forme farmaceutice topice aplicate în afecţiuni cervico-vaginale
-
Upload
nguyenngoc -
Category
Documents
-
view
247 -
download
2
Transcript of forme farmaceutice topice aplicate în afecţiuni cervico-vaginale
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
„GRIGORE T. POPA“ IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
FORME FARMACEUTICE TOPICE
APLICATE ÎN AFECŢIUNI
CERVICO-VAGINALE
Rezumatul Tezei de doctorat
Doctorand
Farm. COJOCARU (PALADE)
LAURA MIHAELA
Conducător ştiinţific
PROF. DR. IULIANA POPOVICI
2014
Conform Deciziei Rectorului Universităţii de Medicină şi Farmacie
”Gr. T. Popa” Iaşi nr. 23312 din 20.10.2014 a fost numită comisia de doctorat.
PREŞEDINTE
Decan Prof.Dr. Monica Hăncianu Universitatea de Medicină şi Farmacie „ Gr. T. Popa “ Iaşi
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC
Prof. univ. dr. Iuliana Popovici
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Gr. T. Popa“Iaşi
REFERENŢI OFICIALI
Prof. univ. dr. Dumitru Lupuleasa Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila“ Bucureşti
Prof. univ. dr. Victoria Hîrjău
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila“ Bucureşti
Prof. univ. dr. Cătălina Lupuşoru Universitatea de Medicină şi Farmacie „Gr. T. Popa“Iaşi
Prezenta teză de doctorat cuprinde 190 pagini, 119 figuri şi 127 tabele.
Numerotarea figurilor, tabelelor şi cuprinsului, din cadrul rezumatului se păstrează în aceeaşi
formă ca în teză.
1
CUPRINS STADIUL CUNOAȘTERII
CAPITOLUL I
SISTEME BIOADEZIVE VAGINALE DE CEDARE A SUBSTANŢEI
ACTIVE
I.1 Generalități
I.2.Avantajele sistemelor mucobioadezive
I.3.Bioadeziune, mucoadeziune
I.3.1.Mucusul, compoziție și funcție
I.3.2.Mecanismul mucoadeziunii
I.3.3.Teoriile mucoadeziunii
I.3.4.Factori care influențează mucoadeziunea
I.4. Forme bioadezive intravaginale
I.5. Polimeri indicaţi pentru formele vaginale mucobioadezive
I.5.1.Metolose ®, Hipromeloză și Metilceluloză
I.5.2.Carbopolii, Carbomers
1
1
1
2
2
4
4
9
10
12
12
15
CAPITOLUL II
ASPECTE FIZIOPATOLOGICE SI STRUCTURALE ALE CĂII VAGINALE DE
ADMINISTRARE A FORMELOR FARMACEUTICE
II.1. Anatomia şi fiziologia vaginului
II.1.1.Mucoasa vaginală
II.1.2. Structura histologică a epiteliului vaginal
II.1.3.Vascularizaţia vaginului
II.1.4.Inervaţia vaginului
II.2. Biochimia mucoasei vaginale
II.3.Absorbţia medicamentelor pe calea intravaginală
II.4.Displaziile cervico-vaginale
II.4.1 Clasificare
II.4.2.Factori de risc în producerea displaziilor cervico-vaginale
II.4.3.Tratamentul medicamentos al displaziei cervico-vaginală
19
19
19
20
22
22
22
23
23
24
28
29
CAPITOLUL III
5- FLUOROURACIL (5-FU) SUBSTANŢA MEDICAMENTOASĂ UTILIZATĂ ÎN
STUDIU
III.1.Structură chimică
III.2. Proprietăţi fizico-chimice
III.3. Proprietăti biofarmaceutice si farmacocinetice
III.4. Mecanism de acţiune
III.5. Interactiuni
III.6.Toxicitate
III.7. Efecte secundare
III.7.1.Efectele adverse la administrare sistemică
III.7.2.Efectele adverse la administrare topică
III.8.Contraindicaţii
III.9. Cercetări privind stabilirea dozei terapeutice
III.10. Utilizăririle 5-fluorouracilului
31
31
32
32
32
36
37
37
38
38
38
38
39
CONTRIBUȚII PERSONALE
CAPITOLUL IV
MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL
VI.1. Motivația
VI.2. Scopul și obiectivele
40
40
41
2
CAPITOLUL V
FORMULAREA, PREPARAREA ȘI CARACTERIZAREA FARMACEUTICO-
TEHNOLOGICĂ A UNOR COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE CU
5- FLUOROURACIL
V.1. Materiale şi metode
V.1.1.Determinarea parametrilor de curgere şi compresibilitate a amestecurilor de
pulberi
V.1.2.Prepararea comprimatelor biomucoadezive vaginale cu cedare modificată cu 5-
FU
V.1.3. Controlul farmaceutico-tehnologic al comprimatelor bioadezive
V.1.4. Determinarea caracteristicile bioadezive ale comprimatelor
V.2. Rezultate
V.3. Discuţii
V.4. Concluzii
43
43
44
45
45
45
47
50
52
CAPITOLUL VI
OPTIMIZAREA FORMULĂRII COMPRIMATELOR BIOMUCOADEZIVE
VAGINALE CU 5 – FLUOROURACIL
VI.1. Studiul influenţei factorilor de formulare asupra proprietăţilor de curgere şi
compresibilitate a amestecurilor de pulbere
VI.1.1. Materiale şi metodă
VI.1.1.1.Planul experimental
VI.1.1.2.Matricea planului experimental
VI.1.1.3.Fitarea datelor şi validarea planului experimental
VI.1.1.4.Analiza influenţei factorilor de formulare asupra parametrilor de curgere
şi compresibilitate conform planului experimental
VI.1.2.Rezultate
VI.1.3.Discuții
VI.2. Studiul influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor
farmaceutico-tehnologice ale comprimatelor
VI.2.1. Materiale şi metodă
VI.2.1.1. Planul experimental
VI.2.1.2. Matricea planului experimental
VI.2.1.3.Fitarea datelor şi validarea planului experimental
VI.2.1.4.Analiza influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor
farmaceutico-tehnologice
VI.2.2.Rezultate
VI.2.3. Discuții
VI.3. Determinarea formulei optime de preparare
VI.3.1 Material și metodă
VI.3.1.1 Metodă
VI.3.2.Rezultate
VI.3.3.Discuții
VI.4.Concluzii
53
56
56
57
59
60
64
67
77
78
78
78
79
81
82
83
93
94
94
94
95
98
98
CAPITOLUL VII
ELABORAREA ȘI VALIDAREA UNEI NOI METODE DE DOZARE A 5-FU DIN
COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE
VII.1.Validarea metodei de determinare cantitativă a 5-FU
VII.1.1. Material și metode
VII.1.1.1.Realizarea studiului de validare
VII.1.1.2.Analiza statistică
VII.1.1.3.Studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză
VII.1.1.4.Estimarea limitelor de detecţie şi de cuantificare
99
99
99
101
101
102
102
3
VII.2. Determinarea cantitativă a 5-fu din formulările de comprimate mucobioadezive
vaginale
VII.3.Rezultate
VII.4.Discuţii
VII.5.Concluzii
102
103
109
110
CAPITOLUL VIII
EVALUAREA DISPONIBILITĂȚII IN VITRO A 5-FU DIN COMPRIMATE
BIOADEZIVE VAGINALE VIII.1.Material şi metodă
VIII.1.1.Materiale
VIII.1.2. Metode
VIII.1.3.Analiza statistică
VIII.2.Rezultate
VIII.3.Discuții
VIII.4.Concluzii
111
112
112
112
112
113
121
122
CAPITOLUL IX
ELABORAREA ȘI VALIDAREA UNEI METODEI DE DETERMINARE A 5-FU
DIN PROBE BIOLOGICE
IX.1.Material și metodă
IX.2.Realizarea studiului de validare
IX.2.1.Identificarea picurilor
IX.2.2.Studiul compatibilităţii sistemului cromatografic
IX.2.3.Studiul liniarităţii şi intervalului de liniaritate pentru 5-fluorouracil
IX.2.4.Studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză
IX.2.5.Estimarea limitelor de detecţie şi de cuantificare
IX.3.Rezultate
IX.3.Determinarea gradului de regăsire
IX.3.1.Acuratețea metodei
IX.4.Discuții
IX.5.Concluzii
123
123
125
125
125
125
125
125
126
133
134
135
136
CAPITOLUL X.
STUDII FARMACOLOGICE COMPARATIVE PRIVIND ADMINISTRAREA
ORALĂ ŞI VAGINALĂ DE 5-FLUOROURACIL
X.1. Motivaţia, scopul şi obiectivele studiului
X.2. Material şi metodă
X.2.1.Material
X.2.1.1. Selecţia comprimatelor de 5-fluorouracil
X.2.1.2. Selecţia speciei de animale
X.2.2. Condiţiile de lucru
X.2.3. Etica experimentelor şi recoltarea probelor biologice
X.2.4.Metode
X.2.4.1. Metodologia cercetării farmacologice comparativă privind administrarea
orală şi vaginală de 5-fluorouracil
X.3. Rezultate
X.4. Discuţii
X.5.Concluzii
137
137
137
137
137
138
138
138
138
138
140
160
162
CAPITOLUL XI
CERCETAREA IN VIVO A FARMACOCINETICII 5-FLUOROURACILULUI
XI.1. Material şi metodă
XI.1.1.Substanțe
XI:1.2.Animale de experiență
XI.1.3. Protocol experimental
XI.1.4. Analiza farmacocinetică a datelor
XI.1.5. Analiza statistică a datelor
X.2. Rezultate privind farmacocinetica 5-FU
XI.2.1. Rezultatele analizei vizuale a datelor experimentale și analizei globale a datelor
pentru 5-FU
XI.2.2. Analiza principalilor parametri farmacocinetici pentru 5-FU
XI.2.2.1. Analiza coordonatelor punctului maxim (Cmax şi Tmax)
163
163
163
163
163
164
165
166
166
166
168
4
XI.2.2.2. Rezultatele ariilor de sub curbă (AUC0 t, AUC0-oo, AUC extra) pentru
5-FU pe căile de administrare studiate
XI.2.2.3. Rezultatele timpului rezidual mediu (MRT) pentru 5-FU pe căile de
administrare studiate
XI.2.2.4. Rezultatele ke pentru 5-FU pe căile de administrare studiate
XI.2.2.5. Rezultatele t1/2 pentru 5-FU pe căile de administrare studiate
XI.4. Discuții
XI.5. Concluzii
170
173
174
175
175
177
CAPITOLUL XII
CONCLUZII GENERALE
178
BIBLIOGRAFIE
ANEXE
Lista lucrărilor științifice
Lucrări publicate in extenso
181
191
5
ABREVIERI ADN acid dezoxiribonucleic
ALT (ALAT) alanin aminotransferază
ARN acid ribonucleic
ARNm acid ribonucleic mesager
AST (ASAT) aspartat aminotransferaza
AUC aria de sub curbă
AUMC aria de sub curba momentelor
CAS engl: contact angle surface (Unghiul de contact cu suprafaţa )
CIN engl: cervical intraepithelial neoplasia (neoplazie cervicală intraepitelială)
CYP Cytochrome 450 P
ºC grade Celsius
DES dietilstilbestrol
DPD dihidropirimidin dehidrogenază
DMSO dimetil sulfoxid
ºF grade Fahrenheit
FdUDP fluorodeoxiuridină difosfat
FdUMP fluorodeoxiuridină monofosfat
FdUTP fluorodeoxiuridină trifosfat
FUDP fluorouridină difosfat
FUDR fluorodeoxiuridină
FUMP fluorouridină monofosfat
FUTP fluorouracil trifosfat
5-FU 5-fluoro-uracil
GP glutation peroxidază
GSH glutation redus
HIV Human Imunodeficiency Virus
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HPMC hidroxipropilmetil celuloză
HPV Human papiloma virus
Ic Indice Carr
LOQ Limit of quantification
LQD Limit of detection
MDA Malondialdehida
MRT Mean Residual Time
N Newton
PO Per os
PMN Polimorfonucleare
RH Raport Hausner
TCA Acid tricloracetic
6
MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL
Tehnologia farmaceutică a cunoscut în ultimele decenii o dezvoltare impetuoasă, iar
sfârșitul secolului XX a oferit imaginea unor succese spectaculoase în terapia
medicamentoasă, prin descoperirea de noi substanțe active, dar și a unor forme farmaceutice
moderne și eficace. Cercetarea farmaceutică abordează în prezent obiective importante ca:
dezvoltarea de noi forme farmaceutice;
cinetica cedării substanțelor active controlată și reproductibilă;
obținerea unei absorbții optime, distribuție sistemică în compartimentul vascular și pătrunderea la locul de acțiune specific;
biodisponibilitate corespunzătoare și reproductibilă;
toleranță bună locală și generală.
În acest context cercetările din teza de doctorat au fost direcționate spre un domeniu
foarte important al terapiei medicamentoase și anume medicația antineoplazică, utilizată în
tratamentul afecțiunilor cervico-vaginale, care să folosească forme farmaceutice moderne
biomucoadezive.
Cancerul de col uterin este o afecțiune malignă care afectează anual peste 500 000 de
mii de femei, având o frecvență care variază de la 0,009 % în țările dezvoltate, până la 0,087
% în țările slab dezvoltate (fig. 2) (74,75). Romania are una dintre cele mai înalte rate de
incidență a cancerului de col uterin, 20-30 cazuri noi/100 000 femei. Îngrijorator este însă
faptul ca rata mortalității prin acest tip de cancer este în continuă creștere. Conform datelor
furnizate de Organizația Mondială a Sănătății, cancerul de col uterin se află pe primul loc ca
prevalență între cancerele la femei, fiind a doua cauză de moarte între cancerele la femei. (134)
Fig. IV.1. Incidența anuală a cancerului de col uterin la nivel modial
(nr. diagnostice noi/100 000 paciente) (75)
7
Cercetările au fost axate pe 5-fluorouracil (5-FU), un chimioterapic derivat de
fluoropirimidină, un antimetabolit analog structural cu metaboliții implicați în sinteza ADN și
ARN. În prezent în terapia afecţiunilor cervico-vaginale, se utilizează forme farmaceutice
clasice cu 5-FU ca: geluri, creme, supozitoare (124,125) sau forme farmaceutice moderne
ca: lipozomi, niozomi, nanoparticule, microemulsii şi filme vaginale (126-132). Formulările
tradiționale folosite în tratamentul local, în special creme, geluri, supozitoare, nu sunt
potrivite pentru a asigura permanența pe suprafața mucoasei vaginale un timp suficient pentru
eradicarea patologiei. Pentru acest motiv și în scopul de a evita terapia orală sau sistemică cu
5-FU, ce prezintă efecte adverse (109,110), este util să se proiecteze noi forme farmaceutice
destinate administrării pe mucoasa vaginală, pentru a controla atât eliberarea cât și timpul de
remanență la locul de aplicare.
În scopul atingerii obiectivelor de lucru propuse în teza de doctorat am efectuat un
studiu complex, interdisciplinar:
farmaceutico-tehnologic, privind formularea și stabilirea tehnologiei de preparare, condiționare și depozitare;
fizico – chimic, de control a parametrilor caracteristici amestecurilor de
pulberi folosite în procesul de formulare a comprimatelor (proprietățile de
curgere și compresibilitate a pulberilor) și specifice formei farmaceutice
(caractere macroscopice,friabilitate, timp de dezagregare, rezistență
mecanică,unghi de umectare,timp de mucoadeziune ex vivo);
analitic, de elaborare și validare a unor metode analitice de dozare 5-FU din
forma farmaceutică, dar și din produse biologice;
farmacologic, în vederea evaluării avantajelor administrării topice intravaginale a 5-FU într-o nouă formulare farmaceutică (comprimate
biomucoadezive vaginale) comparativ cu administrarea pe cale orală, a unor
doze echivalente;
biofarmaceutic, în vederea determinării principalilor parametri farmacocinetici și determinarea comparativă a profilului în timp a 5-FU administrat vaginal
din noua formulare farmaceutică realizată, comparativ cu administrarea pe cale
orală.
Scopul final și noutatea cercetărilor din cadrul tezei de doctorat sunt reprezentate de
dezvoltarea unei forme farmaceutice noi și moderne, comprimate biomucoadezive vaginale
cu 5-fluorouracil, care să corespundă condițiilor de calitate impuse de normele actuale, să fie
sigură și eficace în tratamentului afecțiunilor cervico-vaginale.
8
CAPITOLUL V
FORMULAREA PREPARAREA ȘI CARACTERIZAREA FARMACEUTICO-
TEHNOLOGICĂ A UNOR COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE CU 5-
FLUOROURACIL
Pentru formularea și prepararea unor comprimate biomucoadezive cu cedare
modificată cu 5-FU am selectat patru sorturi de polimeri, încadraţi în principalele categorii de
polimeri hidrofili cu aplicare pe mucoasa vaginală: doi derivaţi celulozici, cu viscozitate
diferită, Metolose 90 SH 4000 şi Metolose 90 SH 100 000; două sorturi de poliacrilaţi, cu
grad de reticulare diferită, Carbopol 71 cu grad redus de reticulare şi Carbopol 974 cu grad
mare de reticulare.
Au fost formulate douăsprezece formule de amestecuri de pulberi folosite ulterior
pentru prepararea de comprimate bioadezive vaginale cu 100 mg 5-FU/comp.: trei formule
pe bază de C 71 notate F1, F2, F3; trei formule pe bază de C 974 notate F4, F5 şi F6; trei
formule pe bază de M 4000 notate F7, F8, F9 şi trei formule pe bază de M 100 000 notate
F10, F11 şi F12. Procentul polimerului formator de matriţă a fost variat pentru fiecare serie
de formulări în intervalul 20 şi 50 % (tabelul V.1.).
Tabelul V.1. Formulările comprimatelor biomucoadezive vaginale cu cedare modificată
cu 5-FU
Substanțe
(mg%)
Formula (F)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C 71 60 90 150 - - - - - - - - -
C 974 - - - 60 90 150 - - - - - -
M 4000 - - - - - - 60 90 150 - - -
M 100 000 - - - - - - - - - 60 90 150
Microcelac 140 110 50 125 95 35 140 110 50 140 110 50
5 FU 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Stearat de Mg - - - 6 6 6 - - - - - -
Aerosil - - - 3 3 3 - - - - - -
Talc - - - 6 6 6 - - - - - -
Pulberile au fost cernute prin sistemul de site TGL 7354/TGLO 4188 (150-400 μm) şi
ulterior amestecate, la o viteză constantă, timp de 15 minute.
Comprimatele au fost preparate prin comprimarea directă a amestecului de pulberi la o maşină Korsch EK0 monopost (dimensiunea poansonului plat φ = 12 cm), la o presiune de
comprimare de 7 - 8 kN.
V.1.1.Determinarea parametrilor de curgere şi compresibilitate a amestecurilor de pulberi
s-a făcut urmărind parametrii caracteristici, timp de curgere (t), coeficient de fricţiune (tg α),
unghiul de repaus (α), raportul Hausner (RH), indicele Carr (IC)
9
V.1.3. Controlul farmaceutico-tehnologicic al comprimatelor bioadezive vaginale cu 5-FU a fost efectuat prin determinarea următoarelor caracteristici de calitate: uniformitatea masei,
grosime, diametru, friabilitate, rezistenţă mecanică, timp de dezagregare.
V.1.4. Determinarea caracteristicile bioadezive ale comprimatelor s-a făcut prin determi-
narea unghiului de contact şi evaluarea timpului de mucoadeziune ”ex vivo”.
V.2. Rezultate şi discuţii
Tabelul V.2 Parametrii de curgere şi compresibilitate a formulărilor F1 – F12.( Tabel V.1)
FORMULA PARAMETRU
t (g/s) α (º) tg α RH IC (%)
F1 0,142 29,5 0,56 1,17 14,70
F2 0,125 34 0,67 1,1 9,09
F3 0,115 32 0,62 1,93 48,38
F4 →∞ 46,4 1,05 1,65 39,70
F5 →∞ 47,8 1,10 1,61 38,23
F6 →∞ 50,2 1,20 1,71 41,66
F7 1 25,2 0,47 1,32 23,94
F8 1,25 34,7 0,69 1,32 23,94
F9 1,35 36,2 0,73 1,39 28,16
F10 0,1 30,1 0,58 1,29 22,72
F11 0,1 29,7 0,57 1,32 23,52
F12 0,35 34,6 0,69 1,50 32,81
Indicele Carr mai mare de 25 determinat la amestecul de pulberi F4, F5, F6 și F12
indică o curgere deficitară, între 18 și 25 pentru F7, F8, F9, F10 și F11 o curgere
satisfăcătoare și o fluiditate foarte bună pentru F1 și F2, care au valori sub 15.
Raportul Hausner mai mare de 1,6 determinat la F4, F5 și F6 indică o curgere proastă,
cuprins între 1,25-1,5 determinat la F7, F8, F9, F10, F11 și F12 o curgere satisfăcătoare, iar
sub 1,2, determinat la F1 și F2 ,o curgere bună.
Tabelul V.3 Caracteristicile farmaceutico-tehnologice ale comprimatelor cu 5-FU
FOMULA
PARAMETRU
Uniformitatea
masei(% +)
Uniformitatea
masei(% -)
Grosime
(mm)
Diametru
(mm)
F1 1,32 0,99 1,92 12,03
F2 1,66 1,00 2,19 12,04
F3 2,32 2,65 2,15 12,03
F4 3,03 1,68 1,99 12,03
F5 2,67 3,34 2,35 12,03
F6 3,37 1,01 2,72 12,05
F7 2,29 1,68 1,92 12,03
F8 1,67 1,33 1,94 12,02
F9 1,34 1,34 2,03 12,03
F10 3,67 3,34 1,94 12,02
F11 0,99 1,32 1,94 12,02
F12 1,67 2,34 2,03 12,03
10
Tabelul V.4. Caracteristicile farmaceutico-tehnologice ale comprimatelor cu 5-FU:
rezistență mecanică, friabilitate, timp de dezagregare, pH
FORMULA
PARAMETRII
Rezistență
mecanica
(N)
Friabilitate
(%)
Timp de
dezagregare
(min)
pH
F1 94,96 0,09 99 3,98
F2 92,52 0,16 165 3,96
F3 85 0,38 196 3,87
F4 60,56 0,61 76 4,06
F5 56,42 0,68 79 4,97
F6 52,16 0,72 67 4,82
F7 95,20 0,33 133 4,26
F8 100,92 0,20 158 4,56
F9 102,24 0,22 188 4,75
F10 100,15 0,28 141 4,62
F11 108,64 0,26 232 4,60
F12 111.38 0,25 282 4,89
Comprimatele analizate prezintă caractere macroscopice (aspect, miros, culoare) și
dimensionale (diametru și grosime) corespunzătoare. Diametrul și grosimea variază în limite
foarte mici față de dimensiunile poansonului ales pentru comprimare.
Friabilitatea s-a încadrat în limitele impuse de normativele în vigoare sub 1%, fiind
sub 0,26% pentru formulările F1, F2 și F8, F9, F10, F11, și F12 crescând odată cu creșterea
cantitătii de polimer în cazul Carbopolului și variind nesemnificativ în cazul hidroxipropil
metilcelulozei
Timpul de dezagregare variază între 67 minute (F6) și 282 minute ( F12). În cazul
C71 M 4000 și M100000, timpul de dezagregare creste odată cu creșterea procentului de
polimer, în timp ce în cazul C974, variațiile sunt nesemnificative la creșterea cantitătii de
polimer din formulare.
Rezistenţa mecanică a comprimatelor prezintă variaţii dependente de natura şi
procentul polimerului din formulă.
pH-ul comprimatelor studiate este cuprins în intervalul 3,82 – 4,89, fiind compatibil
cu pH-ul fiziologic.
Timpul de mucoadeziune ”ex vivo” a comprimatelor prezintă o creştere a valorilor în
funcţie de concentraţia polimerului din formulă, cea mai mare valoare fiind înregistrată
pentru formula F12 de 27,13 ore ( Fig.V.4).
11
Fig.V.4. Reprezentarea grafică a timpului de mucoadeziune ”ex vivo”
a comprimatelor vaginale cu 5-FU
V. 4. Concluzii
Caracteristicile farmaceutico – tehnologice ale comprimatelor mucobioadezive
vaginale cu 5-FU obţinute se încadrează în limitele admise de normativele de calitate în
vigoare. Timpul de dezagregare variază între 67 minute (F6) și 282 minute ( F12).
Timpul de mucoadeziune ”ex vivo” variază astfel: M 100 000 > M 4000 > C 71 > C
974, nefiind observate variaţii foarte mari în funcţie de concentraţia polimerului.
Rezultatele obținute la determinarea unghiului de umectare arată că formulările F2, F6
și F7 prezintă cel mai puternic caracter hidrofil şi cea mai bună adeziune la mucoase.
0
5
10
15
20
25
30T
imp
ul
de m
ucoad
eziu
ne e
x
viv
o
Formula
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
12
CAPITOLUL VI
OPTIMIZAREA FORMULĂRII COMPRIMATELOR BIOMUCOADEZIVE
VAGINALE CU 5 – FLUOROURACIL
Optimizarea reprezintă, pe lângă o tehnică de screening, o metoda de alegere a celei
mai bune asocieri de materii prime şi a procesului tehnologic corespunzător, permițând, în
concluzie, formularea optimă a produsului.
Tehnicile de optimizare specifice sistemelor farmaceutice se referă îndeosebi la
formulare şi procedee tehnologice.
Utilizarea planurilor experimentale şi a metodelor de optimizare, care asigură
achiziţia progresivă de informaţie, permite reducerea numărului de experimente cât mai mult
posibil, fără a pierde însă din calitatea rezultatelor.
VI.1.1.1.Planul experimental
Pentru efectuarea studiului s-a ales un plan experimental cu 9 variabile şi mai mult de
trei nivele. Pentru optimizarea formulării s-a utilizat un plan experimental de tip D-optimal,
care oferă o flexibilitate mare, permite studierea factorilor pentru care există constrângeri
lineare în setare, studierea unui spaţiu experimental neregulat şi studierea factorilor calitativi
la mai mult de două nivele.
Tabel VI.3. Variabilele independente (factorii de formulare)
Factori Simbol NIVELE
0 1 2 3
C 71 X1 0 60 90 150
C 974 X2 0 60 90 150
M 4000 X3 0 60 90 150
M 100 000 X4 0 60 90 150
Microcelac X5 35-140
5 FU X6 100
Stearat de Mg X7 0 6 - -
Aerosil X8 0 3 - -
Talc X9 0 6 - -
Tabel VI.5. Variabilele dependente (răspunsurile folosite pentru evaluarea proprietăţilor
amestecului – parametrii de curgere şi compresibilitate)
Factori Simbol
Timp de curgere (s) Y1
Coeficient de fricţiune Y2
Unghiul de repaus α (°) Y3
Raport Hausner Y4
Indice Carr (%) Y5
13
Tabel VI.6. Matricea planului experimental (N1-N12, plan experimental redus)
Exp. No. Run
Order
Variabila independentă
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
N1 8 0 0 90 0 110 100 0 0 0
N2 4 0 60 0 0 125 100 6 3 6
N3 2 90 0 0 0 110 100 0 0 0
N4 3 150 0 0 0 50 100 0 0 0
N5 5 0 90 0 0 95 100 6 3 6
N6 11 0 0 0 90 110 100 0 0 0
N7 9 0 0 150 0 50 100 0 0 0
N8 12 0 0 0 150 50 100 0 0 0
N9 7 0 0 60 0 140 100 0 0 0
N10 1 60 0 0 0 140 100 0 0 0
N11 10 0 0 0 60 140 100 0 0 0
N12 6 0 150 0 0 35 100 6 3 6
Influenţa celor nouă parametrii stabiliţi prin planul experimental asupra parametrilor
de curgere şi compresibilitate ai amestecurilor propuse pentru comprimare este precizată în
matricea răspunsurilor (tabelul VI.7.).
14
Tabel VI.7. Matricea răspunsurilor planului experimental (N1-N12)
Exp.
No.
Run
Order
Timpul
de curgere
Coeficient de
fricţiune
Unghi
de repaus
Raport
Hausner
Indice
Carr
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5
N1 8 1.25 34.7 0.69 1.32 23.94
N2 4 100 46.4 1.05 1.65 39.7
N3 2 0.125 34 0.67 1.1 9.09
N4 3 0.115 32 0.62 1.93 48.38
N5 5 100 47.8 1.1 1.61 38.23
N6 11 0.1 29.7 0.57 1.32 23.52
N7 9 1.35 36.2 0.73 1.39 28.16
N8 12 0.35 34.6 0.69 1.5 32.81
N9 7 1 25.2 0.47 1.32 23.94
N10 1 0.142 29.5 0.56 1.17 14.7
N11 10 0.1 30.1 0.58 1.29 22.72
N12 6 100 50.2 1.2 1.71 41.66
Tabel VI.8. Rezultatul obţinut în urma fitării datelor în vederea validării planului experimental
Validarea răspunsului
R2 R2 –
ajusted Q2
SDY Deviaţia standard
RSD Deviaţia Standard reziduală
Model Validity
Reproducibility
Timp de curgere (s) 0.987821 0.955342 0.97102 45.0013 9.50977 0.141855 0.592439
Coeficient de fricţiune 0.90471 0.650602 0.888205 8.01083 4.73519 0.135784 0.952423
Unghiul de repaus α (°) 0.942392 0.788771 0.934854 0.237657 0.1099227 0.0348448 0.848697
Raport Hausner 0.625852 0.371875 0.260271 0.242379 0.283892 0.0751735 0.95904
Indice Carr (%) 0.589346 0.30352 0.30352 11.5689 14.196 0.0969723 0.952417
Fig. VI.9. Rezultatul obţinut în urma fitării datelor în vederea validării planului experimental
Rezultatele fitării datelor experimentale şi interpretarea parametrilor statistici calculaţi
în cadrul planului experimental propus demonstrează că modelul ales este corespunzător cu
datele experimentale, iar capacitatea de prevedere a planului este corectă. Rezultate foarte
15
bune s-au obţinut în cazul raportului Hausner care are o valoare a validităţii modelului foarte
aproape de 1. Rezultate bune s-au întâlnit şi în cazul celorlalţi parametri: coeficientul de
fricţiune, unghiul de repaus, viteza de curgere şi respectiv indicele Carr.
VI.1.2. Rezultate
Influenţa factorilor de formulare asupra timpului de curgere (Y1)
În cadrul planurile experimentale reduse efectele medii ale factorilor se confundă cu
interacţiunile de ordin doi, aspect ce duce la imposibilitatea verificării interacţiunilor dintre
factori.
Rezultatele obţinute pe baza testului ANOVA, cât şi în urma analizei curbelor de
dependentă, indică o fitare corespunzătoare a modelului.
Fig.VI.2. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru timpul de curgere
Fig. VI.3. Influenţa factorilor de formulare asupra timpului de curgere
Influenţa factorilor de formulare asupra timpului de curgere este reprezentată în
fig.VI.3. Coeficienţii scalaţi ai ecuaţiei cu ajutorul căreia s-a efectuat fitarea planului
experimental indică faptul că cea mai mare influenţă asupra timpului de curgere o are
16
variabila independentă X2 (C 974). Variabila X5 (Microcelacul) a prezentat o influenţă mai
puţin semnificativă şi negativă, în sensul diminuării valorii timpului de curgere ceea ce
corespunde din punct de vedere tehnologic la o îmbunătăţire a proprietăţilor de curgere a
amestecurilor.
Variabila de formulare X1 prezentă o influenţă semnificativă negativă asupra timpului
de curgere (creşterea concentraţiei determină scăderea timpului de curgere), ceea ce confirmă
proprietăţile bune de curgere ale sortului C71, recomandat pentru comprimarea directă.
Variabila X2 are o influenţă semnificativă asupra variabilei Y1, pozitivă ca valoare,
dar negativă din punct de vedere tehnologic, deoarece creşterea concentraţiei acestei variabile
în formulă va determina o creştere a valorii Y1.
De asemenea, conform rezultatelor obţinute se observă că variabilele independente
X3 (M 4000) şi X4 (M 100000) determină o diminuare a valorii variabilei dependente Y1,
fiind confirmate astfel proprietăţile optime de curgere ale acestor sorturi de hidroxipropil
metilcelluloză.
Influenţa factorilor de formulare asupra coeficientului de fricţiune (tg )
Fig. VI.4. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru coeficientul de fricţiune
Fig. VI.5. Influenţa factorilor de formulare asupra coeficientului de fricţiune
Dintre factorii de formulare analizaţi, cea mai mare influenţă asupra coeficientului de
fricţiune, în sensul creşterii valorii acestui parametru de curgere, o are variabila X2 (C974).
Variabilele X1, X3 şi respectiv X4 au influenţă nesemnificativă (fig. VI.5).
17
Influenţa factorilor de formulare asupra unghiului de repaus (Y3)
Fig.VI.6. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru unghiul de repaus
Fig. VI.7. Influenţa factorilor de formulare asupra unghiului de repaus
Variabila dependentă Y3 este influenţată semnificativ pozitiv, în sensul creşterii
valorii, de variabila X2 (C974) (fig. VI.6).
Variabilele dependente X1, X3 şi X4 nu prezintă o influenţă semnificativă asupra
variabilei dependente Y3.
18
Influenţa factorilor de formulare asupra raportului Hausner (Y4)
Fig. VI.8. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru raport Hausner
Fig. VI.9. Influenţa factorilor de formulare asupra raportului Hausner
Raportul Hausner este influenţat semnificativ de X2 (C974) în sensul creşterii valorii
acestui parametru, în timp ce variabila X5 exercită o influenţă semnificativă în direcţia
diminuării valorii raportului Hausner (fig. VI.8). Influenţa variabilei X5 va conduce la
îmbunătăţirea proprietăţilor de curgere a amestecurilor, fiind confirmat astfel faptul că în
procesul de formulare a fost selectat un diluant optim.
19
Influenţa factorilor de formulare asupra indicelui Carr (Y5)
Fig. VI.10. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru indice Carr
Fig. VI.11. Influenţa factorilor de formulare asupra indicelui Carr
Rezultatele obţinute evidenţiază influenţa semnificativă şi pozitivă a X1 şi X2 asupra
Y5, în timp ce X5 are o influenţă semnificativă dar în sensul diminuării valorii indicelui Carr.
Variabila X3 şi X4 nu influenţează semnificativ Y5 (fig.VI.10.).
Fig. VI.12. Valoarea coeficienţilor normalizaţi scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul
experimental propus pentru factorii de formulare
20
Fig .VI.13. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru factorii de formulare (coeficienţi normalizaţi)
În fig. VI.12 sunt prezentaţi pentru variabilele dependente Y1, Y2, Y3, Y4, Y5
coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus pentru
factorii de formulare (coeficienţi normalizaţi).
VI.2. Studiul influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor farmaceutico-
tehnologice ale comprimatelor a urmat aceeaşi paşi. Pentru optimizarea formulării s-a utilizat
un plan experimental de tip D-optimal, care permite studierea factorilor de formulare ce
prezintă mai mult de două nivele.
În cadrul studiului influenţei factorilor de formulare asupra caracteristicilor farmaco-
tehnice sau calculat coeficienţii scalaţi ai ecuaţiei cu ajutorul căreia s-a efectuat fitarea
planului experimental. Valoarea pozitivă a coeficientului indică o creştere a valorii
răspunsului, în timp ce o valoare negativă indică o diminuare a răspunsului. Coeficienţii
corespunzători factorilor multipli (termenii produs) reprezintă efectul de interacţiune al
factorilor respectivi, iar coeficienţii termenilor pătratici reprezintă evoluţia neliniară a
răspunsului în funcţie de factorul respectiv.
Fig.VI.21. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus pentru
caracteristicile farmaceutico-tehnologice
21
Tabel VI.21. Valoarea coeficienţilor normalizaţi scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind
planul experimental propus pentru factorii de formulare
Coeficienţii
Normalizaţi
Coeff.N:
Uniformitatea
masei minus
(%)
Uniformitatea
masei plus
(%)
Grosime
(mm)
Diametru
(mm)
Rezistenţă
Mecanică
(N)
Friabilitate
(%) pH
Timp de
Dezagregare
(min)
Timp de
Mucoadeziune
„ex vivo”
(ore)
C 71 0.147115 0.200587 8.81153 0.028148 0.138601 0.0914357 0.386509 0.129724 0.413968
C 974 0.455984 0.65289 0.734468 0.938045 0.199258 0.10329 0.465457 0.555283 0.22004
M 4000 0.251676 0.0699775 1.08475 0.275902 0.0964908 0.0404297 0.377987 0.13364 0.336033
M 100 000 0.174605 0.4041 0.319051 0.377246 0.261988 0.0711596 0.552147 0.596914 0.408672
Microcelac 0.146127 0.0172751 0.313593 0.352277 0.0134258 0.133675 0.100419 0.379178 0.172528
Stearat de Mg 0.0169883 0.302662 0.434652 0.213731 0.228248 0.266745 0.0194479 0.0201675 0.30676
Aerosil 0.0169883 0.302662 0.434652 0.213731 0.228248 0.266745 0.0194479 0.0201675 0.30676
Talc 0.0169883 0.302662 0.208581 0.213731 0.228248 0.266745 0.0194479 0.0201675 0.30676
Fig.VI.31. Coeficienţii scalaţi şi centraţi ai ecuaţiei modelului privind planul experimental propus
pentru factorii de formulare (coeficienţi normalizaţi)
Fig.VI.32. Importanţa factorilor de formulare în funcţie de coeficienţii ecuaţie de fitare a planului
experimental
În concluzie, C974, stearatul de mg, aerosilul şi talcul prezintă cea mai mare influenţă
asupra caracteristicilor farmaco-tehnice comprimatelor biomucoadezive vaginale cu cedare
modificată cu 5 – fluorouracil.
22
Timpul de dezagregare (min) şi timpul de mucoadeziune „ex vivo” (ore) au fost
influenţați semnificativ de M100 000, în timp ce C71 a influenţat valorile pH-ului, iar
microcelacul a avut impact semnificativ asupra uniformităţii masei minus (%) şi M100 000
asupra uniformităţii masei plus, asupra rezistenţei mecanice, a timpului de dezagregare (min)
şi a timpului de mucoadeziune „ex vivo” (ore).
VI.3. Determinarea formulei optime de preparare
Metoda Prediction - Design Space arată setările factorilor pentru optimizarea
selectată şi variabilitatea acceptată în jurul acestor setărilor (a factorilor) care se menţin
conform predicţiei în regiunea acceptată pentru răspunsuri. Se poate face o estimare a unei
zone sigure (Design Space) cu simularea Monte Carlo a factorilor. Aplicaţia face o căutare
pentru a găsi cea mai largă regiune (limite maxime) pentru fiecare factor, care poate fi
utilizată şi care respectă toate cerinţele pentru răspunsuri.
Fig. VI.38. Predicţia spaţiului de estimare şi validitatea modelului (DPMO)
Fig. V.11. Formula optimă a comprimatului privind parametrii de curgere şi caracteristicile
farmacotehnice a unor comprimate biomucoadezive vaginale cu cedare modificată cu 5 – fluorouracil
23
Tabel VI.24. Nivelul optim al factorilor de formulare a comprimatului privind parametrii de curgere
şi caracteristicile farmacotehnice a unor comprimate biomucoadezive vaginale cu cedare modificată
cu 5 – fluorouracil
Factori Simbol Nivel optim 1
F2
Nivel optim 2
F1
C 71 X1 90 60
C 974 X2 0 0
M 4000 X3 0 0
M 100 000 X4 0 0
Microcelac X5 110 140
5 FU X6 100 100
Stearat de Mg X7 0 0
Aerosil X8 0 0
Talc X9 0 0
VI.3.3. Discuţii
Etapa de optimizare a utilizat o metodă dependentă de model în cadrul căreia s-au
realizat un număr de experimentări. Pe baza acestora s-a realizat modelarea matematică care a
permis prin metode de analiză factorială găsirea formulării optime. Analiza factorială a
definit clar relaţia ce există între variabilele de intrare, interacțiunile lor (factorii de
formulare) şi variabilele dependente (răspunsuri), realizându-se în acest fel suprafaţa de
răspuns a sistemului sau planul factorial. La baza metodelor de optimizare stă realizarea
planurilor experimentale ce permit identificarea condiţiilor optime după un model matematic
bine stabilit. Procesul de optimizare permite stabilirea unor constrângeri ce pot fi uneori
impuse în cadrul formulării. Nivelul optim al factorilor de formulare privind parametrii de
curgere şi caracteristicile farmacotehnice a unor comprimate biomucoadezive vaginale cu
cedare modificată cu 5 – fluorouracil este definit de tabel VI.24., în care nivelul optim 1 îl
reprezintă formularea F2 cu un conţinut de 30% Carbopol 71, iar nivelul optim 2 este
reprezentat de formularea F1, care conţine acelaşi polimer formator de matriţă, dar în
cantitate de 20%.
VI.4.Concluzii
În urma analizei rezultatelor fitării datelor experimentale putem afirma că există o
bună corelaţie între condiţiile experimentale şi răspunsuri. Variaţia răspunsurilor în funcţie de
modificările concentraţiilor factorilor de formulare, ca variabile independente ale planului,
sunt determinate de condiţiile experimentale.
În urma realizării planului experimental şi pe baza modelului matematic stabilit s-a
identificat formula optimă de formulare şi anume F2 la nivel optim 1, respectiv F1 la nivel
optim 2, și s-au estimat valorile teoretice ale variabilelor dependente prevăzute pe baza
modelului. Rezultatele au fost calculate pentru in interval de încredere de 95%, cu alte
cuvinte se admite o abatere de ±5%, faţă de rezultatele prevăzute teoretic. Valorile DPMO
(Defects Per Million Opportunities) ce constituie un criteriu de delimitare a spaţiului de
estimare, confirmă validitatea modelului.
24
CAPITOLUL VII
ELABORAREA ȘI VALIDAREA UNEI NOI METODE DE DOZARE A 5-FU DIN
COMPRIMATE BIOMUCOADEZIVE VAGINALE
Pentru a putea determina cantitativ concentrația în 5-FU a comprimatelor
mucobioadezive vaginale și pentru a evalua disponibilitatea in vitro a 5-FU din acestea,
următorul obiectiv al cercetării propuse cuprinde studii privind elaborarea şi validarea unei
metode de analiză cantitativă a 5-FU prin cromatografia de lichide de inaltă performanţă,
folosind un sistem cromatografic HPLC Thermo Surveyor, echipat cu Surveyor LC –Pump,
Autosampler Surveyor LC-Plus şi detector UV-VIS. Validarea metodei de determinare cantitativă a 5-fluorouracilului (5-FU) ca
monosubstanţă (condiţii preliminare, mod de lucru, criterii de acceptare) prin cromatografia
de lichide de înaltă performanţă (HPLC) presupune investigarea următorilor parametrii:
compatibilitatea sistemului, specificitatea, liniaritatea, exactitatea metodei, limita de detecţie
şi limita de cuantificare.
Pentru determinarea cantitativă a 5-fluorouracilului s-a folosit metoda standardului
intern. Piridin 3-carbohidrazidă (P3C) a fost ales pentru a juca rolul standardului intern, pe
baza caracteristicilor fizico-chimice similare prezentate în Tabelul VII.1
Tabelul VII.1 Valorile pKa si logP ale 5-FU si P3C
Compus pKa logP
5-fluorouracil(5-FU) 13,0 -1,0
Piridin-3-carbohidrazida(P3C) 11,2 -1,8
VII.3.Rezultate şi discuţii
Metoda se bazează pe separarea HPLC a celor doi compuşi, cu detecţie UV la 270 nm.
a
b
Figura VII.1 a. blanc b. Picuri corespunzatoare celor doua probe amestec 5-FU cu P3C
si proba cu 5-FU
Tabelul VII.2. Caracteristicile solutiilor injectate
Soluţia
injectată
Concentraţia
5FU (mg/ml)
Concentraţia
P3C (mg/ml)
Tr 5FU
(minute)
Tr P3C
(minute)
Aria
5FU
Aria
P3C
SI1 0,01 0,01 2,90 2,0 2046079 977435
SI2 0,01 - 2,903 1998566 -
Minutes
0 1 2 3 4 5 6
mA
U
-10
0
10
20
mA
U
-10
0
10
20
pda-Scan-270 nm
blanc-fm
Minutes
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00
mA
U
0
100
200
300
400
500
600
700
800
mA
U
0
100
200
300
400
500
600
700
800
2.0
75
10
14
81
7
si
2.9
08
18
54
03
1
5fu
pda-270nmp1
Retention Time
Area
Name
25
Se observa ca timpul de retenţie al 5-FU este de aproximativ 2,9 minute, iar timpul de
retenţie pentru P3C este de 2 minute.
Tabel VII. 5. Ariile picurilor pe intervalul de concentratie 0,00005-0,012 mg/ml 5-FU
C5FU
Aria 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.001 0.0005
Seria 1 2554905 2122582 1687026 1242723 811793 364297 158536 102013
Seria 2 2540549 2146008 1683366 1245170 820066 370410 161257 103253
Seria 3 2542362 2136564 1692365 1246569 820125 368566 160236 102564
media 2545939 2135051 1687586 1244821 817328 367757.7 160009.7 102610
Figura VII.2. Dreapta de calibrare a 5- FU
Metoda este exactă pe intervalul de concentratie cercetat 0,0005-0,012mg/ml, având
procentul de regăsire mediu 103.4854, deviaţia standard individuală 0,0148, deviaţia standard
relativă 1,4127, iar valoarea maximă a abaterilor procentuale este 4.16.
Tabel VII. 10 Evaluarea exactitatii metodei HPLC
Rap
ort
con
cen
trat
ii
Teo
reti
ce X
a
Rap
ort
ari
i
5F
U/P
3C
Rap
ort
con
cen
trat
ii
Reg
ăsit
e
Xr
Reg
ăsir
ea
pro
cen
tual
ă
Co
nce
ntr
atii
5F
U
(mg
/ml)
Ab
ater
i
ind
ivid
ual
e
Ab
ater
i
pro
cen
tual
e
SP1 1.021 2.2513 1.060194 103.8388 0.010602 0.039194 3.919417
SP2 1.016 2.2459 1.057698 104.1041 0.010577 0.041698 4.169764
SP3 1.008 2.1932 1.033333 102.5132 0.010333 0.025333 2.533333
y = 216112946.6699x - 42476.4392
R2 = 0.9996
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014
concentratii 5FU (mg/ml)
ari
i (m
Au
)
Liniaritate 5FU Linear (Liniaritate 5FU)
26
Figura VII.5. Distribuția concentrațiilor regăsite de 5-FU
Rezultatele obţinute la determinarea cantitativă a 5-FU din cele 12 formulări folosind
noua metoda elaborată şi validată se înscriu în intervalul de 95-105%, cu excepţia probelor
F8, F10, F11 şi F12.
VII.5.Concluzii
A fost elaborată o metodă de dozare cantitativă prin HPLC a 5- FU din comprimate
bioadezive vaginale care a dovedit compatibilitate, liniaritate, precizie si exactitate.
Compatibilitatea sistemului este definită de repetabilitatea injectării (RSD%5FU =
1,1006 , RSD%P3C = 1,9053), determinarea intervalului de încredere la un nivel de siguranţă
de 95%, repetabilitatea timpului de retenţie (RSD%5FU = 1,8117 , RSD%P3C = 1,8694), gradul
de separarea a două picuri consecutive ( Rs5FU/P3C= 5,38, numărul de talere teoretice ale
coloanei (N5FU = 3757 , NP3C = 3110).
Metoda este exactă pe intervalul de concentratie cercetat 0,0005-0,012mg/ml, având
procentul de regăsire mediu 103.4854, deviaţia standard individuală 0,0148, deviaţia standard
relativă 1,4127, iar valoarea maximă a abaterilor procentuale este 4.16.
Intervalul de concentraţii regăsit în studiul cuantificării conţinutului de 5-fluorouracil
în cele 12 formulări de comprimate mucobioadezive vaginale este cuprins într 93,46 şi
110,28%.
85.00
90.00
95.00
100.00
105.00
110.00
115.00
p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p11 p12
proba
determinarea concentratiilor de 5-fluorouracil
27
CAPITOLUL VIII
EVALUAREA DISPONIBILITĂȚII IN VITRO A 5-FU DIN COMPRIMATE
BIOADEZIVE VAGINALE
Testul de dizolvare „in vitro” este un parametru de calitate important pentru
comprimate care, la rândul său, poate fi un criteriu pentru prognozarea biodisponibilităţii
substanţei medicamentoase din forma farmaceutică.
Evaluarea cineticii de cedare a 5-FU va sta la baza stabilirii protocolului experimental,
în vederea evaluării biodisponibilităţii 5-FU din comprimatele mucobioadezive vaginale cu
cedare modificată.
În altă fază a cercetărilor (Capitolul VI) am elaborat şi validat o metodă de analiză
prin comatrografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) pentru determinarea cantitativă a
5-FU ca monosubstanţă. Metoda a fost utilizată pentru determinarea cantitativă a 5-FU din
comprimatele bioadezive vaginale, cât şi pentru determinarea cedării „in vitro” a acestuia
prin testului de dizolvare.
VIII.2.Rezultate şi discuţii
Figura VIII.1. Profilurile vitezei de cedare a 5-FU din comprimate (Formulele 1- 12.)
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
0
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
80.000
90.000
100.000
110.000
0,50 1,50 2,50 3,50 4,50 5,50 6,50 7,50 8,50 9,50 10,50 11,50
Co
nc
en
tra
tio
ns [
mg
/co
mp
]
Time [h]
P1
P2
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P3
28
Tabel VIII.14. Prelucrare statistică
ANOVA
Sursa variaţiei SS df MS F P-value F crit
În acelaşi grup 38959.79819 11 3541.799835 3.934629054 6.97281E-05 1.869290423
Intre grupuri diferite 108019.3264 120 900.1610537
Total 146979.1246 131
Tabel VIII.15. Factorul de diferenţă f1
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12
P1 - 37.30 20.16 16.12 11.22 7.46 34.96 43.75 43.20 33.74 49.18 55.34
P2
- 32.42 74.66 67.79 57.47 27.41 26.92 27.47 29.07 30.48 32.65
P3
- 36.00 29.98 22.56 24.06 32.82 31.98 24.30 38.93 45.90
P4
- 12.27 17.28 39.00 47.22 47.36 37.46 52.67 58.75
P5
- 9.02 37.73 46.12 46.27 36.20 51.68 57.89
P6
- 33.51 42.56 42.22 31.98 48.16 54.72
P7
- 13.51 13.71 4.05 22.41 32.38
P8
- 5.85 18.48 10.33 21.85
P9
- 18.81 12.21 21.64
P10
- 24.32 34.04
P11
- 12.85
P12
-
Tabel VIII.16. Factorul de similaritate f2
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12
P1 - 20.34 31.29 32.72 46.73 55.24 23.96 19.72 19.72 25.13 17.39 15.12
P2
- 31.36 16.61 18.71 22.29 42.08 38.93 39.17 40.86 34.60 31.35
P3
- 24.02 28.88 36.33 35.02 28.79 28.56 35.35 24.90 22.08
P4
- 44.01 34.39 21.01 17.68 17.62 21.75 15.84 13.66
P5
- 49.09 22.58 18.56 18.54 23.57 16.38 14.09
P6
- 26.20 21.46 21.37 27.30 18.80 16.28
P7
- 54.51 54.56 75.50 43.75 36.90
P8
- 69.89 50.39 62.45 48.34
P9
- 51.21 57.99 48.19
P10
- 41.51 35.40
P11
- 60.40
P12
-
29
În ceea ce priveste cedarea in vitro a 5-FU din comprimatele mucobioadezive vaginale pe
unitatea de timp se observă următoarele:
- formulele P1, P4, P5 şi P6 cedează după 3 ore între 80-99%, după care urmează o cedare
relativ constantă, sub formă de platou pe perioada de timp urmărită, de 10 ore;
- formulele P7, P8, P9, P10,P11şi P12 cedează mai lent, atingând la 6 ore concentraţii de 35-
60%, iar la 10 ore de 60-80%;
- formulele cu un profil de cedare diferit sunt formula P3, care cedeaza la 6 ore 100% 5-FU,
şi formula P2, care cedează la 6 ore 40% 5-FU, continuând să cedeze pe timpul celor 10 ore,
atingând concentraţia de 100%.
Valoarea testului statistic F=3,94 prezintă o valoare de mai mare decât valoarea critic
statistică.Valoarea varianţelor standard individuale indică o diferenţă statistic semnificativă
între ratele de cedare a 5-fluorouracil în cazul celor 12 sisteme studiate.
Profilurile de cedare diferite ale formulărilor cu 5-FU sunt confirmate şi de rezultatele
obţinute la analiza statistică, prin determinarea factorul de diferenţă f1 (Tabel VIII.15) și
factorul de similaritate f2 (Tabel VIII.16.).
VIII.4.Concluzii
Din rezultatele obținute se observă influența tipului de polimer, folosit la formularea
comprimatelor mucobioadezive, asupra cedării 5-FU. Comprimatele care conțin Carbopol
cedează cantităti mai mari de 5-FU (93,85-105,73) după 10 ore, în timp ce formulările F6-
F12, ce conțin Metolose, cedează o cantitate mai mică de 5-FU, concentrațiile variând între
57,11-82,92% din concentrația declarată, după 10 ore.
Profilurile de cedare sunt similare la formulările F1-F6 ce conțin carbopol, precum și
la F7-F12, formulări ce conțin metoloză.
30
CAPITOLUL IX
ELABORAREA ȘI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A 5-FU
DIN PROBE BIOLOGICE
Validarea metodei de determinare cantitativă a 5-fluorouracil din probe biologice prin
cromatografia de lichide de înaltă performanță cuplată cu detecție de spectrometrie de masă
presupune investigarea următorilor parametrii: compatibilitatea sistemului, specificitatea,
liniaritatea, exactitatea metodei, limita de detecţie şi limita de cuantificare.
Pentru determinarea cantitativă a 5-fluorouracil s-a folosit metoda standardului extern.
Metoda se bazează pe separarea HPLC a analitului de interes de matricea biologică prin
utilizarea de tehnici cromatografice și detecție spectrometrie de masă.
Conţinutul în 5-fluorouracil se calculează pe baza ecuaţiei regresiei liniare şi raportate
la concentraţia standardului intern cu ajutorul formulei:
% 5fu=
unde:
- AST= aria picului corespunzător 5-fluorouracil în soluţia de analizat SA
- ASI= aria picului corespunzător standardului intern în soluţia de analizat
SA
- CSI = concentraţia standardului intern în soluţia de analizat SA
- FST = factorul de diluţie corespunător soluţiei de analizat
- b = panta dreptei de calibrare
- a= intreceptul la origine a dreptei de calibrare
IX.3.Rezultate şi discuţii
Figura IX.4. Cromatograma 5-FU în solutie de concentrație 1000PPB
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5
CHROMATOGRAM
31
În urma studiului de elaborare a unei noi metode de dozare a 5-FU din probe
biologice s-a stabilit că timpul de retenţie al 5-fluorouracil prin această metodă este de
aproximativ 1,34 minute (Fig.IX.4.)
Tabel IX.2. Repetabilitatea injectării
Proba
5FU 0.01 mg/ml 5FU 0.01 mg/ml
Aria Abateri
individuale
Abateri
relative
Tr 5FU
(minute)
Abateri
individuale
Abateri
relative
SC1 3595 17.1 0.477934 1.344 0.004 0.298507
SC2 3566 11.9 0.332597 1.334 0.006 0.447761
SC3 3578 0.1 0.002795 1.341 0.001 0.074627
SC4 3568 9.9 0.276699 1.344 0.004 0.298507
SC5 3588 10.1 0.282288 1.335 0.005 0.373134
SC6 3576 1.9 0.053104 1.34 2.22E-16 1.66E-14
SC7 3566 11.9 0.332597 1.344 0.004 0.298507
SC8 3587 9.1 0.254339 1.338 0.002 0.149254
SC9 3600 22.1 0.617681 1.342 0.002 0.149254
SC10 3555 22.9 0.64004 1.338 0.002 0.149254
Media 3577.9 1.34
SD 14.43337 0.003682
RSD 0.403403 0.27476
Repetabilitatea injectării, reflectată în invariabilitatea atât a ariilor picurilor, cât şi a
timpilor de retenţie, defineşte precizia sistemului.
Figura IX.5. Dreapta de calibrare a 5-FU (raportul ariilor/raportul concentrațiilor)
y = 3,404xR² = 0,9963
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0
LINIARITATE
32
Corelograma (dreapta de calibrare) din figura IX.5 evidenţiază o variaţie liniară a ariei
picului în funcţie de concentraţia probei. Prin urmare, estimarea arei picurilor se va face cu
ajutorul ecuaţiei de regresie liniară: Aria = 3.404 * Concentraţia
Pentru studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză se calculează: concentraţia
regăsită (Cregăsit), randamentul de regăsire (R%) al 5-fluorouracil din probele reconstituite,
abaterea procentuală (Xd%) şi oblicitatea experimentală.
O metodă este considerată exactă dacă randamentul de regăsire (regăsirea
preocentuală) este cuprins în intervalul 95– 105 % faţă de concentraţia teoretică introdusă
(Tabel IX.6).
Tabel IX.6. Randamentul de regăsire
Probă Concentrație
Teoretica -Xa
Regăsirea
procentuală
Concentratii 5FU
(ng/ml)
SP1 250 99.62 249.04
SP2 500 99.51 497.53
SP3 1000 95.66 956.62
Celelalte valori obținute în studiul acurateţii/exactităţii metodei de analiză:
- Procentul de regăsire mediu= 98,26
- Deviaţia standard individuală este 0.014
- Deviaţia standard relativă 1.41
arată că metoda elaborată este exactă şi reproductibilă.
IX.5.Concluzii Ţinând cont de valorile experimentale obţinute la studiul compatibilităţii sistemului
cromatografic, care se încadrează în limitele prevăzute de standardele în vigoare, se poate
afirma că sistemul este compatibil.
Analiza statistică prin testul ANOVA indică corectitudinea modelului liniar
determinat, existând o legătură liniară, semnificativă statistic, între concentraţia probei şi aria
picului pentru un prag de certitudine de 95%. Variabila independentă influenţează
semnificativ comportarea variabilei dependente, deci raportul de corelaţie este semnificativ
statistic. Deviaţiile valorilor reziduale şi media sumelor pătratelor prezintă valori apropiate de
0, deci valorile prezise sunt similare valorilor determinate.
Metoda a arătat o relație bună liniară în intervalul de concentrație cuprins între 0,0001
şi 1 ng/ml 5-fluorouracil (R2 = 0,999), cu limite de cuantificare (LOQ) la 138ng / ml ser
uman Regăsirile medii de diferite concentrații de 5-FU în ser au fost de 88,80%.Acuratețea și
precizia datelor sunt acceptabile de-a lungul intervalului de concentrație investigat.
33
CAPITOLUL X.
STUDII FARMACOLOGICE COMPARATIVE PRIVIND ADMINISTRAREA
ORALĂ ŞI VAGINALĂ DE 5-FLUOROURACIL
Datele din literatură evidenţiază faptul că agentul chimioterapic antitumoral
5-fluorouracil (5-FU), administrat pe cale sistemică (orală sau intravenoasă), prezintă atât
efecte citocide, cât şi efecte radiosensibilizatoare la nivelul celulelor canceroase (170). Pe de
altă parte, uneori este necesară reducerea dozelor sau chiar renunţarea la terapia cu 5-FU din
cauza apariţiei efectelor adverse severe, cum ar fi: diaree severă, anorexie, greţuri, vărsături,
atrofii, ulceraţii şi hemoragii la nivel gastrointestinal, leucopenie, anemie, trombocitopenie,
afectare hepatică severă, ischemie miocardică, tromboflebite, tulburări vizuale, fotofobie,
stări confuzionale, dezorientare, euforie, ataxie, cefalee şi nefrotoxicitate (171-173).
Toate aceste aspecte au condus la numeroase cercetări pe modele animale şi
investigaţii clinice privind posibilitatea administrării topice a 5-FU la nivelul mucoasei
rectale (169-170), la nivel ocular (174), la nivel tegumentar (175), la nivelul mucoasei
vaginale sub formă de unguent tip cremă (176) sau gel (177.).
În acest context, scopul studiului a constat în evaluarea avantajelor administrării
topice intravaginale a 5-FU într-o nouă formulare farmaceutică (comprimate biomucoadezive
vaginale) comparativ cu administrarea pe cale orală, a unor doze echivalente.
Obiectivele studiului au fost:
- selecţia unei noi formulări farmaceutice, comprimate biomucoadezive vaginale cu 5-
FU pentru administrare pe cale intravaginală;
- administrarea la şobolani Wistar, femele, de 5-FU, pe cale orală şi pe cale
intravaginală, în două doze echivalente;
- evaluarea biochimică şi hematologică la animalele de laborator cărora le-au fost
administrate 5-FU, pe cale orală, respectiv, pe cale intravaginală în cele două doze.
Pentru studiile farmacologice comparative privind administrarea orală şi vaginală de
5-FU s-a selectat formularea F2 care, în urma testărilor farmacotehnice şi in vitro, a dovedit
că îndeplineşte conditiile de calitate necesare comprimatelor mucobioadezive.
În desfăşurarea experimentelor au fost respectate recomandările Comisiei de Etică a
Universităţii „Gr.T. Popa“, Iaşi, în strictă concordanţă cu reglementările etice internaţionale,
privind lucrul pe animale de laborator.
X.2.4.1. Metodologia cercetării farmacologice comparativă privind administrarea
orală şi vaginală de 5-fluorouracil
Animalele au fost repartizate în 5 loturi de câte 7 şi au primit substanţele zilnic, în
doză unică, la orele 9.00 a.m., timp de 5 zile, după următoarea schemă:
Lotul 1 (Martor, codificat SF): ser fiziologic 0,5 ml/100g corp şobolan, pe cale orală;
Lotul 2 (codificat V5FUD1):, comprimat vaginal echivalent a 6 mg/kgc/zi, 5-FU;
Lotul 3 (codificat V5FUD2): comprimat vaginal,echivalenta 20 mg/kgc/zi, 5-FU;
Lotul 4 (codificat O5FUD1): 6 mg/kgc/zi, 5-FU pe cale orală;
Lotul 5 (codificat O5FUD2): 20 mg/kgc/zi, 5-FU pe cale orală.
După 5 zile de tratament, animalele au fost anesteziate cu eter etilic şi s-a recoltat sânge, pentru următoarele determinări:
- hematologice: hemoleucograma;
- biochimice:
o alaninaminotransferaza (ALAT) - denumită şi transaminaza glutampiruvică
(TGP);
34
o aspartat aminotransferaza (ASAT) - denumită şi transaminaza glutamică
oxalacetică (TGO);
o fosfatază alcalină;
o uree serică;
o creatinină serică;
o acid uric seric;
- cortizol seric;
- parametri de stres oxidativ:
o glutation peroxidaza (GPx);
o glutation redus (GSH);
o malondialdehida (MDA).
Datele au fost centralizate şi prelucrate statistic utilizând testul t-student din
programul Windows EXCEL. Rezultatele au fost exprimate sub forma mediei valorilor ±
deviaţia standard a mediei valorilor determinate pentru fiecare parametru determinat şi pentru
fiecare substanţă studiată în parte. Acestea au permis aprecierea semnificaţiei diferenţelor
constatate între loturile tratate cu 5-FU şi lotul martor. Valorile p < 0,05 sunt considerate
semnificative din punct de vedere statistic.
X.3. Rezultate și discuţii
Toate datele obținute au fost prelucrate după acelaşi algoritm.
TABEL X.1. Numărul total de globule albe (K/μL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil
SF V5FUD1 V5FUD2 O5FUD1 O5FUD2 L1 L2 L3 L4 L5
1 11,02 9,58 9,85 9,75 9,58 2 9,94 10,01 9,61 9,71 9,01 3 10,56 10,42 9,87 9,85 9,42 4 10,93 9,61 9,56 9,62 9,61 5 10,08 10,34 9,78 9,53 9,34 6 11,84 9,65 9,91 9,38 9,65 7 11,76 10,55 9,94 9,67 9,55
Media= 10,88 10,02 9,79 9,64 9,45 Dev. std.= 0,75 0,42 0,15 0,15 0,22
TABEL X.1b. Semnificaţia statistică a rezultatelor. Comparaţie între loturi.
5 zile
L1/L2 L1/L3 L1/L4 L1/L5 0,01 0,00 0,00 0,00
L2/L3 L2/L4 L2/L5
0,10 0,03 0,01
L3/L4 L3/L5
0,05 0,00
L4/L5
0,04
Legendă:
L1 = SF = ser fiziologic (0,5 ml/100 g corp şobolan, pe cale orală)
L2 = V5FUD1 = 5-fluorouracil (6 mg/kgc/zi, comprimate vaginale)
L3 = V5FUD2 = 5-fluorouracil (20 mg/kgc/zi, comprimate vaginale)
L4 = O5FUD1 = 5-fluorouracil (6 mg/kgc/zi, pe cale orală)
L5 = O5FUD2 = 5-fluorouracil (20 mg/kgc/zi, pe cale orală)
35
Fig. X.1. Numărul total de globule albe (K/μL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil
TABEL X.12. Valorile cortizolului (µg/dL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil.
SF V5FUD1 V5FUD2 O5FUD1 O5FUD2
L1 L2 L3 L4 L5
1 1,00 2,30 2,61 2,00 2,84
2 1,29 1,57 2,52 2,56 2,02
3 1,00 1,26 2,93 1,87 3,06
4 1,30 1,48 2,10 1,96 2,91
5 1,23 1,00 2,14 1,74 3,10
6 0,92 1,29 2,00 2,52 2,46
7 1,41 1,61 1,80 2,50 2,18
Media= 1,16 1,50 2,30 2,16 2,65
Dev. std.= 0,19 0,41 0,40 0,35 0,43
TABEL X.12b. Semnificaţia statistică a rezultatelor. Comparaţie între loturi.
5 zile
L1/L2 L1/L3 L1/L4 L1/L5
0,04 0,00 0,00 0,00
L2/L3 L2/L4 L2/L5
0,00 0,00 0,00
L3/L4 L3/L5
0,26 0,07
L4/L5
0,02
Legendă:
L1 = SF = ser fiziologic (0,5 ml/100 g corp şobolan, pe cale orală)
L2 = V5FUD1 = 5-fluorouracil (6 mg/kgc/zi, comprimate vaginale)
L3 = V5FUD2 = 5-fluorouracil (20 mg/kgc/zi, comprimate vaginale)
L4 = O5FUD1 = 5-fluorouracil (6 mg/kgc/zi, pe cale orală)
L5 = O5FUD2 = 5-fluorouracil (20 mg/kgc/zi, pe cale orală)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Loturi
Glo
bu
le a
lbe
(K/μ
L)
L1
L2
L3
L4
L5
36
Fig. X.12. Valorile cortizolului (µg/dL) la şobolani trataţi cu 5-fluorouracil.
Rezultatele obţinute în urma determinării numărului de globule albe la şobolanii
trataţi cu 5-FU sunt prezentate în tabelul X.1 şi graficul corespunzător. În ambele doze
utilizate, 5-FU a determinat scăderea semnificativă statistic a acestui parametru, atât în cazul
administrării orale, cât şi în cazul administrării pe cale intravaginală, comparativ cu lotul
martor (p<0,05). Leucopenia indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la
animalele cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile
obţinute pentru acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale
intravaginală. În ambele forme de administrare, scăderea numărului total de globule albe a
fost semnificativ statistic mai puternică la doza mai mare (20 mg/kgc/zi).
Rezultatele obţinute în urma determinării hemoglobinei au arătat că în ambele doze
utilizate, 5-FU a determinat scăderea acestui parametru, atât în cazul administrării orale, cât şi
în cazul administrării pe cale intravaginală, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind
asigurate statistic (p<0,05) la toate loturile, cu excepţia animalelor din lotul care a primit doza
mică (6 mg/kgc/zi), pe cale intravaginală.
Trombocitopenia indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la
animalele cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile
obţinute pentru acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale
intravaginală.
Creşterea AST indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la animalele
cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile obţinute pentru
acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale intravaginală.
Creşterea ALT indusă de 5-FU a fost semnificativ statistic mai accentuată la animalele
cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile obţinute pentru
acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale intravaginală.
Rezultatele obţinute în urma determinării ureei, creatininei şi acidului uric seric la
şobolanii trataţi cu 5-FU au arătat că în ambele doze utilizate, 5-FU a determinat creşterea
acestor parametri, atât în cazul administrării orale, cât şi în cazul administrării pe cale
intravaginală, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind asigurate statistic (p<0,05) doar în
cazul analizei comparative L1/L3 şi L1/L5 pentru ureea serică şi, respectiv, L1/L4, L1/L5,
L2/L4 şi L3/L5 pentru acidul uric seric.
Rezultatele obţinute în urma determinării cortizolului seric la şobolanii trataţi cu 5-
FU au arătat că în ambele doze utilizate, 5-FU a determinat creşterea acestui parametru, în
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Loturi
Cort
izol
(µg/d
L)
L1
L2
L3
L4
L5
37
ambele forme de administrare, comparativ cu lotul martor, rezultatele fiind acoperite statistic
(p<0,05) doar în cazul analizei comparative L1/L3, L1/L4, L1/L5, L2/L3, L2/L4 şi L4/L5.
Creşterea fosfatazei alcaline indusă de 5-FU a fost mai accentuată la animalele
cărora li s-a administrat substanţa testată pe cale orală, comparativ cu valorile obţinute pentru
acest parametru la animalele cărora li s-a administrat 5-FU pe cale intravaginală, rezultatele
fiind asigurate statistic doar în cazul analizei comparative L2/L4.
X.5. Concluzii
Cercetările experimentale efectuate au condus la următoarele concluzii:
- administrarea pe cale orală a 5-FU, în ambele doze, a determinat leucopenie cu
neutropenie, anemie, trombocitopenie, efectele cele mai puternice înregistrându-se la
doza mai mare (20 mg/kgc/zi);
- administrarea sub formă de comprimate vaginale a 5-FU a determinat aceleaşi efecte
hematologice, dar mai reduse comparativ cu valorile obţinute în cazul administrării pe
cale orală;
- administrarea pe cale orală a 5-FU, în ambele doze, a determinat creşterea AST, ALT,
a fosfatazei alcaline, a acidului uric, a ureei şi a creatininei serice, efectele fiind
ameliorate în cazul administrării pe cale intravaginală;
- modificările cortizolului seric şi ale parametrilor de stres oxidativ induse de
administrarea orală a 5-FU au fost îmbunătăţite în cazul administrării vaginale, în
ambele doze.
38
CAPITOLUL XI
CERCETAREA IN VIVO A FARMACOCINETICII 5-FLUOROURACILULUI
O etapă importantă din dezvoltarea unui medicament o reprezintă cercetarea in vivo a
acestuia s-a considerat necesară efectuarea de studii preliminare de evaluare in vivo, pe
animale de laborator, a biodisponibilității 5-FU sub formă de comprimate mucobioadezive
vaginale, comparativ cu forma de administrare orală.
Obiectivele specifice au avut în vedere determinarea principalilor parametri
farmacocinetici și determinarea comparativă a profilului în timp a 5-FU din formularea
farmaceutică vaginală nou realizată, comparativ cu administrarea clasică pe cale orală a unei
doze echivalente de 5-FU, pentru a demonstra avantajelor acestei noi formulări.
Administrarea substanțelor. Animalele au fost grupate în două loturi a câte 7
șobolani, la care s-a administrat o doză unică de 5 mg/kg 5-FU (într-un volum de 0,2ml/100g
corp). La primul lot s-a administrat substanța prin sondă eso-gastrică, iar la al doilea lot pe
cale intravaginală, astfel:
- Lot 1 (administrare vaginală): lot la care s-a administrat dispersia obținută din
cantitatea de comprimat mucobioadeziv corespunzătoare dozei de 5-FU;
- Lot 2 (administrare per os): lot la care s-a administrat dispersia de 5-FU în
carboximetilceluloza sodică.
Recoltarea probelor de sânge s-a realizat în vacutainere cu heparină, pentru fiecare
punct din schema de recoltare fiind necesară recoltarea a câte 0,3 mL de sânge. Pentru studiul
farmacocineticii 5-FU din formulările administrate, recoltarea probelor de sânge s-a
desfăşurat într-un interval de 24 de ore, conform următoarei scheme:
- proba 0 – momentul 0 (înainte de administrare),
- proba 1 – la 5 min după administrare,
- proba 2 – 10 min,
- proba 3 – 15 min,
- proba 4 – 30 min,
- proba 5 – 1 oră,
- proba 6 – 2 ore,
- proba 7 – 3 ore,
- proba 8 – 4 ore,
- proba 9 – 6 ore,
- proba10 – 8 ore,
- proba11 – 24 ore.
Prelucrarea probelor de sânge a constat în centrifugarea imediat după recoltare, timp
de 10 min, la 4000 rpm, iar plasma a fost transferată în eprubete separate tip Ependorff şi
stocată la congelator, la temperatura de -20ºC, până în momentul analizei cantitative HPLC.
Analiza probelor s-a realizat prin HPLC, conform metodei validate în capitolul VII. Limita de
cuantificare a 5-FU în probele biologice a fost stabilită la 0,14pg / ml ser uman.
Metoda analizei vizuale a datelor experimentale permite evaluarea aspectului
individual şi general al nivelelor plasmatice din graficele concentraţiilor plasmatice în funcţie
de timp.
O serie de parametri farmacocinetici pot fi evaluați direct din datele experimentale,
deoarece sunt independenţi de modelul de reprezentare a cineticii medicamentului în
organism. Alți parametri farmacocinetici depind de modelul cinetic, astfel încât trebuie să se
ţină cont, la calcularea lor, de modelul farmacocinetic ales.
Analiza statistică a datelor de farmacocinetică a fost realizată cu ajutorul programului
KINETICA (InnaPhase, USA). S-a utilizat testul parametric ANOVA pentru compararea
diferenţelor dintre loturi pentru Cmax şi pentru AUC.
39
XI.2. Rezultate și discuții privind farmacocinetica 5-FU
XI.2.1. Rezultatele analizei vizuale a datelor experimentale și analizei globale a
datelor pentru 5-FU
Metoda analizei vizuale a datelor experimentale evaluează aspectul individual şi
general al nivelelor plasmatice din graficele concentraţiilor plasmatice în funcţie de timp.
Fig. XI.3. Concentraţiile plasmatice medii de 5-FU, în funcţie de timp,
comparativ între căile de administrare
Analiza graficelor concentrațiilor plasmatice medii de 5-FU, în funcție de timp, ale
cele două căi de administrare studiate, arată o similaritate a profilurilor farmacocinetice, fiind
aproape superpozabile, pentru unele perioade. Profilul farmacocinetic al formulării
administrate vaginal este caracterizat printr-o valoare mult mai mare a Cmax comparativ cu
administrarea per os, iar valorile concentrațiilor plasmatice, începând cu 8 ore, la valori
similare cu ale administrării orale, până la 24 de ore după administrare.
XI.2.2. Analiza principalilor parametri farmacocinetici pentru 5-FU
Figura XI.4. Reprezentarea grafică a concentraţiilor plasmatice maxime individuale
pentru 5-FU, comparativ între căile de administrare studiate
Din analiza concentrațiilor plasmatice maxime de 5-FU se observă următoarele
valori: media Cmax = 4.84 ± 1.8 mg/mL la administrarea vaginală și media Cmax = 3.15 ±
1.4 mg/mL la administrarea per os. Analiza statistică a datelor Cmax nu a arătat diferențe
semnificative între concentrațiile Cmax măsurate în cadrul fiecarui lot (factor GROUP: F1,11
0
1
2
3
4
5
6
0 4 8 12 16 20 24
mg/
mL
ore
Farmacocinetica 5-FU
VAGPO
0
2
4
6
8
mg/
mL
vaginal per os
Cmax
40
= 3.312, P = 0.099), ceea ce poate fi echivalent cu eficiență clinică similară prin administrare
pe 2 căi diferite.
Figura XI. 7. Reprezentarea grafică a Tmax pentru 5-FU, comparativ
pe căile de administrare studiate
Din analiza timpului Tmax pentru obținerea concentrațiilor plasmatice maxime de 5-
FU se observă valori apropiate: pentru formularea administrată vaginal Tmax = 0.21 ± 0.05
h, iar pentru administrarea per os Tmax = 0.43 ± 0.77 h. Valorile obținute de noi pentru
Tmax sunt în concordanță cu valorile din alte studii de farmacocinetică a 5-FU la șobolani.
Figura XI. 8. AUC0-t pentru 5-FU pe căile de administrare studiate
Din analiza ariilor AUC0-t și AUC0-oo de sub curba concentrațiilor plasmatice de 5-
FU în timp până la momentul ultimei recoltări, respectiv până la infinit ale loturilor, se
observă valori apropiate: media AUC0-t = 25.31 ± 8.16 mg/mL*h la formularea administrată
vaginal și media AUC0-t = 20.29 ± 3.71 mg/mL*h la administrarea per os, media AUC0-oo
= 29.92 ± 8.58 mg/mL*h la administrsre vaginală și media AUC0-oo = 21.58 ± 3.77
mg/mL*h la administrare per os.
0,0
1,0
2,0
3,0
ore
vaginal per os
Tmax
0
10
20
30
40
50
mg/
mL
* h
vaginal per os
AUC
41
XI.2.2. 3. Rezultatele timpului rezidual mediu (MRT) pentru 5-FU pe căile de
administrare studiate
Tabelul XI .7. Valorile individuale şi medii ale MRT (h-1
) pentru 5-FU pe căile de
administrare studiate
vaginal per os
1 6.12 6.16
2 6.49 6.02
3 8.90 6.61
4 7.77 6.52
5 7.01 6.02
6 7.79 6.50
media 7.35 6.31
dev std 1.01 0.27
min 6.12 6.02
max 8.90 6.61
CV 13.81 4.22
Din analiza timpului rezidual mediu MRT se observă valori apropiate: media MRT =
7.347 ± 1.014 h la formularea administrată vaginal și media MRT = 6.305 ± 0.269 h la
administrarea per os.
XI.2.2.4. Rezultatele ke pentru 5-FU pe căile de administrare studiate
Tabelul XI.9. Valorile individuale şi medii ale constantei de eliminare ke (h-1
) pentru 5-FU
pe căile de administrare studiate
vaginal per os
1 0.102 0.107
2 0.092 0.106
3 0.048 0.104
4 0.077 0.106
5 0.083 0.109
6 0.076 0.111
media 0.080 0.107
dev std 0.018 0.003
min 0.05 0.10
max 0.10 0.11
CV 23.08 2.38
Din analiza constantei de eliminare ke se observă valori apropiate: media ke = 0.079 ± 0.018
h-1
la formularea administrată vaginal și media ke = 0.107 ± 0.003 h-1
la administrarea orală.
42
XI.2.2.5. Rezultatele t1/2 pentru 5-FU pe căile de administrare studiate
Tabelul XI.11. Valorile individuale şi medii ale timpului de înjumătățire plasmatică t1/2
(h) pentru 5-FU pe căile de administrare studiate
vaginal per os
1 6.82 6.48
2 7.50 6.53
3 14.48 6.66
4 8.99 6.54
5 8.34 6.38
6 9.13 6.22
media 9.21 6.47
dev std 2.73 0.15
min 6.82 6.22
max 14.48 6.66
CV 29.65 2.35
Din analiza t1/2 se observă valori apropiate: media t1/2 = 9.21 ± 6.47 h la
administrarea vaginală, respectiv media t1/2 = 6.47 ± 0.15 h la administrarea orală.
XI.4. Concluzii
Între cele două căi de administrare luate în studiu, valorile Cmax obținute după
administrarea formulării pe cale vaginală sunt mai mari comparativ cu administrarea per os,
chiar dacă nu sunt diferențe semnificative statistic (P = 0.099), iar între valorile timpului
Tmax nu au fost observate diferențe semnificative statistic. În mod asemănător, valorile
AUC0-t și AUC0-oo obținute după administrarea vaginală sunt mai mari comparativ
cuadministrarea orală, chiar dacă nu sunt diferențe semnificative statistic (P = 0.2012,
respectiv P = 0.054),
Timpul rezidual mediu MRT la administrare vaginală, respectiv orală prezintă valori
apropiate, dar analiza statistică a relevat diferențe semnificative. Analiza statistică a ke și a
t1/2 a relevat diferențe semnificative între cele două căi de administrare luate în studiu, chiar
dacă valorile lor sunt apropiate.
Se poate considera că administrarea intravaginală a 5-FU prezintă profil farmacocinetic
similar cu administrarea pe cale orală, dar asociată cu mai puține efecte adverse sistemice.
43
CAPITOLUL XII
CONCLUZII GENERALE
Studiul realizat aduce contribuții originale la cercetările efectuate la ora actuală
privind tratamentul diferitelor procese neoplazice. Este cunoscut faptul că 5-FU este un
antimetabolit cu acțiune și la nivelul mucoaselor. Mucoasa vaginală prin specificul ei prezintă
o serie de particularității la administrare, ceea ce a determinat să realizarea unei forme
farmaceutice solide mucobioadezivă, cu reale avantaje la administrare cervico-vaginală.
În urma rezultatelor obținute în cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat se
desprind următoarele concluzii.
Au fost formulate şi preparate prin metoda comprimării directe 12 formule de comprimate mucobioadezive vaginale cu 5-FU cu cedare modificată, pe bază de patru
polimeri C 71, C974, M 4000 şi M 100 000.
Rezultatele obţinute la analiza proprietăţilor de curgere şi compresibilitate a
amestecurilor de pulberi folosite la prepararea comprimatelor mucobioadezive vaginale, arată
faptul că formulările pe bază de C 71 prezintă valori optime ale acestor parametrii,
evidențiindu-se formulările F1 și F2.
Caracteristicile farmaceutico – tehnologice ale comprimatelor obţinute se
încadrează în limitele admise de normativele de calitate în vigoare. Formulările pe bază de
derivaţi ai acidului acrilic F1-F6, prezintă o diminuarea a rezistenţei mecanice direct
proporţională cu creşterea concentraţiei de polimer din formulă în timp ce formulările F7 –
F12, pe bază de derivaţi celulozici sunt caracterizate de o creştere a rezistenţei mecanice
direct proporţională cu creşterea polimerului în formulă.Friabilitatea s-a încadrat în limitele
impuse de normativele în vigoare, cele mai bune rezultate obţinându-se pentru formulările
F1, F2 și F8.
Timpul de dezagregare variază între 67 minute (F6) și 282 minute ( F12).
Caracteristicile bioadezive ale comprimatelor apreciate prin timpul de mucoadeziune ”ex vivo” variază astfel: M 100 000 > M 4000 > C 71 > C 974, nefiind
observate variaţii foarte mari în funcţie de concentraţia polimerului.Rezultatele obținute la
determinarea unghiului de umectare arată că formulările F2,F6 și F7 prezintă cel mai puternic
caracter hidrofil şi cea mai bună adeziune la mucoase.
În etapa de optimizare s-a realizat modelarea matematică care a permis prin metode de analiză factorială găsirea formulării optime. Analiza factorială a definit clar relaţia
ce există între variabilele de intrare, interacțiunile lor (factorii de formulare) şi variabilele
dependente (răspunsuri), realizându-se în acest fel suprafaţa de răspuns a sistemului sau
planul factorial. Rezultatele au fost calculate pentru un interval de încredere de 95%, cu alte
cuvinte se admite o abatere de ±5%, faţă de rezultatele prevăzute teoretic. Valorile DPMO ce
constituie un criteriu de delimitare a spaţiului de estimare confirmă validitatea
modelului.Formula optimă este desemnată ca fiind F2.
Pentru determinarea cantitativă a concentraţiei în 5-FU a comprimatelor mucobioadezive vaginale și a evalua disponibilitatea in vitro a 5-FU din acestea, s-a
elaborarat si validat o nouă metodă de analiză cantitativă a 5-FU prin cromatografia de
lichide de inaltă performanță.Ţinând cont de valorile experimentale obţinute la studiul
compatibilităţii sistemului cromatografic, care se încadrează în limitele prevăzute de
44
standardele în vigoare, se poate afirma că sistemul este compatibil. Intervalul de concentraţii
regăsit în studiul cuantificării conţinutului de 5-fluorouracil în cele 12 formulări de
comprimate mucobioadezive vaginale este cuprins într 93,46 şi 110,28%.
Din rezultatele obținute la evaluarea disponibilității in vitro se observă influența tipului de polimer, folosit la formularea comprimatelor mucobioadezive, asupra
cedării 5-FU. Comprimatele care conțin Carbopol cedează cantităti mai mari de 5-FU (93,85-
105,73) după 10 ore, în timp ce formulările F6-F12, ce conțin Metolose, cedează o cantitate
mai mică de 5-FU, concentrațiile variind înte 57,11-82,92% din concentrația declarată, după
10 ore.Profilurile de cedare diferite ale formulărilor cu 5-FU sunt confirmate şi de rezultatele
obţinute la analiza statistică, prin determinarea factorul de diferenţă f1 și factorul de
similaritate f2.
Pentru determinarea 5- FU din probe de matrice biologice s-a elaborat și
validat o nouă metodă HPLC.Valorile experimentale obţinute la studiul compatibilităţii
sistemului cromatografic se încadrează în limitele prevăzute de standardele în vigoare, deci
,se poate afirma că sistemul este compatibil.Analiza statistică prin testul ANOVA indică
corectitudinea modelului liniar determinat existând o legătură liniară, semnficativă statistic
între concentraţia probei şi aria picului pentru un prag de certitudine de 95%. Metoda a arătat
o relație bună liniară în intervalul de concentrație cuprins între 0,0001 şi 1 ng/ml 5-fluorouracil (R2 = 0,999), cu limite de cuantificare (LOQ) la 0,14pg / ml ser uman, respectiv.
recuperările medii de diferite concentrații de 5-FU în ser au fost de 88,80%
Cercetările experimentale efectuate în studii farmacologice comparative
privind administrarea orală și vaginală de 5-FU au evidențiat faptul că administrarea pe cale
orală în doze de 6 respectiv 20 mg/kgc/zi, a determinat leucopenie cu neutropenie, anemie,
trombocitopenie, efectele cele mai puternice înregistrându-se la doza mai mare;administrarea
sub formă de comprimate vaginale a 5-FU a determinat aceleaşi efecte hematologice, dar,
mai reduse comparativ cu valorile obţinute în cazul administrării pe cale orală;administrarea
pe cale orală a 5-FU, în ambele doze, a determinat creşterea AST, ALT, a fosfatazei alcaline,
a acidului uric, a ureei şi a creatininei serice, efectele fiind ameliorate în cazul administrării
pe cale intravaginală;modificările cortizolului seric şi ale parametrilor de stres oxidativ
induse de administrarea orală a 5-FU au fost îmbunătăţite în cazul administrării vaginale, în
ambele doze;
Cercetarea in vivo a farmacocineticii 5-FU a evidențiat faptul că profilul farmacocinetic al formulării administrate vaginal este caracterizat printr-o valoare mult mai
mare a Cmax comparativ cu administrarea orală, iar valorile concentrațiilor plasmatice se
mențin similare cu administrarea orală până la 24 de ore după administrare. Valorile obținute
de noi pentru concentrațiile plasmatice de 5-FU în plasmă pentru caile de administrare
studiate sunt în concordanță cu valorile din alte studii de farmacocinetică a 5-FU la șobolani,
aceste valori se găsesc în intervalul terapeutic al concentrațiilor plasmatice de la om. În mod
asemănător, valorile AUC0-t și AUC0-oo obținute după administrarea vaginală sunt mai mari
comparativ cu administrarea orală, chiar dacă nu sunt diferențe semnificative statistic (P =
0.2012, respectiv P = 0.054).Timpul rezidual mediu MRT la administrare vaginală, respectiv
orală prezintă valori apropiate, dar analiza statistică a relevat diferențe semnificative. Analiza
statistică a ke și a t1/2 a relevat diferențe semnificative între cele două căi de administrare
luate în studiu, chiar dacă valorile lor sunt apropiate.Se poate considera că administrarea
intravaginală a 5-FU prezintă profil farmacocinetic similar cu administrarea pe cale orală, dar
asociată cu mai puține efecte adverse sistemice.
45
In concluzie toate rezultatele obținute în cadrul tezei de doctorat sunt originale, cu
potențială aplicație biologică și aduc o contribuție la dezvoltarea unei noi forme farmaceutice,
comprimate mucobioadezive vaginale cu 5-FU, destinate tratamentului afecțiunilor cervico-
vaginale.
Perspective de cercetare
Cercetările din teza de doctorat pot constitui un model de elaborare a studiilor pentru dezvoltarea de noi forme farmaceutice mucobioadezive, cu alte activităţii terapeutice .
Rezultatele cercetărilor pot fi aplicate pe cale industrială, la fabricarea de
comprimate mucobioadezive vaginale, lărgind astfel gama produselor destinate administrării
în afecţiuni cervico-vaginale, cu rezultate imediate pentru pacientele cu displazii uşoare care
vor beneficia de implementarea acestei noi forme farmaceutice în conduita terapeutică.
Noile preparate formulate , comprimate mucobioadezive vaginale cu 5-FU, vor fi propuse pentru brevetare pe baza originalităţii formulelor în corelaţie cu eficienţa
terapeutică.
46
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Ahuja A, Khar RK, Ali J. Mucoadhesive drug delivery systems. Drug Dev Ind Pharm.
1997;23:489–515.
2. Bindu M. Boddupalli, Zulkar N. K. Mohammed, Ravinder A. Nath,David Banji, Mucoadhesive
drug delivery system: An overview,J Adv Pharm Technol Res. 2010 Oct-Dec; 1(4): 381–387.
3. Chickering DE, III, Mathiowitz E. Fundamentals of bioadhesion. In: Lehr CM, editor. Bioadhesive
drug delivery systems-Fundamentals, Novel Approaches and Development. New York: Marcel
Dekker; 1999:1–85.
4. Popovici I., Lupuleasa D., Tehnologie Farmaceutică, vol. 3., Ed. Polirom, Iași, 2009: 30-73
5. Gavin P. A., Thomas P. L., David S.J.: Mucoadhesive polymeric platforms for controlled drug
delivery. Eur. Pharm. Biopharm., 2009; 71: 505 – 518.
6. Accili D.,Menghi G.,Bonacucina G., et al.: Mucoadhesion dependence of pharmaceutical polymers
on mucosa characteristics, Eur. Pharm. Biopharm. 2004; 57: 133 – 143.
7. *** http://www.metolose.jp/e/industrial/application.shtml.
8. .***Pharmaceutical Bulletin 30, Lubrizol Pharmaceutical Polymers for Controlled Release Tablets
and Capsules, accessed via the internet at: www.pharma.lubrizol.com.
9. ***Pharmaceutical Bulletin 31, Formulating Controlled Release Tablets and Capsules with
Carbopol®
Polymers, accessed via the internet at: www.pharma.lubrizol.com.
10. ***Pharmaceutical Bulletin 32, Application of Carbopol® 71G NF Polymer in Controlled Release
Tablets, accessed via the internet at: www.pharma.lubrizol.com.
11. Tatavarti, A.S., Mehta, K.A., Augsburger, L.L., Hoag, S.W., Influence of Methacrylic and Acrylic
Acid Polymers on the Release Performance of Weakly Basic Drugs from Sustained Release
Hydrophilic Matrices, J Pharm. Sci., 2004:93(9):2319-2331.
12. *** Noveon Company Technical Literature, 2005.
13. *** Martindale – The Complete Drug Reference, 33rd
Edition 2002 :1499.
14. Nae H N, Reichert W W: “Rheological Properties of Lightly Cross-linked Carboxy Copolymers in
Aqueous Solutions,” Rheologica Acta, 1992; 31,(4) : 351-360.
15. Sandri G., Rossi S., Ferrari F., Bonferoni M. C., Caramella C. M.: Strategies to improve systemic
and local availability of drugs administrated via vaginal route, cap. 22 in: Touitou E., Barry B. W.:
Enhancement in drug delivery, CRC Press, Boca Raton, Fl. USA, 2007:441 – 470;
16. Cojocaru, Ileana; Braha, Steriana, Tehnologie farmaceutică. Forme farmaceutice omogene, Ed.
„Gr.T.Popa”, Iaşi, 2003
17. Cojocaru, Ileana, Forme farmaceutice vaginale în Popovici, Iuliana, Lupuleasa, D., Tehnologie
farmaceutică, vol. 2, ed. a I-a, Polirom Iaşi, 2008: 976-1013
18. Leucuţa S.E., Tehnologie farmaceutică industrială, Ed. Dacia, Cluj Napoca, 2001:610
19. Corbo, D.C.; Liu, J.C.; Chien, Y.W., Characterization of the Barrier Properties of Mucosal
Membranes. Journal of Farmaceutical Sciences 1990;79(3): 202-206
20. Diamantis A, Magiorkinis E, Androutsos G. Different strokes: Pap-test and Babes method are not
one and the same. Diagn Cytopathol. 2010; 38(11):857-9
21. Diamantis A, Magiorkinis E, Androutsos G. Different strokes: Pap-test and Babes method are not
one and the same. Diagn Cytopathol. 2010; 38(11):857-9
22. Cox J. T.: Human papilloma virus testing in primary cervical screening and abnormal
Papanicolaou management. Obstr. Gyncol. Surv. 2006; 61(1), 15 – 25.
23. Gammon D. C., Reed K. A., Patel M., Balaji K. C., Intraurethral fluorouracil and lidocaine for
intraurethral condiloma acuminata. Amer. J. Health Syst. Pharm., 2008; 65(19): 1232 – 1236.
24. Syed T. A., Qureshi A., Seyed A. H., Shahida M. A.: Management of intravaginal warts in women
with 5-fluorouracil (1%) in vaginal hydrophilic gel: a placebo – controlled double – bind study.
Int. J. STD AIDS, 2000; 11:371 – 374.
25. Gross K., Kircil L., Kricorian G.: 5% 5-fluorouracil cream for the treatment of small superficial
basal cell carcinoma: efficacy, tolerability, cosmetic outcome and patient satisfaction. Dermatol.
Surg., 2007; 33: 433 – 440.
47
26. Arias J. L., Lopez-Voita M., Degado A. V., Riuz M. A.: Iron – ethylcelullose (core shell)
nanoplatform loaded with 5-fluorouracil for cancer targeting. Colloid and Surface B:
Biointerfaces, 2010;77:111-116.
27. Wang D. S., Li J. G., Li H. P., Tang F. Q.: Preparation and drug releasing property of magnetic
chitosan – 5- fluorouracil nano-particles. Trans. Nonferrous Met. Soc. China, 2009; 19:1232–1236.
28. Fang Y., Qin X., Zhou D., et al. In vitro cytotoxicity, in vivo biodistribution and antitumor activity
of HPMA copolymer – 5-fluorouracil conjugate. Eur. Pharm. Biopharm., 2008;70:770 – 776.
29. Paolino D., Cosco D., Muzzalupo R., et al. Innovative bola – surfactant niosomes as topical
delivery systems of 5-fluorouracil for the treatment of skin cancer. Int. J. Pharm., 2008; 353:233 –
242.
30. Zhu L. Z., Ma J. W., Jia N. Q.,et al.: Chitosan coated magnetic nanoparticles as carrier of 5-
fluorouracil: preparation, characterization and cytotoxicity studies. J. Coll. Surf. B.: Biointerfaces,
2009; 61(1):1 – 6.
31. Huang J., Wang J. W., Gong T., Zhang Z. R.: Synthesis and characterization of insulin - 5-
fluorouracil conjugate, enabling insulin as a multi – drug carrier via dendritic approach. Chin.
Chem. Lett., 2007; 18: 244 – 250.
32. *** MODDE 10.1, Software for Design of Experiments and Optimization, User’s Guide and
Tutorial, Umetrics Academy, Umea, 2012.
33. L.V. Boiculese, G. Dimitriu, Mihaela Moscalu, Biostatistica, Ed. PIM, Iaşi, 2007.
34. Ana Cristina de Mattos, Najeh Maissar Khalil, Rubiana Mara Mainardes
Development and
validation of an HPLC method for the determination of fluorouracil in polymeric nanoparticles
Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences 2013vol. 49, n. 1:251-58
35. ***Ghid ICH, -Validation of Analitycal Methods, Definition and terminology ICH Q2A ,2005
36. ***Ghid ICH-Validation of Analitycal Methods,Procedures and Methodology ICH Q2B,2005
37. ***Ghid ICH -Validation of Analitycal Procedures and Methodology Q2(R1)
38. L. Roman, M. Bojita, R. Săndulescu, D. L. Muntean, Validarea Metodelor de Analiza si Control-
bazele teoretice si practice, Editura Medicala, 2007
39. Gavrilovici C. Introducere în bioetică. Iaşi: Junimea, 2007.
40. ***AVMA Guidelines on Euthanasia (Formerly Report of the AVMA Panel on Euthanasia), 2007,
6-7.
41. ***Protocole d’amendement à la convention européenne sur la protection des animaux vertébrés
utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques. Strasbourg, 22.06.1998.
42. González Sánchez JL, Flores Murrieta G, Chávez Brambila J et al. Topical 5-fluorouracil for
treatment of vaginal intraepithelial neoplasms. Ginecol Obstet Mex 2002; 70: 244-247.
43. Anderson JH, Kerr DJ, Setanoians A, Cooke TG, McArdle CS A pharmacokinetic comparison of
intravenous versus intra-arterial folinic acid. Br J Cancer. 1992;65: 133–135
44. Takahashi T, Kohno K, Yamaguchi T, Narisawa T Preoperative use of 5-FUorouracil suppository
for carcinoma of rectum. Am J Surg.1982; 143: 183–185.
45. Takahashi T, Mizusawa H, Kato T, Yamaguchi T. Preoperative irradiation and 5-fluorouracil
suppository for carcinoma of the rectume. Am J surg. 1988;156: 58–62.
46. Galandiuk S, Wrightson W, Marr L, Myers S, LaRocca RV Suppository delivery of 5-fluorouracil
in rectal cancer. Ann surg Oncol. 1996;3(3): 270–276.
47. Nishioka B, Watanabe S, Fijita Y, Kojima O, Morisawa K, et al Clinical studies of intrarectal
administration of 5-FU emulsion as an adjunct to surgical treatment for rectal cancer. Jpn J Surg.
1980;10(2): 110–114
48. Watanabe S, Nishioka B, Fujita Y, Kojima O, Morisawa K, et al. Experimental studies of
intrarectal administration of emulsified 5-FU as an adjuvant to the surgical treatment of
recta,cancer. Jpn J Surg. 1980;10(2): 17–21
49. Rougler P, Nordlinger B. Large scale trial for adjuvant treatment in high risk resected colorectal
cancers. Ann Oncol. 1993;4: 821–828.
50. Rahangdale L1, Lippmann QK2, Garcia K3, Budwit D4, Smith JS5, van Le L2. Topical 5-
fluorouracil for treatment of cervical intraepithelial neoplasia 2: a randomized controlled trial. Am
J Obstet Gynecol. 2014;210(4):314.e1-8.
48
Lista articolelor publicate
Articole in extenso în cadrul tezei de doctorat
1. Laura Palade, Iuliana Popovici, Gratiela Popa, Ileana Cojocaru, Elaboration and
validation of an HPLC method for the quantitative assay of 5-fluorouracil, Farmacia,
2013; Vol.61:526-532 http://www.revistafarmacia.ro/201303/art.11.palade%20526-
532.pdf IF=0,578
2. Laura Palade, Iuliana Popovici, Ileana Cojocaru, In vitro evaluation of 5-fluorouracil
dissolution profiles from vaginal bioadhesive tablets, Farmacia, 2013, Vol.61, 4,640-
647 http://www.revistafarmacia.ro/201304/art.03.palade%20640-647.pdf IF=0,578
3. Ileana Cojocaru , Laura Palade, Iuliana Popovici , Gabriela Georgescu, Magdalena
Bîrsan: Research on the development of bioadhesive vaginal tablets containing 5-
fluorouracil Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi., 2013 Ian-March;117(1):263-268
4. I. Cojocaru, L. Ochiuz, G. Popa, I. Popovici, M. Voitcu, L. Palade, Development and
characterisation of vaginal bioadhesive tablets with 5-Fluorouracil, 8th World Meeting
on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology,
Istambul,Turkey, 2012
5. Ileana Cojocaru Lăcramioara Ochiuz Gratiela Popa, Laura Palade, Mihaela Moscalu,
Iuliana Popovici: Study on the influence of variables on flow and compressibility
properties of powders for development of bioadhesive vaginal tablets with 5-
Fluorouracil, 38th
Annual Meeting and Exposition of the Controlled Release
Society,Maryland, USA, 2011.
6. Laura Mihaela Palade, Lăcrămioara Ochiuz, Ileana Cojocaru, Iuliana
Popovici,:Formularea si prepararea unor comprimate bioadezive pe baza de polimeri
hidrofili cu 5-fluorouracil, 50 de ani de Invatamant Universitar Farmaceutic la Iasi,
Ed. UMF Gr. T. Popa, Iaşi,2011 p. 138-139,ISBN 978-606-544-073-9
7. Laura Mihaela Palade,Ileana Cornelia Cojocaru,Lacramioara Ochiuz A.
Ionescu,Iuliana Popovici Studii privind dezvoltarea unor comprimate vaginale cu
cedare modificata cu 5-fluorouracil- CNFR 2010 13-16 octombrie ,Tg. Mures
Romania.
Alte lucrări in extenso
1. Magdalena Bîrsan, Iuliana Popovici , Laura Palade , Ileana Cojocaru: Research studies on the quality of bio-mucoadhesive tablets containing miconazole nitrate Rev
Med Chir Soc Med Nat Iasi., 2013 Ian-March;117(1):257-262.
2. Ileana Cojocaru, Gabriela Georgescu, Laura Palade, Factors influencing the content of pharmacist - patient communication related to contraceptive product, CD-ROM -
49
Proceedings – 11th
Panhellenic Pharmaceutical Congress, Athens, march, 2003,
European Journal of Drug Methabolism and Pharmacokinetics, 2003,vol. 28,
3. Ileana Cojocaru, Iolanda Elena Blidaru, Daniela Cristina Dimitriu, Laura Palade
Supozitoare vaginale cu clotrimazol - Vol. “Chimioterapia antimicrobiană
antifungică şi antivirală actuală”, Editor M. Nechifor, Cluj Napoca, 2003, ISBN 973-
686-482-2
4. Ileana Cojocaru, Daniela Cristina Dimitriu, Mariana Voitcu, Iolanda Blidaru, Laura
Palade, Criterii în alegerea metodelor contraceptive,Rev. Medico-Chirurgicală, Iaşi,
Vol. 106, nr. 3, supliment, pag. 198-202, 2002.
Membru în proiecte de cercetare
Contract nr. 18775/2010, titlul proiectului Cercetări privind dezvoltarea unei forme
farmaceutice tip comprimat bioadeziv vaginal cu 5-florouracil (Director de proiect:
Cojocaru Ileana, Membri: Lăcrămioara Ochiuz, Gratiela Popa, Palade Laura
Mihaela);