBT
Lecture directe
Lecture indirecteAjouter une goutte de réactif chlorure de fer III
Lecture indirecteAjouter une goutte de réactifKovacs
Lecture indirecteAjouter 1 goutte de VP1 et VP2 Attendre 10 minutes
Lecture indirecteAjouter 1 goutte de NIT1 et NIT2 et zinc éventuellement
BBT
3- GALERIE API 20E :
son interprétation (identification de la souche)
Validation et possibilité d’interprétation si :
– Cupule Glu +
– Ou 3 autres cupules au moins positives
Démarche d’identification :- apporter la preuve que la bactérie appartient bien à la famille des Enterobacteriaceae (montrer qu’elle a les 7 caractères définissant la famille)- identifier le genre, voire l’espèce :
* approche dichotomique, ou utilisation de tableaux des caractères
* codage API* approche probabiliste utilisant
un logiciel informatique
5 2 1 5 7 7 3 5
+ +-
Code n°: 5 215 773 (55)
++
5
5- Identification de la souche
Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code
Lecture des résultats de la galerie :
Résultats reportés sur la fiche d’identification
5- Identification de la souche (suite)
Méthode d’identification probabiliste (p340 DTK)
• Le nom du micro-organisme est obtenu par un calcul de probabilité
• A chaque caractère d’un micro-organisme donné fait référence une probabilité d’être + ou –
• La probabilité que ce soit un taxon donné correspond aux produits des probabilité attribué à chaque caractère (si + = % de positivité ou si - =100%-% de positivité)
= Le logiciel classe tous les résultats pour donner le ou les taxons les plus probables.
typicité
Indice de typicité : comparaison entre le profil trouvé et le profil réel de la souche