初めて HaloTag®の利⽤用を検討している⽅方へのご案内

HaloTag®のご利⽤用をご検討いただきましてありがとうございます。HaloTag®は、様々なアプリケーションに利⽤用可能な万能タグですが、具体

的に何を購⼊入して実験を始めればよいのか、わかりにくいかもしれません。この案内では、アプリケーションごとにお薦め製品をご紹介します。

お薦め製品以外にも⾊色々な製品をご⽤用意しています。ぜひホームページ、HaloTag ガイドもご覧ください。

何かご不明な点等ありましたら、テクニカルサービス部までお気軽にご相談ください。

HaloTag®ガイド：

http://www.promega.co.jp/halotag/HaloTag_guide.pdf

● 細胞内イメージングに利⽤用する場合 GFP などの蛍光タンパク質と異なり、HaloTag®タンパク質⾃自体は、蛍光性を持ちません。HaloTag®の場合、⽬目的にあった蛍光リガンドを⽤用い

て染⾊色、検出することになります。波⻑⾧長の異なる蛍光リガンドを使えば、⼀一つのコンストラクトで多彩な⾊色に染めることが可能です。また⼀一過的

にリガンドを加えてタンパク質を標識できるので、パルスチェースの実験には最適です（HaloTag ガイド 13 ページ）。さらにリガンドは HaloTag®

タンパク質と共有結合しているので、染⾊色した HaloTag®タンパク質を SDS-PAGE を⾏行行った後に、蛍光ゲルイメージャーで直接そのタンパク質を

検出することも可能です(HaloTag ガイド 8-9 ページ)。

ベクター

哺乳動物細胞において HaloTag®タンパク質を発現させるためには、pFN21A ベクター（カタログ番号 G2821）がお薦めです。⽬目的タンパク質

の N末端側に HaloTag が融合した形で発現されます。⼀一⽅方、N末端側にシグナル配列がある場合や構造上 HaloTag®を⽬目的タンパク質の C末端側

に融合したい場合には、pFC14K ベクター（カタログ番号 G9661）を利⽤用します。アンピシリン耐性遺伝⼦子の持つベクター（例えば pFN21A）か

らカナマイシン耐性遺伝⼦子を持つベクター（例えば pFC14K）へのインサートの移し替えは、Flexi システムを採⽤用しているため⾮非常に簡単です。

詳細は、下記リンク資料をご覧ください。

Flexi システム概要：

http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj16/PJ-No16-04.pdf

また HaloTag 融合型の ORF(cDNA)クローン（Flexi HaloTag クローン）を販売しています。ヒト、マウス遺伝⼦子のORF（cDNA）が pFN21A

にクローニングされており、シーケンス、発現確認済みです。

http://www.promega.co.jp/flexiclone/

リガンド

蛍光観察するためのリガンドとしては、TMR-Ligand(カタログ番号 G8251/G8252)がお薦めです（555Ex/585Em）。その他 GFP と同じフィル

ターを⽤用いて観察したい場合には、Oregon Green® Ligand(カタログ番号 G1001/G1002)などが利⽤用可能です。Alexa 488 リガンド（カタログ

番号G1001, 494Ex/517Em）を⽤用いて細胞外のHaloTagを特異的に観察することも可能です。TMR Direct Ligand (カタログ番号G2991)や R110

Direct Ligand(カタログ番号 G3221) は、Wash の回数を少なくでき、細胞へのダメージも低減した観察に適しています。

蛍光リガンドの案内

http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj28/PJ_No28-4.pdf

プロメガ株式会社

● タンパク質精製に利⽤用する場合 HaloTag®を利⽤用することで、他の Tag に⽐比べて純度の⾼高いタンパク質を調製していただけます。また、HaloTag タンパク質⾃自⾝身の可溶性が⾼高

いため、融合タンパク質全体の可溶性が⾼高くなり、これまで他の Tag では発現、可溶化が難しかったタンパク質も精製できる場合があります

（HaloTag®ガイド 18-19 ページ）。

ベクター

⼤大腸菌で発現させる場合

⼤大腸菌を使ってのタンパク質発現、精製を検討している場合は、まずは N末端側に HaloTag が融合する pFN18A ベクター(カタログ番号 G2751)

をお薦めします。⼀一⽅方、C末端側に HaloTag®を結合させて発現、精製をしたい場合には、pFC20K ベクター（カタログ番号 G1691）を利⽤用しま

す。N末端側に HaloTag を融合した場合の⽅方が可溶性が⾼高いというデータもありますが、HaloTag®と⽬目的タンパク質を切断すると、⽬目的タンパ

ク質の N末端側にリンカー配列の数アミノ酸が残存してしまいます。N末端側に機能領域がある場合など、⽬目的に応じて C末端側に HaloTag を融

合するベクターを利⽤用してください。

無細胞系で発現させる場合

⼤大腸菌での発現が困難なタンパク質であっても無細胞タンパク質合成系で効率よく発現できる場合もあります。無細胞タンパク質合成系で、最

もタンパク質収量が多い TNT® SP6 High-Yield Protein Expression System(カタログ番号 L3261/L3260) を使う場合には、SP6 プロモーター

が必要です。pFN19A ベクター(カタログ番号 G1891)は、T7、SP6 プロモーター配列を有しているため、無細胞タンパク質発現系に最適です。

pFN19A ベクターは、Ribosomal Binding Site(RBS)配列を有しており⼤大腸菌での発現にも利⽤用できますので、⼤大腸菌での発現と無細胞タンパク

質発現系の両⽅方のアプリケーションを検討している場合にお薦めです。C末端側に HaloTag®を融合させて発現、精製をしたい場合には、pFC20K

ベクター（カタログ番号 G1691）を利⽤用してください。

哺乳類動物細胞の場合

pFN21A ベクター（カタログ番号 G2821）をお薦めします。あるいは、ヒトの遺伝⼦子がすでに HaloTag ベクター（pFN21A）に組み込まれた「か

ずさクローン」（別紙参照）であれば、出荷前にシーケンス、細胞での発現、タンパク質の分⼦子量が確認されており、すぐに実験に利⽤用できます。

C末端側に HaloTag®を結合させて発現、精製したい場合には、pFC14K ベクター（カタログ番号 G9661）を利⽤用してください。

その他のベクターも利⽤用可能です。また N末端側ベクターにクローニングしてから、C末端側ベクターへのインサートの移し替えは、Flexi シス

テムを採⽤用しているため、⾮非常に簡単です（上述 Flexi システム概要参照）。

キット、製品

発現した HaloTag®融合タンパク質は、HaloTag®に特異的に結合する担体（HaloLink™ Resin、カタログ番号 G1911）に捕捉して、その後、

⽬目的タンパク質と HaloTag のリンカー配列を切断する TEV プロテアーゼを⽤用いて、⽬目的タンパク質を担体より回収します。発現する⽣生物種に応

じたタンパク質精製に必要な製品をセットにしたキットを発売中です。マニュアルには詳細な実験⽅方法や、トラブルシュートを記載しています。

☆HaloTag® Purification System(カタログ番号G6270/G6280)

⼤大腸菌で発現させた HaloTag®融合タンパク質の精製に適した製品

マニュアル: http://www.promega.com/tbs/tm312/tm312.pdf

製品案内：

☆G6270 HaloTag® Purification System \80,000

・HaloLink™ Resin 2.5ml （精製⽤用担体）

・ProTEV protease 200ml （⽬目的タンパク質と HaloTag を切り離すプロテアーゼ）

・HisLink™ Resin 0.5ml （ProTEV を回収するためのビーズ）

また Single Step (KRX) Competent Cell （カタログ番号 L3002）を利⽤用すると⾃自動誘導プロトコールによって、IPTG による誘導のような濁

度を測定しながら誘導時期を待つ必要がなくなります。実際の⼿手順は、HaloTag® Purification System のマニュアルにも記載があります。

Single Step (KRX) Competant Cell の製品案内、⾃自動誘導プロトコール資料

http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj25/PJ_No25-6.pdf

☆HaloTag® Mammalian Protein Purification System (カタログ番号G6790)

哺乳類動物細胞で発現させた HaloTag®融合タンパク質の精製に適した製品

マニュアル:

http://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/101/halotag-mammalian-protein-detection-and-purification-syste

ms-protocol/

製品案内：

☆G6790 HaloTag® Mammalian Protein Purification System （40ml 培養 25回分） \84,000

・HaloLink™ Resin 2.5ml （精製⽤用担体）

・HaloTEV Protease 200ml （⽬目的タンパク質と HaloTag を切り離すプロテアーゼ）

・Protease Inhibitor Cocktail 2vials （プロテアーゼ阻害剤）

・Spin Columns 25/pack （バッチ法で精製）

蛍光リガンドである HaloTag® TMRDirect™ Ligand が付属した、HaloTag® Mammalian Protein Detection and Purification System （カ

タログ番号 G6795）もあります。培地に添加すると、発現したタンパク質の局在やリアルタイムイメージが観察できます。

もちろんキット品でなくても HaloTag 融合タンパク質を精製することはできます。

以下の製品は単品販売があります。

・HaloLink™ Resin（カタログ番号 G9311 他、様々なサイズがあります：別紙参照）

・Protease Inhibitor Cocktail（カタログ番号 G6521）

・ProTEV Plus（カタログ番号 V6101）

キットに含まれる ProTEV と同等の製品です。His(HQ)タグが付加しているため、HisLink™ Resin（カタログ番号 V8821）を加えればサンプル液

中から除去できます。

・HaloTEV プロテアーゼ（カタログ番号 G6601）

His(HQ)タグのかわりに HaloTag®が付加された TEV プロテアーゼです。⽬目的タンパク質の切り離しと同時に HaloLink™ Resin にトラップされ

るため、TEV プロテアーゼを除去する⼿手間を省くことができます。

● プルダウンアッセイに利⽤用する場合 HaloTag®と HaloLink™ Resin の強固で迅速な結合はタンパク質間の相互作⽤用解析にも有⽤用です。HaloTag® Mammalian Pull-Down System

(カタログ番号 G6504)は哺乳類動物細胞からタンパク質複合体を効率よく単離するために最適化されており、細胞の溶解から、HaloLink™ Resin

による複合体の捕捉、溶出までを⾏行行うための試薬がセットになっています。また、別売りの ProTEV Plus（カタログ番号 V6101）あるいは HaloTEV

プロテアーゼ（カタログ番号 G6601）を使⽤用し、HaloLink™ Resin から複合体の構造を保持したままビーズから溶出することも可能です。溶出し

た複合体は機能解析に使⽤用できます。

ベクター

ベクターは pFN21A ベクター（カタログ番号 G2821）をお薦めします。あるいは、ヒトの遺伝⼦子がすでに HaloTag ベクター（pFN21A）に組

み込まれた「かずさクローン」（別紙参照）であれば、出荷前にシーケンス、細胞での発現、タンパク質の分⼦子量が確認されており、すぐに実験に

利⽤用できます。

キット：

プルダウン、タンパク質相互作⽤用解析に必要な製品をパックにしたキットを⽤用意しています。

☆HaloTag® Mammalian Pull-Down System（G6504）

マニュアル；

http://www.promega.com/tbs/tm342/tm342.pdf

製品案内：

☆G6504 HaloTag® Mammalian Pull-Down System （30ml 培養 24回分） \56,000

・HaloLink™ Resin 1.25ml （HaloTag タンパク質補⾜足⽤用）

・Mammalian Lysis Buffer 10ml （細胞溶解剤）

・10X TBS Buffer 25ml （洗浄バッファー）

・Protease Inhibitor Cocktail 1vials （プロテアーゼ阻害剤）

・SDS Elution Buffer 1.3ml (複合体溶出⽤用バッファー)

このキットに蛍光リガンドであるHaloTag® TMRDirect™ Ligand が付属した、HaloTag® Mammalian Pull-Down and Labeling System （カ

タログ番号 G6500）があります。プルダウンの実験の前に、タンパク質の発現確認や、発現したタンパク質の細胞内局在やリアルタイムイメージ

に利⽤用できます。

参考資料

1. Functional proteomics characterization of human macromolecular complexes using new surface display and imaging technology.

● クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイに利⽤用する場合 HaloTag®タンパク質は、HaloLink™ Resin などの担体に共有結合によって結合するため、不可逆的で⾮非常に効率よくプルダウンすることができ

ます。この性質を利⽤用して、タンパク質-DNA 複合体をプルダウンして、タンパク質に特異的に結合する DNAを解析/定量することが可能です。

抗体を⽤用いないため、従来法よりも効率的で安定したデータが得られます。

☆HaloCHIP™ System（カタログ番号G9410）は、HaloLink™ Resin と HaloTag® Blocking Ligand (TMR-ligand)、さらにバッファーが添付

されており簡単に ChIP 様のアッセイをすることができます。

マニュアル；

http://www.promega.com/tbs/tm075/tm075.pdf

製品案内：

☆G9410 HaloCHIP™ System 20 回分 \85,000

・HaloCHIP™ Blocking Ligand 30ml （コントロール実験⽤用、発現確認⽤用）

・HaloLink™ Resin 2ml （DNA, タンパク質複合体プルダウン⽤用担体）

・High Salt Wash Buffer 25ml （洗浄液）

・Mammalian Lysis Buffer 40ml （細胞溶解液）

・Nuclease-Free Water 150ml （洗浄液）

・Reversal Buffer 8ml （溶出液）

・TE Buffer, 1X, Molecular Grade 100ml （HaloLink™ Resin 平衡化⽤用）

⽇日本語資料；

http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj24/PJ-No24-1.pdf

参考⽂文献；

Van Dijk et al. Human Molecular Genetics. 2010;19: 2658‒2667.

http://hmg.oxfordjournals.org/content/19/13/2658.

Jag et al. Mol Endocrinol.2009; 23: 1587-1602

http://mend.endojournals.org/cgi/reprint/23/10/1587

http://www.promega.co.jp/halotag/Proteomics2011_poster.pdf

● プロテインアレーアプリケーション

HaloTag®融合タンパク質をスライドガラス上に配向性を持って配置することで、⾼高感度なタンパク質相互作⽤用解析、抗体、リガンドのスクリー

ニングに利⽤用できます。標的タンパク質をビオチン化標識して相互作⽤用を検出する⽅方法は、マニュアルにも紹介しています。無細胞タンパク質合

成系（ウサギ網状⾚赤⾎血球タイプもしくは⼩小⻨麦胚芽タイプ）を⽤用いてタンパク質を合成することで、短時間で効率よく相互作⽤用解析が⾏行行えます。T7

プロモーターや SP6 プロモーター配列をもつ pFN19A ベクター（カタログ番号 G1891）などを選択して HaloTag 融合タンパク質を合成して、他

のベクターで標的タンパク質を合成します。タンパク質間相互作⽤用解析の実例など論⽂文を参考にしてください。

マニュアル；

http://www.promega.com/tbs/tm310/tm310.pdf

参考⽂文献；

Protein-protein interaction studies on protein arrays: effect of detection strategies on signal-to-background ratios.

Hurst R, Hook B, Slater MR, Hartnett J, Storts DR, Nath N.

Anal Biochem. 2009 Sep 1;392(1):45-53. Epub 2009 May 22. PMID: 19464993

Improving protein array performance: focus on washing and storage conditions.

Nath N, Hurst R, Hook B, Meisenheimer P, Zhao KQ, Nassif N, Bulleit RF, Storts DR.

J Proteome Res. 2008 Oct;7(10):4475-82. Epub 2008 Sep 6. PMID: 18774839

● ベクター選択ガイド HaloTag®の実験を⾏行行うために、アプリケーションに応じた各種ベクターをご⽤用意しています。この案内では、アプリケーション例ごとにお薦め

ベクターをご紹介しました。以下の英⽂文資料では、その他のベクターのご案内もしています。ベクターの単品での販売以外に、以下のようなスタ

ーターパック、ベクターパックをご⽤用意しています。

http://www.promega.com/pnotes/100/16620_13/16620_13.pdf

☆ベクターパック

G3780には、哺乳動物発現系に関連するベクターが9種類（pFC14K, pFC15K, pFC16K, pFC17K, pFN21A, pFN21K, pFN22K, pFN23K, pFN24K）

が各 2μg ずつ含まれます。

HaloTag® 7 Flexi® Vectors ‒ CMV Deletion Series

Sample Pack 9X2μg G3780 ￥38,000

CMV Deletion Series のベクター(pFC15K, pFC16K, pFC17K, pFN22K, pFN23K, pFN24K)は、哺乳動物細胞で HaloTag タンパク質の発現量

が多すぎる場合に、プロモーター領域を短くしてその活性を低下させ、発現量を抑えることができるベクターです。発現量が⾼高すぎて、細胞内局

在の変化が観察しにくい場合などに利⽤用できます。詳細は、以下の資料をご覧ください。

http://www.promega.com/pnotes/100/16620_16/16620_16.pdf

☆スターターシステム

G6050 は、ベクターパック(G3780)と PCR 産物などをベクターにクローングするために必要な制限酵素、PCR 産物精製キットが添付されていま

す。詳細は Flexi ベクターのマニュアルをご覧ください。

哺乳動物細胞で実験を⾏行行う場合には、このキットをお薦めします。

HaloTag® Cloning Starter System G6050 ￥57,000

HaloTag 7 Flexi Vectors ‒ CMV Deletion Series Sample Pack(G3780)

哺乳動物発現⽤用（⼀一部⼤大腸菌、無細胞系で使⽤用可）のベクターを 9種含む。

Flexi System, Entry/Transfer(C8640)

Enzyme Blend （制限酵素 SgfI+ PmeI) + PCR 産物精製キット(A9280) + T4 DNA Ligase

Carboxy Flexi Enzyme Blend (Sgf I and EcoICR I) (R1901)

C 末端側に HaloTag を導⼊入する際に使う制限酵素

その他、ベクターを構築する上で以下の資料が役に⽴立立つと思います。

・HaloTag®ベクターを作成した時に使える内部配列確認⽤用のプライマー情報

http://www.promega.com/enotes/applications/ap0099.htm

PCR 産物をベクターに導⼊入した際には、内部配列を確認する必要があります。HaloTag®ベクターで利⽤用できるシーケンス⽤用のプライマーの情報

を案内しています。

HaloTag®のみを発現するベクターもあります。

☆HaloTag® Control Vector（カタログ番号G6591）

CMV プロモーターや T7、SP6 プロモーターが含まれており、哺乳動物細胞、⼤大腸菌、無細胞発現系における全ての HaloTag®実験システムでコ

ントロールとして使⽤用できます。

HaloTag® Control Vector 20μg G6591 ￥39,000

・HaloTag®だけを発現するコントロールベクターの作成法

How to Construct and Use a HaloTag® Coding Region Control Expression Vector

HaloTag® Control Vector（カタログ番号 G6591）以外のコントロールベクターが必要になる場合があるかもしれません。オリゴ 2本をアニーリ

ングして、致死遺伝⼦子（Barnase）と置換したベクターを作成する⽅方法を紹介しています。

● HaloLink™ Resin/HaloLink™ Magnetic Beads に関して HaloTag®をプルダウンしたり、⽬目的タンパク質の精製に使う固相化担体は、磁性ビーズタイプとレジンタイプの 2つの製品があります。In vivo

でのプルダウンにはレジンタイプ、ハイスループットや厳しい洗浄を伴う In vitro でのプルダウンには磁性ビーズが適しています。

製品案内ページ：

http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=2001002

タンパク質の結合量に関してホームページの記載法ではわかりにくいかもしれません。

以下の値を参考にしてください。

HaloLink™ Magnetic Beads

→ビーズ体積 0.2 ml（懸濁状態で 1ml）で 2 mg 以上の HaloTag®融合タンパク質を捕捉

HaloLink™ Resin

→レジン体積 1.25 ml（懸濁状態で 5 ml）で 8.75 mg 以上の HaloTag®融合タンパク質を捕捉

http://www.promega.co.jp/halotag/AP0106_HaloTag_control.pdf

製品名 サイズ カタログ番号 価格(￥)

HaloLink™ Magnetic Beads 40 回分 [200μl（1ml）] G9311 \16,000

HaloLink™ Resin 1.25ml（5ml） G1912 \30,000

2.5ml（10ml） G1913 \59,000

10ml（40ml） G1914 \72,000

25ml（100ml） G1915 \150,000

● かずさクローン かずさ DNA研究所の持つヒト cDNA クローンライブラリーから HaloTag 融合タイプが発売しています。解析したい遺伝⼦子がすでに HaloTag ベ

クター（pFN21A、N末端にタグ）に組み込まれ、シーケンスの確認、細胞での発現、タンパク質の分⼦子量が確認されてから出荷されますので、す

ぐに安⼼心して実験に利⽤用できます。また、Flexi システムを利⽤用すれば C末端にタグを付け替えることもできます。この場合、N末端にタグのつい

たクローンから制限酵素 SgfI と PmeI で ORF を切り出し（このとき Stop コドンも切断されます）、SgfI と EcoICR I で処理した pFC14K などの

C末端にタグを付加するベクターとライゲーションを⾏行行います。

製品案内：

http://www.promega.co.jp/flexiclone/

クローン検索ページ：

http://www.kazusa.or.jp/kop/dsearch/

タグの付け替えに必要な酵素のミックスはこちら

10X Flexi® Enzyme Blend (SgfI and PmeI) 25μl R1851 \12,000

Carboxy Flexi® Enzyme Blend (SgfI and EcoICR I) 50μl R1901 \13,000

● HaloTag®に関する Q&A http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_HaloTag.html

● HaloTag®を利⽤用した⽂文献リスト（⼀一部） すでに HaloTag®の特⻑⾧長を⽣生かした実験例が Science や Cell など 60 報以上の論⽂文で発表されています。随時更新されますので、⽂文献検索サイ

トや、以下の短い概要を紹介した資料をご参考にしてください。

HaloTag®に関する論⽂文情報は、随時ホームページで更新しています。

http://www.promega.com/citations/default.aspx?citapp=halotag

問い合わせ先:

プロメガテクニカルサービス部

Tel: 03-3669-7980/ Fax:03-3669-7982

E-mail: prometec@jp.promega.com