Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula
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Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?
Carlos Gilberto Almodin Carlos Gilberto Almodin
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• Sobrevida embriões camundongo -Sobrevida embriões camundongo - Whittinghan Whittinghan
19721972• Congelamento embrião humano - Congelamento embrião humano - lentolento Trouson & Mohr 1983 embriões Trouson & Mohr 1983 embriões 4/8 cels4/8 cels
Congelamento Histórico
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Estágio de transferência
Sobrevida/descongelament
o (%)
Gravidez clínica/transferência
(%)
Implantação/no. transferidos
(%)
Embriões pró-núcleo
1101/1441 (76,4) 99/235 (42,1) 170/997 (17,10)
Embriões divididos
1646/2093 (78,6) 153 /409 (37,4) 231/1516 (15,2)
Blastocistos 196/254 (77,2) 52/81 (64,2) 67/174 (38,5)
Resultados de 1995 – 2002 Veeck LL RBMOnLine 6:367-74
Congelamento lento – embriões humanosHistórico
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Criopreservação de oócitosHistórico- Importância
• Casos de comprometimento da reserva ovariana – tratamento para doenças malignas, falha ovariana prematura
• Problemas éticos relacionados à criopreservação de embriões em FIV-ET
• Síndrome de hiperestimulação ovariana
• Banco de oócitos - doação
• Aumento no sucesso dos resultados de FIV-ET – nova tentativa
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Criopreservação de oócitos:Criopreservação de oócitos:Histórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesCriopreservação de oócitos:Criopreservação de oócitos:Histórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
OócitosOócitos
• Características membrana plasmáticaCaracterísticas membrana plasmática
• Presença de grânulos corticaisPresença de grânulos corticais
• Fusos na metáfase IIFusos na metáfase IIChen et al.,2003Chen et al.,2003
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VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
Criopreservação de OócitosCriopreservação de Oócitos
• Baixo coeficiente de permeabilidadeBaixo coeficiente de permeabilidade
• Alta concentração de lipídeos Alta concentração de lipídeos cristais gelocristais gelo
• Alta sensibilidade ao congelamentoAlta sensibilidade ao congelamentoParks & Ruffing, 1992Parks & Ruffing, 1992
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VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
Oócitos - EmbriõesOócitos - Embriões
• Menor superfície/volume dificulta desidrataçãoMenor superfície/volume dificulta desidrataçãoFabbri et al.,2000Fabbri et al.,2000
• Fecundação - Fecundação - Ca livre citoplasma - PermeávelCa livre citoplasma - PermeávelGook et al., 1993Gook et al., 1993
• Melhor transito crioprotetor e água Melhor transito crioprotetor e água
• Diminuição da formação cristais de geloDiminuição da formação cristais de geloGook et al., 1993Gook et al., 1993
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VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades
Oócitos – Metáfase IIOócitos – Metáfase II
• Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e betabeta
Zhou et al., 2002Zhou et al., 2002
• Cromossomos aos pares em forma de barrilCromossomos aos pares em forma de barrilMaro et al., 1986Maro et al., 1986
• Crioprotetor – alteração dos fusos - Crioprotetor – alteração dos fusos - viabilidadeviabilidade
Chen et al., 2000Chen et al., 2000
• Vesicula germinal – menor condutividade Vesicula germinal – menor condutividade hídricahídrica
Agca et al., 1997Agca et al., 1997
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VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - NecessidadeHistórico - NecessidadeVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - NecessidadeHistórico - Necessidade
Criopreservação de oócitos Criopreservação de oócitos
• Grande velocidade de resfriamento e Grande velocidade de resfriamento e reaquecimentoreaquecimento
• Reduzido tempo de exposiçãoReduzido tempo de exposição
• Pequeno volume de crioprotetorPequeno volume de crioprotetor
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VitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucessoVitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucesso
• Capacidade de permeação CP• Concentração dos CPs• Tempo de exposição aos CPs• Volume da solução
• Impede formação cristais de gelo• Não provoca lesão osmótica ou toxica
Rall & Fahy, 1985
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Vitrificação - Vitrificação - DefiniçãoDefiniçãoVitrificação - Vitrificação - DefiniçãoDefinição
““Vitrificação é a solidificação de uma solução em Vitrificação é a solidificação de uma solução em baixa temperatura sem a formação de cristais de baixa temperatura sem a formação de cristais de
gelo”gelo”Vatja G, 2000Vatja G, 2000
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VitrificaçãoVitrificaçãoDefinição – Como ocorre Definição – Como ocorre VitrificaçãoVitrificaçãoDefinição – Como ocorre Definição – Como ocorre
O fenômeno é obtido com o aumentoextremo da viscosidade, associando
grande velocidade de resfriamento e o uso de soluções crioprotetoras que impeçam a
formação de cristais de gelo.
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Congelamento VitrificaçãoLento
Cristais de gelo ++++ / ++ -Resfriamento ++++ - / +Toxicidade ++ ++++Efeitos osmóticos ++ ++++Problemas Mecânicos +++ +
Equipamento ++++ - / ++Habilidade ++ ++Velocidade ++ ++++
Contaminação + + / ++++
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Avanço da criopreservação nos últimos 30 anos
`70`70 ‘80 ‘90 ‘80 ‘90 ‘00 ‘00
Potencial
lentolento
Décadas
vitvit
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Porque algumas pessoas preferem congelamento lento
1. Educação conservadora
2. Congelamento lento leva a bons resultados com criopreservação de embriões
3. Congelamento lento traz resultados satisfatórios na criopreservação de oócitos
3. Vitrificação não tem uma única técnica padronizada
4. Empresas não estão interessadas
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•Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)• Procedimentos simples e eficientesProcedimentos simples e eficientes• Alta (CPAs) permeação celularAlta (CPAs) permeação celular• - Solidificação sem formação de gelo- Solidificação sem formação de gelo• Sólido contém distribuição iônica normal de estado Sólido contém distribuição iônica normal de estado líquido líquido • - viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”- viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”• Nenhum equipamento $ especial é requeridoNenhum equipamento $ especial é requerido• Todo o custo é baixoTodo o custo é baixo
Vitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápidoVitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápido
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•Vitrificaçaõ: Embriões Vitrificaçaõ: Embriões HumanosHumanos
Autor Ano CPAs/ equipamento Estágio Resultados
Mukaida et al. 1998 EG, ficoll, sacarose/straw
D2-3 (4-8 c) Nascimento 1
Lane et al. 1999 EG, DMSO, ficoll, sacarose/cryolop
D6 spares Sobrevida pós descongel.
Choi et al. 2000 EG, sacarose/ EM grid D5-6 Nascimento 7
Yokota et al. 2000 EG, DMSO/straw D5 Gravidez
Yokota et al. 2001 EG, DMSO/straw D5 Nascimento
Mukaida et al 2001 EG, ficoll, sacarose/ cryoloop
D5 Nascimento
El-Danasouri et al. 2001 EG, sacarose/OPS D3 (6-8 c) Nascimento
Selman et al. 2002 EG, sacarose/OPS D1 zigoto Gravidez
Liebermann et al. 2002 EG, sacarose/ flexipet D1 zigoto Dev. Blast.
Vanderzwalmen et al. 2002 EG, ficoll, sacarose/straw
D 4-5, w/artificial redução da blastocele
Gravidez
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Vitrificação: Oócitos HumanosVitrificação: Oócitos HumanosAutor Ano CPAs/
instrumentoEstágio Resultados
Pensis et al. 1989 DMSO, PROH, sacarose/straw
MII Sobrevida pós-descongelamento
Hunter et al. 1995 DMSO, PROH, EG/straw
MII Fert., desenvolvimento
Hong et al. 1999 EG, sacarose/ EM grid
GV/MII Sobrevida, formação de blastocisto
Kuleshova et al. 1999 EG, sacarose / OPS
MII Nascimento (1)
Chung et al. 2000 EG, sacarose/ grid
GV/ MI Blast., cromossomos normais
Yoon et al 2000 EG, sacarose/ EM grid
MII Nascimento (3)
Wu et al. 2001 EG, sacarose/ EM grid
GV Gravidez bioquímica
Chen et al. 2001 EG, sacarose/ straw
MII Sobrevida, fertilização, clivagem
Yoon et al. 2002 EG, sacarose/ EM grid
MII Sobrevida, fertilização, clivagem, PR (21%) IR (6,4%), nascimento 7
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Esforços para melhorar a vitrificação
• 1985 -1997 decréscimo da toxicidade de crioprotetores
• 1996 – aumento das taxas de congelamento e resfriamento
• 1999 – busca de equipamentos apropriados
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VitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucessoVitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucesso
O aumento da velocidade de resfriamento reduziu os danos produzidos pelas gotas lipídicas
intracelulares, principalmente as contidas nas membranas e no citoesqueleto, por atravessar mais rapidamente as faixas críticas (+15°C a –
5°C) de temperatura
Dobrinski, 1996;Martino, 1996b; Isachenko, 1998; Zeron, 1999
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•Desidratação em 2 passos antes da vitrificaçãoDesidratação em 2 passos antes da vitrificação• Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.• Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 seg.seg.• Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:
Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop (mínimo volume no congelamento), Cryotip (straw puxado (mínimo volume no congelamento), Cryotip (straw puxado e fechado), Vitri-Ingáe fechado), Vitri-Ingá• Mergulhados diretamente no nitrogênio líquidoMergulhados diretamente no nitrogênio líquido• Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com decréscimo da concentração de sacarose.decréscimo da concentração de sacarose.•Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)•Solução de diluição (0,5 M de sacarose)Solução de diluição (0,5 M de sacarose)•Solução de lavagem (não sacaroseSolução de lavagem (não sacarose) )
Métodos de vitrificaçãoMétodos de vitrificação
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VitrificaçãoVitrificação
vitrificação está baseada no contato direto da solução crioprotetora com o nitrogênio líquido
VitrificaçãoVitrificação
vitrificação está baseada no contato direto da solução crioprotetora com o nitrogênio líquido
•A taxa de resfriamento calculada:14.000 a 24.000°C/minuto - Martino, 1996b; Arav, 1997
20.000°C/minuto por Vajta et al., 1997 (OPS), Mezzalira et al., 1999 (vidro), Lane et al., 1999 (cryoloop), Matsumoto et al., 2001(nylon mesh)
![Page 23: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/23.jpg)
Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Vitri-ingáVitri-ingá
2000020000
Taxa de Taxa de resfriamentoresfriamento
°C/min°C/min20002000
Velocidade de resfriamento
![Page 24: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/24.jpg)
Método de vitrificação
Volume de solução (ul)
Taxa de congelamento
(C/min)
Taxa de aquecimento
(C/min)
Straw 25.0 4460 1300
OPS 1.5 16340 13900
Cryotop/ Vitri-ingá
<0.1 22800 42100
Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005
![Page 25: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/25.jpg)
Método No. de oócitos No (%) comMorfologia
normal
No (%)clivados
Desenvolvimento
a blastocisto
Straw 152 144 (94.7) 60 (39.5) 8 (5.3)
OPS 149 143 (96.0) 71 (47.7) 11 (7.4)
Cryotop 153 148 (96.7) 91 (59.5) 35 (22.9)
Controle fresco
152 - 118 (77.6) 68 (44.7)
Desenvolvimento de oócitos bovinos depois da vitrificação
Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005
Vitri-ingá 100 86 (86.0) 32 (37,0)
JBRA 12:20-3,2008
![Page 26: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/26.jpg)
Gestação 2009
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
50,0% 50,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
39,3% 10,7% 10,7% 17,9%
FIV 56,6% 45,3% 3,8% 7,5%
ICSI 56,3% 40,6% 9,4% 6,3%
ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%
![Page 27: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/27.jpg)
Gestação 2009 < 35 anos
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
75,0% 75,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
35,3% 11,8% 0,0% 23,5%
FIV 56,2% 53,1% 0,0% 3,1%
ICSI 59,1% 50,0% 9,1% 0,0%
ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%
![Page 28: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/28.jpg)
Gestação 2010
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
20,0% 20,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
58,4% 41,7% 16,7% 0,0%
FIV 55,6% 55,6% 0,0% 0,0%
ICSI 42,9% 33,3% 4,8% 4,8%
ICSI + PESA 28,6% 28,6% 0,0% 0,0%
![Page 29: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/29.jpg)
Gestação 2010 < 35 anos
Procedimento Gravideztotal
Gravidez clínica
Gravidez química
Aborto
Descongelamento de embriões
25,0% 25,0% 0,0% 0,0%
Descongelamento de oócitos
60,0% 40,0% 20,0% 0,0%
FIV 50,0% 50,0% 0,0% 0,0%
ICSI 40,0% 30,0% 0,0% 10,0%
ICSI + PESA 40,0% 40,0% 0,0% 0,0%
![Page 30: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/30.jpg)
Preparo endometrial• Embrião
Ciclo espontaneo + sup.Lutea. Prg+Est+Bus
• Oocitos
Neovlar 15 ou mais dias
Lupron 0.15 ml nos 5 ultimos dias do neovlar
Estrofen 2 mg/3d + 4 mg/3d + 6mg/d
Prl 100 mg + Bus no 4° d / Est 6 mg (Endométrio > 7 mm / A)
Aquecimento dia seguinte
Transferencia dia 3 pós aquecimento/ICSI
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![Page 32: Fotaleza 2010 - Dr Gilberto Almodin - Slides exibidos em Aula](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022081519/5571f7e749795991698c3da3/html5/thumbnails/32.jpg)
LANÇAMENTO
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Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?
Sem duvida Sem duvida
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OBRIGADO