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FUNDACIÓN PÉREZ-GUERRERO PARA LA COOPERACIÓN ECONÓMICA Y TÉCNICA ENTRE LOS
PAÍSES EN DESARROLLO, MIEMBROS DEL GRUPO DE 77
Informe técnico proyecto: “Aislamiento de Actinomicetos de Cuba, búsqueda de nuevos
agentes antibióticos y antiparasitarios”
Responsable: Dr. Eduardo Rodriguez
Institución responsable: Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET),
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina
Fecha: 10/10/2014
Introducción
Dentro de las estrategias actuales de búsqueda de nuevos productos naturales, por ejemplo
antibióticos, la adopción de metodologías mejoradas para el aislamiento de Actinomycetes
raros o menos conocidos es un requisito para evitar el re-aislamiento de cepas que producen
metabolitos bioactivos ya conocidos (Berdy, 2005). Esta hipótesis de trabajo fue dirigida a la
exploración de una gran variedad de lugares inhóspitos, incluyendo nichos específicos de Cuba
como ser medioambientes marinos y en asociación con plantas como huésped con
características únicas. Las nuevas cepas aisladas fueron usadas con el fin de identificar nuevos
estructuras químicas activas contra bacterias y parásitos de interés médico.
Resultados
En base a lo expuesto nosotros hemos aislado más de 200 Actinomicetes asociados a la
rizósfera, endófitos de plantas, líquenes y bacterias endolíticas así como sedimentos marinos e
invertebrados, algunas de las cuales mostraron al menos propiedades inhibidoras contra algún
agente etiológico. El proceso de caracterización incluyó el análisis fenotípico y genotípico de
las cepas aisladas como así también la producción y caracterización de metabolitos bioactivos
contra las distintas cepas Gram positivas, Gram negativas, hongos y parásitos.
Los distintos Actinomycetes fueron reconocidos mediante el crecimiento en forma de hifas
filamentosas (crecimiento típico de este grupo bacteriano) y la formación colonias adheridas a
la superficie del agar. Las colonias seleccionadas fueron mantenidas a 4°C sobre superficies de
medios solidos para una posterior caracterizacion e identificacion. A su véz, se prepararon
suspenciones de esporas (otra caracteristica típica de este grupo bacteriano) en 20 % glicerol
para su almacenamiento a -80°C (Kiesere et al., 2000).
Algunos ejemplos de las cepas aisladas de Cuba e identificadas como Actinomycetes se
muestran en la Figura 1. Se puede observar el aspecto de colonias secas y la producción de
pigmentos característicos de los metabolitos secundarios como así también la formación de
esporas típico de este grupo bacteriano. Estos ensayos se realizaron en distintos medios de
cultivos ya que tanto la formación de esporas como la posibilidad de producción de
metabolitos secundarios suele ser dependiente de las condiciones de crecimiento como el
medio de cultivo, la fuente de carbono, el pH, la temperatura, etc (Chater, 1984; Bibb, 1996).
Los medios de cultivos sólidos empleados fueron los siguientes: SFM (harina de soja-manitol),
ISP2 (peptona-extracto de levadura-glucosa) y SCA (almidón-caseína). Para el análisis de
producción de metabolitos también se empleó medios líquidos como R5 y F1 (Kieser et al.,
2000).
Fig. 1. Actinomycetes aislados de Cuba.
Tabla 1. Elección de diferentes medios para producir esporas y metabolitos secundarios.
Cepa Crecimiento y Esporulación (por refracción al microscopio)
A2 SCA>SFM
A3 SCA
B1 SFM>SCA
B12 SFM>SCA
B13 SFM>ISP2>SCA
J4 SFM>SCA
J11 SFM>SCA
SM1 SFM=SCA>ISP2
SM2 SFM>ISP2>SCA
SM3 SFM=SCA>ISP2
A partir de estas cepas aisladas se analizó el perfil de actividades antimicrobianas contra un
panel de cepas de referencia incluyendo Mycobacterium smegmatis, Staphylococcus aureus,
Micrococcus luteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans mediante
ensayos de inhibición en medios sólido Mueller Hinton. Estos ensayos se realizaron mediante
distintas técnicas como ser por estría en cruza, por transferencia del agar o medio de cultivo
líquido donde creció el Actinomycete a una placa de Petri conteniendo la cepa testigo. La
Figura 2 muestra fotos de los ensayos de inhibición donde se puede apreciar claramente los
halos de inhibición por la presencia de metabolitos producidos por los Actinomycetes.
Fig. 2. Ensayos de inhibición contra M. smegmatis y M. luteus mediante el agregado de trozo
de agar o sobrenadante de cultivo conteniendo los metabolitos secundarios producidos por los
Actinomycetes.
Las actividades antibióticas encontradas a partir de las cepas aisladas se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividad antimicrobiana de las cepas de Actinomycetes de origen cubano.
Cepa
Microorganismo testigo
E. coli P. aeruginosa S. aureus C. albicans M. luteus M. smegmatis
A2 - - - + - -
A3 - - + - +
B1 + - + + + +
B12 + - + - + +
B13 + - + + + +
B42 - - - - - +
B47 + + + - + +
B63 - - + - + -
B64 - - - - - +
C19 - - + - + +
C21 - - + - + -
C22 - - - - - +
C27 + - - - - +
C28 - - + - + +
FB1 + + – – + +
FB2 + - + – + –
FB3 + - - – + –
FB4 + - - – - –
FB5 + - - – + –
FB6 + - - – - –
FB7 + - + – + +
FB8 + + - – + +
FB9 + - - - - -
FB10 + - - – + +
FB11 + - - - - -
FB12 + + - - - -
FB13 - - + - - +
FB14 + - + + + +
FB15 + - + + - +
FB16 - - - + - +
FB17 - + - – + –
FB18 + – - – - +
J4 - - + + + -
J11 + - + + + +
RL12 - - + - + +
SM1 + - + - - -
SM2 + - + - + -
SM3 + - + + + -
SD8 - - + - + -
V9 + - + - + +
Z15 - - - - + +
Nota: +, inhibición; -, no se detectó inhibición.
En base a los datos de la Tabla 2 se puede deducir que existen una diversidad de metabolitos
secundarios con actividad inhibitoria contra uno a más agente etiológico. En base a estos
resultados se seleccionaron algunas cepas de interés para un estudio más profundo como se
detalla a continuación. Una de las características que suelen presentar las cepas productoras
de antibiótico es la de autoresistencia frente al antibiótico o familia de antibiótico que ella
produce. En base a esto, se estudió la resistencia de estas cepas frente a antibióticos de
distinta clase para ver si las mismas presentaban algún mecanismo de resistencia que podría
indicar la familia de compuesto por ellas producen (Tabla 3).
Tabla 3. Resistencia frente a diferentes antibióticos (Medio Agar SFM).
Cepa Antibiótico (µg/ml)
Apr
50
Cn
50
Tet
50
Amp
50
Lin
50
Tio
10
Eri
50
Pur
50
Nal
50
Str
50
A2 - - - + - + - - + -
A3 - - - - - - - - - -
B42 - + - + + + + - + -
B63 - - - - - + - - + -
C19 - + - + - + - + + -
C21 - - - + - + + - + -
C22 - + - + + + - + + +
C28 - - + + - + - - + -
J4 - - + + - + - - + -
SD8 - - - + - + - - + -
Nota: Apr (apramicina); Cn (cloranfenicol); Tet (teraciclina); Amp (ampicilina); Lin
(lincosamina); Tio (tioestreptona); Eri (ereitromicina); Pur (puronmicina); Nal (ácido nalidíxico);
Str (streptomicina); +, crecimiento; -, no se detectó crecimiento.
Estos resultados indicarían que la mayoría de las cepas son resistentes a antibióticos conocidos
posiblemente por presentar auto-resistencia a los compuestos ya conocidos que ellas
producen como era de esperar.
Por otro lado, se realizaron caracterizaciones genéticas de las cepas de interés. A partir del
aislamiento del ADN genómico se realizaron amplificaciones mediante la técnica de PCR de
fragmentos correspondientes al rRNA ribosomal 16S usando primers descriptos en la literatura
(Stach et al., 2003):
SC-Act-235aS20 5’-CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG SC-Act-878aA19 5’-CCG TAC TCC CCA GGC GGG G
La Figura 3 muestra un gel de agarosa donde se separan los distintos amplicones amplificados
mediante la técnica de PCR a partir de los ADN genómicos de las cepas de interés.
Fig. 3. Amplicones del rRNA 16S.
La secuenciación y análisis bioinformáticos de dichos fragmentos mostró que la mayoría de
estas cepas pertenece al género Streptomyces y posiblemente produzcan compuestos ya
conocido como se detalla a continuación:
A2: 100 % idéntico con Actinomycetales y Streptomyces (S. caeruleus, S. mobaraensis, S.
lusitanus, S. hygroscopicus, S. verticillus)
A3: 99 % idéntico con Streptomyces (S. aureus, S. seoulensis, S. pulveraceus, S. kunmingensis,
S. drozdowiczii, S. phaeochromogenes)
B1: 99 % idéntico con Streptomyces (S. globisporus, S. griseus, S. cavourensis, S.
griseobrunneus, S. lohii, S. olivochromogenes, S. californicus)
B12: 100 % idéntico con Streptomyces (S. setonensis, S. lavendulocolor, S. roseolilacinus, S.
lilaceus, S. aurantiacogriseus)
Mar
cad
or
A2
A3
B1
B1
2
B1
3
J4
J11
SM1
SM2
SM3
640 pb
B13: 100 % idéntico con Streptomyces (S. roseocinereus, S. ramulosus, S. griseocarneus, S.
septatus, S. catenulae, S. fasiculatus, S. misakiensis)
CCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGAATGTCGCCCACAC
CTAGTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCC
TCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACC
GCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTT
AAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACA
ACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCG
TCACTCTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCT
GCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCA
GTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACC
AACAAGCTGATAGGCCGCA (secuencia completa del fragmento correspondiente de la cepa B13
donde se subrayan los primer usados en la amplificación por PCR).
J4: 99 % idéntico con Streptomyces (S. cinnamocastaneus, S. ambofaciens, S. mutabilis, S.
fradiae, S. coeruleorubidus, S. coeruleorubidus, S. finlayi, S. eurocidicus)
J11: 99 % idéntico con Streptomyces (S. flaveus, S. griseus, S. erumpens, S. ornatus, S.
sporovirgulis, S. lavendulae, S. microflavus, S. flavolimosus, S. anulatus, S. flavofuscus)
SM1: 100 % idéntico con Streptomyces (S. rochei, S. avidinii, S. heteromorphus, S. flaveolus, S.
minutiscleroticus, S. olivoverticillatus, S. geysiriensis, S. enissocaesilis, S. glomeratus)
SM3: 100 % idéntico con Streptomyces (S. lusitanus, S. herbaricolor, S. aurantiacus, S.
galilaeus)
Este análisis permitió una posible identificación de los compuestos que las cepas aisladas
podrían estar produciendo. En base a los resultados genómicos y de la Tabla 2 se decidió en
primera instancia profundizar los estudios a partir de algunas de las cepas que eran capaz de
inhibir la mayoría de los microorganismos testigos utilizados: B12 y B13. A partir de estas cepas
se estudió de reversión de la inhibición con cepas testigo E. coli o S. aureus conteniendo
marcadores de resistencia de antibióticos conocidos. La Tabla 4 muestra los resultados
obtenidos con un par de las cepas estudiadas.
Tabla 4. Actividad del extracto crudo de la cepas B12 y B13 frente a S. aureus y E. coli.
Extracto Halo de Inhibición (mm)
Staphylococcus aureus Escherichia coli
ATCC 25923 ATCC 43300 X684* 424** DH5α Erir Str
r Tet
r
B12 20 21 13 25 29 28 27 22
B13 25 26 28 28
Nota: * Resistente a meticilina; ** Resistente a Oxacilina, Ciprofloxacino, Gentamicina, r (resistente).
Por otro lado se caracterizó la producción de metabolitos por parte de estas cepas en distintas
condiciones de crecimiento. Para esto se estudió la producción de metabolitos secundarios por
algunas de las cepas en diferentes medios sólidos (Tabla 5) y líquidos (Tabla 6) comúnmente
usado para cepas de Streptomyces.
Tabla 5. Actividad de las cepas de Actinomycetes crecidas en medio sólidos
Organismo Halo de Inhibición (mm)
B1 B12 B13 J11
SCA ISP2 SFM SCA ISP2 SCA ISP2 SFM SCA SFM
M. smegmatis 9 13 17 7 12 7 9 9 10 19
Tabla 6. Actividad de las cepas de Actinomycetes crecidas en medio líquido
Organismo
de
Ensayo
Halo de Inhibición (mm)
B1 B13 J11
R5 F1 R5 F1 R5 F1
M. smegmatis 0 0 12 9 0 0
Estos resultados evidencian la diferencia en producción de antibiótico bajo diferentes
condiciones de crecimiento y fuente de carbono (Bibb, 1996). A partir de estos estudios se
eligió una de las condiciones ensayadas para realizar un escalado del proceso con el fin de
purificar el compuesto de interés de una de las cepas seleccionadas. Por otro lado se realizaron
pruebas preliminares que permitieron identificar distintas condiciones de extracción con
solventes orgánicos de los compuestos producidos por las cepas seleccionadas (Tabla 7).
A partir de estos resultados se decidió seguir trabajando con la cepa B13 creciéndola en escala
de 1 litro en medio R5 por una semana a 30°C con agitación. Se descartó utilizar la cepa B12 ya
que el compuesto no podía ser extraído con solventes orgánico y esto dificulta en mayor
medida su purificación. Para la extracción del cultivo de la cepa B13 se decidió utilizar acetato
de etilo a pH neutro. Se mezcló la fase orgánica con el medio de cultivo por una hora con
agitación, se separaron las fases, se tomó la fase orgánica y se evaporó por vacío. El extracto se
analizó por cromatografía en capa delgada (TLC) utilizando distintas tinciones (Figura 4). Una
de las tiras de la TLC se colocó en el fondo de una placa de Petri y se llenó con medio Mueller
Hinton conteniendo la cepa testigo M. smegmatis. Esto permitió identificar el compuesto con
el principio activo por comparación con las TLC reveladas con los otros reactivos.
Tabla 7. Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de los extractos de las cepas B12 y
B13 frente a M. smegmatis.
Extracto
Halo de Inhibición (mm)
30 Min.
100 °C
pH=3
H2O
pH=3
AcEt
pH=9.5
H2O
pH=9.5
AcEt H2O AcEt
B12 11 13 0 0 0 13 0
B13 23 12 18 11 0 12 14
Nota: AcEt, acetato de etilo.
Fig. 4. Cromatografía en capa delgada del extracto concentrado de la cepa B13 revelado por
bioactividad (M. smegmatis), p-anisaldehido, rodamina B y sulfato de cobre fosfórico.
Luego se realizaron una serie de pasos en columnas de sílica lo que permitió purificar e
identificar mediante NMR el compuesto producido por la cepa B13 como albociclina (Figura 5).
La identificación de este compuesto fue realizada por comparación con los compuestos
producidos por las cepas identificadas mediante los estudios genéticos con ayuda de
búsqueda bibliográfica. De esta manera se encontró que la cepa S. roseocinereus, que
Compuesto bioactivo
mostraba 100% identidad con el fragmento amplificado de la cepa B13, es una productora
natural de albociclina (Furumai et al., 1968). Dicho sea de paso esta búsqueda nos permitió
discontinuar con esta línea de investigación ya que se trataba de un compuesto conocido y sin
mucho interés actual sobre el mismo.
O
O
HO
MeO
13
2
3
4
5
6
7
8
9
12
Fig. 5. Estructura química de la albociclina
Se realizaron varios intentos más para la purificación de otros productos producidos por otras
de las cepas sin éxito por distintos motivos técnicos. Alguno de estos análisis mediante
cromatografía líquida de alta presión acoplada un detector de masa (HPLC-MS) se ven en la
Figura 6.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min]0
1
2
3
4
6x10
Intens.
FB37_1-C,5_01_839.d: TIC +All MS FB37_1-C,5_01_839.d: Solvent B
0 2 4 6 8 10 Time [min]0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
6x10
Intens.
16_1-A,1_01_2909.d: TIC +All MS 16_1-A,1_01_2913.d: TIC -All MS
Fig. 6. Análisis por HPLC-MS de extractos de las cepas productoras
Por otro lado el interés de otro grupo de nuestro laboratorio se centra principalmente en el
estudio de inhibidores de Mycobacterias. Es por esto que otra estrategia llevada adelante en
este proyecto fue la de buscar cepas que inhiban selectivamente a M. smegmatis y no al resto
de las bacterias. Como puede observarse en Tabla 2 existen varias cepas que presentaban esta
característica: B42, B64, C22.Cabe destacar que estos resultados se habían obtenido cuando
las cepas aisladas habían sido crecidas en medio sólido de harina de soja y manitol. El análsisi
de los extractos de estas cepas arrojó un resultado que mostraba perfiles similares entre las
distintas cepas. Ya que las mismas habians sido aisladas de regiones diferentes se llevó a cabo
un control realizando la extracción con solventes del medio de cultivo sin que haya crecido
ninguna de las cepas. Lo llamativo de este caso fue que se encontró que el principio activo
estaba presente en la harina de soja. EL análisis por HPLC-MS y la búsqueda bibliográfica sobre
el tema en estudio arrojó que los flavonoides presente en la harina de soja presentan actividad
inhibitoria contra Mycobacterium (Alistair et al., 2007). La figura 7 muestra los resultados
obtenidos a partir del medio SFM. En base a esto se descartó el uso de este medio para futuros
análisis de producción de antibióticos.
0 2 4 6 8 10 Time [min]0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
6x10
Intens.
35_1-A,2_01_2910.d: TIC +All MS 35_1-A,2_01_2914.d: TIC -All MS
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Time [min]
0
50
100
Intens.
[mAU]
35_1-D,2_01_3025.d: UV Chromatogram, 360 nm
35_1-D,2_01_3025.d: Solvent B
Fig. 7. HPLC-MS de extyratos de medio harina de soja-manitol.
Finalmente se realizaron ensayos de inhibición de Trypanosoma cruzi a partir de los extractos
de cultivos de las cepas seleccionadas. Lamentablemente los mejores extractos que
presentaban actividad antibacteriana no fueron capaces de inhibir al parásito como se muestra
en la Figura 8.
3 4 5 6 7 8 9 10 Time [min]0
1
2
3
4
5
4x10
Intens.
35_1-A,2_01_2910.d: EIC 255.1 +All MS
35_1-A,2_01_2910.d: EIC 285.1 +All MS
35_1-A,2_01_2910.d: EIC 271.0 +All MS
255.1
277.0 285.1
+MS, 6.7-6.7min #(397-401)
0
1
2
3
4
4x10
Intens.
230 240 250 260 270 280 290 300 310 m/z
255.1
270.0
277.0
285.1
307.0313.1
+MS, 6.9-7.0min #(413-418)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4x10
Intens.
230 240 250 260 270 280 290 300 310 m/z
255.1
271.1
293.0
+MS, 7.7-7.7min #(458-462)
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
230 240 250 260 270 280 290 300 310 m/z
Fig. 8. Ensayos de inhibición de T. cruzi.
Conclusiones
En este proyecto se realizaron experimentos de aislamiento de cepas y posterior
caracterización de producción de metabolitos de interés medicinal por las mismas. La mayor
problemática encontrada fue el re-aislamiento de cepas y compuestos ya conocidos. Este es un
inconveniente muy común en este campo de acción que se pensaba evitar mediante la
búsqueda en lugares inhóspitos de Cuba. Sin embargo este no el éxito de este planteo no fue
el esperado. Por otro lado, si sirvió para desarrollar las capacidades operativas y de nuevas
metodologías de la gente que participo del mismo siendo muy enriquecedor para la formación
académica de los involucrados. Además se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica intensa con
los datos genómico en mano que permitió diseñar nuevas estrategias para futuros proyectos.
Como ser, se encontró que la cepa de Streptomyces eurocidicus entre optras es productora de
2-nitroimidazole más conocido como azomicina. Interesantemente este producto es un
principio activo de la droga utilizada como antichagásica Benznidazol. El 2-nitroimidazole es
actualmente produicido por la industria química para asistir la síntesis del antichagásico.
Numerosos ejemplos de la industria farmacéutica indican una preferencia de los procesos
fermentativos por sobre la síntesis química debido a que en muchos casos permite reducir
costos de producción y establecer procesos menos agresivos para el medio ambiente. Es por
esto que como corolario del presente proyecto nos proponemos explorar la posibilidad de
0.00E+00
2.00E+07
4.00E+07
6.00E+07
8.00E+07
1.00E+08
1.20E+08
1.40E+08
1.60E+08
1.80E+08
2.00E+08
0 2 4 6 8
ControlB13B12J11C22FB15
Dias post-infección
N°
Par
ásit
os/
mL
mejorar el proceso de producción de 2-nitroimidazol mediante la implementación de un
proceso fermentativo a partir de su cepa productora o la cepa J4.
Referencias bibliográficas
- Alistair K. Brown, Athina Papaemmanouil, Veemal Bhowruth, Apoorva Bhatt, Lynn G. Dover
and Gurdyal S. Besra (2007) Flavonoid inhibitors as novel antimycobacterial agents targeting
Rv0636, a putative dehydratase enzyme involved in Mycobacterium tuberculosis fatty acid
synthase II. Microbiology. 153: 3314–3322.
- Berdy J (2005) Bioactive microbial metabolites. J Antibiot (Tokyo), 58, 1-26.
- Bibb, M. J. (1996). The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2).
Microbiology 142: 1335-1344.
- Chater, K. F. (1984) Morphological and physiological differentiation in Streptomyces. In:
Microbial Development (ed. R. Losick and L. Shapiro). Cold Spring Harbor L. 89-116.
- Furumai T, Nagahama N, Okuda T. (1968) Studies on a new antibiotic, albocycline. II.
Taxonomic studies on albocycline-producing strains. J Antibiot. Feb;21(2):85-90.
- Kieser T, Bibb M, Buttner MJ, Chater KF, and Hopwood DA (2000). Practical Streptomyces
genetics. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.
- Stach JEM, Maldonado LA, Ward AC, Goodfellow M & Bull AT (2003) New primers for the
class Actinobacteria: application to marine and terrestrial environments. Environ Microbiol 5:
828–841.