Flavo Ephera

5/11/2018 Flavo Ephera

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Ciencia e lnvestigacion Vol IV (I). 2001/ Flavonoides de Epehedra americana - Pablo Bonilla, Bertha Pareja

FLAVONOIDES DE Ephedra americana (pineo-pineo), ACCION BIOLOGICA SOBREEL SISTEMA INMUNOLOGICO (IgE)

Pablo Bonilla Rivera* Bertha Pareja Pareja**

RESUMEN

Se realiz6 el estudio fitoqufrnico y de la aetividad bio16gica de la parte aerea de Ephedraamericana, "pinco-pineo" planta que erece en zonas altoandinas del departamento del Cusco,en la provincia de Calca, Peru, aproximadamente a 3500 msnm. Con la muestra en polvo, sereaIiz6 la marcha fitoqufmica , determinandose la presencia de alcaloides, compuestosfen6Iieos tipo flavonoides, taninos, glie6sidos, etc., mediante ensayos de solubilidad seobserve que los metabolitos secundarios eran de mediana yalta polaridad, confirmandose porcromatograffa en capa fina. Se procedi6 a la separaci6n de los compuestos fenolicos porcrornatograffa en columna rapida, obteniendose varias fraeciones. Estas fueron purificadasmediante cromatografia a escala preparativa utilizando diversos sistemas de solventeselucidandose estructuralmente cinco flavonoides de conocida actividad antioxidante,denominados: Hesperidina; Crisina; 3',4' ,5,7-tetrahidroxi-6,8-di-R flavona; 3' ,5,1' -trihidroxi-4' ,6-dimetoxi flavonol y 4' -hidroxi -5,7 -dimetoxi flavonona. En el extracto etan6lico sedetermin6 actividad inmunoestimulante, efecto antioxidante, accion t6xica sobre Artemiasalina, acci6n antiulcerosa, acci6n sobre la motilidad intestinal, actividad antiinflamatoria, sutoxicidad y actividad antimicrobiana.

Palabras clave: Efedra, compuestos fenolicos, flavonoides, hesperidin a, crisina,sistema inmune, efecto antioxidante.


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ABSTRACT

In the present investigation we have developed a phytochemical study and determined thebiological activity of the aerial parts of a vegetal Peruvian species named Ephedra americanaKnown as-"pinco-pinco", It grows in the highlands of Cusco-Peru, in the province of Calca,approximately at 3500 m.o.s.l. The powder of the sample was used to for the phytochemicalscreening in wich we identified the presence of alkaloids, phenolic compounds, flavonoidstypes, tannins, glicosydes, etc. By means of a solubility screening test, it was determined thatthe secondary metabolites were moderately and highly polar.This was pruved by means ofThin Layer Chromatograpy. Also, a separation of the phenolic compouunds by Flash ColumnChromatograpy has been performed, obtaining many fractions. These were purified by meansof Preparative Scale Chromatograpy using various solvent systems and five flavonoids withaccepted antioxidant activity were structurally elucidated: hesperidin; chrisyn;3',4' ,5,7-tetrahidroxi-6,8-di R flavone; 3' ,5,7-trihidroxi-4' ,6-dimetoxi flavonol and 4'-hidroxi-5,7-dimetoxi flavanone. In the ethanolic extract it has been determinated theinmunostimulant activity, the antioxidant effect, toxic action by Artemia salina, antiulceractivity, action on the intestinal motility, anti-inflammatory activity, toxicity andantimicrobial activity.Key words : Ephedra, fenolic compounds, flavonoids, hesperidin, chrisyn, inmune system,antioxidant effect.

INTRODUCCIONA los metabolitos secundarios de lasplantas medic inales se les atribuye, enmedicina tradicional, algunas propiedadescurativas y constituyen un gran potencialde reserva inexplorada de gran utilidad alhombre, las disciplinas que los estudianson la Fitoqufrnica y la Farmacologfa quepermiten conocer los principios activos,evaluar las vias de biosfntesis, degradaciony los mecanismos de regulacion. (1).La presente investigacion es sobreEphedra americana" pinco-pinco " , queposee gran cantidad de flavonoides, quepenni ten a la planta medicinal crecer,

multiplicarse, defenderse y sobrevivir,evidenciando su actividadinmunoestimulante y su posible utilidadpara tratar disfunciones del SistemaInmunitario y otras actividades biologicas.

GENERALIDADES

2.1. EPHEDRAS- La hierba"rna huang" usada en China desde laantiguedad para el tratamiento de granvariedad de afecciones, estimulantecirculatorio, diaforetico, antipiretico,sedante de la tos, etc., pertenece al grupode las "Ephedras''.


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El genero Ephedra pertenece a la familiaEPHEDRACEAE 0 GNETACEAE delorden GNETALES, con cerca de 60especies,subarbustivas

plantas arbustivaserguidas, trepadoras

oo

rastreras, con ram as equisetifonnes.Crecen en Africa, Asia, Europa Central,America del Norte y en Sudamerica.Entre las especies mas conocidas tenemos:Ephedra vulgaris del Asia; Ephedrahelvetica de Europa; Ephedra multifloraPhil., Ephedra gracilis Phil., Ephedraandina Poepp., Ephedraamericana Humb, et BonpI. ex Willd.( E.americana Umbo et Bonpl. var. HumboldtiiStapf "pinco-pinco", Peru), de Sudamerica.(2,3)

2. 2. ASPECTOS QUIMICOS DE LASEPHEDRACEAE

2.2.1. ALCALOIDES DE EPHEDRAS:Derivados de la f 3 -feniletilamina:

OHOH

Quercet ina

Efedrina CIOHIs NO ; Pseudoefedrina CIOHI5 NO; N-metil efedrina c., H17NO; N-metil Psedoefedrina c.. HI7 NO;Norefedrina C9 H13 NO;NorPseudoefedrina C9 H13NO ; O-BenzoilPseudoefedrina C17 H19 NO; EfedroxanoCll HI5 N02 6 4(S), 5(R) - 3, 4- dimetil-5 - feniloxazolidona; Efedralona CII H9N04; Feruloilhistamina, etc. (2-4).

2.2.2. COMPUESTOS FENOUCOSEN EPHEDRAS :

Fenilpropanoides: acido clorogenico, acidocafeico, etc. y ChaIconas; Flavonoidestipo flavona 0 flavonol y

sus glic6sidos: Kaemferol, Rutina,Herbacetina, Apigenina, Quercetina,Quercetin -3-0- galact6sido, etc.;

Proantocianidinas, Catequinas,Prodelfi nidinas, Leucopel argonidinas,Leucocianidina, etc. (5-7).

OH

HO

OH

O-GalO H o

Quercet ina-3-Q-Galactosa


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2.3. ASPECTOS BIOLOGICOS DELAS EPHEDRACEAE

Son plantas de uso medicinal empleadas enel tratamiento de enfermedades de las viasrespiratorias y genitourinarias (1-7) Laactividad biol6gica reportada para algunosflavonoides aislados de efedras, es unefecto antiviral, contra la infecci6n delHIV-2 yel virus Herpes simplex. (8)

En la medicina orientalla ephedra es usadapara el tratamiento del asma y bronquitis,enfriamientos y resfriados, tos, fiebre,dolor de cabeza, congesti6n nasal y comoun agente antialergico, segiin Bruneton,1991.(1) En China han investigado sususos . clinicos para el asma bronquial,bronquitis cr6nica, neumonfa infantil,catarros, etc.

2.4. LA EPHEDRA PERUANALa hierba conocida por los nativosperuanos como "pinco-pinco", ereeeabundantemente en el Cuseo, Arequipa yCajamarea, es usada en la medieinatradieional, ereee en las altiplanicies deBoli via y la conocen como "condorsara"En la zona andina de Argentina y Chilela llaman "pingo-pingo" y "solupe".

En el Peru habitan la Ephedra americanaH & B var. andina y la Ephedra andinaPOEPP & ENDL, ambas indistintamentellamadas eomunmente "pinco-pinco", (7).

Segun referencias hist6ricas,etnobotanicas, de medicina popular y dela etnofarmaeologfa, la Ephedra

americana "pinco-pinco" fue usada por losantiguos peruanas y araueanos (chilenos),considerandolos como un remediouniversal, como antidisenterico,antiinflamatorio, hemostatico, diuretico,afecciones renales, tratamiento defracturas, sudorffico, antipiretico, sedantede la tos, estimulante respiratorioespecialmente para el asma bronquial, asftambien como midriatico,2.S. SISTEMA INMUNELa respuesta a un antfgeno se denominarespuesta inmune.

Los linfocitos, celulas derivadas del tejidolinfatico, son activados por antfgenos quereconoeen especfficamente, se dividen yproliferan para produeir un clon. CelulasT, dependientes del timo, respondendirectamente a los antfgenos que puedenser algunos bacilos acido resistentes,hongos, celulas extrafias, formando clonesque le confieren inmunidad celular.Celulas B, equivalentes de bolsa, requierencooperaci6n de las celulas T antes de poderformar un clan, pera tambien pueden serestimuladas direetamente por anttgenos, enparticular por macromoleculas extrafias.Los orgamsmos son continuamenteinvadidospor sustancias extrafias 0anttgenos, por 10 que producen anticuerposque se unen a los antfgenos .y losdestruyen.

Estrueturalmente la molecula de unanticuerpo esta form ada par dos cadenaspolipeptfdicas livianas y dos cadenaspesadas unidas por puentes disulfuro, eada


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cadena liviana 0 pes ada incluye dosregiones; una variable (V) que difiere enlos distintos anticuerpos y otra constante(C), que suele ser la misma en la mayorfade anticuerpos.Todos los anticuerpos son protefnasllamadas globulinas y del analisis de losgenes de la cadena pesada se obtienen 8tipos de secuencias en la region constante:~, (), Y3, Y!' Y2b, Y2a, E, a, correspondientes alas inmunoglobulinas: IgM, IgD, IgG3 .IgG), IgG2b, IgG2a, IgE, IgA , ademas dela region variable en 3 segmentos:V, D, 1.La IgG es un anticuerpo bivalente yes casiel 75% de los anticuerpos en una personanormal y fija el complemento, conjunto deprotefnas sericas que destruyen a losmicroorganismos; la IgE constituye soloun pequefio % de los anti cuerpos

denominados reagmas, y estaespecial mente implicada en la alergia, seune a ciertos receptores de membrana delas celulas cebadas, las cuales contienengrandes cantidades de histamina, la queprovoca diversas reacciones alergicas porla union con el antfgeno.(10-12).

2.6. ANTIOXIDANTES

Los antioxidantes previenen lasmodificaciones indeseables debidas a lasoxidaciones, son aquellas sustancias queimpiden 0retard an las oxidaciones,

Los antioxidantes pueden ser clasificados,segun su estructura qufmica en fenoles,quinonas, aminas, enzimas, etc. y segiin su

mecanismo de acci6n como sustancias queinterrumpen Ia reacci6n en cadena defonnaci6n de radicales libres, sustaneiasreduetoras y agentes quelantes .

a) BiofIavonoides de ongen natural:quercetina, rutina, genistefna,prunetina, rarnnetina, kaemferol,eatequinas, etc.

b) Fenilpropanoides: acidoclorogenico, acido eafeieo, acidofenilico, etc. (9)

PARTE EXPERIMENTALMATERIAL Y METODOS

Se emplearon tecnicas instrumentales,espectrofotometricas y metodos biologicosdebidamente validados.

INVESTIGACI6N FITOQuiMICA3.2.1. RECOLECCION yPREPARACION DE LA

MUESTRA.La planta Ephedra americana "pineo-pineo" fue ubieada y recoleetada en laprovincia de Calc a (Cuseo) a 3500 m s nm., en el mes de mayo, epoca de fIoraei6n.La parte aerea fue secada a la sombra atemperatura ambiente y posteriormentepulverizada en un molino de euchillas yalmacenada en frascos color ambar, parasu posterior tratamiento fitoqufrnico ybiol6gico.


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3.2.2. TECNICA DE EXTRACCION DELOS METABOLITOSSECUNDARIOS DE Ephedraamericana:

Se maceraron 100 g de polvo de la parteaerea de Ephedra americana en 1000 mlde etanol durante 9 dfas, protegido de Ialuz y el calor, haciendose una segundarnaceracion en otros 1000 ml. de etanoldurante 8 dias mas, los filtrados sejuntaron y evaporaron a sequedad a 40Cen una estufa de aire circulante, hastaobtener el extracto etanolico I, que seutilize para realizar los ensayosfi toqufmicos , como el de solubilidad, lamarcha fitoqufrnica y los ensayoscromatograficos. (13)

3.2.3. CROMATOGRAFIA EN CAPAFINA DEL EXTRACTOETANOUCO I.

EI extracto etanolico I se sometio acromatografta en capa fina unidimensionalascendente, en Silicagel G 60, conc1orofonno y metanol en variasproporciones y BAW (4:1:5), por 4 hs , Seobservo a la luz UV 366 nm,cornprobandose fluorescencias de coloresceleste, verdosa, rojiza asf como algunasde color purpura; al revelar con acidosulfurico al 50% se observe a luz visibleunas manchas amarillas verdosas que nosindicaban la presencia de compuestosfenolicos tipo flavonoides, igualmente alusar vapores de amonfaco; al revelar conluz UV 366 nm + acido sulfurico al 50%,se observe la intensificacion de lafluorescencia celeste a celeste brill ante; al

revelar con tric1oruro ferrico, se observeque algunas manchas tomaban un colormatron grisaceo 10 que indicaba que erancompuestos fenolicos; y revelando con elreacti vo de Dragendorff, se observemanchas intensas de color rojo ladrillo 1 0que indicaba la presencia de alcaloides.

3.2.4. CROMATOGRAFiACOLUMNA RAPIDA DE I.

EN.

Se realize una cromatograffa en columnarapida, con la finalidad de fraccionar elextracto total I, en subextractos condiversos solventes de polaridad creciente.

Se prepare una columna de silicagel con 5g del extracto total disuelto en 1 ml deetanol, el cual fue mezc1ado con 10 g desilicagel hasta fonnar una papilla granularhomogenea que fue sembrada en la partesuperior de la columna, sobre la superficiede la silicagel. Se procedio a la elucionutilizando: n-hexano, c1orofonno, metanoly agua destilada; con la ayuda de unabomba de vacfo, que facilito la eluci6n enfonna rapida y continua, obteniendose lassoluciones que al concentrarse dieron lossubextractos II, III, IV YV. Las fraccionesfueron controladas por c.c.f.

3.2.5. CROMATOGRAFIACAPAFINA APREPARATIV A

ENESCALA

Para aislar y purificar los metabolitossecundarios presentes en el subextracto II,se realizaron cromatograffas en capa fina aescala preparativa, utilizando


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como soporte plaeas de vidrio de 20x20em, como adsorbente silieagel 0-60 6Celulosa + F366 nm, como sistema desolventes BAW, y observandose con LuzU V 366 Y 254 nm, fueron separados conmezc1as de metanol c1oroformo en formarepetitiva hasta lograr la pureza adeeuadapara su posterior elucidacion estructuralmediante Espectroscopfa UV.

3.2.6. DETERMINACI6N DE LAACTIVIDAD ANTIOXIDANT EPOR c.c.r.

Se utilize la tecnica cromatografica encapa fina, por decoloracion de extractosricos en beta caroteno para la detecci6n deeaptadores de radicales libres , segiinJoyeux y col. 1995, (14) se ensayaron lafraeei6n metanolica II y la fraccion acuosam .

a) MP : extracto metanolico II; fasefija: Silieagel 0-60 de 5 x 20 em.;fase movil: BAW 4: 1:5 v/v; tiempode desarrollo: 2 hs; frente desolventes: 12 em.Revelador: Extraeto con betacaroteno en cloroformo + Luz UV254 nm.(100 g de zanahorias + 100 ml deacetona, se filtra, al residuo se Ieagrega 100 ml de eloroformo sefi1tra y se deseca con sulfato desodio anhidro).

b) MP: extracto acuoso ill; fase fija:Silieagel 0-60 de lOx 20 em; fasemovil: BAW 4: 1:5 v/v; tiempo dedesarrollo: 2 hs; frente desolventes: 12 em.

Revelador: Extracto con betacaroteno en cloroformo + Luz UV254nm.

3.2.7. ELUCIDACION ESTRUCTURALDE COMPONENTES AISLADOS

Los componentes qufmicos aisladosmediante cromatograffa en capa fina aescala preparativa, fueron elucidadosespectroscopicamente mediante leeturas alUV en metanol y correlaeionadosqufmicamente con reactivos dedesplazamiento, los que unidos a losresultados crornatograficos y a lasreacciones quimicas especfficas, nospermitieron sugenr las estructurasqufmicas.

3.3.0. INVESTIGACION BIOLOGICA3.3.1. ENSAYO

INMUNOESTIMULANTE:ESTIMULACION RETicULOENDOTELIAL DE DELA VEAUY COL.(1980), en Gershwin yCooper. (23)

Materiales: Animales de experimentacion:ratas albinas marcadas y pesadas.Extracto Etanolico total I, Xilol, Tintachina N 17, Twen al 5%, Suerofisiokigico.Equipos: Espectrofotometro UV-Visible,Microscopio, Balanza Analftica.

PROCEDIMIENTO

Se realizo el metodo de Delaveau y col.(Tabla N 1 deserito en Gershwin yCooper, 1988): se determinaron los


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datos basales de cada animal, seadministro 0.5 ml de solucion al 1% delextracto total en estudio ( dosis variadasdurante cinco dias), se espero 24 horas yluego se adrninistro 0.5 ml desolucion detinta china al 10% en suero fisiologico viaendovenoso, utilizando la vena sagitalde la cola, se extrajeron muestras desangre venosa ai, 2 y 3 horas, se

hemolizo 10 ul de sangre en 5 ml de aguadestilada, se leyo en el espectrofotornetroUV -Visible, longitud de onda 650 nm,filtro rojo, anotandose los resultados, seefectuo frotis, tifiendose con el coloranteGiemsa, contandose las celulas, setabule y comparo los resultadosobtenidos. (12,23).

TABLA N 1 METODO DE DELAVEAU Y COL. ENSAYO INMUNOESTIMULANTE

GRUPO TRATAMIENTO N DE RATAS1 Control 82 Ext. Total Efedra 12.5 mg/kg 83 Ext. Total Efedra 50 mg/kg 84 Ext. Total Efedra 100 mg/kg 85 Isoprinosine 300 mg/kg 8Estimulante Sistema Inmune6 Prednisona 100 mg/kg 8

corticoide, Inhibidor SistemaInmune.

3.3.2 ENSA YO DE TOXICIDAD ENARTEMIA SALINA

Se 'prepare la dilucion del extracto total: 20mg del extracto total I se disolvieron en 2ml de DMSO, se transfirieron 5, 50 y 500ul a viales que corresponden a lasdiluciones de 10, 100 y 1000 ug/ml,preparandose 3 viales para cadaconcentracion. Se prepare tambien vialescontrol conteniendo 50 ul de DMSO. Serealizo la incubacion de los huevos deArtemia salina, a temperatura ambiental,luego de 48 hs. los huevos eclosionaron,colectandose las larvas con una pipetaPasteur, adicionandose 10 larvas a cada

vial, ajustandose el volumen a 5 ml porvial con agua de mar. Transcurridas 24 hs.,se procedi6 a contar el mimero de larvassobrevivientes en cada diluci6n, los datosse procesaron con el programa decomputadora Finney (DOS) para obtenerlos valores de CONCENTRACIONLETAL MEDIA, con intervalos deconfianza del 95%. (15-16)3.3.3. ACTIVIDAD ANTIULCEROSASe ensay6 la actividad antiulcerosa delextracto etan6lico I y la fracci6nmetanolica n ; con tres niveles de dosis decada extracto, los que fueronadministrados por via peroral a ratones con


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lesiones gastricas inducidasindometacina. (17,18).

por

3.3.4. ACTIVIDAD SOBRE LAMOTILIDAD INTESTINAL

Se evalu6 la motilidad intestinal por elextracto etanolico I y la fracci6nmetanolica II; con tres niveles de dosis decada extracto, los que fueronadministrados por vfa peroral a ratones,que recibieron posteriormente carbonactivado 0,1 ml de una suspensi6n al 5%en goma tragacanto, utilizado comomarcador de avance de la materia fecal enel raton. (19)3.3.5.ACTIVIDAD ANTllNFLAMATORIA

Se ensay6 la actividad antiinflamatoria delextracto etan6lico I y la fraccionmetan6lica II ; los extractos fueronadministrados por via peroral a ratones conedema subplantar inducido porcarragenina. (20,21)3.3.6. ENSA Y~S DE TOXICIDAD

AGUDA Y SUBCRONICA3.3.6.1. TOXICIDAD AGUDA.

DETERMINACION DE DOSISLETAL50.

DL50 POR viA PERORAL:Se tomaron ratones albinos, formandosegrupos at azar de seis animales cada uno,un grupo recibi6 el solvente (para elextracto I suspendido en una solucion depropilenglicol al 5% en agua destilada) queayud6 a disolver al extracto; hasta producirla muerte de todo el grupo. Se tuvo encuenta el criterio de Williams y Burson

para la calificacion de los resultados deDLso (mg/kg); la sustancia esextremadamente toxica


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RESULTADOS

4.1.0. RESULTADOS FITOQuiMICOS

TABLA N 2 MARCHA DE SOLUBILIDAD

MUESTRA PROBLEMA SOLVENTES RESULTADOS5 mg de extracto etan6lico 0,5 ml de agua destilada +5 mg de extracto etan6lico 0,5 ml de metanol ++++5 mg de extracto etan6lico 0,5 ml de etanol +++5 mg de extracto etanolico 0,5 ml de n-butanol +

(+) Poco soluble, (+++) Soluble, (++++)Muy soluble 0bastante soluble

TABLA N 3 MARCHA FITOQUIMICA DEL EXTRACTO ETANOLICO DE Ephedraamericana

Reactivo Resultado MetaboliteNinhidrina - Aminoacidos libresTric1oruro ferrico +++ Compuestos fen61icosGelatina +++ TaninosShinoda (Mg + HCI) ++ FlavonoidesHidroxilamina ++ OximasNitrato de cerio amoniacal ++ AlcoholesMolish +++ Gluc6sidosVainillina sulfurica +++ GlucosidosBenedict +++ Gluc6sidosAntrona +++ Gluc6sidosTollen's +++ Azucares reductoresFehling +++ Azucares reductoresMayer ++ AIcaloidesDragendorff +++ AlcaloidesIndice afrosimetrico +- Esteroides (saponinas)


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TABLA N 4 CROMATOGRAMA DE LOS COMPONENTES DE Ephedra americana~-- .... - H2SO4 H2SO4 Reactivoo m p o Rf. Visible Luz UV36 6 FeCI3 AUV Metabolito

N -i-Visible + Luz UV36 6 DragendorffMarron Fluorescencia Marron Marron Fluorescencia Glicosido1 0.26 Claro celeste gris verdoso celeste - 280,326 flavanonabrillante

2 0.39 Marron Purpura Gris Marron Purpura 284,298 FlavonaClaro verdoso - (h) ,3443 0.57 Marron Fluorescencia Azulado Verdoso Marron 276,364 Flavonolrojizo rojiza rojizo -

Marron Fluorescencia Marron 252 (h),4 0.65 claro purpura Azulado Verdoso rojizo - 268,314 Flavonarojiza5 0.78 Marron PUrpura Gris Verdoso Purpura 276,314 Flavanonaoscuro6 0.87 Marr6n Florescencia Marron Marron Rojo intenso Clorofilaroja azulado verdoso - -scuro7 0.04 Marr6n Purpura Marr6n Marron Purpura Rojo - Alcaloidesladrillo8 0.13 Marron Purpura Marr6n Marr6n Purpura Rojo - Alcaloidesladrillo

TABLA N 5 CROMATOGRAFfA EN COLUMNA RAPIDA DEL EXTRACTO I

Subextractos Peso del beaker Peso del beaker Peso del extracto y+ muestra porcentajesMetanolico II 106 g 108,5_g 2,5 g 50%Cloroforrnico IV 109,8 g 110,2 g 0,4 g 8%n-hexano V 53,9 g 53,95 g 0,05 g 1%Acuoso III 104g 105,1 g 1,1 g 22%

TABLA N 6 CROMATOGRAMA DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOSMETANOLICO II Y ACUOSO III DE Ephedra americana

Extracto Metan61ico II Extracto Acuoso IIIComp, N Visible Visible + UV254 + Visible Visible + UV366 + UV254 +caroteno caroteno caroteno caroteno caroteno

1 Marron - Oscuro - - - -claro2 Marron - Oscuro - - - -claro3 Marron Naranja Oscuro - - - -4 Marron Naranja Oscuro - - - -5 Marron Naranja Oscuro - - - -6 Marron - - - - - -7 - - - Marron - - Se decolora8 - - - Marron - - Se decoloraclaro


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4.2.0. RESULTADOS BIOLOGICOS4.2.1 RESULTADO DEL ENSAYO INMUNOESTIMULANTE

TABLA N 7 EXTRACTO 1 SOBRE LA CAPTACION DE LA TINTA CHINA(VALORES MEDIOS VM DESVIACION STANDARD DE)

Tratamiento Primera hora (15") Segunda hora (15") Tercera hora (15")Control 0.05835 0.006893 0.04249 0.001754 0.02770 0.001316Efedra 12.5 mg/kg 0.04492 0.005250 0.03840 0.003402 0.01507 0.001243Efedra 50 mg/kg 0.04563 0.005379 0.04345 0.002548 0.02093 0.002201Efedra 100 mg/kg 0.06010 0.004815 0.03084 0.003402 0.01263 0.001092Isoprinosine 300 0.05339 0.006300 0.04345 0.002548 0.01231 0.001069mg/kgPrednisona 100 0.05481 0.004485 0.04345 0.002548 0.02636 0.003587mg/kg

P 0.0284 0.001 0.0001

%ARSI = C-T x 100C

C = CONTROLT = TRATAMIENTO% ARSI = ACTIVACION DE LA RESPUESTA DELSISTEMA INMUNE

TABLA N 8 PORCENTAJES DE ACTIVACI6N DE LA RESPUESTADEL SISTEMA INMUNE EN RATAS

Tratamiento Primera % Segunda % Tercera %(mg/kg)

Control 0.05835 0 0.04249 0 0.0277 0Efedra 12.5 0.04492 23.0162811 0.0384 9.6257943 0.01507 45.5956679Efedra 50 0.04563 21.7994859 0.04345 2.25935514 0.02093 24.4404332Efedra 100 0.0601 2.9991431 0.03084 27.4182161 0.01263 54.4043321Isoprinosine 0.05339 8.50042845 0.04345 2.25935514 0.01231 55.5595668300Prednisona 0.05481 6.06683805 0.04345 2.25935514 0.02636 4.83754513100


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TABLA N 9 ACCI6N SOBRE ELEMENTOS BLANCOS DE LA SANGRE DERATAS

Tratamiento Linfocitos SegmentadosControl 56.3 3.7 38.0 4.1Prednisona 100 mglkg 33.0 4.5 50.0 7.2Isoprinosine 300 mg/kg 59.5 3.3 45.9 8.5Efedra 12.5 mglkg 45.8 4.3 48.8 5.1Efedra 50 mg/kg 40.3 4.4 38.9 0.9Efedra 100 mgtkg 57.5 5.8 39.3 6.7P 0.001 0.570

4.2.2 RESULTADO DEL ENSAYO DE ARTEMIA SALINA: EI valor de laconcentraci6n letal media CL50 obtenido para el extracto total I fue de 2.9166 ug/ml.

4.2.3 RESULTADO DE LA ACTIVIDAD ANTIULCEROSA

TABLA N 10 VALORES MEDIOS DE ACTIVIDAD ANTIULCEROSA DE EXTRACTOSFRENTE A LESIONES GA..8TRICASINDUCIDAS POR INDOMETACINA EN RATONES

TTO DOSIS N lesion Eficienciamg/kg Gastrica Antiul, %

Control ----- 58 + 2,5 0I 10 53 + 3,1 8,6I 100 40 + 1,6 31I 200 32 + 3,6 44,8n 10 46 + 4,1 20,7n 100 40 + 5,1 31n 200 48 + 5,5 17,2


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4.2.4 RESULTADO DE LA EVALUACION DE LA MOTll.JDADINTESTINAL

TABLA N 11 VALORES MEDIOS DEL AVANCE DEL CARB6NACTIVADO EN RATONES

DOSIS Avance Dism. DeTTO mgIkg ID le s t .em Motilid.%Control - - - - - - 58,7 + 5,5 100I 10 36,4 + 3,1 37,9

I 100 35,2 + 2,6 40,03

I 200 40,3 + 4,6 31,3

II 10 55,3 + 3,1 5,8

II 100 57,3 + 6,1 2,4

II 200 50,4 + 3,5 14,1

4.2.5. RESULT ADO DE LA ACTIVIDAD ANTllNFLAMATORIA

TABLA N 12 VALORES MEDIOS DE ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIADE EXTRACTOS FRENTE A INFLAMACI6N INDUCIDA PORCARRAGENINA EN RATONES

Edema ED Mm VM+DE EficienciaTTO Dosis mgIkg Basal N Bas.lnfla 1 hora 2 horas 3 horas Antiinf. %

0,237 + 0,411 + 0,410+ 0,400+ 0,400 +Control . 0 . ,012 0,009 0,015 0,010 0,9130,231 + 0,394 + 0,371 + 0,347 + 0,287 +I 200 28,250,008 0.017 0,011 0,010 0,014

200 0,236 + 0,409 + 0,389 + 0,367 + 0,333 +II 16,750,015 0,013 0,017 0,015 0,009


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4.2.6. RESULTADO DEDETERMINACIONTOXICIDAD.

LADE

4.2.6.1.ENSA YO DEAGUDA, DL50:

TOXICIDAD

La DL50 para el extracto etan61ico I, estarfasobre los 5360 mg/kg,

4.2.6.2. ENS AYO DE TOXICIDADSUBCRONICA:

A la dosis de 50 mglkg del extractoetan6lico total I en ratas por via peroralluego de tres meses de tratamiento,los resultados de los examenes delaboratorio clfnico de muestras de sangrefueron: funci6n renal no se vi6alterada al evaluarse los valores sericos deurea y creatinina; en los valores decolesterol y lfpidos totales se aprecia unatendencia a la disminuci6n.

4.2.7. RESULTADO DE LOS ENSAYOS MICROBIOLOGICOS

TABLA N 13 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO ETAN6LICO DEEPHEDRA AMERICANA

CEPA REFERENCIA mm. DE INHIBICIONEscherichia coli ATCC 11313 8Salmonella cholerae suis ATCC 14028 11Serotipo typhimuriumStreptococcus faecalis ATCC 19433 9Staphylococcus aureus ATCC 25923 11Salmonella cholerae suis ATCC 13076 9serotipo enteritidisBacillus subtilis ATCC 6633 14StaphYlococcus ATCC 12228 8

DISCUSIONEI extracto etan6lico I de Ephedraamericana, demostr6 buena solubiIidad ensolventes polares como en alcohol etflico ymetflico, Tabla N 2, 10 que indica que loscomponentes qufrnicos son de mediana yalta polaridad.

Segun Ia marcha fitoqufmica efectuada,Tabla N 3, se detect6 la presencia dea1caloides y un alto porcentaje de

compuestos fen6licos, entre ell osflavonoides libres y glicosidados.

Mediante ensayos cromatograficos seconfirm6en el extracto etan61ico I lapresencia de alcaloides y flavonoides,Tabla N 4. Se realiz6 el fraccionamientodel extracto total I mediante cromatografiaen columna rapida, Tabla N5. AIcontrolar los subextractos mediante c.c.f.se observ6 que los compuestos fen6licosestaban principalmente en el extracto


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metan6lico II, mientras que los alcaloidesen el extracto acuoso III.

Los metabolitos secundarios en el extractometan6lico II, fueron aislados ypurificados mediante cromatografta encapa fina a escala 'preparativa, observadoscon luz UV 366 nm. y recuperados de lasilicagel con mezclas de cloroformometanol, 5 fueron purificados yelucidadosestructuralmente mediante correlacionesqufrnicas con los datos obtenidos porespectroscopia UV, con reactivos dedespla~amiento y por comparaci6n conespectros UV dados en la literatura porMabry y col. (13), sugiriendose lasestructuras de 5 flavonoides:

Fraccion I A MeOH = 280, 326 nm: 3',5dihidroxi 4' -metoxi-7-0-ramnoglucosil flavonona (hesperidin a)Fracci6n II A MeOH = 284, 298 (h), 344nm: 3',4',5,7-tetrahidroxi-6,8-di R flavona.

Fracci6n m A MeOH = 276, 364 nm:3' ,5,7-trihidroxi - 4',6- dimetoxi flavonol

Fracci6n IV A MeOH = 252 (h), 268, 314;NaOMe ::::264 (h), 274, 360; AlClJ_::::250(h), 276. 328, 384; AlCl} +HCl= 250 (h),278,324,384; NaOAc:= 274,360; NaOAc+ H1BO,l_ 272, 316 nm: crisina: 5.7-dihidroxi f1avona.

Fracci6n V A MeOH = 276, 314 nm: 4'-hidroxi - 5, 7 - dimetoxi flavonona.Determinaci6n de Ia acci6n antioxidantemediante c.c.f , Tabla N 6: el extractometan6lico II que esta constituidoprincipalmente por los 5 flavonoides, al ser

revel ados con el extracto de beta carotenoy exponerse a la Luz UV 254 nm loslugares cuyo Rf corresponden a losflavonoides no se decoloran 0 mantienensu coloraci6n 10 que indica que tienenactividad captadora de radicales libres(14), en tanto que el extracto acuoso, quecontiene principal mente compuestos tipoalcaloides, al ser revelados con el extractode beta caroteno y ser expuestos a la LuzUV 254 nm no se observa mancha algunaen estos lugares del cromatograma, por 1 0que los alcaloides no tendrfan actividadantioxidante 0 actividad captadora deradicales libres.

Se evalu6 el extracto etan6lico total I de laEphedra americana sobre la respuesta delSistema Inmune , mediante el metodo deEstimulaci6n Reticulo Endotelial deDelaveau y col. 1980 (23) Tabla N 1,utilizandose 48 ratas albinas can pesospromedios entre 250 Y 300 g,adrninistrandose par via peroral durantecinco dfas, el extracto etan61ico total I , atres niveles de dosis: 12.5, 50 Y 100 mg/kg, y los estandares farmacol6gicos deinhibici6n la prednisona 100 mg/kg, que esun corticosteroide que disminuyesignificativamente la respuesta inmune, a 1reducir la presencia de los linfocitos T,segun Bentley et al. 1996 (24) y de .estimulacion el isoprinosine 300 rug/kg,que es un agente que activa la respuestadel sistema inmune, segun Betts y co1.1978y Grieco y co1.1984 (25, 26). En Tablas N7,8 observamos que el extracto I en dosisde 100 mg/kg aumenta 1a respuestainmune, en forma similar como 1 0 haee elisoprinosine que es una sustancia quo


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activa la inmunidad celular (25,26); lainmunoestimulaci6n ha sido corroborada alevidenciarse mayor captaci6n de tintachina usada como sustancia crom6fora decontraste y determinado medianteespectroscopia UV- Visible a una longitudde onda de 650 nm con filtro rojo enmuestras de sangre de ratas previamentehemolizadas. Se extrajeron muestras desangre venosa a 1,2 Y3 horas; se hicieronfrotis tifiendose con el colorante Giemsa ycontandose las celulas,

Tambien se observe que la prednisonaredujo la respuesta inmune, al disminuir elmimero de linfocitos circulantes (24).LaTabla N 7 muestra la captaci6n de la tintachina expresada en valores medios con unadesviaci6n estandar correspondiente; conuna probabilidad < 0,05 es decir una altasignificaci6n estadistica. La Tabla N 8muestra los resultados en porcentajes de laacti vaci6n de la respuesta del sistemainmune en ratas, cuyos valores han sidoobtenidos utilizando la siguiente f6rmula:

% ARSI = C - T x 100C

donde:

C=CONTROLT = TRA TAMIENTO

% ARSI = % ACTIVACION DE LARESPUESTA DELSISTEMA INMUNE

Se observ6 una mayor activaci6n de larespuesta del sistema inmune para captar Iatinta china, al administrar el isoprinosine(55.6%), seguido del extracto etan6lico

total I de Ephedra americana a dosis de100 mg/kg y 12.5 rng/kg (55.4 y 45.6%respectivamente), observandose que elresultado dado por el extracto I esindependiente de la dosis.

Mediante coloracion Giemsa, se realize lacomprobacion de los elementos blancos dela sangre de ratas, los resultados semuestran en Ia tabla N 9, comparando Iacantidad de linfocitos en

el grupo control se observ6 un aumento delos mismos por acci6n del Isoprinosine,similar efecto es obtenido con dosis de100 mg/kg del extracto etanolico total I deEphedra amencana, resultados queconcuerdan con los obtenidos y anotadosen las Tablas N 7 ,8 (12,24-26), Y siendolos flavonoides metabolitos mayoritariosen concentracion presentes en el extracto I,podrian ser los responsables de la actividadobservada sobre el sistema mmune enratas, por activacion de los anticuerpostipo 1 9 E . La presente investigaci6n alevidenciar un aumento de la .respuestammune en ratas, indicaria que losproductos naturales presentes en Ephedraamericana, podrian ser utilizados enpacientes con cuadros de disminuci6n de laactividad del sistema inmunitario, previaevaluaci6n clinica.

EI valor de la CONCENTRACIONLETAL MEDIA CL50 obtenido para elextracto total Ide Ephedra americana fuede 2.9166 uglml. demostrando que es unextracto biol6gicamente activo, 0 sea quecontiene sustancias de alta actividadbiologica se consideraa que


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biologicamente activo si el CL50 esinferior a 1000 ug/mL, segun Me Laughliny col. 1991. (16)

Al detenninar la actividad antiulcerosacomparativa del extracto etanolico total Iy el subextracto metanolico Il , frente alesiones gastric as inducidas porindometacina en ratones, Tabla N 10, elextracto total I a dosis de 200 mg/kgdemostro mayor eficiencia antiulcerosa de44.8%, siendo dosis dependiente, estaactividad antiulcerosa evidenciada seexplicaria por la alta cantidad deflavonoides presentes que estimularfan laproduccion de prostaglandinas E2 , segunBeil W. y co1.1995; y Reyes y col. en1996. (17,18)

Al realizar la evaluacion de la motilidadintestinal comparativa entre eI extractoetanolico total I y el subextractometanolico Il, frente al avance de carbonactivado en ratones, Tabla N 11, elextracto II evidenci6 disminucion de lamotilidad intestinal a una dosis de 100mg/kg, con un porcentaje de disminucionde motilidad de 2.4%, no siendo dosisdependiente. Serfa debido a que lostlavonoides inducen una disminucion delingreso de los iones calcio al interior de Iacelula, segiin Duarte y coL 1993 .(19).

AI determinar la actividad antiintlamatoriadel extracto etanolico total I y delsubextracto metan61ico II, los que fueronadministrados por la via peroral a ratonescon edema subplantar inducido porcarragenina, Tabla N 12, el extractoetanolico total I brind6, mayor eficienciaantiinflamatoria a una dosis de 200 mg/kg,

con un valor de 28.25%. Esto se explicarfapor la presencia de los flavonoides quienesademas tienen una accion antioxidante,inhiben la enzima adenosina deaminasa,segun Koch y col. 1992 (20); Yposiblemente tambien por inhibir lasecrecion de prostaglandinas, segunKakbrender y col. 1992. (21).

ENSA YO DE TOXICIDAD AGUDA:

La DLso para el extracto etanolico I, deEphedra americana, estarfa sobre los 5360mg/kg administrados a los ratones,cali ficandolo una sustanciaomopracticamente no toxica, segun Williams yBurson. (22).

ENSAYOSUBCRONICA: DE TOXICIDAD

A la dosis de 50 mg/kg del extractoetanolico total I en rat por via peroralluego de tres meses dJ tratamiento, losresultados de los examenes de laboratorioclfnico de muestras de sangre fueron:funcion renal no se vio alterada alevaluarse los valores sericos de urea ycreatinina; en los valores de colesterol ylfpidos totales se aprecia una tendencia a ladisminucion.

Luego de los ensayos microbiologicosefectuados con el extracto etanolico total I,Tabla N 13, podemos decir que presentaun pequefio halo de inhibici6n de 11 mm.frente a Salmonella cholerae suis serotipotyphimurium, al igual que frente aStaphylococcus aureus, se observa mayorinhibicion a Bacillus subtilis , 14 mm.


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CONCLUSIONES1. Se detennin6 la estructura deflavonoides de Ephedra americana, talescomo:

Hesperidina; Crisina;tetrahidroxi -6,8-di -R flavona;trihidroxi-6,4' -dimetoxi flavonolhidroxi-5, 7-dimetoxi flavonona.

5,7,3',4' -5,7,3'-Y 4'-

2. Se determine que Ephedra americanaposee un significativo efectoantiinflamatorio, buena actividadantiulcerosa y que acnia sobre la motilidadintestinal. Tiene un DL50 alto, no es t6xicayes biol6gicamente activa.

El extracto etanolico total I de Ephedraamericana, eonstituido prineipalmente porflavonoides, administrado por vfa peroralen ratas, ha mostrado efecto antioxidante yactividad inmunoestimulante similar alisoprinosine utilizado como estandarfarmacol6gico.

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Flavo Ephera

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