Gab1 adapter fehérje eredetű, sejtmembrán permeábilis...
Transcript of Gab1 adapter fehérje eredetű, sejtmembrán permeábilis...
Gab1 adapter fehérje eredetű, sejtmembrán permeábilis
foszfopeptidek hatása a B sejtek jelátviteli folyamataira
doktori értekezés
Készítette: Kertész Ákos
Témavezető: Prof. Sármay Gabriella, egyetemi tanár
Programvezető: Prof. Mandl József, egyetemi tanár
SOTE KKK Doktori Iskola, Molekuláris orvostudományok / Pathobiokémia
(7/2) Program
A bírálóbizottság elnöke:
Prof. Falus András, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja
Opponensek:
Prof. Sarkadi Balázs, kutató professzor, az MTA levelező tagja
Dr. Reményi Attila, tudományos főmunkatárs, Ph.D.
Bizottsági tagok:
Prof. Enyedi Péter, egyetemi tanár, az MTA doktora
Dr. Bauer Pál, egyetemi docens, Ph.D.
Dr. Vellai Tibor, tanszékvezető, Ph.D.
Dr. Váradi András
ELTE TTK, Immunológia Tanszék
Budapest, 2008
Tartalomjegyzék
Összefoglalás 3
Summary 4
Rövidítések 6
1. Irodalmi áttekintés 7
1.1. A fehérje foszforiláció szerepe 7
1.2. Receptorok és jelátviteli folyamatok B sejtekben 9
1.2.1. A B-sejt receptor komplex (BCR) 9
1.2.2. BCR keresztkötés által indukált jelátviteli folyamatok 10
1.2.3. A koreceptorok szerepe 13
1.3. SHP2 14
1.4. PI3-K 16
1.5. A Gab adapter-fehérje 18
1.5.1. A Gab transzlokációja a membránhoz, majd ezt követő foszforilációja 19
1.5.2. A Gab fehérje szerepe a jelátvitel szabályozásában 22
Gab-SHP2 22
Gab-PI-K 24
1.6. Foszfopeptidek transzportja a citoplazmába 25
2. Célkitűzések 27
3. Anyagok és módszerek 29
3.1. A kísérletek során felhasznált pufferek és médiumok 29
3.2. A felhasznált ellenanyagok 29
3.3. A kísérletekben felhasznált szintetikus, sejtmembrán permeábilis peptidek
(CPP) szekvenciái 30
3.4. A kísérletekben felhasznált szintetikus, Gab1 fehérje eredetű peptid
szekvenciák 30
3.5. A kísérleti módszerek 31
4. Eredmények 36
4.1. Az optimális, sejt-permeábilis hordozó peptid kiválasztása 36
4.2. Az hordozó-foszfopeptid konjugátum penetrációs képességének és
toxicitásának vizsgálata 42
1
4.3. A foszfopeptidekhez kapcsolódó fehérjék azonosítása 47
4.4. A foszfopeptidek in vitro SHP2 enzim-aktivitást módosító hatása 50
4.5. A Gab1-SHP2 sejten belüli interakció gátlása a sejtmembrán permeábilis
foszfopeptidekkel 52
4.6. Az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidek hatása az intracelluláris
fehérje foszforilációs mintázatra. 53
4.7. Az SHP2 szerepe az Erk foszforiláció gátlásában 59
4.8. A PI3-K függő degranuláció gátlása RBL hízósejtekben 60
4.9. Módosított peptidek alkalmazása 61
5. Megbeszélés 64
6. Következtetések 78
7. Irodalomjegyzék 79
Köszönetnyílvánítás 91
Saját közlemények jegyzéke 92
2
Összefoglalás
A fehérjék reverzibilis tirozin foszforilációja kiemelt szerepet játszik a különböző
receptorok által közvetített jelátviteli kaszkádokban. A tirozin kinázok és foszfatázok
által szabályozott aktivációs lépések végső soron a sejtek sokrétű válaszát
eredményezhetik, úgymint proliferáció, túlélés, programozott sejthalál, differenciáció
vagy migráció. Az adapter fehérjék interakciós felszínt szolgáltatnak a multimolekuláris
jelátviteli komplexek számára, ezáltal fontos szerepet játszanak a plazmamembrántól a
sejtmagba irányuló jeltovábbítás szabályozásában. A Gab1 (Grb2-associated binder 1)
adapter fehérje fontos integráló szerepet játszik a növekedési faktor, citokin és antigén
receptorok keresztkötésével megindított jelátviteli eseményekben. A ligand általi
receptor keresztkötést követően a Gab1 számos tirozinján foszforilálódik. A
foszfotirozin tartalmú motívumokhoz SH2 doménnel rendelkező fehérjék
asszociálódnak, mint például az SHP2 tirozin foszfatáz és a foszfatidilinozitol-3 kináz
(PI3-K). A Gab1/SHP2 kapcsolat lényeges szerepet játszik a sejtnövekedés
szabályozásában, míg az SHP2 és PI3-K-nak a túlélési és proliferációs szignálokban
van nélkülözhetetlen szerepe. A Gab1/SHP2 és a Gab1/PI3-K fehérje kölcsönhatások
ebből kifolyólag a tumor terápiás kutatások kiemelt célpontjaivá válhatnak.
Feltételezésünk szerint az SH2 doménekkel interakcióba lépő szintetikus
foszfopeptidek gátolhatják a fehérje-fehérje kapcsolatok kialakulását, befolyásolva
ezáltal a jelátviteli folyamatok kimenetelét. Célunk a Gab1 fehérje SH2 doménekhez
kötődő szekvenciáit reprezentáló sejtmembrán-permeábilis foszfopeptidek tervezése és
vizsgálata, amelyek szelektíven módosíthatják a B sejtek jelátvitelét, ill. végső soron
gátolni képesek a B limfociták kóros sejtburjánzását. A foszfopeptidek élő sejtbe
juttatásához az előkísérletek alapján az oktanoil zsírsavlánccal kovalensen konjugált
okta-arginin (OR8) hordozót találtuk a legalkalmasabbnak. A továbbiakban
sejtvonalakon vizsgáltuk a membrán-permeábilis peptidek ex vivo hatásait. Kimutattuk,
hogy az SHP2 foszfatázhoz kötődő, Gab1 eredetű foszfopeptid (OR8-GDLDpe)
módosította az intracelluláris fehérjék tirozin foszforilációját, és csökkentette az anti-
IgM által kiváltott Erk foszforiláció mérékét BL41 Burkitt-limfóma sejtekben. Továbbá
az OR8-GDLDpe korlátozta a BCR által indukált Gab1-SHP2 kapcsolat kialakulását. A
PI3-K kötő OR8-ELPNpe szekvencia csökkentette az anti-IgM indukált Akt
3
foszforilációt és gátolta a PI3-K függő degranulációt RBL-2H3 patkány hízósejtvonal
eredetű sejtekben.
Az eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a sejtmembrán- permeábilis
foszfopeptidek gátolni képesek a Gab1/SHP2 és Gab1/PI3-K fehérje kölcsönhatások
kialakulását és ezáltal módosíthatják a proliferációs, apoptotikus és túlélési szignálokat.
Summary
Reversible phosphorylation of protein tyrosine residues plays a critical role in
signaling cascades triggered by growth factors, cytokine and antigen receptors: BCR
and TCR. These activation events controlled by the opposing activities of protein
tyrosine kinases (PTKs) and phosphatases (PTPs) eventually lead to diverse cellular
response such as proliferation, survival, apoptosis, differentiation or migration. Adaptor
proteins play important regulatory role in downstream signal transduction from the cell
membrane towards the nucleus, providing a surface to form multimolecular signaling
complex. Grb2-associated binder 1 (Gab1) is a scaffolding/adaptor protein involved in
the signal transduction pathways of growth factors, cytokines, and antigen receptors.
Gab1 adaptor protein has several tyrosine residues, which are phosphorylated upon
ligand mediated tyrosine kinase activation and binds signaling molecules with SH2
domains, such as SHP-2 tyrosine phosphatase and phosphatidyl inositol 3-kinase (PI 3-
K). Gab1/SHP-2 contact is essential for cell growth, in addition, SHP-2 and PI3-K
regulate signals leading to proliferation and cell survival, thus Gab1/SHP-2 and
Gab1/PI3-K interactions might be attractive targets for the therapy of malignant cell
growth.
We hypothesized that phosphopeptides interacting with SH2 domains may disrupt
protein-protein interaction, thereby influencing intracellular signaling. Our main goal is
to design cell membrane permeable phosphopeptides corresponding to the SH2 domain
binding sequences of Gab1 that would selectively regulate the B cell response,
ultimately inhibiting the growth of B cell tumors. In order to transport the
phosphopeptides into living cells they were conjugated to membrane-permeable carrier,
namely octanoyl-oligoarginin (OR8). With this strategy the ex vivo effect of cell
4
membrane-penetrating phosphopeptides was analyzed. We have shown that
phosphopeptides corresponding to the SHP-2 binding motif of Gab1 (OR8-GDLDpe)
modulated tyrosine phosphorylation of intracellular proteins and reduced Erk
phosphorylation triggerd by anti-IgM in BL41 Burkitt-lymphoma cell line. Furthermore,
OR8-GDLDpe attenuated the BCR induced interaction between Gab1 and SHP2. The
PI3-K binding sequence of Gab1, OR8-ELPNpe decreased the anti-IgM induced Akt
phosphorylation and inhibited the PI3-K dependent mast cell degranulation in RBL-2H3
cells.
These data suggests that the cell penetrating phosphopeptides may interfere with the
Gab1/SHP-2 and Gab1/PI3K interaction and modulate intracellular signaling leading to
cell proliferation and cell survival.
5
Rövidítések
BCR - B Cell Receptor
BLNK – B cell linker protein
Btk – Bruton’s type kinase
BTAM-Bisphosphoryl tyrosine-based activation motif
CPP – Cell Penetrating Peptides
Csk – C terminal Src Kinase
Erk – Extracellular regulated kinase
FACS – Fluorescein Activated Cell Sorter
Gab – Grb2 associated binder
ITAM – Immunreceptor Tyrosine-based Activation Motif
ITIM - Immunreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif
LPC – Lysophosphatidylcholine
MAPK – Mitogen Activated Protein Kinase
MIRR – Multisubunite Immune Recognition Receptor
MS – Mass Spectrometry
PH – Pleckstrin Homology
PI3-K – Phosphoinositide-3 - kinase
PIP3 /PIP2 – Phosphatidylinositol Tri/Bisphosphate
PLC – Phospholipase C
PP - Phosphopeptide
PTB – Phosphotyrosine Binding
PTEN – Phosphatase and Tensin Homolog deleted on chromosome 10
PTK – Protein Tyrosine Kinase
PTP – Protein Tyrosine Phosphatase
SH2 – Src Homology 2
SHP2 – Src Homology 2 domian containing Protein Tyrosine Phosphatase
SPR – Surface Plasmon Resonance
TCR – T Cell Receptor
6
1.) Irodalmi áttekintés
1.1. A fehérje-foszforiláció szerepe
A sejtélettani folyamatok egyik legáltalánosabb és egyben legfontosabb reverzibilis
szabályozási módja a fehérje-foszforiláció folyamata. Emlős sejteken végzett 32P
foszfor-izotópos vizsgálatok alapján a celluláris fehérjék mintegy harmadánál jellemző
e transzlációt követő kovalens módosítás. A kinázok által katlizált foszforiláció, ill. az
ellentétes szerepű foszfatázok által irányított defoszforiláció lényeges szerepet játszik a
növekedés és differenciáció szabályozásában, a sejtciklus, az alakváltozás, a
metabolizmus, az apoptózis, a transzkripció kontroljában és az intracelluláris jelátvitel
szabályozásában1,2.
A fehérjék foszforilációja túlnyomó többségben a szerin és treonin aminosavak
oldalláncain történik. A tirozin foszforilációja mindössze néhány százalékot tesz ki a
teljes fehérje-foszforilációs mintázatban, szerepe mégis kiemelt jelentőséggel bír,
ugyanis mintegy tíz százalékos eltérés a normál, egyensúlyi értéktől elegendő lehet a
sejt rosszindulatú transzformációjának megindításában ill. egyéb kóros működés
kialakításában3,4,9.
Számos receptor maga is rendelkezik fehérje tirozin kináz (PTK) aktivitással, mint
pl. az EGFR, PDGF növekedési receptorok vagy különböző citokin receptorok, míg
más receptorok citoplazmatikus PTK-okat toboroznak a közelükbe a jeltovábbítás során.
Ide tartoznak a több alegységből álló MIRR család receptorai a BCR, TCR ill. Fc-
receptorok. A sejtfelszíni receptorhoz történő ligandum kötődését követően a
receptorok, ill. a receptorhoz asszociált PTK-ok tirozin foszforilációja egy jelátviteli
kaszkádot indít meg. Az összetett jelpályák iránya a sejtmembrántól a sejtmagba vezet,
és a génátírást követően a jel minőségétől függő diverz sejtválasz alakul ki, amely lehet
differenciáció, prolifráció, apoptózis, motilitás változás stb5.
A tirozin foszforiláció egyrészt a molekulák konformációjának megváltoztatásával,
másrészt SH2, illetve PTB domént hordozó fehérjék toborzásával és intracelluláris
irányításával fejti ki szabályzó szerepét a jelátviteli folyamatokban. Az SH2 és PTB
domének olyan fehérjemodulok, melyek szelektíven képesek kapcsolódni foszforilált
tirozint tartalmazó peptidszekvenciákhoz. A mintegy 100 humán SH2 gén termékei
különböző osztályba tartozó foszfotirozin ligandumokhoz asszociálódnak. A kötődés
7
affinitásában és szelektivitásában a tirozint körülvevő amiosavak játszanak szerepet,
ezek közül is kiemelt jelentőséggel bír a C-terminálisan 3-as pozícióban elhelyezkedő
aminosav minősége (Yxx?)6,7.
Számos PTK játszik stimuláló szerepet a proliferációs jelpályákban, így a tirozin
kinázok gyakran válnak az onkogenikus mutációk célpontjává humán tumorok esetében.
Példa erre az emberben először azonosított proto-onkogén termék, az Src tirozin kináz.
Egészséges sejtben a vad típusú Src kináz 527-es foszforilált tirozinja intramolekuláris
kapcsolatot alakít ki a fehérje saját, SH2 doménjével, gátolva ezáltal az enzim
katalitikus aktivitását, míg mutált onkogén termék esetében hiányzik az 527-es gátló
tirozin, aminek következtében a kináz konstitutíven aktív8,9. Emellett meg kell jegyezni,
hogy szerin-treonin kinázok (Raf) ill. más jelátviteli molekulák, pl. G-fehérjék (Ras) is
protoonkogén termékek.
A foszfatázoknak konvencionálisan a kinázokkal ellentétes hatást tulajdonítanak,
többek között a proliferációs szignál csendesítésében játszanak szerepet, ezáltal egyes
foszfatázok tumor szupresszor hatásúak. Számos esetben ez már bizonyítást is nyert, pl.
a receptor típusú fehérje tirozin foszfatáz (PTP), Dep-1 overexpressziós kísérletekben
tumor szupresszor hatásúnak bizonyult, ill. a PTEN lipid foszfatáz esetében, amely a
PI3-K aktivációs utat gátolja10. Más PTP-k esszenciális szerepet játszanak a proliferáció
és/vagy túlélés pozitív szabályozásában. A PTPN11 volt az első leírt proto-onkogén,
1.1.ábra Az SHP2 mutációk okozta különböző megbetegedések.
8
melynek a terméke az SHP2 tirozin foszfatáz, és konstitutívan aktív mutált formája
szerepet játszik a gyermekkori leukémia, a Noonan-szindróma, Leopárd szindróma és
más fejlődési rendellenességek kialakulásában (1.1.ábra).
A mutáció hatására megszűnik az N-terminális SH2 domén és a foszfatáz doménben
található foszfotirozin közötti inhibíciós kölcsönhatás, amely következtében
folyamatosan aktív konformációt vesz fel az SHP2, ami a továbbiakban kóros
elváltozásokhoz vezet11,12.
A fent említett tények miatt a foszforilációs eseményekben szerepet játszó proto-
onkogén termékek mára a tumorterápiás kutatások kiemelt célpontjaivá váltak.
1.2. Receptorok és jelátviteli folyamatok B sejtekben.
1.2.1. A B-sejt receptor komplex (BCR) A B limfociták antigén-receptoron keresztül közvetített jelátviteli folyamatai
különböző módon befolyásolhatják a perifériára került B-sejtek sorsát. A BCR által
közvetített tonikus jelek ill. a BCR-antigén kölcsönhatás a körülményektől függően a
sejtek érését, szelekcióját, apoptózisát, anergiáját, túlélését ill. aktivációját válthatják
ki13-15.
A B-sejt receptor komplex a MIRR receptorcsalád többi tagjához hasonlóan több
komponensből áll, melyben ligandumkötő és jeltovábbító alegység különíthető el
egymástól. Az antigén megkötéséért felelős alegység a nagy variabilitást mutató
sejtfelszíni immunglobulin, melynek három aminosavat tartalmazó citoplazmatikus
régiója jeltovábbításra alkalmatlan. A hozzá nem kovalensen kapcsolódó járulékos
heterodimer Igα és Igβ láncok alkotják a jeltovábbító alegységet. A disszulfidhíddal
összekötött transzmembrán glikoprotein Igα és Igβ intracelluláris szakasza 61 ill. 48
aminosav hosszúságú. Ezek a szakaszok tartalmazzák az immunreceptor tirozin-alapú
aktivációs motívumot (ITAM), amely hat konzervált aminosavat tartalmaz a
D/Ex7D/Ex2Yx2L/Ix7Yx2L/I szekvenciában16. A BCR-ok keresztkötése az ITAM
motívumok tirozin foszforilációjához vezet. Az ITAM által közvetített jelekhez mindkét
konzervált tirozin aminosavra szükség van, bármelyikük fenilalaninra történő cseréje a
jeltovábbítás megszűnésével jár13,17.
9
A foszforilált ITAM motívumokhoz a jelátviteli folyamatok továbbításáért felelős
molekulák képesek kötődni. Ezek az SH2 doménnel rendelkező fehérjék az ITAM
motívum foszforilált tirozinjaihoz kapcsolódnak.
1.2.2. BCR keresztkötés által indukált jelátviteli folyamatok A BCR aggregációját követő foszforilációs kaszkád megindítja a korai aktivációs
folyamatokat, melyeknek részletei még számos ponton tisztázásra szorulnak18. A három
legjelentősebb és legjobban feltérképezett útvonal a következő: a foszfatidil-inozitol
specifikus foszfolipáz Cγ (PLCγ) aktiváció, a p21ras aktiváció és a foszfatidil-inozitol 3-
kináz (PI3-K) aktiválódásával beinduló jelpálya (1.2.ábra).
Proliferáció Túlélés Apoptózis
1.2.ábra A B sejt receptor által közvetített proliferációs, túlélési és apoptotikus
szignálok.
10
Érett B sejtekben az antigén általi keresztkötést követően a BCR áthelyeződik a lipid
raftokba, ahol a membrán asszociált Src tirozin kinázok (Lyn, Fyn) foszforilálják az
ITAM motívum tirozinjait, ami további Src kináz kötődését és aktivációját váltja ki19. A
következő lépésben a két SH2 doménnel rendelkező Syk tirozin kináz kapcsolódhat a
kétszeresen foszforilált ITAM szekvenciához, bár kis mértékű kötődése ismert a nyugvó
állapotú receptor komplexhez is20. Az ITAM-hoz kötődve fokozódik a Syk auto- és
transz-foszforilációs aktivitása, ami által a folyamat felerősödik és az enzimatikusan
aktív Src és Syk kinázok számos szubsztrátot foszforilálhatnak és több jelátviteli utat is
bekapcsolhatnak21.
A Syk egy másik tirozin kinázzal, a Btk-val együtt katalizálja a PLCγ jelpálya
aktiválódását22,23. A Btk PH doménjén keresztüli asszociációja a membrán
foszfatidilinozitol-3,4,5-triszfoszfáthoz elengedhetetlen szerepet játszik a kináz
aktivációjában24. A Syk foszforilálja a PH doménjével a sejtmembránhoz kötődő
BLNK adapter fehérjét, amely ezáltal dokkoló helyet képez a Btk és a PLCγ számára25.
A PLCγ tehát a BLNK-hoz kapcsolódva a citoplazmából a plazmamembrán közelébe
helyeződik át és Btk általi foszforilációja után hidrolizálja szubsztrátját, a
membránalkotó foszfatidil inozitol-4,5-biszfoszfátot (PIP2). A hasítási termékek az
1,4,5-inozitol-triszfoszfát (IP3) és a diacil-glicerol (DAG)26. Az IP3 az endoplazmatikus
retikulum (ER) membránjában lévő IP3 receptorokhoz kötődve Ca2+ felszabadulást
indukál. A megnövekedett intracelluláris szabad kalcium szint a plazmamembrán
kalciumcsatornáinak (SOC - store operated calcium) kinyílásához vezet, így további
kalcium ionok áramlanak a citoplazmába. A sejten belüli Ca2+ koncentráció
megemelkedése kalciumfüggő enzimek aktiválódását idézi elő, ami végül a korai gének
(c-fos, c-myc) átíródásához vezet. A lipid hidrolízis másik terméke a DAG a protein
kináz C (PKC) család számos izoformáját aktiválja. A szerin-treonin kináz aktivitású
PKC-k különböző transzkripciós faktorok (CREB) és jelátviteli molekulák (Ras)
működését szabályozzák27.
A BCR keresztkötése aktiválhatja a ras proto-onkogén termékét, a p21ras GTP-kötő
fehérjét is. A Ras membránhoz kötött guanin-nukleotid kötő fehérje, amely GTP-t kötött
formában aktív, GDP-t kötött formában pedig inaktív. A Ras PKC-tól független módon
történő aktivációjában a Grb2-Shc-Sos fehérje-komplex játszik főszerepet. Aktiváció
hiányában a Sos guanin nukleotid-cserefaktor a Ras-GDP formát stabilizálja és nyugvó
11
limfocitákban nincs kapcsolatban a Grb2-vel. Aktiváció során az Src kinázok tirozinon
foszforilálják a Shc adapter fehérjét, aminek következtében az a Grb2 adapterfehérje két
SH2 doménjével léphet kölcsönhatásba, miközben a Shc molekula SH2 doménje
segítségével a plazmamembránhoz transzlokálódnak. A membrán közeli Shc-Grb2
komplex a Grb2 SH3 doménjén keresztül a Sos prolinban gazdag régiójához
kapcsolódik. A továbbikban a Sos cserefaktor katalizálja a Ras-hoz kötött GDP
disszociációját ill. GTP-re történő cseréjét, ezután a Ras GTP-kötött formájáról a Sos-
Grb2-Shc komplex leválik28,29. Az aktivált Ras-hoz a Raf szerin-treonin kináz
kapcsolódik, amely aktiválódása után a MAP kináz kinázokat foszforilálja (MEK1/2). A
jelátviteli kaszkád következő lépése a MAP kinázok (Erk1/2) aktivációja, melyek végül
transzkripciós faktorokat aktiválnak (c-jun, c-fos, c-myc) és így a korai aktivációs gének
átírását szabályozzák. A Ras aktiválódását ezen kívűl számos egyéb tényező
befolyásolja B-sejtekben, így többek között a PI3-K, a PKC, a BLNK, Cbl vagy negatív
szabályozója a RasGAP fehérje13,30.
A harmadik jelentős jelpálya a B-sejtekben a PI3-kináz aktiválódásához kötődik. A
PI3-K egyrészt a transzmembrán CD19 molekulához, másrészt a Gab adapter fehérjéhez
asszociálódva vesz részt a B-sejtek aktivációjában31. A PI3-K p85-ös regulátor
alegysége SH2 doménjével kapcsolódik a CD19 ill. Gab fehérjék Src kinázok által
foszforilált tirozinjaihoz, aktiválva ezáltal a p85-höz kapcsolódó p110-es katalitikus
alegységét32. A PI3-K legfontosabb szerepét a membránalkotó foszfatidilinozitol
átalakulás szabályozásában tölti be. Az inozitol gyűrűt 3-as pozícióban foszforilálva a
foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfátot foszfatidilinozitol-3,4,5-triszfoszfáttá (
PtdIns(3,4,5)P3 v. PIP3 ), ill. a foszfatidilinozitol-4-foszfátot foszfatidilinozitol-3,4-
biszfoszfáttá ( PtdIns(3,4)P2 v. PIP2 ) alakítja át. Ezek a termékek dokkoló helyet
szolgáltatnak a különböző PH domén tartalmú fehérjék számára, mint például a PLCγ, a
Btk, az Akt, vagy a Gab adapterfehérjék33,34.
A PI3-K tehát a membránhoz toborzott fehérjék mennyiségét és összetételét
szabályozva a jelátadás igen sokrétű irányítója. Befolyásolja a sejtaktivációt, a
sejtciklust a citoszkeleton működését. Fontos szerepet tölt be a túlélési, proliferációs és
apoptotikus szignálok szabályozásában ill. hibás működés esetén a karcinogenezisben35.
12
1.2.3. A koreceptorok szerepe A BCR-en keresztül érkező jeleket az Igα/Igβ járulékos láncok ITAM motívumai
közvetítik a sejt belsejébe, ahol a különböző jelpályákat az adapter fehérjék integrálják
oly módon, hogy végül a sejt az adott környezeti ingerre egy bizonyos válasszal reagál..
Azonban a B-sejt jelátvitel szabályozásában in vivo körülmények között számos
koreceptor is részt vesz, melyek gátló vagy serkentő módon hatnak az antigénreceptor
közvetített aktivációs folyamatokra.
Aktiváló koreceptor a már korábban említett CD19 transzmembrán glikoprotein,
amely a CD21, CD81, Leu13 molekulákkal alkot tetramer receptorkomplexet36. A BCR
keresztkötése a CD19 gyors tirozin foszforilációját is eredményezi, amely SH2 domén
tartalmú jelátviteli fehérjéket toboroz a BCR közelébe (PI3-K, Lyn, Vav)37. Mivel a
CD19 kapcsolódik a CR2 (CD21) komplementreceptorral, a komplement tartalmú
immunkomplexek által kialakított jelátviteli folyamatokban is szerepet játszik38. A fenti
folyamatok következtében a CD19 és BCR egyidejű keresztkötése szinergista hatású,
ezáltal a CD19 csökkenti a B-sejtek aktivációs küszöbértékét.
Az FcγRIIb (CD32) a humorális immunválasz negatív szabályozó receptora, amely
gátolja az ellenanyag termelést, az intracelluláris kalcium koncentráció növekedését és a
proliferációt39. Az FcγRIIb a többi Fc receptorhoz hasonlóan az immunglobulinok nehéz
láncának konstans részét ismerik fel. Az antigén és a hozzá kapcsolódó ellenanyag
komplex egyidejűleg kapcsolódhat ugyanazon B-sejt sejtfelszíni immunglobulinjához és
Fc receptorához. Ebben az esetben a BCR-en keresztüli aktivációs szignállal
párhuzamosan az FcγRIIb negatív jelet közvetít a B-sejt felé. A gátló szignál csak az
FcγRIIb és a BCR együttes keresztkötésekor alakul ki. Ebben az esetben az FcγRIIb
intracelluláris szakaszán található immunreceptor tirozin-alpú inhibíciós motívum
(ITIM) I/VxYxxL/V szekvenciájában található tirozint foszforilálja a Lyn src kináz40. A
foszforilált ITIM ezután SH2 doménnel rendelkező tirozin- (SHP2, SHP1) ill. inozitol-
foszfatáz (SHIP) aktivitású molekulákat toboroz az aktiváló receptorok közelébe,
melyek negatívan szabályozzák a BCR indukált jelátviteli folyamatokat40,41 (1.3.ábra).
13
1.3.ábra A BCR indukált korai jelátviteli események és az FcγRII receptor
keresztkötésével megiduló, aktivációt gátló folyamatok.
A fent említett koreceptorokon kívűl számos egyéb serkentő ill. gátló hatású
sejtfelszíni receptor (CD22, PIR család, CD40, MHCII, B7 stb.) és intracelluláris
fehérje (Cbl, Vav, Crk, Cdc42 stb.) is szerepet játszik a B-sejt válasz kialakításában,
azonban ezek tárgyalására nem térünk ki.
1.3. SHP2 tirozin foszfatáz Az SHP2 két N-terminális SH2 domént és egy centrálisan elhelyezkedő foszfatáz
(PTP) domént tartalmazó 68 kDa-os fehérje. Inaktív formában a citoplazmában
helyezkedik el és zárt konformációt vesz fel, amelyben az N-terminális SH2 domén
kapcsolatba lép a PTP doménnel, ezáltal gátolva az enzim aktivitását. Ha az SH2 domén
egy tirozinon foszforilált peptidhez kapcsolódik a fehérje felveszi a nyitott
konformációját, ami által a PTP domén felszabadul a gátlás alól és az enzim aktívvá
14
válik. Tehát az SHP2-höz SH2 doménen keresztül kapcsolódó molekuláris partnerek a
lokalizáció mellett egyben az enzim aktivitását is szabályozhatják. A nyugalmi
állapotban mérhető alapaktivitáshoz képest 10-szeresére nő az enzim aktivitása, ha
monofoszfo-peptidhez kötődik, míg 100-szorosára, ha mindkét SH2 doménhez
kapcsolódó bifoszfo-peptiddel lép kapcsolatba a fehérje42,43. Irodalmi adatok szerint az
SHP2-közvetített Erk aktivációhoz az SHP2 C-terminális tirozinjainak a foszforilációja
is szükséges bizonyos növekedési faktorok jelátvitelében (PDGF, FGF) 44. Emellett az
SHP2 egy prolinban gazdag régiót is hordoz C-terminálisan, így adapter molekulaként
is funkcionálhat..
Míg a hasonló szerkezeti felépítést mutató SHP1 főleg hematopoetikus sejtekben
expresszálódik és az intracelluláris folyamatok negatív regulátora, az SHP2 minden
szövettípusban kifejeződik és általában a növekedési faktorok, citokinek, hormonok
pozitív szabályozója (PDGF, EGF, Inzulin, IL-1, IL-2, IL-6) 45-48. Funkcionális szerepük
csak részben átfedő, ami főleg az SH2 közvetített eltérő fehérje interakciókból és
katalitikus doménjeik közti különbségekből adódnak49,50.
Az SHP2 nélkülözhetetlen az embrionális fejlődésben, a hemato és limfopoézisben.
Hiánya letális51,52. Akár az azonos jelátviteli útvonal során betöltött pozitív és/vagy
negatív szabályzó mechanizmusaival a jelintenzitás finomra hangolásában, ill. a jel
időtartamának meghatározásában játszik fontos szerepet.
Pozitív szabályzó szerepét többféle mechanizmus alapján is betöltheti (1.4.ábra).
1.4.ábra Az SHP2 általi pozitív szabályzás lehetőségei
15
Az src kinázok szabályozása a Csk-t (C-terminális src kináz) kötő adapter-fehérje
SHP2 általi defoszforilációján keresztül valósul meg. A defoszforilációt követően a Csk
távol kerül szubtrátjaitól, így az src kinázok fölszabadulnak a Csk általi gátlás alól53.
Egyes receptorok jelátvitelében az SHP2 a Grb2-Sos komplexhez kapcsolódva, mint
adapter fehérje serkenti a Ras aktivációt47,54. Az EGF receptoron keresztüli Ras-Erk
aktivációban pedig a Gab1-el komplexben játszik pozitív szabályzó szerepet (lásd
később) 55. ITIM motívumot hordozó receptorokhoz asszociáltan az SHP2 negatív
regulátorként szerepel (CTLA-4, PD-1, BTLA, KIR, PECAM-1).
A Noonan szindrómás (NS) betegek 50%-nál kimutatható az SHP2 rendellenes
működése. Az NS betegekre jellemző, hogy nagy valószínűséggel alakul ki bennük
fiatalkori mielo-monocitozisos leukémia (JMML) 11,56. Szerepe van továbbá a BCR-
ABL onkogén okozta krónikus mieloid leukémiában (CML) 57.
1.4. PI3-K Az PI3-K (CLASS IA) 85 kDa-os regulátor alegysége hordozza az YxxM motívumot
felismerő két SH2 domént és emellett, izoformától függően SH3 domént ill. prolinban
gazdag régiókat is tartalmazhat. A 110 kDa-os alegység hordozza a kináz domént, mely
katalitikusan aktív konformációját akkor veszi fel, amikor a regulátor alegység SH2
doménje foszfotirozint tartalmazó szekvenciához kapcsolódik. Alternatív aktiválódási
lehetőség, amikor a fehérje a p110-es alegységén keresztül a Ras G-fehérjéhez kötődik
(CLASS IB) 58,59. A p110-es alegység α és β izoformájának hiánya egyaránt letális,
ugyanis nélkülözhetetlen szerepet játszanak az embrionális fejlődés korai
szakaszában60,61.
Legfontosabb szerepét a membrán foszfatidilinozitol összetétel szabályozásán
keresztül a PH domén tartalmú fehérjék membránhoz irányításával tölti be (lásd fent).
Az egyik legjobban ismert és a túlélési szignálokban legfontosabb szerepet játszó PI3-K
közvetített jelpálya az Akt/PKB szerin/treonin kináz aktivációs út. Az Akt első lépésben
a PI3-K foszforilációs termékéhez a PIP3-hoz asszociálódik PH doménjén keresztül. Ezt
követő lépésekben a PH doménjükkel szintén a PIP3-hoz kapcsolódó PDK1 és PDK2
kinázok foszforilálják az Akt thr 308, ill. ser 473 aminosav oldalláncait, ami által az Akt
elnyeri teljes aktivitását62,63. Az Akt a továbbiakban növekedési, túlélési, sejtciklust
szabályzó és anti-apoptotikus szignálokat közvetítő fehérjéket foszforilál ( Bad, GSK3,
16
mTOR, NFκB), melyek hibás szabályozás esetén kóros sejtburjánzást indukálhatnak64-66
(1.5.ábra).
1.5.ábra A PI3-K – Akt jelpálya szerepe
A foszfoinozitidek metabolizmusában a PI3-K mellett fontos szabályozó szerepet
játszanak a PTEN és az SHIP foszfatázok. Az SHIP a PtdIns(3,4,5)P3 ill. PtdIns(4,5)P
inozitol gyűrűket defoszforilálja 5’ pozícióban, míg a PTEN a PI3-K-al ellentétes
működésű, tehát 3’ pozícióban defoszforilálja a PtdIns(3,4,5)P3 –at10.
Emellett a PI3-kináznak szerepe van több, Akt-tól független, kevésbé ismert út
aktiválásában is. Az SGK kináz aktiválásával túlélési szignált közvetít, a Rac1, CdC42,
PKC fehérjéken keresztül a citoszkeleton átrendezésében és/vagy a sejtek
transzformációjában játszik szerepet67,68.
17
1.5. A Gab adapter-fehérje Az adapter fehérjék rendkívül fontos szerepet töltenek be a különböző stimulusok
hatására aktiválódó jelpályák szabályozásában, ill. a jel amplifikációban. Olyan
enzimatikusan inaktív fehérjék, amelyek a felszínükön található tirozinon-foszforilált
peptidszekvenciái és prolinban gazdag régiói segítségével különböző -SH2, PTB, SH3-
domén tartalmú enzimeket, ill. további adapter fehérjéket gyűjtenek egy
multimolekuláris jelátviteli komplexbe. Tehát a jelátviteli hálózatban szereplő
különböző enzimek és azok szubsztrátjainak térbeli lokalizációját szabályozva az egyes
jelpályák integrálásában van szerepük. Az úgynevezett scaffolding adapter fehérjék
sajátsága, hogy rendelkeznek egy sejtmembránhoz kapcsoló PH doménnel, vagy
valamilyen zsírsav-oldallánccal (pl.:mirisztoil-csoport), ami által képesek a jelátviteli
fehérjéket a membrán asszociált receptorok közelébe toborozni. A scaffolding adapter
fehérjék (pl.LAT, PAG, IRS ) közé soroljuk a Gab molekulacsaládot is, amely többek
között a növekedési faktorok, citokinek, inzulin ill. a MIRR család receptorain keresztül
aktivált jelpályák szabályozásában vesz részt69,70.
A Gab adapter családba tartozó Gab1, Gab2, Gab3 fehérjék emlősökben, míg a Soc1
Caenorhabditis elegansban, és a Dos molekula Drosophilaban expresszálódnak. Az öt
fehérje mintegy 40-50%-os szekvencia azonosságot, és nagyfokú strukturális
hasonlóságot mutat (1.6.ábra). Általános jellemzőjük az N-terminálisan elhelyezkedő,
62-76%-os homológiát mutató PH domének, melyek a plazmamembrán belső oldalán
található PIP3-hoz irányítják az adaptert. Emellett számos foszforilálható tirozin ill.
szerin/treonin aminosavat és több prolinban gazdag szekvenciát hordoznak71. A Gab1
(Grb2 associated binder 1) molekulát először a Grb2-höz asszociált fehérjeként
azonosították EGF és inzulin receptor közvetített jelátvitelben72. A Gab2-t az IL-3,
MCSF stimulust követően SHP2 tirozin foszfatáz szubsztrátként, ill. ahhoz asszociált,
tirozinon foszforilált fehérjeként klónozták73. A Gab3-at a Gab1 és Gab2 szekvencia
azonossága alapján írták le74. A Gab1 és Gab2 általánosan expresszálódik a különböző
emlős sejtekben, limfoid sejtekben azonban relatívan gyengébben fejeződnek ki72,73.
18
1.6.ábra A Gab adapter családba tartozó fehérjék
A Gab3 is általánosan előforduló fehérje, viszont a hematopoetikus sejtekben
expresszálódik erőteljesebben74. Gab3 hiányos egerek nem mutatnak fejlődési
rendellenességet, a hematopoézis és az immunrendszer funkciója zavartalan75. A Gab2
kiütött egerek is egészségesek és normális életidejűek, azonban magasabb az eozinofil
és bazofil sejtszám és a hízósejtek működése is abnormális. A nagy affinitású IgE
receptoron (FcRεI) keresztüli aktiváció során csökkent mértékű degranuláció és hibás
citokin génexpresszió figyelhető meg Gab2-/- hízósejtekben76,77. A Gab1 gén kiütése
letális. Az egérembriók 12-18 napos korukban elpusztulnak a szív, a placenta, a váz és
izomrendszer, a máj rendellenes fejlődése következtében, ami valószínűleg a EGF,
PDGF, HGF, gp130 jelátvitel kombinált, hibás működésével magyarázható78.
1.5.1. A Gab transzlokációja a membránhoz, majd ezt követő foszforilációja Nyugvó sejtekben a Gab fehérjék a citoplazmában lokalizálódnak, majd a stimulációt
követően a plazmamembrán közelébe helyeződnek át és ott foszforilálódnak. Az
aktiváló receptorok közelébe kerülés történhet direkt és indirekt módon (1.7.ábra). A
Gab1 molekulában található 13 aminosav hosszúságú MBS (Met-binding sequence)
szekvencia 487-499 ill. MBD (Met-binding domain) 450-532 alkalmassá teszik a
19
fehérjét, hogy direkt kapcsolatba kerüljön a tirozinon foszforilált cMet (hepatocita
növekedési faktor-HGF) receptorral. A többi Gab fehérje nem tartalmazza a MBD ill.
MBS szekvenciákat és ezek közvetlen receptorhoz kötődése nem ismert79,80.
Az indirekt kapcsolat egyik formája, amikor a Gab fehérje egy másik molekulán
keresztül kapcsolódik az adott receptorhoz. A Gab fehérjék több prolinban gazdag
régióval rendelkeznek, melyek közül a PXXPXK/R szekvencia tipikus kötőhelyet
szolgáltat a Grb2 adapter molekula SH3 doménje számára81. A Grb2 rendelkezik egy
olyan SH2 doménnel, melyen keresztül a Gab-Grb2 komplex az YXNX motívumot
hordozó receptorhoz asszociálódhat (pl.: HGFR, EGFR receptorok esetén)82. Az IL3,
IL-5, GM-CSF citokin receptorok estében hiányzik a Grb2-t kötő motívum, viszont a
jeltovábbító β láncban az Y577 kötődési lehetőséget nyújt az Shc molekula PTB
doménje számára. A foszforilált Shc pedig a Grb2 SH2 doménjeihez tud kapcsolódni,
kialakítva ezáltal a Shc-Grb2-Gab2 komplexet, amely a Shc-en keresztül kapcsolódik a
citokin receptorokhoz83.
1.7.ábra A Gab adapter fehérje irányítása ill. kötődési lehetőségei a jelátvivő
receptorhoz.
Az Gab fehérjék PH doménjeik segítségével is közel kerülhetnek a jelátvivő
receptorhoz, amely mechanizmust legjobban az EGFR jelátvitelében tisztázták. Az
EGFR ligandum kötődését követően a Gab1 a Grb2 fehérjén keresztül a receptorhoz
kapcsolódik, miközben tirozinjain foszforilálódik. A foszforilált Gab1 kölcsönhatásba
lép a PI3-K p85-ös alegységével, ami a PI3-K aktivációjával és foszfatidilinozitol-
triszfoszfát (PIP3) képződésével jár a plazmamembrán belső rétegében. A Gab1 ezután a
20
PH doménjén keresztül a PIP3-hoz asszociálódik, ezáltal erőteljesebbé válik a
receptorközeli lokalizáció és további Gab1 molekulák membránhoz toborzásával a PI3-
K-on keresztül egy pozitív visszacsatolási kör alakul ki84. A B-sejt aktivációban is
fontos szerepe van a Gab1 PH doménnek, ugyanis a PH deléciós mutáció esetén a BCR
aggregációt követően elmarad a Gab1 foszforilációja. Más esetekben a PH domén
szerepe nélkülözhetőnek tűnik85. A PH domén hiányának nincs hatása a Gab1 tirozin
foszforilációjára MDCK sejtek Met jelátvitelében, ill. BaF3 sejtek IL-3 stimulációját
követően normális a PH deletált Gab2 fehérje foszforilációja86.
A különböző receptorokon keresztüli aktiváció, részben átfedő módon az egyes Gab
fehérjék foszforilációjához vezet. Immunsejtek BCR, TCR ill. IL-3 stimulációja a Gab1
és Gab2 tirozin-foszforilációját okozza, míg az IL-6-on keresztüli aktiváció a Gab1
foszforilációját váltja ki87-89. A T-sejtek IL-2, IL-15, makrofágok FcγRII és hízósejtek
FcεRI aktivációja a Gab2, míg az M-CSF stimulus a Gab2 és a Gab3 foszforilációját
indukálja90,91,77.
A Gab1-et az Src családba tartozó tirozin kinázok (Lyn) foszforilálják a B-sejt
aktiváció során92. A TCR-en keresztüli stimulus hatására a Zap70, míg IL-2 és IL-15
aktivációt követően a JAK3 foszforilálja a Gab2-t T-sejtekben93,90. Az BCR
keresztkötést követően a számos tirozin-foszforilált Gab1 molekulához szekvencia
specifikusan SH2 doménnel rendelkező SHP2, PI3-K, PLCγ, Grb2, Shc fehérjék
kötődnek92. TCR aktivációt követően Zap70, SHP2, LAT, Grb2, CD3ζ fehérjék, míg
makrofágokban FcγRII stimulust követően PI3-K, SHP2 molekulák toborzódnak a Gab
foszfotirozin tartalmú motívumaihoz91.
A 13-16 darab foszforilálható tirozin mellett több szerin és treonin aminosav is
található a Gab fehérjék szekvenciájában, amelyeket sejtaktivációt követően a
szerin/treonin kinázok foszforilálhatnak. Ezek a foszforilált szerin/treonin aminosavak
szintén szerepet játszanak a Gab fehérjék jelátvitelének szabályozásában. A Gab1 Erk
általi foszforilációja például ellenkező hatású a Met és az EGFR jelátvitelben. Met
stimulációt követően az Erk2 foszforilálja a Gab1-en a p85 kötő Tyr472-hoz közeli
Thr477-et, ami fokozza a p85-Gab1 kölcsönhatás erősségét és így a PI3-K aktivációját.
Mivel a PI3-K elősegíti az Erk aktivációját, a Thr477 Erk2 általi foszforilációja egy
pozití visszacsatolási kört alakít ki. Ezzel ellentétben EGF stimulust követően az Erk2
21
foszforilálja a Gab1 egy eddig azonosítatlan ser/thre aminosav oldalláncát, ami ebben
esetben a PI3-K gátlását okozza94,95.
A Gab1 és Gab2 molekulák ekvivalens szerepe még a legtöbb jelátviteli út esetében
tisztázásra szorul, így limfociták esetében is. EGF receptoron keresztüli jelátvitelben
azonban siRNS módszerrel MCF7 (emberi emlőrákos) sejtvonalon kimutatták, hogy a
teljes Erk aktivációhoz a Gab1-SHP2 és a Gab2-SHP2 jelenléte is szükséges, tehát
egymást kiegészítő, jelamplifikáló hatású a Gab fehérjék együttes jelenléte96.
1.5.2. A Gab fehérje szerepe a jelátvitel szabályozásában
Gab1-SHP2
A legtöbb irodalmi adat a Gab adapter fehérjéket az SHP2 és PI3-K aktivációs utak
mediátoraként írja, melyekben egyaránt betölthetnek pozitív és negatív reguláló
szerepet.
Mindhárom emlős Gab fehérje hordoz két, konzervált, tirozin tartalmú
I/VLXYXXI/V/L motívumot (BTAM-bifoszforilált tirozin-alpú aktivációs motívum),
amely foszforilált formában képes az SHP2 foszfatáz két SH2 doménjéhez kötődni ill.
aktiválni az enzimet97. Az SHP1 és SHP2 foszfatázok SH2 doménjei hasonló
peptidszekvenciákat ismernek fel, a Gab fehérjék mégis az SHP2 kötődését preferálják,
ami talán magyarázatot adhat az SHP2 és az SHP1 ellentétes biológiai szerepére.
Számos receptoron keresztül meginduló jelpályában nélkülözhetetlen a Gab-SHP2
interakció a teljes Erk-MAPK-kináz kaszkád aktivációhoz, ami az egyik legfontosabb
közvetítője a növekedési szignáloknak és a celluláris transzformációnak72,88. A Gab
gének kiütése elnyomja az EGF indukált Raf-MEK aktivációt és csökkenti a Ras-GTP
kötött formáját, így a Gab1 a Ras előtt lép be a jelpálya szabályozásába98,99. Az SHP2
megkötésére képtelen Gab1 mutánsokkal végzett kísérletek alapján a Gab-SHP2
kapcsolat és az SHP2 aktivációja szükséges a normális szintű Erk aktivációhoz100. A
legtöbb esetben azonban a Gab1-SHP2 komplex nem a Ras-Erk aktiváció
megindításában, hanem a jel erősítésében és fenntartásában játszik szerepet101. Gab1-et
fokozottan kifejező NIH3T3 fibroblaszt sejtek transzformációs képessége és növekedése
22
erőteljesebb, a szabályozás Gab1-SHP2 interakciótól függő, viszont ebben az esetben
Erk ill. Akt útvonaltól független módon zajlik102.
A Ras-Erk jelpálya Gab-SHP2 általi
szabályozására három lehetséges modellt
írnak le103. a) Az SHP2 defoszforilálhatja a
Gab foszforilált tirozinjat, szabályozva
ezáltal az SH2 és/vagy PTB doménnel
rendelkező további fehérjék jelátviteli
komplexbe kerülését. b) Az SHP2
szabályozhatja a Gab-hoz kötődő fehérjék
foszforilációját, ezzel módosítva azok
szerkezetét, akivitását. c) A Gab toborozza
az SHP2-t a megfelelő szubsztrátja
közelébe. Az el ső modellt támasztja alá egy
1.8.ábra A Ras aktiváció SHP2 általi gátlása mostanában leírt eredmény. EGF stimulációt
követően az SHP2 defoszforilálja a Ras-t
negatívan szabályzó RasGAP fehérjének a kötőhelyét a Gab1 molekulán EGF
stimulációt követően (1.8.ábra). A RasGAP így nem tud szubsztrátja, a Ras közelébe
lokalizálódni, ezáltal a Ras-Erk aktivációs út felszabadul a gátlás alól 55 . Egy másik
kutatócsoport eredményei szerint az SHP2 a RasGAP kötőhelyét magán az EGFR-on
defoszforilálja (Y992), így gátolva a RasGAP plazmamembránhoz való áthelyeződését,
ill. katalizálva a hosszabb életidejű Ras-GTP kialakulását104. Az SHP2
defoszforilálhatja a Gab több tirozin motívumát is, melyeknek szerepe lehet a szignál
csendesítésben. A p85 kötőhely defoszforilációja például negatívan szabályozza az EGF
indukált PI3-K-Akt jelpályát 105. Emellet az SHP2 saját kötőhelyét is defoszforilálhatja
a Gab-on, ezáltal mintegy lekapcsolva magát a jelátviteli komplexről.
Az SHP2 kötőhelyre mutált Gab2 overexpressziója bizonyos stimulusuk esetében
gátolhatja az Erk aktivációt (M-CSF1) 106. Azonban Gab2 kiütött egerek hízósejtjeiben
és makrofágjaiban csökkent az Erk aktiváció szintje SCF és M-CSF1 stimulációt
követően76. A Gab2-SHP2 komplex ugyanakkor más jelátviteli utakban is szerepet
játszhat. Az SHP2-t megkötni képtelen Gab2 mutánsok overexpressziója gátolja az IL-3
indukált korai génaktivációt, miközben az Erk aktivációra nincs hatással73. Gab2
23
overexpressziója T-sejtekben gátolja a TCR indukált IL-2 promoter aktivációt az NFAT
és NFkB transzkripciójának blokkolásával107.
Gab-PI3-K
Minden Gab fehérje rendelkezik YVPM motívummal, amely potenciális kötőhelyet
szolgáltat a PI3-K p85-ös alegységének SH2 doménje számára86. A p85 alegység
megkötésével a Gab fehérjék lehetőséget nyújtanak a PI3-K jelpálya aktivációjához
olyan receptorok esetében, melyek nem rendelkeznek direkt PI3-K kötő motívummal
(BCR, TCR, IL-3/GM-CSF, FcεRI FGFR)77,85,107. Emellett PI3-K kötőhellyel
rendelkező receptorok esetében is toboroznak a Gab fehérjék PI3-K-t (NGFR, Ret) 108.
A Gab-hoz kapcsolódó PI3-K a membrán közelébe kerülve foszforilálja a foszfatidil-
inozitol gyűrűt a hármas pozícióban, dokkoló helyet létrehozva ezáltal a PH domént
hordozó fehérjék számára (PDK, Akt, Gab, Btk, PLCγ, Vav). Az evolúció során
megőrzött, konzervatív PI3-K-Akt jelpálya túlélési, növekedési és anti-apoptotikus
jelpályák aktivációját közvetíti. A különböző receptorokon keresztüli aktiváció során a
Gab fehérjéken kívül más adapterek is szerepet játszanak a PI3-K toborzásában és
aktiválásában (pl. Inzulin receptornál az IRS, TCR-nél a LAT). Egér embrionális
fibroblaszt sejtekben bizonyítottan a Gab1 játszik elsődleges szerepet az EGFR-on
keresztüli PI3-K-Akt jelpálya katalizálásában. ErB3 expresszáló sejtekben az EGF
stimulus Gab1 függő és Gab1-től független módon is képes a PI3-K-Akt jelpálya
aktiválására109.
B-sejtekben a BCR és az FcγRIIb együttes keresztkötése gátolja a sejtaktivációt. A
keresztkötés hatására csökken az intracelluláris Ca2+ szint ill. a membránban található
PIP3 molekulák száma, ami gátolja az Akt membránhoz toborzását és aktivációját.110 Ez
egyrészt csökkent PI3-K aktivitással magyarázható, másrészt azzal, hogy az FcγRIIb
tirozinon foszforilált ITIM motívuma az inzitol-5’ foszfatáz aktivitású SHIP enzimet
toborozza a membrán közelébe, ahol a PIP3-at PIP2-vé alakítja át. Munkacsoportunk
korábban kimutatta, hogy BCR és FcγRIIb keresztkötésekor a Gab1-hez kapcsolódó
SHP2 defoszforilálja a PI3-K-t kötő Gab1 motívumot, gátolva ezáltal a PI3-K-Akt
jelpálya aktiválását111. Az EGF indukált Gab1-PI3-K jelpálya aktivációjában is
termináló szerepet játszik az SHP2 a PI3-K kötőhely defoszforilálásával, míg más
receptorokon keresztüli jelátvitelben az SHP2 nincs hatással a PI3-K jelátvitelre105.
24
Tehát a PI3-K SHP2 általi szabályozása receptor specifikusan változik. A szabályozás
fordítottja is megvalósul. Gyenge EGF stimulus esetén a PI3-K játszik pozitív szerepet
az Gab1-SHP2 közvetített Erk aktivációban, ugyanis a PIP3 szint emelkedése a
membránban növeli a Ras közelébe kerülő Gab1-SHP2 komplex mennyiségét112.
A Gab fehérjék in vivo szerepét bizonyítja, hogy egérből izolált Gab2-/- hízósejtekben
jelentős mértékű PI3-K aktiváció gátlás figyelhető meg FcεRI keresztkötés hatására77.
A Gab2 negatív szabályzó szerepét is leírták az FcεRI közvetített hízósejt jelátvitelben,
melyben a Gab2-vel interakcióba lépő Lyn és PLCγ fehérjéknek lehet szerepe. Gab2
overexpresszált hízósejtekben csökken a TNFα és IL-6 gének transzkripciója, a kalcium
ionok mobilizációja és a degranuláció mértéke113.
Összességében a Gab-SHP2 és Gab-PI3-K közvetített jelpályák a proliferációs,
növekedési, túlélési és anti-apoptotikus szignálokra kifejtett serkentő hatását receptor és
sejttípustól függően változatos módon töltheti be. Az egyes jelátviteli lépésekben
azonban nemcsak pozitív, hanem negatív szabályozó szerepet is játszhatnak.
1.6. Foszfopeptidek transzportja a citoplazmába Különböző fehérje eredetű tirozinon-foszforilált peptidek in vitro esszékben
bizonyítottan fokozni tudják SH2 domén tartalmú enzimek katalitikus aktivitását111.
Ezek a foszfopeptidek sejtbe juttatva módosíthatják az endogén enzimek aktivitását, ill.
az intracelluláris fehérje-fehérje kölcsönhatásokat, ily módon megváltoztatva egyes
jelátviteli utak végső kimenetelét. Ezáltal ezek a funkcionális szekvenciát hordozó
foszfopeptidek új lehetőséget nyújthatnak a jelátviteli folyamatok tanulmányozásában és
a jelátviteli terápián alapuló eljárások lehetséges célpontjaivá válhatnak114,115.
Fizikai-kémia tulajdonságaikból kifolyólag a legtöbb oligopeptid a sejtmembránon
nem képes átjutni. A plazmamembrán permeabilizálásával, ill. pórusformáló reagensek
segítségével elérhető a peptidek sejtbe juttatása, azonban ezek a módszerek egyben a
membrán károsítását is előidézik116. Ezért előtérbe került a peptid alapú membrán-
permeábilis hordozó szekvenciák kutatása és alkalmazása, melyeknek több csoportját
különböztetik meg. PTD-nek (protein transduction domains) vagy CPP-nek (cell
penetrating peptides) is nevezik ezeket a vektor jellegű peptideket. A legjobban
karakterizált CPP-k az Antennapedia transzkripciós faktor fehérje eredetű Penetratin
(pozíció: 43-58), a HIV-1 transzaktivációs Tat fehérjéből származó Tat szekvencia
25
(pozíció: 48-60), ill. a különböző hosszúságú Oligoarginin (R7-9) peptidek. Mindhárom
CPP bázikus struktúrájú, pozitív töltéseket hordozó szekvencia, de míg a Penetratin
lizinben gazdag, addig a Tat és R7-9 peptideknél az arginin hordozza a pozitív
töltéseket117-119.
A CPP-hez kovalensen konjugált aktív peptid vagy fehérje, ill. a fúziós fehérjeként
előállított hordozó-peptid/fehérje konstrukció viszonylag gyorsan internalizálódik a
különböző sejttípusokba. A sejtmembránon való átjutás mechanizmusa még részleteiben
nem tisztázott, vitatott folyamat, melyben a különböző metodikák és sejttípusok eltérő
eredményeket adnak. Az eddigi eredmények alapján úgy tűnik, hogy a Penetratin
endocitózis útján, míg a Tat ill. R7-9 egy másik, energiát nem igénylő mechanizmus
alapján juttatják a sejtbe az aktív molekulákat. Az internalizációs folyamatban kiemelt
szerepet tulajdonítanak az arginin guanidino-csoport protonáltságának, amely a lipid
membránban elhelyezkedő foszfát és szulfát csoportok negatív töltéseivel léphet ionos
kölcsönhatásba. Ezután a membránnal kapcsolatba kerülő CPP-k vezikulák képződését
indukálják, melyek a továbbiakban a peptiddel együtt lefűződnek a citoplazmába120.
Egy másik membrán-transzlokációs szekvencia a 27 aminosavból álló Transportan,
amely a neuropeptid galaninból és a darázsméreg mastoparanból felépülő chimera
peptid. A molekula az előző CPPk-hez képest nagyobb hidrofóbicitást mutat és SDS
micellákon végzett kísérletek alapján jelentős mértékben ágyazódik a foszfolipid
membránt modellező SDS felszínbe.121 Ez a polipeptid nagyobb méretű molekulákat is
képes átjuttatni a membránon (pl.:GFP). Főleg DNS és RNS transzportjára használják a
27 aminosavból felépülő, amfipatikus MPG-t, amely a HIV-1 gp41 fehérjéből és az
SV40 NLS (nukleáris lokalizációs szekvencia) szekvenciájából felépülő fúziós peptid,
ami a nukleinsavakat nem kovalens komplex formájában juttatja a sejtekbe122.
Az említett CPP-k tehát eszközként szolgálhatnak biológiailag aktív peptidek/fehérjék
élő sejtekbe juttatásához.
26
2. Célkitűzések
Az intracelluláris fehérjék tirozinon foszforilát motívumainak kölcsönhatása az SH2
domén tartalmú molekulákkal központi szerepet játszik a jelátviteli folyamatok
szabályozásában. A Gab1 adapter fehérjéhez SH2 doménekkel kapcsolódó SHP2 és
PI3-K molekulák növekedési, proliferációs és túlélési jeleket közvetítenek a különböző
receptorokon keresztüli sejtaktiváció során. Az SHP2, illetve PI3-K gének onkogenikus
mutációi következtében átíródó fehérjék hibás működése a sejtek rosszindulatú
transzformációjához és kóros sejtburjánzáshoz vezethet. A foszfotirozin-SH2 domén
kölcsönhatáson alapuló jelátvitelt gátolhatják a sejtbe juttatott, foszforilált tirozint
tartalmazó peptidek, amelyek nagy affinitással és specifikusan kötődnek az adott SH2
doménhez, s így megakadályozzák annak kapcsolódását fiziológiás ligandumával. Célul
tűztük ki, olyan Gab1 fehérje eredetű sejtmembrán-permeábilis tirozinon foszforilált
peptideket előállítását és vizsgálatát, amelyek szelektíven szabályozhatják az SHP2 és a
PI3-K által irányított jelpályákat B sejtekben.
Tisztázni kívántuk:
1. Milyen sejtmembrán permeábilis hordozó (CPP) peptid a legalkalmasabb a bioaktív
foszfopeptidek sejtbe juttatására?
2. Milyen mechanizmus alapján jutnak át a plazmamembránon a CPP-k, illetve a CPP-
vel konjugált Gab1 eredetű foszfopeptidek, és milyen intracelluláris lokalizációt
mutatnak?
3. Hogyan befolyásolják az SHP2 foszfatáz aktivitását a Gab1 adapter fehérje SHP2 és
PI3K kötőhelyeit reprezentáló szintetikus foszfopeptidek, ill. ezek a peptidek
játszhatják-e az SHP2 szubsztrát szerepét?
4. Az irodalmi adatok alapján feltehetően az SHP2-höz kötődő GDLDpe és a PI3-K-hoz
kötődő ELPNpe foszfopeptidek kapcsolatba lépnek-e más SH2 domén tartalmú
fehérjékkel?
5. A sejtbe juttatott tirozinon foszforilált peptidek módosítják-e az SH2-foszfotirozin
kapcsolaton alapuló in vivo fehérje kölcsönhatásokat B sejtekben?
6. Hogyan befolyásolják a sejtbe jutott foszfopeptidek a fehérje foszforilációs
folyamatokat nyugvó és BCR aktivált sejtekben?
27
7. Szerepet játszhat-e az SHP2 és a PI3-K az Erk aktiváció szabályozásában B
sejtekben?
8. Befolyásolják-e az OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe foszfopeptidek az SHP2 és PI3-K
fehérjék által közvetített jelpályákat?
28
3. Anyagok és módszerek 3.1. A kísérletek során felhasznált pufferek és médiumok
RPMI 1640 sejttenyésztő médium
DMEM sejttenyésztő médium
GKN puffer
PBS puffer
TWB puffer
FACS puffer
Lízis puffer
Foszfatáz ELISA puffer
Degranulációhoz használt pufferek:
Tyrode puffer, Tyrode puffer 20x, Szubsztrát oldat, Stop puffer
3.2 A felhasznált ellenanyagok
szériaszám, elnevezés
specificitás származás izotípus gyártó/eredet
BU1 anti-humán IgM egér IgG2a Roy Jefferis,
Anglia
anti-humán IgM+IgG
kecske Jackson,
anti-csirke IgM
PY 20 anti-humán P-Tyr egér IgG2b Transduction
PT 40 anti-humán P-Tyr nyúl poli-klonális Israel Pecht, Izrael
Lyn anti-humán Lyn nyúl poli-klonális Transduction anti-human PLCγ2 nyúl poli-klonális Santa Cruz
SC-280 anti-human SHP2 nyúl poli-klonális Santa Cruz
610621 anti-human SHP2 egér IgG1 Transduction
SC-423 anti human PI3-K nyúl poli-klonális Santa Cruz
anti-human P-Erk nyúl poli-klonális Sigma
29
anti-human P-Akt nyúl poli-klonális Santa Cruz
SC-6293 anti-human Gab1 kecske poli-klonális Santa Cruz
SC-9049 anti-human Gab1 nyúl poli-klonális Santa Cruz
A-9917 HRPO jelölt anti-egér IgG F(ab)2
kecske poli-klonális Sigma
A-6154 HRPO jelölt anti-nyúl IgG F(ab)2
kecske poli-klonális Sigma
3.3. A kísérletekben felhasznált szintetikus, sejtmembrán permeábilis peptidek (CPP) szekvenciái R8C: RRRRRRRR-C(BODIPY) (-NH2)
Okt-R8C: Oktanoil-RRRRRRRR-C(BODIPY) (-NH2)
MPG alfa: C(BODIPY)-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV (-NH2)
MPG alfa-ox: C(BODIPY)-GALFLAFLAAALSLM(O)GLWSQPKKKRKV (-NH2)
Transportan: C(BODIPY)-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (-NH2)
TP10: C(BODIPY)-AGYLLGKINLKALAALAKKIL (-NH2)
3.4. A kísérletekben felhasznált szintetikus, Gab1 fehérje eredetű peptid
szekvenciák
3.1.ábra. A kísérletekben használt SHP2 ill. PI3-K kötő Gab1 szekvenciák
30
Okt-R8C-GDLDpe (foszfoészter):
Oktanoil-RRRRRRRR-C-GDKQVEY(p)LDLDLD(NH2)
Okt-R8C-GDLDsp (tiofoszfát):
Oktanoil-RRRRRRRR-C- GDKQVEY(sp)LDLDLD (NH2)
Okt-R8C-ELPN(pe):
Oktanoil-RRRRRRRR-C-ELDENY(p)VPMNPN (NH2)
Kontrolként használt peptidek:
Oct-R8C-GDLD: Octanoil-RRRRRRRR-C-GDKQVEYLDLDLD(NH2)
Oct-R8C-GDFLD: Octanoil-RRRRRRRR-C-GDKQVEFLDLDLD(NH2)
Oct-R8C-DELD: Octanoil-RRRRRRRR-C- DELVKLDFDQGLD(NH2)
Valamint alkalmaztuk ezen peptidek Bodipy-FL fluorokrómmal konjugált, ill.
hordozó szekvencia nélküli, Biotinnal kapcsolt formáit. A Bodipy-FL és a Biotin
konjugáció a nyolc arginin és az aktív peptid C-terminális vége közötti szerin
aminosavval történt.
A különböző peptidek és konjugátumaik szintézisére vonatkozó pontos leírását az
„Optimization of the cellular import of functionally active SH2-domain-interacting
phosphopeptides” című közlemény anyag-módszer részében lehet megtalálni.
3.5. A kísérleti módszerek
Sejttenyésztés
Vizsgálataink nagy részében BL41, Epstein Barr vírussal transzformált, de EBV
negatív, humán Burkitt limfóma sejtvonalat használtunk. A kísérletek másik
csoportjában ALV (avian leukosis virus) indukált burza limfóma eredetű DT40 csirke
B sejtvonalat, ill. RBL 2H3 sejtvonalat alkalmaztunk. A BL41 és DT40 sejteket
polisztirén sejttenyésztő edényekben (Costar, Amerikai Egyesült Államok), 10% FCS
tartalmú RPMI 1640 médiumban tartottuk fenn, a csirke sejtek médiumát 1%
csirkesavóval kiegészítve. Az RBL 2H3 hízósejteket 10% FCS-t tartalmazó DMEM
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) médiumban tenyésztettük.
31
FACS analízis A sejteket 4°C-on és 37°C-on inkubáltuk a Bodipy-FL festékkel konjugált különböző
permeábilis peptidekkel 5, 20, 60 percig (mintánként 5x105 sejtszámmal). A peptid
kezelést követően a sejteket kétszer mostuk FACS pufferben, majd bizonyos minták
esetén 1 μg propidium jodidot adtunk a károsodott sejtek jelölésére mintánként. Ezután
FACS Calibur (Beckton Dickinson, USA) áramlási citofluoriméteren mértük a sejtek
fluoreszcencia intenzitását. A méréshez és a kiértékeléshez a CellQuest programot
használtuk.
Mikroszkópos vizsgálatok Mintánként 2x106 sejtet inkubáltunk különböző, Bodipy-FL festékkel konjugált
permeábilis peptiddel 10μM-os végkoncentrációban, 4 és 37°C-on, különböző
időtartamokban. A mosási lépést követően a mintákat tárgylemezre cseppentve
konfokális lézer-pásztázó mikroszkóppal (Olympos FluoView 500) vizsgáltuk a sejtek
peptid felvételét, 488nm hullámhosszúságú argon-ion lézer gerjesztő fényforrást
alkalmazva. A sejtmembrán festésére a lipofil DiI-C18 (1,1’-dioktadecil–3,3,3’,3’-
tetrametilindokarbocianid perklorát) fluoreszcens festéket használtuk, míg a savas
partikulumok jelöléséhez a Lyso Tracker Red-et alkalmaztuk. Az utóbbi két festék
gerjesztéséhez az 543 nm-es fényt kibocsájtó He-Ne lézert használtuk. A kiértékelést és
a Pearson koeficiens értékek számítását az Image-J szoftver segítségével végeztük
Sejtaktiváció, lízis, immunprecipitáció
A sejtkultúrából mintánként 2x106 sejtet különítettünk el. A mintákat 0,5 ml szérum-
mentes RPMI 1640 médiumban 30 percig 37°C-on inkubáltuk, majd a permeábilis
peptidekkel különböző ideig, ill. különböző koncentrációban előinkubáltuk a sejteket.
Ezt követően a peptidkezelés utolsó két percében IgM specifikus egér monoklonális
ellenanyaggal 37°C-on aktiváltuk a sejteket. Ezután a sejteket azonnal lecentrifugáltuk
14000 rpm-mel 20 másodpercig, a felülúszót eltávolítottuk, majd a sejtüledéket
folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Ezt követően a mintákat 100μl lízis pufferben
vettük fel, mely a már leírtakon kívül frissen hozzáadva az alábbi proteázgátlókat
tartalmazta: 10 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin, 5 μg/ml pepsztatin, 0,2 mM fenil
metil szulfonil fluorid (PMSF). A mintákat jégen tartva és többszörösen alaposan
32
felkeverve 30 percen keresztül inkubáltuk a fent említett lízis pufferben. Fél óra
elteltével a lizátumokat 4°C-on 15000 rpm-mel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó
80μl-ét 20μl 5x SDS-PAGE mintapufferrel 95°C-on 5 percig inkubáltuk.
Immunprecipitációra szánt minták esetében 4x107 sejtből indultunk ki. A
továbbiakban a fent említett aktiválási metódust alkalmaztuk 400μl lízis puffert
alkalmazva a lizálást követő centrifugálásig. Ezután a felülúszót 1 órán át inkubáltuk
4°C-on rázatva 10μl Protein-G Sepharose (Pharmacia Biotech, Svédország) gyöngyökre
kötött ellenanyagok jelenlétében. 1 óra letelte után mintáinkat háromszor mostuk lízis
pufferrel (a centrifugálásokat 14000 rpm-mel 20 másodpercig végeztük), majd a
mintákat 40μl SDS-PAGE mintapufferrel 95°C-on 5 percig inkubáltuk. A
mintapufferben megfőzött mintákat SDS-poliakrilamid gélen futtattuk, majd a
fehérjéket nitrocellulóz membránra blottoltuk át.
SDS poliakrilamid gélelektroforézis, Western blot
Az elektroforézist 10%-os SDS poliakrilamid gélen, 120-150 V feszültséggel
végeztük (BioRad, USA). Ezt követően a szétválasztott fehérjéket Hybond C-extra
nitrocellulóz membránra (Amersham, Anglia) blottoltuk 90 V feszültséggel. Ezután a
membránt 10 percig mostuk 40 ml TWB - 0,05% Tween pufferben, majd blokkoltuk 20
ml 0,1% zselatin tartalmú TWB-ben. 1 óra eltelte után eltávolítottuk a blokkoló oldatot,
majd a membránt 10 ml TWB - 0,05% Tween-ben oldott 5-10 μg/ml végkoncentrációjú
elsődleges ellenanyaggal újabb egy órát inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezt követte
háromszor 5 perc mosás TWB - 0,05% Tween pufferben, majd ismét egy óra inkubálás
szobahőmérsékleten HRPO-val jelzett, az első ellenanyagra specifikus másodlagos
ellenanyaggal. Ezt 10 ml 0,1% zselatintartalmú TWB-0,05% Tween pufferben oldottuk,
a végkoncentrációja 0,1-0,5 μg/ml volt. Majd hatszor 10 percet mostuk TWB-0,05%
Tween pufferben. Az inkubálások és mosások ideje alatt a membránt lengőasztalon
helyeztük el. Előhíváshoz ECL reagenst (Pierce,USA) használtunk. A HRPO által
elhasított ECL kemilumineszcenciás jeleit Kodak röntgenfilmmel detektáltuk.
33
Affinitás tisztítás („pull down”) assay A sejtkultúrából mintánként 4x107 sejtet különítettünk el. A mintákat 0,5 ml szérum
mentes RPMI 1640 médiumban 30 percig 37°C-on inkubáltuk, majd IgM specifikus
egér monoklonális ellenanyaggal 2 percig 37°C-on aktiváltuk a sejteket. Ezt követően a
már leírt lizálási eljárás után a minták felülúszóit 2 órán át inkubáltuk 4°C-on rázatva
10μl Agarose-Streptavidin (Sigma) gyöngyökre kötött biotinált peptidek jelenlétében. 2
óra letelte után a mintáinkat háromszor mostuk lízis pufferrel, majd a mintákat 40μl
SDS-PAGE mintapufferrel 95°C-on 5 percig inkubáltuk. Ezután a már szintén leírt
módon SDS-PAGE és Western blot technikák segítségével azonosítottuk a fehérjéket,
ill. SDS-PAGE-t követően Comassie Blue festést alkalmaztunk az MS analízisre
küldendő fehérjék jelölésére.
Foszfatáz aktivitás mérés A rekombináns SHP2 különböző hígításait 96-lyukú plate-en 1 óráig, 37°C-on foszfatáz
pufferben inkubáltuk a biotinált foszfopeptidekkel. Az enzimreakció után az enzim
szubsztrát elegyet átmértük egy avidinnel fedett ELISA lemezre és egy éjszakán át 4°C-
on hagytuk, ami idő alatt kialakult a biotinált peptidek és az avidinnel fedett ELISA
lemez közötti kapcsolat. Másnap 3x-i mosást követően anit-foszfotirozin specifikus egér
ellenanyaggal jelöltük az ELISA lemezhez kötött maradék foszfotirozint, majd további
három mosási lépés után HRPO-val konjugált anti-egér másodlagos jelölést
alkalmaztunk. Eztán 6x mostuk a plate-et majd 30%-os H2O2 szubsztrátot adtunk a
mintákhoz, ami a tetrametil-benzidin (TMB) oxidációjával járó színreakciót ad. A
színváltozást kénsavval állítottuk le, majd ELISA leolvasón 450nm mértük a reakció
intenzitását jelző optikai denzitást (OD).
Hízósejt degranuláció mérése Az FcεRI indukált hízósejt degranuláció detektálása a granulumokból felszabaduló β-
hexaminidáz enzim-aktivitás mérésén alapszik. A megfelelő antigén dózis
kiválasztásához egy előkísérletet végeztünk, amelyben különböző koncentrációjú DNP-
BSA-val aktiválva a sejteket, kiválaszthatjuk a szuboptimális antigén mennyiséget. Az
34
RBL-2H3 hízósejteket DNP specifikus IgE-vel szenzitizálzuk. A sejteket 96 lyukú
lemezre mértük (1,5x105/ luk), majd két óra múlva Tyrode pufferrel mostuk. Ezt
követően a permeábilis peptidekkel 30 percig előinkubáltuk a sejteket, majd a
szuboptimális antigén dózissal (DNP-BSA) aktiváltuk a sejteket 37°C-on 1 óráig. Az
aktiválás után a felülúszókat a p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine szubsztrátot
tartalmazó oldatra mértük és 45 percig 37°C-on inkubáltuk. A reakciót glicin tartalmú
„stop” pufferrel állítottuk le, majd fotometriásan mértük az optikai denzitást 405 nm-en.
35
4. Eredmények
4.1. Az optimális, sejt-permeábilis hordozó peptid kiválasztása Számos CPP (cell penetrating peptid)-ről leírták, hogy képes biológiailag aktív
peptideket/fehérjéket a sejtmembránon átjuttatni, azonban a különböző hordozó
vektorok egy rendszerben történő vizsgálata még nem történt meg119,123,124. Az optimális
hordozó kiválasztásához ezért három különböző típusú CPP-t és ezek módosított
formáit hasonlítottuk össze. A vizsgálat a bázikus karakterű okta-Argininra (R8), ennek
oktanoil-zsírsavláncal acilezett formájára (Okt-R8, OR8), a Transportanra és rövidebb
változatára a TP10-re ill. az MPG-re, mely a transportanhoz hasonlóan egy chimera
peptid és oxidált variációjára (MPGox) terjedt ki (lásd anyag-módszer fejezet). A
szintetizált hordozókat BL41 Burkitt lymphoma sejtvonalon teszteltük.
A Bodipy-FL (488nm gerjesztés) fluoreszcens festékkel jelzett CPP-k internalizációs
képességét konfokális lézer-páztázó mikroszkóppal vizsgáltuk, szolubilis, fixálatlan
sejteken. A sejtmembrán jelölésére a lipofil tulajdonságú DiI-C18-at, míg a hordozók
intracelluláris lokalizációjának jellemzésére az alacsony pH értékű kompartmentekkel
kapcsolatba lépő Lyso Tracker Red (543nm gerjesztés) festéket használtuk. 37 C°-on
történő 20 perces inkubációt követően a mikroszkópos felvételek alapján a CPP-k a
citoplazmában helyezkednek el diszkrét granulumok formájában. Kivételt az MPG
oxidált formája mutatott, melyet a plazmamembránhoz asszociáltan tudtunk detektálni
viszont a citoplazmában nem, ill. csak igen csekély mértékben. A granulált
elhelyezkedést mutató CPP-k a Lyso Trackerrel jelzett lizoszómákkal, ill. savas
partikulumokkal mutatnak ko-lokalizációt. A Pearson koeficiens alapján számított
korreláció mértéke az MPGox kivételével az összes hordozó esetében 0,4-0,5 közötti
értéket mutatott, amit az Image-J szoftver segítségével számoltuk. Tehát 20 perccel a
sejtek kezelése után a különböző CPP-k jelentős mennyisége ezekben a savas
vezikulákban található, melyek valószínűsíthetően a transzport során fűződtek le a
plazmamembránról (4.1.ábra). A fáziskontraszt képek alapján azt feltételezzük, hogy a
sejtmagba nem jutnak be a hordozók, de ezt magi jelöléses kísérlettel nem támasztottuk
alá.
36
DiI-C18 (piros) Bodipy-FL– CPP (zöld), Lyso-Tracker(piros)
R8
OR8
Transportan
TP10
MPG
MPGox
4.1.ábra. A Bodipy-FL (zöld) – CPP konjugátumok a sejtbe jutva részleges ko-
lokalizációt mutatnak a Lyso Tracker-el(piros) jelölt partikulumokkal. Az inkubálás
37C°-on 20 percig tartott 10 μM-os CPP koncentrációnál. Az MPG oxidált formája nem
detektálható a sejten belül.
37
A Bodipy-FL festékkel konjugált hordozók transzlokációjának kinetikai vizsgálatára és
bejutásuk mértékének kvantitatív összehasonlítására FACS analízist alkalmaztunk
(4.2.ábra). A kísérleteket 4C°-on és 37C°-on végeztük három különböző inkubációs
időtartammal. A hordozó peptidekkel történő inkubációt követően a sejtszuszpenzióhoz
propídium-jodidot (PI) adtunk, ami a sérült membránnal rendelkező sejtek magjába
jutva jelöli a halott, ill. nem ép sejteket. Az ép és halott sejtek arányából
következtethetünk a hordozók citotoxikus jellegére.
4.2.ábra
A hordozók 4 és 37C°-on is bejutnak a sejtekbe
már az 5 perces (fekete) kezelést követően, ami tovább
fokozódik 20 (zöld) ill. 60 percnél (kék). A legnagyobb
penetrációs képességet az R8 és OR8 hordozó mutatott,
melyek a többivel ellentétben a sejteket sem károsítják.
4C°
OR8
PI FL-3
Kontroll
FL-1
Bodipy
95%
37C°
R8
58%
MPG
94%
93%
38
Trans
TP10
25%
26%
Az FL-1 csatornában detektált Bodipy-FL fluoreszcencia intenzitási adatok alapján a
CPP-k 4C°-on és 37C°-on egyaránt bejutottak a sejtekbe, ami nem endocitózis
közvetített transzportra utal. Az internalizáció mértékében jelentkező különbségek jól
detektálhatók az áramlási citofluoriméter segítségével. Öt perc elteltével már jelentős
mértékben nő a sejtek FL-1-ben mért fluoreszcencia intenzitása, és a CPP-k
plazmamembránon keresztüli transzportja még tovább folytatódik a 20 és a 60 perces
inkubációs periódusok alatt. A penetráció legnagyobb mértéket az R8 és az igen hasonló
értéket mutató OR8 hordozóknál figyelhetjük meg. A Transportan-nál és a TP10-nél
jelentkező nagyobb FL-1 intenzitású csúcsokat a károsodott membránnal rendelkező ill.
elpusztult sejtek mutatják, melyekbe a CPP-k könnyebben jutnak be. Az MPG oxidált
formája az áramlási citofluoriméterrel mért eredmények alapján is igen alacsony
internalizációs éréket mutatott (az ábrán nem szerepel). A 4.2. ábra harmadik
oszlopában ábrázolt Dot Plot ábrákon látható, hogy a PI kezelést követően az MPG-vel
kezelt sejtek enyhe, míg a Transportan és TP10-el kezelt sejtek erőteljes FL-3
csatornában mért intenzitásnövekedést mutatnak, azaz PI pozitívak. Az R8 és OR8
hordozóknál ez nem figyelhető meg. A sejtek viabilitását jellemző százalékos értékeket
az alsó két kvadránsban elhelyezkedő sejtszám alapján számoltuk, melyek PI festésre
negatívak. Ez alapján az R8 és OR8 kezelt sejtek a kontrolhoz hasonlóan nem
károsodtak, míg a többi CPP hatására a plazmamembrán integritása és a sejtek
életképessége többé-kevésbé csökkent.
39
Vizsgáltuk továbbá, hogy hosszabb időtartam alatt hogyan hatnak a hordozó-
peptidek a sejtek életképességére. A vizsgálat 1, 6 és 24 órás inkubációs időközöket ill.
10 és 50 μM CPP koncentrációkat foglalt magába. Ebben az esetben is propidium-
jodidos festést alkalmaztunk az élő és károsodott sejtek elkülönítéséhez. A BL41
sejteket 96-lyukú plate-en tenyésztettük, majd a hordozókkal történő inkubációs idő
leteltével áramlási citométert használtunk az élő és elpusztult/károsodott sejtek
detektálására (4.3.ábra).
0
20
40
60
80
100
120
contr
ol
R8 1
0uM
R8 5
0uM
OR8 10u
M
OR8 50u
M
MPG 10
uM
MPG 50
uM
MPGox
10uM
MPGox
50u
M
trans
porta
n 10u
M
trans
porta
n 50u
M
TP10
10
uM
TP10
50
uM
Élő
sejte
k %
1h6h24h
4.3.ábra. A CPP-k 1, 6, 24 órás hatása a sejtek viabilitására
Az áramlási-citofluoriméteren mért életképességi adatok oszlopdiagramm formájában
láthatók a 4.3. ábrán, ahol az élő sejtek százalékos értékeit tüntettük fel. Az R8 és OR8
hordozókkal kezelt sejtek mindhárom kezelési periódus után a kontrollal
tulajdonképpen megegyező viabilitási értékeket mutattak a 10μM-os dózis esetében.
Ebben a koncentrációban az MPG, az MPGox, a TP10 és a Transportan már több mint a
sejtek felét elpusztította a 6 órás kezelést követően, ill. az MPG és az MPGox az összes
sejtet megölte/károsította a 24 órás inkubációs idő elteltével. Az 50 μM-os dózis már az
R8 és az OR8 esetében is erőteljesen toxikusnak mutatkozott, a többi CPP esetében
pedig mindhárom kezelési időben, minden sejt elpusztult ennél a koncentrációnál.
40
A későbbi műtermékek elkerülése végett tisztáznunk kellett továbbá, hogy a sejtbe
juttatott CPP-k hatással vannak-e a jelátviteli, ill. foszforilációs folyamatokra. Tehát a
kevésbé toxikus és nagy penetrációs fokkal rendelkező hordozók közül kell a leginkább
inert sajátosságút kiválasztanunk. Ennek érdekében vizsgáltuk a hordozókkal kezelt
BL41 sejtek foszforilációs mintázatának változását sejtlizátumból SDS-PAGE és
Western blot módszer segítségével. Az előzetes vizsgálatok alapján már csak az R8, az
OR8 és az MPG hordozókat teszteltük. A foszfotirozin specifikus ellenanyaggal történő
előhívás eredményeképpen azt mondhatjuk, hogy az R8 ill. OR8 hordozókkal kezelt
minták foszforilációs mintázata a kontrol mintáéval megegyező, míg az MPG a 85kDa
és 110 kDa környékén lévő, valamely fehérjék enyhe foszforilációját indukálják. Pozitív
kontrolként a BCR-ek keresztkötésével stimuláltuk a sejtek (4.4.ábra).
118-
85-
47-
5’ 30’ MPG
5’ 30’ OR8
5’ 30’ R8
A K
Wb: pTyr
Wb: PI3-K
kDa
4.4.ábra. BL41 sejtlizátum CPP indukált foszforilációs mintázata. A sejteket 5 ill. 30
percig kezeltük 10 μM-os CPP-kel . A membránt anti-foszfotirozin ellenanyaggal hívtuk
elő. K:kezeletlen kontrol, A: anti-μ specifikus ellenanyaggal aktivált pozitív kontrol.
Mennyiségi kontrolként PI3-K specifikus ellenanyaggal újra hívtuk a membránt.
41
Az elővizsgálatok eredményei alapján az arginin8 (R8) és az oktanoil-csoporttal
kapcsolt változata (OR8) bizonyultak a legalkalmasabb hordozó szekvenciáknak.
Viszont e két hordozó minden tesztben hasonló eredményt mutatott, így a további
vizsgálatokra történő kiválasztás némileg önkényesen történt a kettő közül. Irodalmi
adatok alapján a sztearilsavval konjugált R8 mintegy 100-szorosára növeli a hordozó
permeabilizációs képességét COS7 sejtekben125. Az általunk használt BL41 sejtek
esetében nem mutatkozott fokozott permeabilizáció a zsírsavlánccal megnövelt R8
hordozónál, mégis az OR8 vektort választottuk a további kísérletekhez, mert más sejtek
esetében a későbbiekben talán érvényesülhet előnyös hatása.
4.2. Az hordozó-foszfopeptid konjugátum penetrációs képességének és toxicitásának vizsgálata A megfelelő hordozó kiválasztása után a következő tisztázandó kérdés, hogy miként
változik a foszfopeptidekkel (PP) kapcsolt hordozó penetrációs képessége, sejtbe jutás
kinetikája, hőmérsékletfüggése, toxicitása a szimpla hordozó peptidhez képest. A
további kísérletekhez a Gab1 adapter fehérje SHP2 és PI3K kötőhelyeit reprezentáló,
foszforilált tirozint tartalmazó peptidszekvenciákat konjugáltuk kovalensen az OR8
hordozó vektorhoz. A hordozó-PP konstrukciók sejtbe jutását konfokális mikroszkóp
segítségével, míg a bejutás kinetikáját és hőmérsékletfüggését áramlási citométerrel
vizsgáltuk BL41 B-sejtvonalon. Az SHP2 kötő tirozinon foszforilált peptidszekvenciát
GDLDpe (pe:foszfo-észter), míg a PI3-K kötőt ELPNpe röviditésekkel jelöljük a
továbbiakban. Ezek membrán-permeábilis, hordozóhoz kötött formái az OR8-GDLDpe
és az OR8-ELPNpe (hordozó-PP)
A mikroszkópos vizsgálat során Bodipy FL fluorokrommal jelölt hordozó-PP
konstrukciók a CPPk-hez hasonlóan gyorsan transzlokálódtak a citoplazmába és ott a
Lyso Tracker-el jelöt granulumokkal ko-lokalizáltak. A Pearson koeficiens értéke 0,45
körüli érték volt mindkét peptid esetében (4.5. ábra).
42
OR8-GDLDpe OR8-ELPNpe
4.5.ábra. 10 perces inkubációt követően az OR8 hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek
internalizálódnak a citoplazmába és a Lyso Tracker-el ko-lokalizált, granulált
elrendeződést mutatnak. A inkubáció 37C°-on történt 10 μM-os peptidkoncentráció
mellett.
A FACS analízis során érdekes különbséget tapasztaltunk a Bodipy-val konjugált
hordozó és a hordozó-PP között a transzlokáció kinetikájában és a sejtek által felvett
peptid mennyiségében. Míg az OR8 hordozónál az idő függvényében folyamatosan
növekszik a felvett peptid intracelluláris koncentrációja, addig az OR8-GDLDpe
peptidnél nem tapasztaltunk időfüggést (4.6.ábra).
OR8 OR8-GDLDpe
4.6.ábra. A sejmembránon átjutó, hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek sejtbejutásának
kinetikája. 37C°-on történő 5, 20, 60 perces (piros, zöld, kék) OR8 ill. OR8-GDLDpe
kezelést követően eltérő fluoreszcencia intenzitásváltozást tapasztaltunk a két peptid
között. 10 μM-os peptid dózist alkalmaztunk.
43
Az 5 perces kezelési időt követően ugyanakkora a sejtek FL-1-ben mért fluoreszcencia
intenzitása, mint a 60 perces inkubációt követően. Emellett az OR8 hordozónál
körülbelül egy nagyságrenddel nagyobb penetrációs képességet mértünk, mint az OR8-
GDLDpe esetében egyazon kontrol mellett, ugyanabban a kísérletben.
Az időfüggés mellett vizsgáltuk a hordozó-foszfopeptid konjugátumok sejtbe
jutásának hőmérséklet és koncentrációfüggést (4.7.ábra). Az OR8-GDLDpe 4C°-on és
20C°-on ugyanakkora mértékben penetrálódott a sejtekbe, és a felvett peptid
mennyisége a fentiekkel megegyezően az inkubáció idejétől függetlenül zajlott. A
20C°-on történő 1, 10, 50 μM-os OR8-GDLDpe kezelést követően a sejtek a növekvő
dózissal korrelálva egyre több sejtpermeábilis peptidet vesznek fel. A különböző
inkubációs idők (5’, 20’) után mért azonos peptidkoncentrációk azonos FL-1-ben
mérhető intenzitási értékeket mutattak.
A B
OR8-GDLD 4C°
5’, 20’ OR8-GDLD 5’ ,10,50μM 1
OR8-GDLD 20’ ,10,50μM 1OR8-GDLD 20C° , 20’ 5’
4.7.ábra. Az OR8-GDLDpe sejtbe jutása hőmérséklet és inkubálási időtől független
(A,B oszlop), viszont dózisfüggő módon zajlik (B oszlop) BL41 sejtek esetében. Az A
oszlop mintáinál 10μM-os peptid koncentrációt alkalmaztunk.
44
Ezt követően az OR8-ELPNpe esetében már csak idő és dózis-függést vizsgáltunk
FACS analízissel. Az 5 és 30 perces inkubációs periódus és az 1, 10, 40μM-os
koncentrációk mellett az OR8-ELPNpe az OR8-GDLDpe-hez igen hasonló
eredményeket mutatott szobahőmérsékleten történő inkubálást követően (4.8.ábra).
OR8-ELPN 1μM, 5’ , 30’ OR8-ELPN 10μM, 5’ , 30’ OR8-ELPN 40μM, 5’ , 30’
4.8.ábra. Az OR8-ELPNpe koncentrációfüggően és időtől függetlenül jut a sejtekbe.
Tehát a hordozó-foszfopeptid konstrukciók sejtbe jutása - a hordozókétól némileg
eltérően - az inkubációs időtől függetlenül (az első néhány percet követően), viszont
dózisfüggő módon megy végbe.
Kíváncsiak voltunk, hogy a membrán-permeábilis foszfopeptidek miért mutattak ilyen
kinetikai sajátságokat a sejtbe jutáskor. Az időintervallumtól független és a
koncentrációtól függő internalizáció intenzitás alapján azt feltételeztük, hogy a
sejtmembrán külső és belső oldala között egy gyorsan kialakuló egyensúly alapján
oszlanak meg a hordozó-PP-k. Ebben az esetben az intercelluláris tér csökkenő
peptidkoncentrációja az intracelluláris térben lévő peptidek kiáramlását, azaz csökkenő
fluoreszcencia intenzitást vonnának maguk után. Ezt igazolandóan a következő
kísérletet hajtottuk végre a Bodipy FL-val jelölt OR8-GDLDpe, az OR8-ELPNpe és az
OR8 peptidekkel. A három peptiddel párhuzamosan 30 percig inkubáltunk 3X5 minta
sejtszuszpenziót. A minták közül az elsőt nem mostuk, viszont a másodikat egyszer, a
harmadikat kétszer, a negyediket háromszor és az ötödik mintákat négyszer mostuk
PBS-ben, majd ezt követően áramlási citométeren mértük a sejtben maradt peptidek
mennyiségét (4.9.ábra).
45
OR8-GDLDOR8-GDLD
OR8-ELPNOR8-ELPN
OR8OR8
4.9.ábra. A peptidek kimoshatóak a sejtekből, tehát a plazmamembránon keresztüli
transzportjuk kétirányú is lehet. Zöld-nem mosott, rózsszín-1x, világoskék 2x, narancs
3x, sötétkék 4x mosott sejtek.
A mért eredmények alátámasztják az elképzelésünket, azaz mindhárom peptid
kimosható a sejtekből. Az egymást követő mosások után azonban egyre kevesebb
permeábilis peptid hagyta el a sejtet, és egy alsó koncentrációhatár után úgy tűnt, hogy a
kiáramlás megszűnt. Ez a jelenség az OR8-GDLDpe-nél egyértelműen megfigyelhető, a
másik két esetben talán még egy mosási lépés tette volna ezt egyértelművé.
Vizsgáltuk továbbá a hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek sejtkárosító hatását 10μM
és 50μM-os koncentráció értékek mellett 1, 4, 24 órás kezelési időt követően. A
károsodott sejteket PI festéssel detektáltuk FACS segítségével (4.10.ábra).
46
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
contr. OR8-GDLD10 uM
OR8-GDLD50 uM
OR8-GDLD-Bodipy 10
uM
OR8-GDLD-Bodipy 50
uM
OR8-ELPN10uM
OR8-ELPN50uM
OR8-ELPN-Bodipy10uM
OR8-ELPN-Bodipy50uM
Élő
sejte
k %
-a1h 4h 24h
4.10.ábra. Az OR8 hordozóval kovalensen konjugált foszfopeptidek hatása BL41 sejtek
életképességére, százalékos formában feltüntetve az élő sejtek mennyiségét.
Az OR8-GDLDpe ill. OR8-ELPNpe peptidek még 50μM-os koncentrációnál sem
okoztak viabilitás csökkenést vagy csak néhány százaléknyit. Tehát a 13 aminosavnyi
foszfopeptiddel megnövelt hosszúságú hordozó még kevésbé toxikus, mint az OR8
hordozó magában. Viszont a Bodipy FL festék peptidekhez kapcsolása növelte a
konstrukció toxicitást, ami az 50μM-os dózisnál jelentkezett. Ezt a körülményt
figyelembe kell venni a festékkel konjugált peptid-kezelések során.
4.3. A foszfopeptidekhez kapcsolódó fehérjék azonosítása Annak tisztázására, hogy a sejtbe juttatott foszfopeptidek milyen hatással lehetnek a
jelátviteli folyamatokra, ismernünk kell, hogy milyen fehérjékkel léphetnek
kölcsönhatásba. Munkacsoportunk SPR (Surface Plasmon Resonance) módszerrel
korábban már kimutatta, hogy a Gab1 eredetű GDLDpe (Y627) peptid nagy affinitással
(Kd=1,5) kötődik az SHP2 tirozin foszfatázhoz111. Az ELPNpe (Y447) peptid irodalmi
adatok szerint a PI3-K megkötéséért felelős szekvencia. A továbbiakban vizsgáltuk,
hogy a két peptid és a GDLD különböző módosított formái milyen fehérjékkel
asszociálódnak BL41 sejtek lizátumában.
47
A kísérlet során streptavidinnel fedett gyöngyökhöz kötöttük a peptidek biotinált
formáit és inkubáltuk kontroll, ill. anti-IgM-el aktivált sejtek lizátumaival. A lizátumból
íly módon, szelektíven kihalászott fehérjék a gyöngyökhöz kapcsolódnak (pull down
assay). A gyöngyöket redukáló mintapufferben főztük, majd SDS-PAGE-t követően
Western blot analízis során specifikus ellenanyagokkal mutattuk ki a peptidekhez
kötődő fehérjéket (4.11.ábra). Az eredmények megerősítésére a gélből kivágott mintákat
tömegspektroszkópiás analízissel is azonosítottuk. A GDLDpe peptid
(GDKQVEY(p)LDLDLD) módosított formáit egyrészt kontrolként kívántuk
alkalmazni, másrészt kíváncsiak voltunk, hogy a kapcsolódó fehérjék mennyire
szekvencia specifikusak. Kontrol peptidnek tirozin-fenilalanin cserélt GDFLD-t ill.
tirozinon nem foszforilált GDLD-t szintetizáltattunk. Vizsgáltuk továbbá egy irodalmi
adatok szerint foszfatázokkal szembeni rezisztenciát okozó, a foszfát csoportban
oxigén-kén atom cserét hordozó GDYLDsp (tiofoszfát) peptidet 126. A QVDLpe peptid
pedig a GDLDpe N és C-terminálisan 3-3 aminosavval rövidített formája. Az ELPNpe
módosított formáit nem vizsgáltuk.
- + - + - +
BL41 lysate
Biot EL
4.11.ábra. A biotinált GDLDpe és módosított formáival ill. a biotinált ELPNpe
peptidekkel sejtlizátumban asszociálódó fehérjék azonosítása SDS-PAGE, Western blot
analízissel. Kontrol (-) és anti-IgM-el stimulált (+) BL41 sejtek lizátumát használtuk.
Az ábrán látható specifikus ellenanyagokkal történő előhívás után azt az eredényt
kaptuk, hogy az eredeti GDLDpe és módosított, tiofoszfát változata, a GDLDsp is
YPN pe
- + - + - +
130-
95-
72-
55-
PLCγ2
SHP2
kDa
BL41 lysate
Biot- GDYLD pe
Biot-GD
YLD sp
Biot- QV DL
Ype
Biot- GD
FLD Biot- GDYLD
PI3-K
Anti-I
PLCγ2
PI3-K SHP2
Lyn
pErk
Lyn
gM - + - +
48
erőteljesen asszociálódik az SHP2 tirozin foszfatázzal. Emellett a GDLDpe peptidhez a
PLCγ2 is egyértelműen kapcsolódik, míg a GDLDsp-nél ez a kapcsolat kevésbé
egyértelmű, inkább a röntgenfilm túlexponálásának a következménye (ahogy a Lyn
esetében is). A másik érdekesség, hogy a rövidítet QVDLpe szekvenciánál a PLCγ2-vel
a kapcsolat megmarad, viszont az SHP2 nem kötődik hozzá. A kontrolként használt
GDFLD ill. a GDLD nem foszforilált formájához sem az SHP2-t sem a PLCγ2 lipid
foszfatázt nem kötődött. Továbbá az ELPNpe foszfopeptidhez a vizsgált fehérjék közül
csak a PI3-K kötődött, míg ez a fehérje a GDLD egyik formájához sem asszociálódott .
A gélfestésből kiderült, hogy a kontrolként használt streptavidin gyöngyhöz több
fehérje is kötődött aspecifikusan. Ezek az MS-el azonosított fehérjék azonban a biotinált
peptidekkel fedett gyöngyöknél nem jelentek meg, tehát nem jelentettek zavaró
tényezőt. Az egyes peptidekhez kapcsolódó fehérjék tekintetében az MS-el mért adatok
alátámasztották a specifikus ellenanyagokkal kimutatott eredményeket (4.12.ábra).
1 2 3 4 5 6
4.12.ábra. A poliakrilamid gélből kivágott fehérjék azonosítása tömegspektroszkóppal.
A gél fölött az adott minta előállításához használt biotinált peptidek láthatók, míg jobb
oldalt az egyes mintákból azonosított fehérjéket és azok molekulatömegét ábrázoltuk. A
gélen pirossal bekeretezett minta megfelel a jobb oldalon bekeretezett azonosított
molekuláknak.
Da
1. -acetyl-CoA 270 000 -methylcrotonoyl-CoA 80 000
- Hsp 60 61 000 2. -PI3-K kat. alegység 120 000 -PI3-K reg alegység 83 000
-Hsp 90 98 000 3. -SHP-2 68 000
-beta aktin 41 000 4. -PLCgamma2 149 000
-PLCgamma1 161 000 -SHP-2 70 000 5. -PLCgamma2 149 000
6. -Hsp70/Hsp90 62 000 -alpha 1 aktin 42 000 -laktóz dehidrogenáz 36 000
Stre
ptav
idin
gyö
ngy
EL Y
p Ysp
Yp Yp F
PN
GD
LD
GD
LD
QV
DL
GD
LD
95-
72-
55-
42-
130-110-
Stre
ptav
idin
gyö
ngy
EL
PN
GD
LD
GD
LD
QV
DL
GD
LD
95-
72-
55-
42-
Yp Ysp
Yp Yp F
kDa
130-110-130-110-130-110-95-
72-
55-
42-
95-
72-
55-
42-
49
A festett gélkép és az MS adatok rávilágítanak arra, hogy a Western blottal kimutatott
fehérjéken kívül további molekulák is asszociálódnak a peptidekhez (pl. β-actin, Hsp60,
Hsp70). A negatív kontrol GDFLD például tényleg nem kötődött a PLCγ2 vagy SHP2-
höz, viszont három másik fehérje interakcióba lépett vele. Az eredményekből nem
minden esetben lehet megállapítani, hogy a fehérje közvetlen kapcsolatban volt-e az
adott peptiddel, vagy egymáshoz kapcsolódva, komplex formában halásztuk-e ki őket a
lizátumból.
4.4. A foszfopeptidek in vitro SHP2 enzim-aktivitást módosító hatása A tirozinon foszforilált permeábilis peptidek a sejtekbe jutva többféle módon
befolyásolhatják a jelátviteli folyamatokat. Adott enzim SH2 doménjeivel interakcióba
lépve fokozhatják az enzim katalitikus aktivitását, betölthetnek szubsztrát szerepet és
kompetálhatnak az endogén SH2 domén kötő fehérjeszekvenciákkal.
Teszteltük tehát a peptidek enzim-aktivitást befolyásoló tulajdonságait. Mivel a
csoportunk rendelkezett SHP2 rekombináns fehérje nagymennyiségű előállítására
alkalmas baktérium-expressziós rendszerrel, ezért a foszfopeptideket erre az enzimre
kidolgozott foszfatáz-assay-ben vizsgáltuk. A foszfopeptidek egyrészt a szubtrát
szerepet töltik be a rendszerben, másrészt az SHP2 SH2 doménjéhez kapcsolódó
foszfopeptid aktiválja az enzimet. Az ELISA alapú rendszer lényege, hogy a biotinált
foszfopeptideket a megfelelő pufferben rekombináns SHP2-vel inkubáltunk, majd az
enzimreakciót követően avidinnel fedett plate-re vittük fel. A mosási lépéseket követően
specifikus ellenanyaggal detektáltuk a maradék, SHP2 által nem defoszforilált, plate-
hez kötött foszfopeptidet. Tehát gyenge enzim-aktivitásnál sok foszfotirozint
detektáltunk és erős jelet kaptunk, míg az enzim-aktivitás növekedésével folyamatosan
csökkent a detektálható foszfopeptid mennyisége, így a jel erőssége is csökkent. A
kísérletben az ELPN és QVDL peptidek a negatív kontrol szerepét is betöltik
A 6nM-os enzimkoncentrációjú minták esetében azt tapasztaltuk, hogy mindhárom
peptid jelentős mértékben defoszforilálódott. Mivel az előzetes vizsgálatok alapján
bebizonyosodott, hogy az ELPNpe és QVDLpe peptidek nem kötődnek az SHP2
fehérjéhez, azaz SH2 doménen keresztül sem aktiválhatják, ezért ezekben az esetekben
csak az enzim alapaktivitása érvényesülhetett. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy az
50
SHP2 koncentráció csökkentésével az ELPNpe és QVDLpe minták a kontrol értékekhez
tartó foszforiláltságot mutattak ugyanazon peptidkoncentrációknál. Az SHP2-höz
kapcsolódni képes GDLDpe esetében a 6 és 3 nM-os enzimkoncentrációnál minden
peptid defoszforilálódott, és az OD értékek a hatvanszoros SHP2 higítást követően is
csak a kontroll értékek 25%-át érték el (4.13.ábra). Tehát a kísérletből kiderűlt, hogy in
vitro körülmények között mindhárom tirozinon foszforilált peptid-szekvencia lehet
szubsztrátja az SHP2 tirozin foszfatáznak, és a GDLDpe peptid fokozni képes az enzim
katalitikus aktivitását.
.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
_ 6 3 1,5 0,75 0,37 0,18 0,09 SHP2 nM
OD
biot-GDLDpe
biot-QVDLpe
biot-ELPNpe
4.13.ábra. A foszfopeptidek hatása az SHP2 enzimaktivitásra. Az indirekt mérés alapján
a gyenge jel nagy enzimaktivitást jelöl. Az enzimet felező higításban alkalmaztuk
állandó (0,5μM) peptidkoncentráció mellett. A kontroll minták csak a foszforilált
peptidet tartalmazták, SHP2-t nem.
Ezzel a módszerrel a GDLDsp enzim-aktiváló tulajdonságát ill. foszfatáz rezisztenciáját
nem tudtuk mérni, mert az előhívás során használt foszfotirozin-specifikus ellenanyag a
módosított foszfát-csoport miatt a peptidet nem ismerte fel.
51
4.5. A sejten belüli Gab1-SHP2 interakció gátlása a sejtmembrán-permeábilis foszfopeptidekkel A 4.4 pontban említettük, hogy a foszfopeptidek a sejtbe jutva SH2 domén tartalmú
fehérjékhez kötődve gátolhatják a molekuláris interakciókat. A kérdés tisztázására a
következő kísérletet végeztük el. Az OR8 hordozóval konjugált peptidekkel (5μM)
előkezelt BL41 sejteket BCR keresztkötéssel stimuláltuk, majd lizáltuk a sejteket. A
lizálást követően Gab1 ill. SHP2 specifikus monoklonális ellenanyaggal
immunprecipitációt végeztünk, majd SHP2 ill. Gab1 specifikus ellenanyaggal
ellenőriztük a Gab1-SHP2 interakció változását (4.14.ábra).
kDa
anti-IgM - + + + + +
OR8-GDpe - - 5’ 30’ - -OR8-GDsp - - - - 5’ 30’
anti-IgM - + + + + +
OR8-GDpe - - 5’ 30’ - -OR8-GDsp - - - - 5’ 30’
A
-72
-110
-95
SHP-2
IP:Gab1
Gab1
WB:
-72
-110
-95
SHP-2
IP:Gab1
Gab1
WB:
kDaB
C A GD GD El pe sp pe
anti.-IgM - + + + +
C A GD GD El pe sp pe
anti.-IgM - + + + +
WB: Gab1
SHP2
110-
95-
IP:SHP-2
72-
4.14.ábra. Az OR8-GDLP pe ill.OR8-GDLDsp peptidekkel 5 percig kezelt sejtekben a
Gab1-SHP2 interakció erőssége csökken (A és B panel), míg az OR8-ELPNpe peptiddel
kezelt mintában nincs változás (B panel 5 perces kezelés).
52
Az anti-IgM stimulust követően kialakuló Gab1-SHP2 interakció erőssége jelentős
mértékben csökken az 5 perces OR8-GDLDpe előkezelésen átesett mintákban. A 30
perces előinkubálást követően a peptid hatása sokkal gyengébben érvényesül, visszaáll a
pozitív kontrolra jellemző Gab1-SHP2 kapcsolat. Az OR8-GDLDsp esetében ugyanezt
tapasztaltuk (4.14.ábra A panel). Az OR8-ELPNpe peptid esetében ez a hatás nem
jelentkezik az elvártaknak megfelelően, ugyanis nem kompetál az endogén Gab1 SHP2
kötőhelyeivel (4.14.ábra B panel). A eredmények azt bizonyítják tehát, hogy a sejtbe
jutott GDLDpe peptid egy bizonyos időintervallumban gátolja az Gab1 SHP2 kapcsolat
kialakulását.
4.6. Az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidek hatása az intracelluláris fehérje foszforilációs mintázatra. A következő lépésben arra a kérdésre kerestünk választ, hogy a BL41 sejtekbe
juttatott OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidek megváltoztatják-e a nyugvó sejtek
tirozin foszforilációs mintázatát. A kísérletben két peptidkoncentrációt, és 5 perctől 120
percig terjedő inkubálási időket alkalmaztunk.
OR8-GDLDpe
Wb: anti-pTyr
SHP2
pErk
130- 100- 70-
55-
40-
kDa
5’ 20’ 60’ 120’ OR8-40µM GDLDpe
- - 5’ 20’ 60’120’
1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-
40µM GDLDpe- - 5’ 20’ 60’120’
1µM
- + - - - - - - - - anti-IgM 2’- + - - - - - - - - anti-IgM 2’
10
4.15.ábra. Az OR8-GDLDpe peptid hatására kialakuló fehérje-foszforilációs
állapotváltozás nyugvó B sejtekben. Kontrolként kezeletlen és BCR keresztkötött
mintákat alkalmaztunk.
53
Az 1μM-os OR8-GDLDpe peptid hatására 60 és 120 percnél fokozatosan erősödő
fehérje foszforilációt figyelhettünk meg, amely egy 55 kDa körüli fehérjénél
jelentkezett a legintenzívebben (4.15.ábra). A magasabb dózis alkalmazásánál csak az 5
perces mintában láthattunk egy enyhe intenzitásbeli növekedést a szintén 55 kDa körüli
fehérje foszforilációjában. Sem a kisebb, sem a nagyobb dózisú peptidkezelés hatására
nem idukálódott az Erk szerin/treonin kináz foszforilációja.
Az OR8-ELPNpe peptid kezelés hatására viszont egészen más változás következett
be a nyugalmi foszforilációs mintázatban. Az 1 és 10 μM-os peptid dózis
alkalmazásánál határozottan megszűnik egy fehérje foszforilációja a 20 percig kezelt
mintákban, melynek mólsúlya szintén 55kDa környékén helyezkedik el. Ugyanakkor
más fehérje foszforilációja 85 kDa körül változatlan marad ugyanezekben a mintákban.
Az OR8-ELPNpe peptid kezelés sem indukálta az Erk és az Akt kinázok foszforilációját
(4.16.ábra). Az 55 kDa-os fehérjét még nem azonosítottuk, egyelőre a peptidek
szelektív hatására voltunk kíváncsiak. Az ábrák 2-3 független kísérlet egybevágó
eredményeit reprezentálják.
58-
45-
Wb: anti-pTyr
SHP2
OR8-ELPNpe
116-90-
58-
45-
OR8-ELPNpe
116-90-
58-
45-
116-90-
58-
45-
pErk
pAkt
kDa
5’ 20’ 60’ 120’ OR8-10µM ELPNpe
- - 5’ 20’ 60’120’
1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-
10µM ELPNpe- - 5’ 20’ 60’120’
1µM
- + - - - - - - - - anti-IgM 2’- + - - - - - - - - anti-IgM 2’
4.16.ábra. Az OR8-ELPNpe peptid hatása nyugvó B sejtek tirozin-foszforilációs
mintázatára. A strippelt membránt újra hívtuk pAkt és pErk specifikus ellenanyagokkal.
54
Ezt követően megvizsgáltuk, hogy változik-e a BCR keresztkötés hatására kialakuló
Erk, Akt, ill. össz foszforilációs mintázat, ha a sejteket különböző ideig előkezeljük a
permeábilis foszfopeptidekkel. A különönböző előkezelési idők után egységesen két
percig aktiváltuk a sejteket IgM specifikus monoklonális ellenanyaggal. Ezután SDS-
PAGE , majd Wester blot technikák segítségével analizáltuk a foszforilációs mintázat
változásást (4.17.ábra). A GDLD peptid estében elsősorban arra voltunk kíváncsiak,
hogy a sejtbe jutott peptid befolyásolja-e a BCR keresztkötés által indukált Erk
foszforilációt. Az ELPN esetében, pedig egyrészt a GDLD hatásával való egyezéseket
ill. különbségeket figyeltük az Erk vonatkozásában, valamint a PI3-K-Akt útvonalra
gyakorolt hatást vizsgáltuk.
Az 1μM-os koncentrációjú OR8-GDLDpe előkezelés hatására egy erőteljes
intenzitásbeli növekedés figyelhető meg az össz-fehérje tirozin-foszforilációjában a csak
anti-IgM-el kezelt pozitív kontrolhoz képest. Az anti-IgM és a foszfopeptid
szinergisztikus hatása a 60 és 120 percig előkezelt mintáknál mutatkozott, hasonlóan a
csak peptiddel kezelt mintákhoz. A 10μM-os peptiddózis esetében ugyanez a hatás az öt
perces előinkubálásnál jelentkezett. Az Erk aktiváció vizsgálatánál azt tapasztaltuk,
hogy az öt perces OR8-GDLDpe kezelést követően az Erk foszforilációja csökkent a
pozitív kontrolhoz viszonyítva 1μM-os dózisnál. A 10μM-os pepid koncentrációnál
semmilyen inkubálási időnél nem tapasztaltunk változást az Erk foszforilációban. Az
Akt foszforilációja egységesen azonos képet mutatott, az anti-IgM-el aktivált mintához
képest nem tapasztaltunk eltérést. Az OR8-ELPNpe kezelt minták esetében a totál
fehérje foszforilációs szint enyhén emelkedett szintet mutatott a pozitív kontrolhoz
viszonyítva a legtöbb mintában. Az 1μM-os peptid dózis esetében a 60 perces, míg a
10μM-os koncentráció esetében 5 percnél figyeltük meg a legintenzívebb foszforilációt.
Az Erk foszforilációban megfigyelhető erősödés korrelált az össz fehérje-foszforiláció
változásával. Az Akt foszforilációjában itt sem tapasztaltunk eltérést a kontrolhoz
képest. Tehát az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe ellentétes módon befolyásolta az
anti-IgM indukált Erk foszforilációt, míg az Akt foszforilációjára egyik sem volt
hatással.
55
Wb:
anti-pTyr
panErk
55-
40-
70-
55-
40-
70-
pErk
pAkt
A
5’ 20’ 60’ 120’ OR8-10µM GDLDpe
- - 5’ 20’ 60’120’
1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-
10µM GDLDpe- - 5’ 20’ 60’120’
1µM
- + + + + + + + + + anti-IgM 2’- + + + + + + + + + anti-IgM 2’
100-
55-
40-
130-
70-
kDa
100-
55-
40-
130-
70-
kDaOR8-GDLDpe
OR8-ELPNpe
Wb: anti-pTyr
panErk
pErk
pAkt
5’ 20’ 60’ 120’ OR8-10µM ELPNpe
- - 5’ 20’ 60’120’
1µM5’ 20’ 60’ 120’ OR8-
10µM ELPNpe- - 5’ 20’ 60’120’
1µM
- + + + + + + + + + anti-IgM 2’- + + + + + + + + + anti-IgM 2’
116-90-
58-
45-
116-90-
58-
45-
kDaB
4.17.ábra. Az OR8-GDLDpe (A) és az OR8-ELPNpe (B) peptidek hatása a BCR
keresztkötésével indukált intracelluláris fehérje-foszforilációra.
56
Kontrol peptidnek az OR8-GDLD szekvencia nem foszforilált formáját
teszteltük ugyanebben a rendszerben. A tirozinon nem foszforilált OR8-GDLD azonban
az OR8-GDLDpe-hez hasonlóan gátolta az anti-IgM indukált Erk foszforilációt az 5
percig előkezelt mintákban (4.18.ábra). Mivel az előzetes in vitro kísérletekben
bebizonyosodott, hogy ez a kontrol peptid nem kötődik az SHP2 tirozin foszfatázhoz,
úgy gondoljuk, hogy a sejtbe jutva kinázok által foszforilálódhatott és ez által nyert
biológiai aktivitást.
58-
46-
58-
46-
58-
46- pErk
pAkt
- - 2’ 5’ 20’ - - - OR8-GDLDpe- - - - - 2’ 5’ 20’ OR8-GDLD- - 2’ 5’ 20’ - - - OR8-GDLDpe- - - - - 2’ 5’ 20’ OR8-GDLD
- + + + + + + + anti-IgM
4.18.ábra. Az OR8-GDLD foszforilált és és nem foszforilált formája egyaránt gátolta az
anti-IgM indukált Erk aktivációt. Feltételezzük, hogy a sejtbe jutott peptideket az
intrcelluláris kinázok foszforilálják.
Mivel a tirozin-fenilalanin cserélt OR8-GDFLD peptid sem mutatkozott
konzekvensen inert szekvenciának a precipitációs és fehérje foszforilációs
kísérletekben, ezért a továbbiakban egy kevert GDLD szekvenciát használtunk negatív
kontrolként.
A negatív kontrolként használt kevert szekvenciájú OR8-DELD peptid valóban nem
befolyásolta az anti-IgM indukált Erk foszforilációt. Azonban a munkacsoportunk az
eddig használt monoklonális anti-IgM helyett ezután egy Jackson gyártmányú, affinitás
tisztított kecskében termelt anti-IgM + anti-IgG pecifitású ellenanyagot használt a B-sejt
receptorok keresztkötésére. Az ellenanyagcsere következtében, az előzőekkel azonos
körülmények között végrehajtott kísérletekben, a sejt-permeábilis foszfopeptidek az
eddigiektől eltérő hatást gyakoroltak az Erk foszforilációra. Az OR8 hordozóhoz
kapcsolt GDLDpe, GDLDsp és ELPNpe peptidek egyaránt gátolták a BCR
keresztkötésével aktivált Erk foszforilációt, azonban nem az 5 perces, hanem minden
57
esetben a 60 perces előinkubálást követően. Az OR8-ELPNpe esetében ez a jelenség a
60 perces mintákban az Akt foszforiláció gátlásával is párosult (4.19.ábra).
pAkt
panErk
panErk
pAkt
pErk
panErk
pErk
pErk pErk
panErk
4.19.ábra. A kevert szekvenciájú kontrol peptid kivételével, minden aktív peptid
esetében a 60 perces előkezelést követően tapasztaltuk az Erk foszforiláció gátlását. Az
ELPN peptid a GDLD-től eltérően az Akt foszforilációját is gátolta.
Tehát a különböző ellenanyagokkal aktivált BL41 sejtekben a permeábilis peptidek
eltérő módon hatottak az Erk foszforiláció kinetikájára, emellett az anti-IgG+IgM
(Jackson) ellenanyag esetében a PI3-K kötő ELPNpe peptid is gátolta az Erk
aktivációját. A továbbiakban tisztáznunk kellett, hogy a permeábilis foszfopeptidek
általi Erk foszforiláció gátlása SHP2 közvetített módon zajlik-e, ill. más sejtek esetében
milyen hatást gyakorolnak a peptidek a BCR indukált Erk/Akt foszforilációra.
58
4.7. Az SHP2 szerepe az Erk foszforiláció gátlásában A DT40 csirke B-sejtvonal általánosan használt vizsgálati rendszer a különböző gén
kiütött sejtek jelátvitelének vizsgálatára 127. Kísérletünkben a foszfopeptidek hatását
hasonlítottuk össze SHP2 foszfatázt tartalmazó vad típusú és SHP2 kiütött DT40
sejteken. A korábbi kísérletekhez hasonlóan a sejteket különböző ideig előkezeltük a
sejt-permeábilis foszfopeptidekkel (1μM-os koncentráció), majd csirke IgM specifikus
ellenanyaggal aktiváltuk a sejteket.
Wb:
SHP2
pErk
pErk
PI3-K
2’
4.20.ábra. Az OR8-GDLDpe peptid gátolja az Erk foszforilációját a vad típusú DT40
sejtekben (120 percnél), míg ez a hatás az SHP2-re kiütött DT40 ΔSHP2 sejtekben
megszűnik. Az OR8-ELPNpe peptid mindkét esetben gátolta az Erk aktivációt.
Az eredmények tulajdonképpen megegyeznek a BL41 sejteken végzett kísérletekkel,
amelyben az anti.IgG+IgM ellenanyagot használtuk. A 120 perces előinkubálást
követően az OR8-GDLDpe, az OR8-GDLDsp (nem ábrázoltuk), és az OR8-ELPNpe
peptidek egyaránt gátolták a BCR indukált Erk foszforilációt a vad típusú DT40
sejtekben (4.20.ábra). Az SHP2 deletált DT40 sejtekben az OR8-GDLDpe gátló hatása
megszűnik, míg az OR8-ELPNpe esetében az Erk foszforiláció gátlása megmarad. A
SHP2 fehérje hiányát Western blot technikával ellenőriztük sejtlizátumból. Az
eredmények alapján a GDLDpe peptid SHP2 függő módon gátolja az Erk foszforilációt,
míg az ELPNpe általi gátlás SHP2-től függetlenül zajlott.
59
4.8. A PI3-K függő degranuláció gátlása RBL hízósejtekben Az OR8-ELPNpe peptiddel törénő 60 perces előkezelés a BL41 sejtekben gátolta a
BCR keresztkötéssel kiváltott Akt foszforilációját. Az Akt kináz aktiválásában központi
szerpet játszik a PI3-K, amely a Gab adapter fehérjéhez kötődve, a PIP3 termelésén
keresztül indukálhatja a PH doménnel rendelkező Akt membrán asszociációját és
foszforilációját. Tisztázni kívántuk, hogy a Gab1 eredetű OR8-ELPNpe peptid a PI3-K
endogén kötőhelyével kompetálva gátolja-e a PI3-K-Akt aktivációs utat.
Az hízósejtek IgE receptor közvetített degranulációja részben PI3-K függő részben
attól független jelátviteli úton indukálódik 113,128. A PI3-K függő folyamatban
nélkülözhetetlen a Gab2-PI3-K interakció. Az RBL 2H3 hízósejteken végzett
degranulációs teszt lehetőséget nyújt arra, hogy vizsgáljuk az OR8-ELPNpe szerepét a
Gab2-PI3K közvetített jelátviteli folyamatban. A kísérlet során a foszfopeptidekkel 1
óráig előkezelt RBL sejteket DNP-BSA antigénnel aktiváltuk, majd ezt követően
mértük a degranuláció mértékét (4.21.ábra). Az LY294002
PI3-K gátlószert használtuk kontrolként, és összehasonlító vizsgálatként a PI3-K-hoz
nem kötődő OR8-GDLDpe peptiddel is kezeltük a sejteket. A degranuláció mértékét a
peptidkezelés nélküli 100%-os értékhez viszonyítva százalékos formában adtuk meg.
pe
4.21.ábra. A foszfopeptidek által gátolt PI3-K függő degranuláció RBL hízósejtekben
60
A kísérlet előtt konfokális mikroszkóp segítségével ellenőriztük a permeábilis peptidek
bejutását az RBL sejtekbe. Érdekes módon az OR8-GDLDpe hasonló mértékben gátolta
a DNP-BSA indukált degranulációt, mint az OR8-ELPNpe leghatásosabb
koncentrációja. Mindkét peptid hatása megközelítette az LY294002 általi gátlás
mértékét. A kísérlet alapján feltételezzük, hogy az OR8-ELPNpe peptid gátolni képes a
PI3-K kötődését a Gab2 adapter fehérjéhez, ami által a PI3-K-tól függő további
folyamatok is korlátozottá válnak. Mivel a GDLDpe peptid nem kötődik a PI3-
kinázhoz, ezért ez csak közvetett módon fejthetett ki gátló hatását a degranuláció
folyamatára.
Az eddigi eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a GDLDpe peptid egyaránt
befolyásolhatja az Erk és a PI3-K aktivációjában szerepet játszó jelátviteli lépéseket, ill.
az ELPNpe peptid szintén hatást gyakorol mindkét fehérje aktivitására.
4.9. Módosított peptidek alkalmazása A fenti kísérletek alapján azt állítjuk, hogy a sejtpermeábilis, Gab1 adapter fehérje
eredetű foszfopeptidekkel befolyásolni tudjuk a túlélési és növekedési szignálok egyes
korai jelátviteli lépéseit az Erk ill. PI3-K-Akt fehérjék szintjén. Azonban a sejtbe jutott
foszfopeptidek többféle módon is szerepet játszhatnak a jelátviteli fehérjék
aktivitásának szabályozásában, ezért egyes kísérletekben nem lehet egyértelműen
megállapítani az aktív peptid szerepét. A peptidek általi gátlás hatásmechanizmusának
pontosabb megértésében segítséget jelenthet olyan módosított peptidek alkalmazása,
melyek szűkebb hatásspektrummal rendelkeznek. A további tervek között szerepel tehát
olyan módosított peptidek tervezése és funkcionális analízise, amelyek segítségével
szelektívebb hatást érhetünk el, és ezáltal pontosabban feltérképezhetjük a Gab1-Erk ill.
Gab1-PI3-K jelpályák szabályozását B sejtekben. Az egyik ilyen irányú törekvést a
foszfatáz rezisztens tiofoszfát peptid alkalmazása jelentette, ugyanis ennél a peptidnél
elgondolásunk szerint nem kell számolnunk azzal, hogy a sejtbe jutva a foszfatáz
inaktiválja a peptidet, mivel irodalmi adatok szerint ez nem lehetséges 126. Azonban a
GDLDsp peptid az összes kísérletben a GDLDpe peptiddel megegyező hatást mutatott.
A továbbiakban vizsgálnunk kell tehát egy anorganikus foszfát-csoport felszabadulását
mérő foszfatáz rendszerben, hogy a tiofoszfát módosítás csakugyan foszfatáz
rezisztenciát okoz-e.
61
A továbbiakban a legrövidebb hatékony peptidszekvenciát szerettük volna
megtalálni. A GDLD peptid rövidítésével egy olyan szekvenciához jutottunk, amely az
SHP2 fehérjéhez még kötődik, de az enzim aktivitást fokozó hatása jóval gyengébb a 13
aminosavnyi GDLDpe peptidnél.
GDKQVEY(p)LDLDLD
DKQVEY(p)LDLD
KQVE LDLDY(p)
QVE LDLDY(p)
A
Wb:
B
4.22.ábra. A rövidített GDLDpe peptidekhez asszociálódó fehérjék (A). A peptidek SHP
enzim aktivitást módosító hatása, a maradék foszfotirozint ábrázolva (B), ahol az
alacsony OD érték nagy SHP2 aktivitást jelent.
Először a már korábban leírt, úgynevezett pull-down assay segítségével vizsgáltuk a
különböző rövidített peptidekhez kapcsolódó fehérjéket. A korábbi vizsgálatokkal
összhangban az összes rövidített szekvencia asszociálódott a PLCγ2-val, viszont az
62
SHP2-höz csak a 10 aminosav hosszúságú peptid kötődött. Az SHP2-vel kapcsolódni
képes DKLDpe enzim aktivitást fokozó hatása a két rövidebb peptiddel (KQLDpe,
QVLDpe) egyezett meg, amit az SHP2 alapaktivitásának tulajdoníthatunk, és jóval
kevésbé módosította az SHP2 foszfatázaktivitását, mint a teljes hosszúságú GDLDpe
peptid.
63
5. Megbeszélés
A tirozinon foszforilált fehérjék kölcsönhatása az SH2 doménekkel kulcsszerepet
játszik a jelátviteli folyamatok szabályozásában. A multimolekuláris jelátviteli
komplexekeben a foszfotirozint hordozó motívumok szelektíven kötődnek a különböző
jelátviteli molekulák SH2 doménjeihez, ezen keresztül lehetőség nyílik a kinázok és
foszfotázok lokalizációjának és aktivitásának pontos szabályzására7,129,130. Nagyszámú
próbálkozás irányult már a jelátviteli kaszkádok gátlásának megvalósítására a fehérje-
fehérje interakciók blokkolása révén. In vitro kísérletekben már számos esetben sikerült
szintetikus, SH2 doménhez kötődő fehérje szekvenciákat reprezentáló foszfopeptidekkel
(PP) gátolni különböző SH2 domének és foszforilált fehérjék közötti specifikus
kölcsönhatások kialakulását131-133. In vivo körülmények között azonban a
foszfátcsoport negatív töltése következtében a PP-ek nem képesek átjutni a lipid
kettősréteg alkotta sejtmembránon. A PP-ek sejtbe juttatásának egyik lehetséges módja
a plazmamembrán átjárhatóvá tétele (például LPC kezeléssel), ami által azonban a
membrán integritása károsodást szenved. A sejtek fiziológiás állapotát kevésbé
módosító lehetőség, hogy magát a PP-t tesszük permeábilissá. Több olyan természetes
eredetű, membrán permeábilis peptid szekvenciát ismerünk, amelyek hordozó
molekulaként viselkedve képesek a hozzájuk kapcsolt bioaktív peptideket/fehérjéket a
sejtek citoplazmájába/sejtmagjába juttatni 118-122. Mivel a foszfotirozin tartalmú
motívumok (pYXXX, ahol az X bármilyen aminosav lehet) specifikusan kapcsolódnak
a különböző fehérje SH2 doménekhez, a sejt permeábilis foszfopeptidek modellként
szolgálhatnak az SH2 domén alapú, fehérje-fehérje kölcsönhatás blokkolására szolgáló
peptid-mimetikumok, ill. kis molekulasúlyú gátlószerek tervezéséhez.
A Gab1 adapter fehérje fontos szerepet játszik több receptor és nem receptor-tirozin
kináz által aktivált jelpálya szabályozásában. A sejtaktiváció során a számos tirozinján
foszforilálódó adapter molekula interakciós felszínt képez az SH2 domén tartalmú
kinázok, foszfatázok és/vagy SH3 doménnel rendelkező további adapter molekulák
számára. A Gab1 fehérjéhez kapcsolódó, SH2 domén tartalmú fehérjék közül a
legtöbbet tanulmányozott az SHP2 tirozin foszfatáz és a PI3 kináz jelátvitelben betöltött
szerepe. A Gab1-SHP2 interakció több növekedési és citokin receptor esetében szerepet
játszik a Ras-Erk aktivációs jelpálya pozitív szabályozásán keresztül a növekedési és
64
proliferációs szignálokban. A Gab1-PI3-K kapcsolat az Akt szerin kináz által közvetített
túlélési, ill. anti-apoptotikus jelpályák aktiválásában tölt be fontos szerepet103,134. Az
SHP2 és PI3-K gének onkogenikus mutációi következtében átíródó fehérjék hibás
működése a sejtek rosszindulatú transzformációjához és kóros sejtburjánzáshoz
vezethet, így ezek a fehérjék, ill. a különböző jelpályákban betöltött szerepük a
tumorterápiás kutatások kiemelt célpontjaivá váltak. A malignus limfomák a limfoid
rendszer klonális daganatos betegségei. Jelenleg a 6. leggyakoribb daganattípus és a
halálozás vonatkozásában is az 5-6. helyen áll. Feltételezzük, hogy szintetikus tirozin
foszfopeptidek sejtbe juttatásával gátolhatók azok a patológiás jelátviteli utak,
amelyeknek szerepük van a B-sejt limfómák kialakulásában.
A B limfociták antigénkötő receptoraikon keresztüli aktivációját követően a Gab1
számos tirozinján foszforilálódik és kölcsönhatásba lép többek között az SHP2 és PI3-K
molekulákkal is92. A Gab1 fehérje jelamplifikáló szerepét már leírták B sejtekben,
azonban még nem tisztázott a Gab1-SHP2 és Gab1-PI3-K fehérje kölcsönhatások hatása
a Ras-Erk és az Akt közvetített jelpályákra, ill. ezen keresztül a proliferációs,
apoptotikus és túlélési szignálokra85. Kísérleteinkben SHP2- és PI3-K-kötő Gab1
motívumokat reprezentáló, tirozinon foszforilált peptideket juttattunk B limfocitákba,
majd vizsgáltuk a korai jelátviteli eseményekre gyakorolt hatásukat.
Az optimális hordozó szekvencia kiválasztása Kísérleteink első fázisában olyan sejt permeábilis hordozó molekulát (CPP)
kerestünk, amely alkalmas a bioaktív foszfopeptideket az élő sejtek citoplazmájába
juttatni a sejt károsítása nélkül. Fontos szempont volt továbbá a műtermékek elkerülése
végett olyan, „inert” hordozó kiválasztása, amely önmagában nem befolyásolja az
általunk vizsgált jelátviteli folyamatokat. Az optimális CPP kiválasztásához eltérő
rendszerekben már vizsgált, membrán permeábilis peptid szekvenciákat hasonlítottunk
össze egységes körülmények között, BL41 sejtvonalon. A HIV1 transzaktivációs
doménből (Tat) származtatható oktaarginin (R8) és a nyolc szénatomos, oktanoil
zsírsavlánccal módosított OR8 konstrukció esetében az arginin aminosavak pozitív
töltéstöbbletet hordoznak. A galaninból és mastoparanból felépülő 27 aminosavnyi
kiméra peptid Transportan és rövidített származéka, a TP10 az előző hordozóhoz képest
nagyobb hidrofóbicitással rendelkezik, míg a szintén 27 aminosavból felépülő MPG
65
amfipatikus tulajdonságú. Az MPG metioninon oxidált származéka a kromatográfiás
vizsgálatok alapján jelentős háromdimenziós változáson esett át a MPG-hez képest.
Az eltérő fizikai tulajdonságokkal rendelkező CPP-k a mikroszkópos vizsgálatok
alapján, a sejtbe jutást követően egységesen granulált elrendeződést mutattak az MPGox
kivételével. A savas partikulumokat festő Lyso Tracker-el történő jelölés jelentős
mértékű ko-lokalizációt mutatott a Bodipy-val konjugált CPP-ket tartalmazó
granulumokkal. Eredményeink alapján azt mondhatjuk, hogy a penetrálódott hordozók
jelentős része (kb. 40 %) a savas vezikulákban lokalizálódik 20 perces kezelést
követően, míg a többi a citoplazmában és a nem savas vezikulákban található. A
fáziskontraszt felvételek sejtmorfológiáját összehasonlítva a fluoreszcens képekkel azt
gondoljuk, hogy a hordozók a sejtmagba nem jutottak be.
A kinetikai vizsgálatokra és a kvantitatív összehasonlításra alkalmasabb FACS
analízis jobban rávilágított a CPP-k eltérő fizikai-kémiai tulajdonágaira. Az egyes
peptidek penetrációs képessége 4°C-on és 37°C-on azonos mértékű volt, tehát a CPP-k
transzportja nem magyarázható a tipikus endocitózis modellel. A hordozók már öt perc
elteltével az összes sejtben egységesen detektálhatók voltak és a hosszabb inkubációval
a felvétel mértéke még tovább fokozódott. A különböző hordozók penetrációs
képessége azonban eltérő mértékű volt azonos koncentráció viszonyok mellett. A BL41
sejtek a legnagyobb mértékben az R8 és OR8 hordozókat vették fel, és ehhez képest,
egységnyi idő alatt majdnem egy nagyságrenddel kevesebb MPG ill. TP10 jutott a
sejtekbe. A legkevésbé penetrábilis peptidnek a Transportan mutatkozott. A 20 percig
tartó 10 μM-os peptidkezelést követően a Transportannal és a TP-10-el kezelt sejtek 25
ill. 26 %-a, míg az MPG-vel inkubált sejtek 58 %-a maradt életben. Az R8 és az OR8
peptidek a kontrol értékekhez hasonló 94 %-os túlélést mutattak. A hosszú távú (1, 6, 24
óra) CPP kezelés eredményei egybevágnak a 20 perces kísérlet viabilitási adataival,
miszerint a két oktaarginin tartalmú hordozó jóval kevésbé toxikus hatású a BL41
sejtekre, mint az MPG, a Transportan vagy a TP10.
A Transportan és a TP10 magas toxicitása miatt a CPP-k hatását az intracelluláris
fehérje tirozin foszforilációs mintázat változására már csak az R8, OR8 és MPG
peptideken vizsgáltuk. Az R8 és OR8 hordozók önmagukban nem indukálták fehérjék
foszforilációját és az alap foszforiláltsági mintázatot sem változtatták meg, míg az MPG
hordozóval inkubált mintáknál néhány fehérje foszforilációjának enyhe intenzitásbeli
66
növekedését tapasztaltuk. Az R8 és OR8 hordozókat tehát a fehérje foszforiláció
szempontjából inertnek, és a Gab eredetű peptidek sejtbe juttatására alkalmasnak
találtuk.
Az eredmények alapján úgy gondoljuk, hogy a mikroszkópos vizsgálatok során
mutatott egységes intracelluláris lokalizáció ellenére, az eltérő fizikai tulajdonágú CPP-
k valószínüleg eltérő transzlokációs mechanizmussal jutnak a sejtekbe. Az irodalmi
adatok szerint az R8 peptid esetében leírt invertált micella elméletnek nem mondanak
ellent az eredményeink. Ezek szerint a pozitív töltésű oktaarginin peptidek kapcsolatba
lépve a sejtfelszíni negatív töltésű foszfát és/vagy szulfát csoportokkal vezikulák
lefűződését indukálják a plazmamembránról a citoplazma felé. A lefűződő vezikulákkal
egyrészt savas lizoszómák fúzionálhatnak, másrészt a felnyíló vezikulákból a
citoplazmába kerülhetnek az internalizálódott peptidek. Az amfipatikus MPG és a
lipofil Transportan/TP10 esetében elképzelhető, hogy a sejtmembránba épülve
pórusokat hoztak létre, megbontva ezzel a membrán integritását, ami végső soron
csökkentette a sejtek viabilitását. Az oktanoil csoporttal kapcsolt OR8 esetében a
hordozó fizikai tulajdonsága némileg változott a lipofil zsírsavlánc miatt, de a vizsgálati
körülmények között minden esetben az R8 hordozóhoz hasonlóan viselkedett. Az
irodalmi adatok szerint a zsírsavlánccal kapcsolt oktaarginin permeábilis képessége
bizonyos sejtek esetében jelentősen megnő125. Mivel a kísérleteket a későbbiekben más
sejttípuson is folytatni kívánjuk, ahol az oktanoil csoport penetrációs képességet fokozó
szerepe esetlegesen érvényesülhet, a további kísérletekhez az OR8 hordozót
választottuk a bioaktív foszfopeptidek sejtbe juttatásához.
Az OR8 hordozóval konjugált foszfopeptidek penetrációs és toxicitási jellemzői Továbbiakban a kiválasztott OR8 hordozóhoz kovalensen kapcsolt, SHP2-hez
kötődő GDLDpe és PI3-K-hoz kötődő ELPNpe foszfopeptidek penetrációs
tulajdonságát és toxicitását vizsgáltuk a hordozóhoz képest. A mikroszópos felvételek
alapján mind az OR8-GDLDpe, mind az OR8-ELPNpe hasonló intracelluláris
elhelyezkedést mutatott BL41 sejtekben, mint az OR8 hordozó magában. A hordozóval
kapcsolt foszfopeptidek jelentős része szintén a Lyso Tracker-el jelölt savas
partikulumokban helyezkedett el, míg a maradékot a citoplazmában és a nem savas
67
vezikulákban detektáltuk. A peptidek kolokalizációjának mértékét a Lyso Tracker-el
0,45-ös Pearson koefficiens érték jellemezte.
A FACS analízis eredményei alapján a hordozó-foszfopeptid konstrukciók (OR8-PP)
az CPPk-hez hasonlóan, ugyanolyan mértékben transzlokálódtak a plazmamembránon
keresztül 4°C-on mint szobahőmérsékleten. Viszont a 13 aminosavval megnövelt OR8-
PP szekvenciák penetrációs képessége csökkent a szimpla OR8 hordozóhoz képest.
Érdekes különbséget tapasztaltunk a hordozó és a hordozó-PP sejtbe jutás kinetikája
között. Az áramlási citofluoriméteren végzett kísérlet szerint a legrövidebb kezelési idő
alatt (5 perc) a sejtbe jutott OR8-PP-k mennyisége megegyezik a 20 ill. 60 perc alatt
penetrálódott OR8-PP mennyiséggel. A sejtbe jutás mértéke az OR8-PP
koncentrációjával arányosan nőtt, azonban a sejt által felvehető maximális OR8-PP
mennyiség már a legrövidebb kezelési idő alatt bejutott az intracelluláris vezikulákba,
ill. a citoplazmába. Következésképpen az OR8-PP-k internalizációja koncentációtól
függő és (a sejtbe jutás néhány percétől eltekintve) időintervallumtól független
folyamat, ellentétben az OR8-al, ahol időfüggést tapasztaltunk a hordozó felvételében.
Az eredmények alapján úgy gondoljuk, hogy gyorsan kialakuló egyensúlyi állapot jön
létre a plazmamembrán két oldala között. A permeábilis peptidek számára a
plazmamembránon keresztül kétirányú transzport lehetséges, amit a foszfopeptidekkel
kezelt sejtek mosásával vizsgáltunk. A sejtek többszöri mosása során az OR8-PP-k
intracelluláris mennyisége adott koncentráció szintig folyamatosan csökkent, de a teljes
mennyiséget nem tudtuk eltávolítani a sejtekből. Ezzel szemben a sejten belüli OR8
hordozó mennyisége a legutolsó mosási lépést követően is tovább csökkent. Ebből arra
következtethetünk, hogy a hordozóhoz kapcsolt foszfopeptidek egy része nagy
affinitással kapcsolódik az intracelluláris, SH2 domént tartalmazó fehérjékhez, míg a
foszforilált tirozint nem tartalmazó OR8 nem lép kölcsönhatásba intracelluláris
molekulákkal, így könnyebben kimosható a sejtekből.
Az 1, 4, 24 órás viabilitási tesztekben az OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidek
még kevésbé mutatkoztak toxikusnak, mint az OR8 hordozó szekvencia. Még az 50
μM-os peptid dózis alkalmazásánál is csak az OR8-GDLDpe kezelt sejtek túlélési
aránya csökkent néhány százalékkal a kontrolhoz képest. Tehát a hordozó-foszfopeptid
konstrukciók penetrációs képessége valamelyest csökkent a hordozóhoz képest, viszont
kevésbé bizonyultak citotoxikusnak.
68
A foszfopeptidekkel kölcsönhatásba lépő intracelluláris fehérjék azonosítása A különböző receptorokon keresztüli sejtaktivációt követően a Gab1 adapter fehérje
számos tirozin, szerin és treonin aminosav oldalláncán foszforilálódhat. A foszforilált
aminosavakat tartalmazó peptid szekvenciákhoz kapcsolódó fehérjék közül már többet
azonosítottak. Az Y627 és Y659 által alkotott BTAM motívumhoz két SH2 doménnel
kapcsolódó SHP2 és az Y447, Y472 és Y589 aminosavakat hordozó YVPM
motívumhoz kötődő PI3-K fehérjéken kívül több SH2 doménnel kapcsolódó molekulát
is azonosítottak a Gab1-hez asszociáltan (PLCγ, Nck, RasGAP)97,101,108. A Gab1
prolinban gazdag régiójához SH3 doménnel kapcsolódik a Grb2 adapter fehérje, míg a
foszforilált szerin/treonin aminosavakhoz az Erk1/2 kinázok kötődhetnek.
A Gab1 eredetű peptid konstrukciókkal kapcsolatba kerülő intracelluláris fehérjék
azonosítása céljából streptavidinnel fedett gyöngyökhöz kötött biotinált peptideket
inkubáltunk nyugvó és aktivált BL41 sejtek lizátumával. A magas foszfopeptid
koncentráció valószínűleg leszorította az SH2 domén tartalmú fehérjéket az endogén
kötődési partnereikről, amit alátámaszt, hogy a nyugvó és aktivált minták között nem
jelentkezett különbség a peptidekhez kapcsolódó fehérjék mennyiségében. Elsősorban
az SH2 doménen keresztül kötődő fehérjékre voltunk kíváncsiak, bár a
tömegspektroszkópiás eredmények alapján számos SH2 doménnel nem rendelkező
molekulát is azonosítottunk a különböző peptidekhez asszociáltan. Ezek az SH2
doménnel nem rendelkező fehérjék vagy az adott peptid szekvenciához kapcsolódtak
közvetlenül, vagy közvetve, az SH2 doménen keresztül kötődött fehérjékhez
kapcsolódhattak. A peptiddel kialakított közvetlen kapcsolatra utal a tirozin-fenilalanin
cserét hordozó GDFLD kontrol szekvencia, ahol SH2 doménnel rendelkező fehérjét
nem tudtunk kimutatni, de három más molekulát igen (Hsp70/Hsp90 organizáló fehérje,
α-1-aktin, laktóz dehidrogenáz). A kapcsolatok erősségét jellemzi, hogy detergenssel
történő többszöri mosási lépést követően sem tudtuk ezeket az „aspecifikus” fehérjéket
eltávolítani. Az irodalmi adatok alapján a PI3-K fehérje regulátor alegységének SH2
doménjéhez kötődő ELPNpe peptid esetében MS technika segítségével festett gélből
kimutattuk a PI3-K 85 kDa-os regulátor és 120 kDa-os katalitikus alegységeit, és
emellett a Hsp 90 fehérje kis mennyiségét is. A GDLDpe és GDLDsp peptidek pedig az
SHP2 mellett a β-aktint kötötték jelentős mennyiségben. A GDLDpe szekvencia
69
rövidített formája, a QVDLpe nem kötődött az SHP2-höz, viszont a hosszabb GDLDpe
peptidhez hasonlóan, az SH2 doménnel szintén rendelkező PLCγ2 fehérjéhez igen. A
Western blot analízis eredményei tökéletesen alátámasztották a tömegspektroszkópiás
adatokat. Az eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a Gab1 adapter fehérje 627-es
tirozinját hordozó motívumot reprezentáló GDLDpe peptid az SHP2 fehérjén kívül in
vitro körülmények között a PLCγ2 fehérjével is interakcióba lép, ami az irodalmi adatok
között idáig nem szerepelt. A HGF és EGF receptor keresztkötést követően a Gab1
kilenc tirozinon foszforilálódik, amelyek közül az Y307, Y373, Y407 potenciális
kötőhelyet szolgáltat a PLCγ1 számára135. Tehát a Gab1 627-es tirozinja dokkoló helyet
szolgáltathat mind az SHP2, mind a PLCγ2 számára. A tirozin foszfátcsoportján
módosított, GDLDsp tioészter formához nem kötődött a PLCγ2, viszont a 13-ról 7
aminosavra rövidített QVDLpe foszfoészterhez igen. Az SH2 domének mély
kötőzsebébe kötődik bele a foszfotirozin, és a kötés erősségét a zseb alján levő
konzervált arginin biztosítja. A egyes fehérjék SH2 doménje esetében a kötőzseb és az
azt „bélelő” oldalláncok nem azonosak, így eltérő foszforilált motívumokkal léphetnek
kölcsönhatásba. A tiofoszfát csoportban oxigént helyettesítő kén atom nagyobb mérete
miatt lehetséges, hogy a PLCγ SH2 kötőzsebébe már nem fér be a foszfát csoport, míg
az SHP2 SH2 doménjébe igen. A kísérlet egyben arra is bizonyítékul szolgál, hogy a
PLCγ2 az SH2 doménjén keresztül kapcsolódott a foszfotirozint hordozó
szekvenciához. A PLCγ2-vel ellentétben az SHP2 a GDLDpe (foszfoészter) és a
GDLDsp (tioészter) formához is kötődött, viszont a rövidített QVDLpe szekvenciához
már nem. Tehát az SHP2 esetében a foszfotirozint körülvevő szekvenciának nagyobb
szerepe van az SH2 doménhez történő szelektív kötődésben, mint a PLCγ2 esetében.
Összefoglalva tehát a sejtmembrán permeábilis OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe
peptidek a BL41 sejtekbe juttatva képesek az endogén SHP2 és PI3-K fehérjékkel
kölcsönhatásba lépni. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy néhány egyéb fehérjével is
kapcsolatba kerülhetnek, melyek hatással lehetnek a jelátviteli folyamatokra.
A foszfopeptidek enzimaktivitást módosító hatása A sejtek citoplazmájába juttatott foszfopeptidek alapvetően háromféleképpen
változtathatják meg a jelátviteli folyamatok egyes lépéseit. A tirozinon foszforilált
peptidek kompetálhatnak az endogén, SH2 doméneket kötő fehérje szekvenciákkal
70
(Gab1 627Y, 447Y), így az adott fehérje SH2 doménjéhez kötődve megakadályozhatják
annak eredeti térbeli lokalizációját. Szubsztrátként szolgálhatnak az SHP2 és más
tirozin foszfatázok számára, kompetálva ezáltal az enzimek eredeti szubsztrátjaival.
Végül az SH2 doménekhez kötődve, konformáció változást előidézve módosíthatják az
enzimek katalitikus aktvitását. Tisztázni kívántuk, hogy a lehetséges
hatásmechanizmusok közül, a már bizonyított fehérje-foszfopeptid kölcsönhatásokon
kívűl, melyek azok, amelyek élő sejtekben érvényesülhetnek.
Az irodalmi adatok alapján az SHP2 aktiválásában a N-terminális SH2 domén
foszfotirozin ligandummal kialakított kapcsolata játszik kritikus szerepet, bár az enzim
teljes aktivitásához a C-terminális SH2 domén ligand kötésére is szükség van43,48. Az
enzim aktiválása mellett a szubsztráthoz történő irányításban is nélkülözhetetlen
szerepet játszanak a foszfotirozin motívumokat hordozó fehérjék (Gab, FcγRII, CD45).
Az SHP2 leírt szubsztrátjai mellett (Gab1, Gab2, EGFR, PDGF, STAT) számos
ismeretlen, ill. feltételezett (CBP, PAG, Src) további szubsztrát is szerpelhet a
különböző jelátviteli utakban.
Az SHP2 N-terminális SH2 doménjével kölcsönhatásba lépő GDLDpe peptid
egyértelműen fokozta az enzim aktivitást, tehát a monofoszfo peptid is képes aktiválni a
rekombináns SHP2-t . Az előzetes vizsgálatokban az SHP2-höz nem kötődő rövidített
QVDLpe, illetve a PI3-K-hoz kötődő ELPNpe peptidek nem módosították jelentős
mértékben a foszfatáz aktivitását. Magas SHP2 koncentrációnál viszont az enzimet nem
aktiváló QVDLpe és ELPNpe is defoszforilálódott, ami csak az enzim alapaktivitásával
magyarázható, viszont rámutat arra, hogy fiziológiás körülmények között akár ezek a
peptidek is lehetnek szubsztrátjai az SHP2-nek.
A sejtbe jutott foszfopeptidek tehát egyrészt képesek megváltoztatni az enzimek
aktivitását, másrészt az SHP2 szubsztrátként szolgáló endogén Gab1 fehérje, ill. más
tirozinon foszforilált motívumokkal versengve alternatív enzim célpontokat
jelenthetnek.
A foszfopeptidek hatása a molekuláris interakciókra élő sejtekben A következőkben azt vizsgáltuk, hogy a sejtbe juttatott foszfopeptidek befolyásolják-e
a sejten belüli fehérje-fehérje kölcsönhatások létrejöttét.
71
B limfocitákban bizonyított, hogy a BCR-en keresztüli aktiváció hatására
foszforilálódó Gab1 adapterfehérje 627-es és 659-es tirozinjai az SHP2 tirozin foszfatáz
két SH2 doménjával lépnek kölcsönhatásba97. Ez a kapcsolat egyrészt katalizálja az
SHP2 nyitott, enzimatikusan aktív térszerkezetének kialakítását, másrészt lehetőséget
nyújt arra, hogy a szignaloszómába kerülő aktív enzim defoszforilálhassa szubsztrátjait.
Az SHP2 fehérje C-terminális foszforilált tirozinjain keresztül adapter funkciót is
elláthat, további jelátviteli molekulákat toborozva a multimolekuláris jelátvieteli
komplexbe (Grb2)136. Emellett a Gab1 447, 472, 589-es foszforilált tirozinjai a PI3-K
dokkolásával az Akt kináz aktiválása mellett a PI3-K további aktiválását eredményező
pozitív visszacsatolási mechanizmust biztosítanak, a Gab fehérje sejtmembrán PIP3-hoz
való kapcsolása és további PI3-K kötődésén keresztül. Amennyiben a sejtbe juttatott
peptidek in vivo körülmények között is kölcsönhatásba lépnek a citoplazmatikus
célfehérjék SH2 doménjeivel, akkor az adott fehérjék térbeli lokalizációja megváltozik,
ezáltal az általuk közvetített további funkciók gátolttá válhatnak.
Kísérleteinkben nagyobb hangsúlyt fektettünk az SHP2 kötő GDLDpe szekvencia,
ill. ennek módosított formáinak vizsgálatára, így a foszfopeptidek fehérje-fehérje
kölcsönhatásokra gyakorolt hatását a Gab1-SHP2 kapcsolat viszonylatában vizsgáltuk.
A PI3-K kötő ELPNpe szekvencia a kísérlet során negatív kontrolként szolgált, ugyanis
ez a peptid nem kötődött az SHP2 molekulához, tehát nem kompetálhat a foszfatáz
endogén kötőhelyeivel. A BL41 sejtek 5 perces OR8-GDLDpe előkezelését követően a
kontrol minta színtjére csökkent az anti-IgM stimulus hatására kialakuló Gab1-SHP2
kölcsönhatás erőssége, vagyis a foszfopeptid leszorította az SHP2-t a Gab1 SH2 domént
kötő motívumáról. A kölcsönhatás gátlása a foszfatáz rezisztens OR8-GDLDsp peptid
esetében is hasonlóan alakult, míg az OR8-ELPNpe szekvencia nem módosította
jelentős mértékben a Gab1-SHP2 fehérje interakció erősségét. Érdekes módon az SHP2
kötő foszfoészter és tiofoszfát GDLD peptidekkel törénő 30 perces előkezelés már
hatástalan volt az IgM indukált Gab1-SHP2 kölcsönhatás kialakulására. Erre
magyarázatul szolgálhatna a citoplazmában lévő proteázok és peptidázok működése,
azonban a kinetikai vizsgálatok eredményei nem támasztják alá a sejtbe jutott OR8-PP-
k enzimek általi, ilyen gyors lebontását. Feltételezhető, hogy a sejtbe juttatott
foszfopeptidek többféle hatásmechanizmusa egy időben is érvényesülhet, tehát nem
csak az SH2 doménekhez kötődő ligand szerepét játszák, hanem egyben szubsztrátként
72
is szolgálhatnak az aktivált SHP2, ill. egyéb foszfatáz molekulák számára. Ebből
kifolyólag a kezelési idő növelésével folyamatosan változhat a foszforilált peptidek
intracelluláris mennyisége. Ennek a hatásnak a kiküszöbölésére terveztük a
foszfatázoknak ellenálló GDLDsp (tiofoszfát) peptidet, amely a sejtbe jutást követően
hosszú távon is megtartja foszforilált formáját126. Mivel az általunk használt foszfatáz
aktivitást meghatározó rendszerben nem tudtuk tesztelni a GDLDsp foszfatáz
rezisztenciáját, és az a további kísérletekben sem mutatott eltérést a foszfoészter
GDLDpe formától, lehetséges, hogy a foszfátcsoportban végrehajtott oxigén-kén
szubsztitúció nem elégséges a teljes foszfatáz rezisztencia kialakulásához. Szerepe lehet
továbbá a fehérje kölcsönhatások gátlásában a citoplazma és a lefűződő vezikulák
közötti peptid megoszlásnak, ugyanis csak citoplazmába kerülő peptidek léphetnek
kölcsönhatásba az SH2 doménekkel. Mivel a foszfopeptid-kezelés és az azt követő anti
IgM-el történő aktiváció során a sejteket nem mostuk, és gyorsan kialakuló egyensúlyt
feltételezünk a sejtmembrán két oldala között, a kiindulási peptid koncentrációnak nagy
jelentősége van a kiváltott hatás időbeli lefolyására.
Az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidek hatása az intracelluláris fehérje foszforilációs folyamatokra. A nyugvó B-sejtek alap foszforilációs mintázatára alapvetően eltérő módon hatott az
OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptid kezelés. Mindkét foszfopeptid megváltoztatta
a nyugvó sejtek tirozin foszforilációs mintázatát, de míg az SHP2-höz kötődő OR8-
GDLDpe hatása koncentráció és időfüggést mutatott, a PI3-K-hoz kötődő OR8-ELPNpe
esetében ezt nem tapasztaltuk. Mivel a két peptid penetrációs tulajdonságai között nem
tapasztaltunk jelentős különbséget, az eltérő hatásmechanizmust a különböző
ligandumokkal kialakított kölcsönhatásokkal magyarázhatjuk. Az 1μM-os OR8-
GDLDpe dózis alkalmazásánál a hosszabb (1-2 órás) inkubálási idő okozott egy
általánosan fokozódó, fehérje foszforilációs szint növekedést, amely részben hasonlított
az anti-IgM stimuláció hatására kialakuló foszforilációs mintázatra. Az OR8-GDLDpe
kezelés következtében megváltozott fehérje foszforiláció intenzitás arra utal, hogy az
SHP2 foszfatáz kiemelt szerepet játszik a sejt foszforilációs állapotának
szabályozásában és ebből kifolyólag a sejtaktivációban is. Az előzetes kísérltekben
bebizonyosodott, hogy a sejtbe juttatott OR8-GDLDpe peptid többféle módon is
73
szerepet játszhat az SHP2 foszfatáz szabályozásában. Az SHP2-vel kölcsönhatásba lépő
foszfopeptid aktiválhatja az enzimet, amely ezt követően például a Csk kötőhely v. az
Src kinázok inhibíciós C-terminális tirozinjainak defoszforilációjával tirozin kinázokat
szabadíthat fel a gátlás alól. Az OR8-GDLDpe peptid a foszfatáz SH2 doménjéhez
kapcsolódva megakadályozhatja, hogy az SHP2 szubsztrátja közelébe kerüljön és
defoszforilálja azt. Továbbá az SHP2 szubsztrátként szolgáló endogén Gab1, ill. más
tirozinon foszforilált motívumokkal versengve az OR8-GDLDpe alternatív enzim
célpontot jelenthet. Ezek a hatások együttesen vagy külön-külön is okozhatják az
intracelluláris fehérje foszforilációs szint emelkedését. Úgy gondoljuk, hogy a
membránról lefűződő vezikulákból történő foszfopeptid kiáramlás sebessége szintén
befolyásolja a peptidhatás időbeli lefolyását.
A magasabb OR8-GDLDpe peptid koncentráció nem okozott intenzívebb változást a
fehérjék tirozin foszforilációjában, és az időbeli hatás is sokkal hamarabb jelentkezett.
A 10 μM-os foszopeptid koncentráció valószínűleg másképpen befolyásolta a fehérje
kölcsönhatásokat és a vezikulákból történő kiáramlás sebessége (esetleg minősége) is
megváltozhatott.
A PI3-K SH2 doménjéhez kötődő OR8-ELPNpe peptid egy nyugalmi állapotban
foszforilált, 55 kDa körüli fehérje tirozin foszforilációjának teljes gátlását okozta. A
specifikus hatás a peptid koncentráció növelésével sem változott, és csak a 20 perces
kezelést követően figyelhettük meg. Az OR8-ELPNpe hatása a nyugvó sejtek
foszforilációs állapotára tehát az OR8-GDLDpe-vel szemben sokkal specifikusabbnak
mutatkozott. Az 55 kDa körüli fehérje azonosítása későbbi munkánk egyik célpontja
lesz. Lehetséges, hogy a PI3-K térbeli lokalizációját megváltoztatva gátoltuk a membrán
PIP2, PIP3 képződését, és ezáltal egy PH domén tartalmú fehérje membránhoz történő
áthelyeződését, amely folyamatok eredményeképpen az azonosítatlan 55 kDa-os fehérje
nem foszforilálódhatott.
A BCR keresztkötést követően a Gab1 molekulák foszforilált tirozint tartalmazó
motívumaihoz SHP2 és PI3-K fehérjék kötődnek, melyek pontos szerepe a további
jelátviteli lépésekben még nem tisztázott B-sejtek esetében. Számos receptoron
keresztüli jelátvitelben ismert, hogy az Gab1-SHP2 kapcsolat pozitívan szabályozza
Ras-Erk aktivációs utat, bár az SHP2 szubsztrátja a legtöbb esetben még
74
azonosítatlan72,100. EGFR-on keresztüli aktiváció esetében leírták, hogy az SHP2
defoszforilálja a Ras-t negatívan szabályzó RasGAP kötőhelyét a Gab1 fehérjén
fibroblaszt sejtekben, amely a Ras-Erk kaszkád felerősítését eredményezi55. Az SHP2
adapter funkciója által, a Grb2-Sos komplex Ras-hoz irányításával is aktiválhatja a
MAP-kináz kaszkádot, amely folyamatban az SHP2 katalitikus aktivitására nincs
szükség. A Gab1-PI3-K kapcsolat Akt aktivációjában betöltött szerepe ismert, viszont a
Ras aktivációra gyakorolt hatása még tisztázásra szorul.
A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy a BL41 sejtekbe juttatott Gab1 eredetű
foszfopeptidek milyen hatást gyakorolnak az antigén receptor keresztkötésével kiváltott
Erk ill. Akt foszforilációra. Az SH2 doménekhez kapcsolódó foszfopeptidek a Gab1
közvetített és Gab1-től független jelátviteli eseményeket egyaránt befolyásolhatják.
Két különböző eredetű, IgM, ill. IgM+IgG specifikus monoklonális ellenanyaggal
történő aktiváció során eltérő eredményeket kaptunk. Az anti-IgM-el történő
sejtaktiváció során az OR8-GDLDpe peptiddel 5 percig előkezelt mintában csökkent a
BCR keresztkötés által indukált Erk foszforiláció. Az eredmény ebben az esetben is
koncentráció függő volt, ugyanis a magasabb peptid dózisnál nem alakult ki az Erk
gátlása. Az Erk foszforiláció gátlásának egyik lehetséges magyarázatául szolgálhat a
Patrick Raynal munkacsoportja által leírt mechanizmus, miszerint az SHP2
defoszforilálja a Gab1 molekula RasGAP kötőhelyét, amely negatívan szabályozza a
Ras aktivációt és ezen keresztül az Erk foszforilációját55. Amennyiben a sejtbe juttatott
OR8-GDLDpe peptid kölcsönhatásba lép az SHP2 SH2 doménjével, akkor a Gab1 627-
es tirozinjáról leszorítva nem tudja defoszforilálni a RasGAP kötőhelyét és így
kialakulhat a Ras-on keresztüli Erk gátlás. Az összes fehérje tirozin foszforilációját
vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az OR8-GDLDpe peptid és az anti-IgM hatása
összeadódott, és időbeli lefutása megegyezett a csak peptiddel kezelt minták esetében
tapasztalttal. Az OR8-GDLDpe foszfopeptid tehát a sejtbe juttatva időben eltolva két
különböző hatást is kiváltott. Az OR8-ELPNpe peptiddel előkezelt sejtekben a várt
eredményekkel ellentétben nem változott a BCR indukált Akt foszforiláció, az Erk
foszforilációja viszont bizonyos mintákban, idő és dózisfüggő módon fokozódott (60’ és
5’). Az anti-IgM-el történő aktivációt követően tehát nem érvényesült OR8-ELPNpe
peptid nyugvó sejtekre gyakorolt hatásmechanizmusa.
75
Az IgM+IgG specifikus ellenanyag használata rávilágított, hogy milyen jelentősége
van a membránhoz kötött eseményeknek az OR8-PP-k hatásának kimenetelére.
Lehetséges, hogy a különböző típusú ellenanyagok használata eltérő módon
befolyásolja a foszfopeptid tartalmú vezikulák lefűződését, azok stabilitását, ill.
foszfopeptidek citoplazmába kerülését. Az anti-IgG+IgM ellenanyaggal történő B-sejt
aktiváció során az Erk foszforilációjának a gátlása a korábbiakkal ellentétben csak a 60
perces OR8-GDLDpe előkezelést követően jelentkezett. Ugyanezt az eredményt kaptuk
az OR8-GDLDsp esetében is. Ugyanakkor a 60 perces OR8-ELPNpe kezelés hatására
egyaránt csökkent a BCR indukált Erk ill. Akt foszforiláció. Ebben az esetben az OR8-
ELPNpe gátolhatta a PI3-K membrán közelébe kerülését, ami a membrán PIP3 szint
csökkenését eredményezhette, ezzel megakadályozva az Akt membránhoz történő
asszociációját és PDK általi foszforilációját. Emellett a Ras aktiválásában szerepet
játszó PH domén tartalmú fehérjék (pl. Gab1) sem tudtak a membrán PIP3-hoz
kapcsolódni, így a foszfopeptid közvetett módon gátolhatta az Erk foszforilációját is.
Eredményeink alapján feltételezzük, hogy a BCR-en keresztüli Erk aktiváció
szabályozásában az SHP2 és a PI3-K is szerepet játszik. SHP2 fehérjét kifejező DT40
csirke B-sejtvonal sejtjeiben az OR8-GDLDpe és az OR8-ELPNpe peptidekkel történő
60 perces előinkubálás egyaránt gátolta az anti-IgM aktivációt követő Erk foszforilációt.
Az SHP2 fehérjét nem expresszáló DT40 sejtek esetében a BCR keresztkötést követően
megmaradt OR8-ELPNpe általi Erk gátlás, míg az SHP2-re szelektív OR8-GDLDpe
nem gátolta az Erk foszforilációját. Eredményeink szerint tehát az OR8-GDLDpe
valóban az SHP2-től függő Erk aktivációt befolyásolta, míg az OR8-ELPNpe peptid
SHP2-től független módon gátolta a BCR indukált Erk foszforilációt csirke B
sejtvonalon.
Az OR8-ELPNpe foszfopeptid PI3-kinázon keresztüli szabályzó szerepét támasztják
alá a hízósejtek IgE mediált degranulációjának vizsgálatával nyert eredmények. A
részben Gab1-PI3-K függő, IgE receptor közvetített hízósejt degranuláció mértékét az
LY294002 PI3-K gátlószer a felére képes csökkenteni113. Az OR8-ELPNpe peptiddel
történő 60 perces előkezelést követően az IgE keresztkötést követően 60-70%-ra
csökkent a degranuláció mértéke. A PI3-K-hoz nem kapcsolódó OR8-GDLDpe hasonló
mértékben gátolta a degranuláció mértékét, amit úgy is értelmezhetünk, hogy az SHP2
76
SH2 doménjéhez kapcsolódó foszfopeptid katalizálja a PI3-K kötő Gab1 tirozin
motívum defoszforilációját.
A sejtmembrán-permeábils OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe foszfopeptidek a sejtbe
jutva koncentráció és időfüggő módon megváltoztatják az SHP2, ill. PI3-K függő
jelátviteli utakat, tehát befolyásolhatják a proliferációs és apoptotikus jelpályák
kimenetelét. Mivel a foszfopeptidek többféle hatása akár egy időben is érvényesülhet,
így a jelátviteli kaszkádra gyakorolt pontos hatásmechanizmusokat egyelőre nem tudjuk
megállapítani. A foszfopeptidek hatásspektrumának csökkentésével tisztázhatjuk, hogy
a sejtbe juttatva miként befolyásolják az egyes jelátviteli lépéseket, ill. miként hatnak a
fehérje-fehérje kölcsönhatásokra.
Jelen kísérleteinkben a GDLDpe szekvenciának egy rövidített formáját vizsgáljuk,
amely az SHP2 fehérjéhez még kötődik, de az enzim aktivitást fokozó hatása jóval
gyengébb a GDLDpe-nél. Emellett olyan módosított peptidek szintézisét tervezzük,
amelyek ellenállnak a metabolizáló enzimeknek és foszfatázoknak (erre irányuló
próbálkozás volt a GDLDsp tiofoszfát). A további kísérletek célja tehát a fent leírt
tulajdonságú peptidek tervezése és funkcionális vizsgálata jelátviteli folyamatokban.
Tesztelni kívánjuk továbbá a meglévő és a módosított peptidek apoptózisra és
proliferációra gyakorolt hatását egészséges és beteg emberekből izolált sejteken.
A proliferáció gátlásában, ill. az apoptózis fokozásában hatásosnak bizonyuló
foszfopeptidek alapjául szolgáltathatnak farmakológiailag aktív peptidomimetikumok
tervezésének akár B-sejtes, akár más típusú tumorok esetében.
77
6. Következtetések 1. Az oktaarginin alapú hordozó peptidek alkalmasak bioaktív peptidek élő sejtekbe
juttatására. A hordozó-foszfopeptid konstrukciók kevésbé toxikusak, de penetrációjuk
gyengébb, mint a hordozóé.
2. A peptidszekvenciák és az SH2 domének kapcsolata specifikus. Az OR8-GDLDpe
és OR8-ELPNpe az endogén SHP2, illetve PI3-K fehérjékhez kötődnek. A Gab1
adapter 627Y-t hordozó motívumot reprezentáló GDLDpe az SHP2-n kívűl a PLCγ2-
vel is kapcsolatba lép.
3. In vitro körülmények között a GDLDpe megváltoztatja az SHP2 foszfatáz
enzimaktivitását, másrészt a szintetikus peptidek alternatív enzim célpontokat is
jelentenek.
4. Az SHP2-höz kötődő OR8-GDLDpe gátolja a BCR keresztkötést követő
Gab1-SHP2 kölcsönhatás kialakulását, tehát kompetál az endogén fehérjékkel az SH2
domén kötőhelyekért.
5. Az OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidek eltérő módon változtatják meg az
intracelluláris fehérjék alap tirozin foszforilációs mintázatát BL41 sejtekben.
6. A OR8-GDLDpe és OR8-ELPNpe peptidkezelés hatására egyaránt csökken a BCR
indukált Erk foszfotiláció, míg Akt foszforilációját csak az OR8-ELPNpe gátolja.
7. A foszfopeptidek – egyenlőre nem ismert mechanizmussal – koncentráció és
időfüggő módon megváltoztatják az SHP2 és PI3-K függő jelátviteli utakat. Az SHP2-
nek szerepe lehet az Erk foszforiláció szabályozásában B limfocitákban.
78
7. Irodalomjegyzék
1 Bartholomew M. Sefton: Overview of protein phosphorilation. Current Protocols in Cell Biology 1998.Unit 14.1
2 Hunter T: Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein
phosphorylation and signaling. Cell. 1995. 80, 225-236 3 Hunter T. Protein modification: phosphorylation on tyrosine residues. Curr. Opin. Cell
Biol. 1989. 1, 1168–1181 4 Kolibaba K. S., and Druker, B. J. Protein tyrosine kinases and cancer. Biochim.
Biophys. Acta. 1997.1333, F217–248 5Schemarova .: The role of tyrosine phosphorylation in regulation of signal transduction
pathways in unicellular eukaryotes. Curr Issues Mol Biol. 2006 Jan;8(1):27-49.
6Nollau, P., and Mayer, B. J. Profiling the global tyrosine phosphorylation state by Src homology 2 domain binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. 98, 13531–13536
7Bradshaw, J. M., and Waksman, G.: Molecular recognition by SH2 domains. Adv.
Protein Chem. 2002. 61, 161–210 8Levin V.A.: Basis and importance of Src as a target in cancer. Cancer Treat Res. 2004.;
119:89-119.
9 Blume-Jensen P; Hunter T: Oncogenic kinase signalling. Nature 2001. 411:355-365
10Cantley LC, Neel BG.: New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13;96(8):4240-5
11
Bentires-Alj M, Paez JG, David FS, Keilhack H, Halmos B, Naoki K, Maris JM, Richardson A, Bardelli A, Sugarbaker DJ, Richards WG, Du J, Girard L, Minna JD, Loh ML, Fisher DE, Velculescu VE, Vogelstein B, Meyerson M, Sellers WR, Neel BG.: Activating mutations of the Noonan syndrome associated SHP2/PTPN11 gene in human solid tumors and adult acute myelogenous leukemia. Cancer Res. 2004.;64:8816-8820.
12
Kratz CP, Niemeyer CM, Castleberry RP, Cetin M, Bergsträsser E, Emanuel PD, Hasle H, Kardos G, Klein C, Kojima S, Stary J, Trebo M, Zecca M, Gelb BD, Tartaglia M, Loh ML. : The mutational spectrum of PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia and Noonan syndrome/ myeloproliferative disease. Blood. 2005.; 106:2183-2185.
13DeFranco AL.: The complexity of signaling pathways activated by the BCR. Curr
Opin. Immunol. 1997 Jun;9(3):296-308.
79
14Fuentes-Pananá EM, Monroe JG.: Ligand-dependent and -independent processes in B-
cell-receptor-mediated signaling. Springer Semin Immunopathol. 2001 Dec;23(4):333-50
15Fuentes-Pananá EM, Bannish G, Monroe JG.: Basal B-cell receptor signaling in B lymphocytes: mechanisms of regulation and role in positive selection, differentiation, and peripheral survival. Immunol Rev. 2004 Feb;197:26-40
16 Reth M.: Antigen receptor tail clue. Nature. 1989 Mar 30;338(6214):383-4. 17 Cambier JC. Antigen and Fc receptor signaling. J Immunol. 1995 Oct 1;155(7):3281-
5.
18 Reth M, Wienands J.: Initiation and processing of signals from the B cell antigen receptor. Annu Rev Immunol. 1997;15:453-79
19Law DA, Chan VW, Datta SK, DeFranco AL.: B-cell antigen receptor motifs have redundant signalling capabilities and bind the tyrosine kinases PTK72, Lyn and Fyn. Curr Biol. 1993 Oct 1;3(10):645-57.
20Hutchcroft JE, Harrison ML, Geahlen RL.: Association of the 72-kDa protein-tyrosine kinase PTK72 with the B cell antigen receptor. J Biol Chem. 1992 Apr 25;267(12):8613-9. 21Rowley RB, Burkhardt AL, Chao HG, Matsueda GR, Bolen JB.: Syk protein-tyrosine
kinase is regulated by tyrosine-phosphorylated Ig alpha/Ig beta immunoreceptor tyrosine activation motif binding and autophosphorylation. J. Biol Chem. 1995 May 12; 270(19):11590-4.
22 Fu C, Turck CW, Kurosaki T, Chan AC.:BLNK: a central linker protein in B cell activation. Immunity. 1998 Jul;9(1):93-103.
23Takata M, Kurosaki T.: A role for Bruton's tyrosine kinase in B cell antigen receptor mediated activation of phospholipase C-gamma 2. J Exp Med. 1996 Jul 1;184(1):31-40.
24 Hashimoto S, Iwamatsu A, Ishiai M, Okawa K, Yamadori T, Matsushita M, Baba Y,
Kishimoto T, Kurosaki T, Tsukada S.: Identification of the SH2 domain binding protein of Bruton's tyrosine kinase as BLNK--functional significance of Btk-SH2 domain in B-cell antigen receptor-coupled calcium signaling. Blood. 1999 Oct 1;94(7):2357-64.
25 Kurosaki T, Tsukada S.: BLNK: connecting Syk and Btk to calcium signals. Immunity. 2000 Jan;12(1):1-5. 26Bijsterbosch MK, Meade CJ, Turner GA, Klaus GG.: B lymphocyte receptors and
polyphosphoinositide degradation. Cell. 1985 Jul;41(3):999-1006.
80
27Xie H, Rothstein TL.: Protein kinase C mediates activation of nuclear cAMP response element-binding protein (CREB) in B lymphocytes stimulated through surface Ig. J Immunol. 1995 Feb 15;154(4):1717-23.
28Ravichandran KS, Lorenz U, Shoelson SE, Burakoff SJ.: Interaction of Shc with Grb2 regulates association of Grb2 with mSOS. Mol Cell Biol. 1995 Feb;15(2):593-600.
29Harmer SL, DeFranco AL.: Shc contains two Grb2 binding sites needed for efficient formation of complexes with SOS in B lymphocytes. Mol Cell Biol. 1997 Jul;17(7):4087
30Roose JP, Mollenauer M, Gupta VA, Stone J, Weiss A.: A diacylglycerol-protein kinase C- RasGRP1 pathway directs Ras activation upon antigen receptor stimulation of T cells. Mol Cell Biol. 2005 Jun;25(11):4426-41
31Tuveson DA, Carter RH, Soltoff SP, Fearon DT.: CD19 of B cells as a surrogate kinase insert region to bind phosphatidylinositol 3-kinase. Science. 1993 May 14;260(5110):986
32Pleiman CM, Hertz WM, Cambier JC.: Activation of phosphatidylinositol-3' kinase by Src- family kinase SH3 binding to the p85 subunit. Science. 1994 Mar 18;263(5153):1609-12.
33Falasca M, Logan SK, Lehto VP, Baccante G, Lemmon MA, Schlessinger J.: Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 1998 Jan 15;17(2):414-22.
34 Gliki G, Wheeler-Jones C, Zachary I.: Vascular endothelial growth factor induces protein kinase C (PKC)-dependent Akt/PKB activation and phosphatidylinositol 3'-kinase-mediates PKC delta phosphorylation: role of PKC in angiogenesis. Cell Biol Int. 2002;26(9):751-9
35 Younes H, Leleu X, Hatjiharissi E, Moreau AS, Hideshima T, Richardson P, Anderson KC, Ghobrial IM.: Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase pathway in multiple myeloma. Clin Cancer Res. 2007 Jul 1;13(13):3771-5.
36Cherukuri A, Shoham T, Sohn HW, Levy S, Brooks S, Carter R, Pierce SK.: The tetraspanin CD81 is necessary for partitioning of coligated CD19/CD21-B cell antigen receptor complexes into signaling-active lipid rafts. J Immunol. 2004 Jan 1;172(1):370-80.
37Fujimoto M, Poe JC, Jansen PJ, Sato S, Tedder TF.: CD19 amplifies B lymphocyte signal transduction by regulating Src-family protein tyrosine kinase activation. J Immunol. 1999 Jun 15;162(12):7088-94
81
38Cherukuri A, Cheng PC, Sohn HW, Pierce SK.: The CD19/CD21 complex functions
to prolong B cell antigen receptor signaling from lipid rafts Immunity. 2001 Feb;14(2):169-79
39 Coggeshall KM.: Inhibitory signaling by B cell Fc gamma RIIb. Curr Opin Immunol. 1998 Jun;10(3):306-12
40Leibson PJ.: The regulation of lymphocyte activation by inhibitory receptors. Curr Opin Immunol. 2004 Jun;16(3):328-36
41Ono M, Bolland S, Tempst P, Ravetch JV.: Role of the inositol phosphatase SHIP in negative regulation of the immune system by the receptor Fc(gamma)RIIB. Nature. 1996 Sep 19;383(6597):263-6
42Hof P, Pluskey S, Dhe-Paganon S, Eck MJ, Shoelson SE: Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 1998 Feb 20;92(4):441-50
43Barford D, Neel BG.: Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 1998 Mar 15;6(3):249-54
44Araki T, Nawa H, Neel BG.: Tyrosyl phosphorylation of Shp2 is required for normal
ERK activation in response to some, but not all, growth factors. J Biol Chem. 2003 Oct 24;278(43):41677-84.
45Qu CK.: Role of the SHP-2 tyrosine phosphatase in cytokine-induced signaling and cellular response. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 11;1592(3):297-301
46Wang Q, Downey GP, Herrera-Abreu MT, T Kapus A, McCulloch CA.: SHP-2 modulates interleukin-1-induced Ca2+ flux and ERK activation via phosphorylation of phospholipase Cgamma1. J Biol Chem. 2005 Mar 4;280(9):8397-406.
47MacGillivray M, Downey GP.: The protein tyrosine phosphatase SHP-2 regulates interleukin-1-induced ERK activation in fibroblasts. J Biol Chem. 2003 Jul 18;278(29):27190-8. Epub 2003 Apr 29
48Neel BG, Gu H, Pao L.: The 'Shp'ing news: SH2 domain-containing tyrosine phosphatases in cell signaling. Trends Biochem Sci. 2003 Jun;28(6):284-93.
49Tenev T, Keilhack H, Tomic S, Stoyanov B, Stein-Gerlach M, Lammers R, Krivtsov AV, Ullrich A, Böhmer FD.: Both SH2 domains are involved in interaction of SHP-1 with the epidermal growth factor receptor but cannot confer receptor-directed activity to SHP-1/SHP-2 chimera. J Biol Chem. 1997 Feb 28;272(9):5966-73
50Wang N, Li Z, Ding R, Frank GD, Senbonmatsu T, Landon EJ, Inagami T, Zhao ZJ:
Antagonism or synergism. Role of tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2 in growth factor signaling. J Biol Chem. 2006 Aug 4;281(31):21878-83.
82
51Feng GS.: Shp2-mediated molecular signaling in control of embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Res. 2007 Jan;17(1):37-41
52Qu CK, Nguyen S, Chen J, Feng GS: Requirement of Shp-2 tyrosine phosphatase in lymphoid and hematopoietic cell development. Blood. 2001 Feb 15;97(4):911-4
53Zhang SQ, Yang W, Kontaridis MI, Bivona TG, Wen G, Araki T, Luo J, Thompson JA, Schraven BL, Philips MR, Neel BG.: Shp2 regulates SRC family kinase activity and Ras/Erk activation by controlling Csk recruitment. Mol Cell. 2004 Feb 13;13(3):341-55.
54Yu WM, Hawley TS, Hawley RG, Qu CK.: Catalytic-dependent and -independent roles of SHP-2 tyrosine phosphatase in interleukin-3 signaling. Oncogene. 2003 Sep 4;22(38):5995-6004.
55Montagner A, Yart A, Dance M, Perret B, Salles JP, Raynal P.: A novel role for Gab1 and SHP2 in epidermal growth factor-induced Ras activation. J Biol Chem. 2005 Feb 18;280(7):5350-60.
56Tartaglia M, Niemeyer CM, Fragale A, Song X, Buechner J, Jung A, Hählen K, Hasle H, Licht JD, Gelb BD.: Somatic mutations in PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia, myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Nat Genet. 2003 Jun;34(2):148-50
57Chen J, Yu WM, Daino H, Broxmeyer HE, Druker BJ, Qu CK.: SHP-2 phosphatase is required for hematopoietic cell transformation by Bcr-Abl. Blood. 2007 Jan 15;109(2):778-85.
58Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-kinase AKT pathway in human
cancer. Nat Rev Cancer 2002;2:489-501
59Yu J, ZhangY, McIlroy, Rordorf-NikolicT, Orr GA, BackerJM. Regulation of the p85/p110 phosphatidylinositol 3-kinase: stabilization and inhibition of the p110a catalytic subunit by the p85 regulatory subunit. Mol Cell Biol 1998;18:1379^87.
60Bi L, Okabe I, Bernard DJ, Wynshaw-Boris A & Nussbaum RL.: Proliferative defect and embryonic lethality in mice homozygous for a deletion in the p110alpha subunit of phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry 1999. 274 10963–10968.
61Bi L, Okabe I, Bernard DJ & Nussbaum RL 2002 Early embryonic lethality in mice deficient in the p110beta catalytic subunit of PI 3-kinase. Mammalian Genome 13 169–172.
62 Lawlor MA, Alessi DR.: PKB/Akt: a key mediator of cell proliferation, survival and insulin responses? JCell Sci 2001;114:2903-10.
83
63Brazil DP, Park J, Hemmings BA.: PKB binding proteins. Getting in on the Akt. Cell 2002;111:293-303.
64Downward J.: PI 3-kinase, Akt and cell survival. Semin Cell Dev Biol 2004;15:177-82
65 Pene F, Claessens YE, Muller O, Viguié F, Mayeux P, Dreyfus F, Lacombe C, Bouscary D.: Role of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mTOR/P70S6-kinase pathways in the proliferation and apoptosis in multiple myeloma. Oncogene 2002;21:6587-97. 26.
66 Fresno Vara JA, Casado E, de Castro J, Cejas P, Belda-Iniesta C, Gonzalez-Baron M. PI3K/Akt signalling pathway and cancer. CancerTreat Rev 2004;30:193 - 204
67 Hemmings BA.: Akt signaling: linking membrane events to life and death decisions. Science. 1997 Jan 31;275(5300):628-30
68 Alblas J, Honing H, de Lavalette CR, Brown MH, Dijkstra CD, van den Berg TK.: Signal regulatory protein alpha ligation induces macrophage nitric oxide production through JAK/STAT- and phosphatidylinositol 3-kinase/Rac1/NAPDH oxidase/H2O2-dependent pathways. Mol Cell Biol. 2005 Aug;25(16):7181-92.
69Simeoni L, Kliche S, Lindquist J, Schraven B.: Adaptors and linkers in T and B cells.
Curr Opin Immunol. 2004 Jun;16(3):304-13.
70Veillette A.: Specialised adaptors in immune cells. Curr Opin Cell Biol. 2004 Apr;16(2):146-55.
71 Liu Y, Rohrschneider LR: The gift of Gab. FEBS Lett. 2002 Mar 27;515(1-3):1-7. Review.
72 Holgado-Madruga M, Emlet DR, Moscatello DK, Godwin AK, Wong AJ.: A Grb2-associated docking protein in EGF- and Insulin-receptor signaling. Nature 1996. 379, 560-564
73 Gu H, Pratt JC, Burakoff SJ, Neel BG.: Cloning of p97/Gab2, the major SHP2 binding protein in hematopoietic cells, reveals a novel pathway for cytokine-induced gene activation. Mol Cell. 1998. 2, 729-740
74
Wolf I, Jenkins BJ, Liu Y, Seiffert M, Custodio JM, Young P, Rohrschneider LR.: Gab3, a new Dos/Gab family member, facilitates macrophage differentiation. Mol. Cell. Biol. 2002. 22, 231-244
75Seiffert M, Custodio JM, Wolf I, Harkey M, Liu Y, Blattman JN, Greenberg PD, Rohrschneider LR.: Gab3-deficient mice exhibit normal development and hematopoiesis and are immunocompetent. Mol Cell Biol. 2003 Apr;23(7):2415-24.
84
76Nishida K, Wang L, Morii E, Park SJ, Narimatsu M, Itoh S, Yamasaki S, Fujishima M, Ishihara K, Hibi M, Kitamura Y, Hirano T.: Requirement of Gab2 for mast cell development and KitL/c-Kit signaling. Blood. 2002 Mar 1;99(5):1866-9.
77Gu H, Saito K, Klaman LD, Shen J, Fleming T, Wang Y, Pratt JC, Lin G, Lim B, Kinet JP, Neel BG.: Essential role for Gab2 in the allergic response. Nature. 2001 Jul 12;412(6843):186-90.
78Itoh M, Yoshida Y, Nishida K, Narimatsu M, Hibi M, Hirano T.: Role of Gab1 in heart, placenta, and skin development and growth factor- and cytokine-induced extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase activation. Mol Cell Biol. 2000 May;20(10):3695-704.
79Weidner KM, Di Cesare S, Sachs M, Brinkmann V, Behrens J, Birchmeier W.: Interaction between Gab1 and the c-Met receptor tyrosine kinase is responsible for epithelial morphogenesis. Nature. 1996 Nov 14;384(6605):173-6
80Lock LS, Maroun CR, Naujokas MA, Park M.: Distinct recruitment and function of Gab1 and Gab2 in Met receptor-mediated epithelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 2002 Jun;13(6):2132-46.
81Lock LS, Royal I, Naujokas MA, Park M.: Identification of an atypical Grb2 carboxyl-terminal SH3 domain binding site in Gab docking proteins reveals Grb2-dependent and -independent recruitment of Gab1 to receptor tyrosine kinases. J Biol Chem. 2000 Oct 6;275(40):31536-45.
82Nguyen L, Holgado-Madruga M, Maroun C, Fixman ED, Kamikura D, Fournier T, Charest A, Tremblay ML, Wong AJ, Park M.: Association of the multisubstrate docking protein Gab1 with the hepatocyte growth factor receptor requires a functional Grb2 binding site involving tyrosine 1356. J Biol Chem. 1997 Aug 15;272(33):20811-9.
83Ravichandran KS.: Signaling via Shc family adapter proteins. Oncogene. 2001 Oct 1;20(44):6322-30.
84Rodrigues GA, Falasca M, Zhang Z, Ong SH, Schlessinger J.: A novel positive feedback loop mediated by the docking protein Gab1 and phosphatidylinositol 3-kinase in epidermal growth factor receptor signaling. Mol Cell Biol. 2000 Feb;20(4):1448-59
85Ingham RJ, Santos L, Dang-Lawson M, Holgado-Madruga M, Dudek P, Maroun CR, Wong AJ, Matsuuchi L, Gold MR.: The Gab1 docking protein links the B cell antigen receptor to the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and to the SHP2 tyrosine phosphatase. J Biol Chem. 2001 Apr 13;276(15):12257-65.
86Gu H, Maeda H, Moon JJ, Lord JD, Yoakim M, Nelson BH, Neel BG.: New role for Shc in activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway. Mol Cell Biol. 2000 Oct;20(19):7109-20.
85
87 Takahashi-Tezuka M, Yoshida Y, Fukada T, Ohtani T, Yamanaka Y, Nishida K, Nakajima K, Hibi M, Hirano T.: Gab1 acts as an adapter molecule linking the cytokine receptor gp130 to ERK mitogen-activated protein kinase. Mol Cell Biol. 1998 Jul;18(7):4109-17.
88Nishida K, Yoshida Y, Itoh M, Fukada T, Ohtani T, Shirogane T, Atsumi T, Takahashi-Tezuka M, Ishihara K, Hibi M, Hirano T.: Gab-family adapter proteins act downstream of cytokine and growth factor receptors and T- and B-cell antigen receptors. Blood. 1999 Mar 15;93(6):1809-16.
89Podar K, Anderson KC.: Critical role for hematopoietic cell kinase (Hck)-mediated
phosphorylation of Gab1 and Gab2 docking proteins in interleukin 6-induced proliferation and survival of multiple myeloma cells. J Biol Chem. 2004 May 14;279(20):21658-65.
90 Gadina M, Sudarshan C, Visconti R, Zhou YJ, Gu H, Neel BG, O'Shea JJ.: The docking molecule Gab2 is induced by lymphocyte activation and is involved in signaling by interleukin-2 and interleukin-15 but not other common gamma chain-using cytokines. J Biol Chem. 2000 Sep 1;275(35):26959-66.
91 Gu H, Botelho RJ, Yu M, Grinstein S, Neel BG.: Critical role for scaffolding adapter Gab2 in Fc gamma R-mediated phagocytosis. J Cell Biol. 2003 Jun 23;161(6):1151-61.
92Ingham RJ, Holgado-Madruga M, Siu C, Wong AJ, Gold MR.: The Gab1 protein is a docking site for multiple proteins involved in signaling by the B cell antigen receptor.
J Biol Chem. 1998 Nov 13;273(46):30630-7.
93Yamasaki S, Nishida K, Hibi M, Sakuma M, Shiina R, Takeuchi A, Ohnishi H, Hirano T, T Saito T.: Docking protein Gab2 is phosphorylated by ZAP-70 and negatively regulates T cell receptor signaling by recruitment of inhibitory molecules. J Biol Chem. 2001 Nov 30;276(48):45175-83.
94Yu CF, Roshan B, Liu ZX, Cantley LG.: ERK regulates the hepatocyte growth factor-mediated interaction of Gab1 and the phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2001 Aug 31;276(35):32552-8.
95Yu CF, Liu ZX, Cantley LG.: ERK negatively regulates the epidermal growth factor-mediated interaction of Gab1 and the phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2002 May 31;277(22):19382-8.
96Meng S, Chen Z, Munoz-Antonia T, Wu J.: Participation of both Gab1 and Gab2 in the activation of the ERK/MAPK pathway by epidermal growth factor. Biochem J. 2005 Oct 1;391(Pt 1):143-51.
97Cunnick JM, Mei L, Doupnik CA, Wu J.: Phosphotyrosines 627 and 659 of Gab1 constitute a bisphosphoryl tyrosine-based activation motif (BTAM) conferring
86
binding and activation of SHP2. J Biol Chem. 2001 Jun 29;276(26):24380-7. Epub 2001 Apr 25
98Cunnick JM, Dorsey JF, Munoz-Antonia T, Mei L, Wu J.: Requirement of SHP2 binding to Grb2-associated binder-1 for mitogen-activated protein kinase activation in response to lysophosphatidic acid and epidermal growth factor. J Biol Chem. 2000 May 5;275(18):13842-8.
99Yamasaki S, Nishida K, Yoshida Y, Itoh M, Hibi M, Hirano T.: Gab1 is required for EGF receptor signaling and the transformation by activated ErbB2.Oncogene. 2003 Mar 13;22(10):1546-56
100Schaeper U, Gehring NH, Fuchs KP, Sachs M, Kempkes B, Birchmeier W.: Coupling
of Gab1 to c-Met, Grb2, and Shp2 mediates biological responses. J Cell Biol. 2000 Jun 26;149(7):1419-32
101Maroun CR, Naujokas MA, Holgado-Madruga M, Wong AJ, Park M.: The tyrosine phosphatase SHP-2 is required for sustained activation of extracellular signal-regulated kinase and epithelial morphogenesis downstream from the met receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol. 2000 Nov;20(22):8513-25
102Holgado-Madruga M, Wong AJ.: Role of the Grb2-associated binder 1/SHP-2 interaction in cell growth and transformation. Cancer Res. 2004 Mar 15;64(6):2007-15.
103Gu H, Neel BG.: The "Gab" in signal transduction. Trends Cell Biol. 2003 Mar;13(3): 122-30.
104Agazie YM, Hayman MJ.: Molecular mechanism for a role of SHP2 in epidermal growth factor receptor signaling. Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(21):7875-86
105Zhang SQ, Tsiaras WG, Araki T, Wen G, Minichiello L, Klein R, Neel BG.: Receptor-specific regulation of phosphatidylinositol 3'-kinase activation by the protein tyrosine phosphatase Shp2. Mol Cell Biol. 2002 Jun;22(12):4062-72.
106Liu Y, Jenkins B, Shin JL, Rohrschneider LR.: Scaffolding protein Gab2 mediates differentiation signaling downstream of Fms receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol. 2001 May;21(9):3047-56.
107Pratt JC, Igras VE, Maeda H, Baksh S, Gelfand EW, Burakoff SJ, Neel BG, Gu H.: Cutting edge: gab2 mediates an inhibitory phosphatidylinositol 3'-kinase pathway in T cell antigen receptor signaling. J Immunol. 2000 Oct 15;165(8):4158-63.
108 Holgado-Madruga M, Moscatello DK, Emlet DR, Dieterich R, Wong AJ.: Grb2-associated binder-1 mediates phosphatidylinositol 3-kinase activation and the promotion of cell survival by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Nov 11;94(23):12419-24
87
109 Mattoon DR, Lamothe B, Lax I, Schlessinger J.: The docking protein Gab1 is the primary mediator of EGF-stimulated activation of the PI-3K/Akt cell survival pathway. BMC Biol. 2004 Nov 18;2:24.
110 Astoul E, Watton S, Cantrell D.: The dynamics of protein kinase B regulation during B cell antigen receptor engagement. J Cell Biol. 1999 Jun 28;145(7):1511-20.
111 Koncz G, Tóth GK, Bökönyi G, Kéri G, Pecht I, Medgyesi D, Gergely J, Sármay G.: Co-clustering of Fcgamma and B cell receptors induces dephosphorylation of the Grb2-associated binder 1 docking protein. Eur J Biochem. 2001 Jul;268(14):3898-906.
112 Sampaio C, Raynal P.: Signal strength dictates phosphoinositide 3-kinase contribution to Ras/extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 activation via differential Gab1/Shp2 recruitment: consequences for resistance to epidermal growth factor receptor inhibition. Mol Cell Biol. 2008 Jan;28(2):587-600. Epub 2007 Nov 19.
113 Xie ZH, Ambudkar I, Siraganian RP.: The adapter molecule Gab2 regulates Fc epsilon RI-mediated signal transduction in mast cells. J Immunol. 2002 May 1;168(9):4682-91
114Foged C, Nielsen HM.: Cell-penetrating peptides for drug delivery across membrane barriers. Expert Opin Drug Deliv. 2008 Jan;5(1):105-17. Review.
115Morris MC, Deshayes S, Heitz F, Divita G.: Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol Cell. 2008 Apr;100(4):201-17. Review.
116Chitu V, Demydenko D, Tóth GK, Hegedüs Z, Monostori E.: Conditions for permeabilization of cells used for intracellular tyrosine phosphorylation studies. Biotechniques. 1999 Sep;27(3):435-7.
117Vivès E, Brodin P, Lebleu B.: A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 1997 Jun 20;272(25):16010-7.
118Derossi D, Joliot AH, Chassaing G, Prochiantz A.: The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem. 1994 Apr 8;269(14):10444-50
119Futaki S, Suzuki T, Ohashi W, Yagami T, Tanaka S, Ueda K, Sugiura Y.: Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem. 2001 Feb 23;276(8):5836-40.
120Thorén PE, Persson D, Lincoln P, Nordén B.: Membrane destabilizing properties of cell-penetrating peptides. Biophys Chem. 2005 Apr 22;114(2-3):169-79.
88
121Lindberg M, Jarvet J, Langel U, Gräslund A: Secondary structure and position of the cell-penetrating peptide transportan in SDS micelles as determined by NMR. Biochemistry. 2001 Mar 13;40(10):3141-9.
122Simeoni F, Morris MC, Heitz F, Divita G.: Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1;31(11):2717-24.
123Fischer PM, Krausz E, Lane DP.: Cellular delivery of impermeable effector molecules in the form of conjugates with peptides capable of mediating membrane translocation. Bioconjug Chem. 2001 Nov-Dec;12(6):825-41
124Tung CH, Weissleder R.: Arginine containing peptides as delivery vectors. Adv Drug Deliv Rev. 2003 Feb 10;55(2):281-94.
125Futaki S, Ohashi W, Suzuki T, Niwa M, Tanaka S, Ueda K, Harashima H, Sugiura Y. Stearylated arginine-rich peptides: a new class of transfection systems. Bioconjug Chem. 2001 Nov-Dec;12(6):1005-11.
126 Zhao Z.: Thiophosphate derivatives as inhibitors of tyrosine phosphatases. Biochem Biophys Res Commun. 1996 Jan 17;218(2):480-4.
127 Winding P, Berchtold M.: The chicken B cell line DT40: a novel tool for gene distruption experiments. J. of Imm. Methodes 2001 249, 1-16
128 Tkaczyk C, Beaven MA, Brachman SM, Metcalfe DD, Gilfillan AM.: The phospholipase C gamma 1-dependent pathway of Fc epsilon RI-mediated mast cell activation is regulated independently of phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 2003 Nov 28;278(48):48474-84.
129Pawson T, Nash P.: Protein-protein interactions define specificity in signal
transduction. 2000 Genes Dev. May 1;14(9):1027-47.
130Pawson T, Gish GD, Nash P.: SH2 domains, interaction modules and cellular wiring. Trends Cell Biol. 2001 Dec;11(12):504-11.
131Liu WQ, Vidal M, Mathé C, Périgaud C, Garbay C.: Inhibition of the ras-dependent mitogenic pathway by phosphopeptide prodrugs with antiproliferative properties. Bioorg Med Chem Lett. 2000 Apr 3;10(7):669-72.
132Nam NH, Ye G, Sun G, Parang K.: Conformationally constrained peptide analogues of pTyr-Glu-Glu-Ile as inhibitors of the Src SH2 domain binding. 2004 J Med Chem. Jun 3;47(12):3131-41.
133Nam NH, Pitts RL, Sun G, Sardari S, Tiemo A, Xie M, Yan B, Parang K.: Design of tetrapeptide ligands as inhibitors of the Src SH2 domain. 2004 Bioorg Med Chem. Feb 15;12(4):779-87.
89
134Nishida K, Hirano T.: The role of Gab family scaffolding adapter proteins in the signal transduction of cytokine and growth factor receptors. Cancer Sci. 2003 Dec;94(12):1029-33. Review.
135Gual P, Giordano S, Williams TA, Rocchi S, Van Obberghen E, Comoglio PM.: Sustained recruitment of phospholipase C-gamma to Gab1 is required for HGF-induced branching tubulogenesis. Oncogene. 2000 Mar 16;19(12):1509-18.
136Li W, Nishimura R, Kashishian A, Batzer AG, Kim WJ, Cooper JA, Schlessinger J.: A new function for a phosphotyrosine phosphatase: linking GRB2-Sos to a receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol. 1994 Jan;14(1):509-17.
90
Köszönetnyilvánítás
Mindenekelőtt témavezetőmnek, Prof. Sármay Gabriellának szeretném kifejezni
hálámat a sok éves törődésért, szakmai segítségért és türelméért.
Köszönettel tartozom a SOTE KKK doktori iskolának, hogy a Pathobiokémia doktori
program keretein belül lehetőséget kaptam a Ph.D fokozat megszerzésére.
Köszönöm Prof. Erdei Annának, hogy lehetőséget biztosított az ELTE Immunológia
Tanszéken a doktori munkám elvégzéséhez.
Köszönettel tartozom Prof. Tóth K. Gábornak és Váradi Györgyinek a peptidek
szintézisében vállat munkájukért, és Prof. Haihua Gu-nak aki a DT40 sejtvonalat és az
SHP2 vektort biztosította számunkra.
Köszönöm Péterfy Hajnának a hízósejt degranulációs tesztekben nyújtott segítségét.
Külön hálával tartozom labortársaimnak, Koncz Gábornak, Medgyesi Dávidnak, Maus
Máténak, Angyal Adriennek, Barad Zsuzsának, Hérincs Zoltánnak, Mikesy Árpádnak
és a többieknek, akik a szakmai segítségen túl emberileg is sokat nyújtottak számomra
az elmúlt években.
Köszönöm továbbá az Immunológia Tanszék összes munkatársának a segítséget és a
felejthetetlen hangulatot.
91
Saját közlemények jegyzéke
Sármay G, Angyal A, Kertész A, Maus M, Medgyesi D.: The multiple function of Grb2
associated binder (Gab) adaptor/scaffolding protein in immune cell signaling.
Immunol Lett. 2006 Apr 15;104(1-2):76-82.
Kertesz A, Takacs B, Varadi G, Toth GK, Sarmay G.: Design and functional activity of
phosphopeptides with potential immunomodulating capacity, based on the sequence of
Grb2-associated binder 1. Ann N Y Acad Sci. 2006;1091:437-44.
Kertész A, Váradi G, Tóth GK, Fajka-Boja R, Monostori E, Sármay G.: Optimization of
the cellular import of functionally active SH2-domain-interacting phosphopeptides.
Cell Mol Life Sci. 2006;63(22):2682-93.
Györgyi Váradi, Dávid Medgyesi, Ákos Kertész, Gabriella Sármay, Gábor K. Tóth.:
Synthesis of cell-permeable fluorescent lipo-phosphopeptides. in: Peptides 2004
Proceedings of the third international and twenty-eight European Peptide Symposium
Sept 5- 10, 2004 Prague. Kenes International pp 1137-1138
Sármay Gabriella, Kertész Ákos, Angyal Adrienn, Maus Máté, Medgyesi Dávid.:
Jelátvitel és Immungenomika: új eredmények az immunsejtek jelátviteli folyamatainak
vizsgálatában. Magyar Tudomány 2005/6, 671-682.
Sarmay, G; Kertesz, A; Takacs, B; et al.: The role of Grb2 associated binder 1 (Gab1)
scaffolding adaptor protein on signal transduction in human B cells.
FEBS JOURNAL, 272: 323-324 Suppl. 1 JUL 2005
92