Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Scholtz BeátaMolekuláris Terápiák – 2. előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

1.1 DEFINÍCIÓK

1.2 A BETEGSÉGEKRŐL

1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI1.3.1 A génexpresszió szabályozásának alapesetei1.3.2 Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért1.3.3 Genetikai aberrációk és betegségek1.3.4 Genom microarray-k

1.3.4.1. Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH)

A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány fejlődéséhez.

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 2.

4

Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért

• Ki tartozik a magasabb kockázatú csoportba (Prognózis)

• Kinél várható jó (vagy gyenge) terápiás válasz

• Alternatívák a kemorezisztens rákok kezelésére

• Létező és új gyógyszerek hatékonyabb alkalmazása

• Gyógyszerek egyedi kombinációinak kidolgozása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

5

Herceptin: a páciensek kiválasztásának fontossága

Összes emlőtumorospáciens

Her2+ emlőtumorospáciensek

Herceptin

10% válasz

Herceptin

35-50% válasz

Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007

Alkalmazható-e ugyanez az általános kemoterápiáskezeléseknél is?

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

6

Előrehaladott stádiumú petefészekrákJelenlegi protokoll

Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007

Műtét

70% teljes válasz30% részleges válasz

Primer kemoterápiaPlatina/taxán

Kiújuló betegség

Másodlagos kemoterápia10-20% válasz80-90% nincs válasz

Inaktív ágensek - szükségtelen toxicitásSok pácienst kezelnek eredmény nélkül

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

7

14 sejtvonal

több mint 50 gén

NCI-60 sejtvonal panel

rezisztens és érzékeny sejtvonalak azonosításaexpressziós prediktor a válasz előrejelzésére

- Kemoterápiás válasz adatai - Affymetrix expressziós adatok

Kemoterápiás válaszprediktív profil

rezisztens érzékeny

Kemorezisztens tumorok kezelésének újabb lehetőségei

Holly Dressman, IGSP, Genomes 101 2007

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

8Potti et al. Nat Med 2006

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

9

Expressziós mintázategyéb kemoterápiáságensekre -ugyanaz az alapelv

Potti et al. Nat Med 2006

Génlista NCI-60 sejtekre

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

10

Páciensadatok (petefészekrák)Már meglévő génexpressziós adatok a GEO adatbázisból

Valószínűségi szám, Potti et al. által hozzárendelveKemoterápiás válasz adata ua. kísérletből

Potti et al. Nat Med 2006

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

11

Korreláció onkogénszignál útvonalakaktivációja éskemorezisztenciákközött:

Kombinációs terápiaaz útvonalakatcélzó gyógyszerekkel?

src: SU6656PI3K: LY-294002

Potti et al. Nat Med 2006

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

12

• A sejtbéli információ alapvető tárhelye

• Ugyanazok a DNS aberrációk ismétlődnek a tumorokban - nem hagyható figyelmen kívül!

• Bizonyos fajta DNS aberrációkra nagyon hatékony, általános vizsgálómódszerek léteznek

• A DNS meglehetősen stabil, és sokféleképpen kezelt mintákban is analizálható, pl. kórházi laborokból

származó archív szövetmintákban.

Miért tanulmányozzuk a tumorok DNS-ét?TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

13

Pontmutáció - egy vagy néhány bázis megváltozása - megváltozik a protein vagy azexpressziós szintje

Gén egyik kópiája elvész - expressziós szint csökkenése (tumorszuppresszor elvesztése)

Extra génkópia - expressziós szint nő

(onkogén aktiváció) Génpromoter metilációja/demetilációja - expressziós szint csökken/nő

(tumorszuppresszor elvesztése/ onkogén aktiváció)

A DNS törése és a végek aberráns újracsatlakozása új géneket eredményezhet.

Sokféle genetikai aberráció okozhat fejlődési rendellenességet vagy betegséget

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

14

Genetikai aberrációk térképezése

Aberráció térképezése

Pozíció finomítása Gén azonosítása

Prognózis, diagnózis, progresszió, stádiumok,terápia választás genetikai háttere

Valószínűsíthető gén/útvonalteljes biológiai analízise

Génspecifikusterápia

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

15

Genom microarray-k

Definíció: Olyan microarray technológia, mely a kromoszóma aberrációkat detektálja

Felhasználás: Klinikai laboratórium: fluroeszcens in situ hibridizációval (FISH)komplementer technológia Kutatólaboratórium: azonosíthatja a betegségek genetikai hátterét

Jelentőség: Sok betegséget mikrodeléciók és olyan egyéb kromoszómaaberrációk okozhatnak, melyeket a FISH technika nem detektál.SNP array-k még jobb felbontást biztosítanak, és a genotípusról és kópiaszámról is adnak információt.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

16

Sokféle microarray, különböző célkitűzésekhezTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

17

Array összehasonlító genom hibridizáció(comparative genomic hybridization, CGH)

Microarray alapú összehasonlító genom hibridizációNem az RNS, hanem a DNS mennyiségét mériKét mintát hasonlít össze:

Teszt mintaReferencia minta

Nagy felbontás1-3 Mb (teljes genom array CGH), vagy 10-25 kb (oligó

aCGH) vs 5-10 Mb (kariotipizálás)Időigény : 3-4 nap (array CGH) vs 2-4 hét (kariotipizálás)

Egyszerű DNS preparálás az aCGH-hoz, szemben a metafázisos kromoszómák analízisével

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

18

Array CGH

Tumorokban előforduló genetikai átrendeződések detektálása (tumorgenom és normál genom összehasonlítása)

Genom kópiaszám variációk analíziseszegregálódó variánsok léteznek a populációbanBizonyos patogén variánsok betegségekkel asszociálódnak

Beteg és egészséges egyének genomjának összehasonlítása

Genetikai markerekkel kapcsolt, ismert próbák használata a betegségek jobb megértésehez vezethet

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

19

Array CGH: azonosítja a DNS kópiaszám változásokat, és pozíciójukat a genomban

pozíció a szekvenciában

Ará

ny

Teszt genom DNS Referencia genom DNS

Extra DNS kópiák a tumorban

DNS vesztés a tumorban

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

20

Egy tumorgenom array CGH analízise

Extra Vesztett

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

21

• Olyan génexpressziós változások szelekciója, melyek a tumorkialakulásának kedveznek. Bizonyos genetikai aberrációk együttesénekmegtartása szelektív előnyt jelent.

• A genetikaiminstabilitás többféle mechanizmus révén indukál változásokat a genomban. (Iniciáló onkogén események egérmodellekbenés metotrexát rezisztencia MMR deficiens és proficiens sejtvonalakban)

A tumorok kópiaszám profilja két folyamatot tükrözTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

22

• Az eredmények alapján jobb tesztek alakíthatók ki, melyek az onkogénekés tumor szuppresszor gének kópiaszámát detektálják

• Tumorprogresszió monitorozása, korai és metasztatikus léziókmegkülönböztetése FISH próbákkal, melyek a több tumortípusbanmegfigyelhető kópiaszámváltozások régióit detektálják.

• További kópiaszám markerek azonosítása, melyek tumor predikcióra alkalmasak

• A tumorok kialakulásában közreműködő gének azonosítása és analízisesegíthet olyan új gyógyszerek tervezésében, melyek a diszfunkcionálisgéneket/útvonalakat veszik célba, és/vagy nem okoznak terápia rezisztenciát.

aCGH hasznosítása a rákkutatásbanTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

23

Elváltozások egy tumorsejtvonal genomban:Kromoszomális és microarray alapú CGH megfeleltetése

Amplifikációk: aktivált onkogénekDeléciók: Inaktivált gének (tumorszuppresszorok)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

24

A SNP array-k ereje: „loss-of-heterozygosity” detektálása, kópiaszám változás hiányában is

Tan DSP et al. Laboratory Investigation 2007. 87:737

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

25

SNP adatbázisok

dbSNP az NCBI honlaponhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP

Humán SNP adatbázis (Whitehead Institute)http://www.broad.mit.edu/tools/data/genvar.html

A SNP Konzorcium (TSC)http://snp.cshl.org

J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

26

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

27

Új terápiás célpontokazonosítása:a „felülről lefelé”módszer

Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

28

Tan DSP et al. Pathobiology 2008. 75:63

Új terápiás célpontokazonosítása:a „lentről felfelé”módszer

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

29

Myeloma multiplex aCGH analízise

Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313

55 MM sejtvonal, 73 páciens minta

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

30

nem-hiperdiploid: k3,k4

hiperdiploid: k1, k2

Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313

Konklúzió:

ch11 extra : jobb prognózisch1q extra: rosszabbch13 vesztés: rosszabb

Myeloma multiplex aCGH analízise:prognosztikus besorolás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

31

Myeloma multiplex kombinált génexpressziós és aCGH analízise

Carrasco DR et al. Cancer Cell 2006. 9:313

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

32

Laphámsejtes tüdőrák aCGH analízise

Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372PIK3CA3q26.2-q27.3

A: Összes minta

B: Magas kópiaszám változások

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

33

Laphámsejtes tüdőrák aCGH analízise:PIK3CA expressziós szintek és amplifikáció korrelációja

Boelens MC et al. Lung Cancer 2009. 66:372

Új terápiás célpont?

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

34

A PIK3/Akt/mTOR szignál transzdukciós útvonalTÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011

35

Klinikai kipróbáláson levő PI3K inhibitorok jellemzői

Ihle N T , Powis G Mol Cancer Ther 2009;8:1-9

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-011