カビ・キノコ由来の 多様な新規環状ペプチド 生合 …KexA UstH/P UstP/H UstM MT...
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• 1915年：稲コウジの水抽出物から見出される（日本）• 1992年：構造決定（日本）• 2014年：生合成遺伝子同定（日本）
ウスチロキシン
• 動物毒性（家畜の急死、ウサギでの試験による脾臓・胸腺障害）
• 強い微小管形成阻害活性
3
Pro
cess
ed b
y K
ex2
前駆体ペプチド
カビで初めてのリボソームペプチド(RiPPs)生合成経路
Umemura et al., Fungal Genetics and Biology, 68, 23-30 (2014)
ウスチロキシン B/A
Norvaline
Ala/Val (A/V)
Ile (I)
Gly (G)
Tyr (Y)
• 化合物の骨格構造に対応した、高い繰り返し配列を持つ前駆体ペプチド
• 遺伝子レベルで化合物構造をデザインできる可能性
ustMustRustTustQustF2ustDustHustYbustPustYaustAustCustF1ustO ustS
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RiPPs生合成経路とは
シグナルペプチド
前駆体ペプチド
リーダーペプチド
コアペプチド 認識配列
プロテアーゼによる切断
-amanitin
翻訳後修飾
シグナルペプチド
リーダーペプチド
コアペプチド 認識配列
RiPPs: Ribosomally-synthesized and
Post-translationally-modified Peptides
• 真核生物では、テングタケからアマトキシンの例が知られているのみだった
(Hallen et al., PNAS, 104:19097-101 (2007))
• ウスチロキシンの後、ホモプシンもカビから報告される
(Ding et al., PNAS, 113:3521-3526 (2016))
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どのように見つけたのか？
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二次代謝経路発見・利用プラットフォーム
✓NGSシークエンシング、アセンブリ、遺伝子アノテーション✓遺伝子発現情報解析
✓モチーフ検索(antiSMASH/SMURF)
✓比較ゲノム解析✓MIDDAS-M
✓遺伝子破壊、メタボローム解析
二次代謝遺伝子群
ゲノム情報
化合物
利用✓酵素機能解析✓化合物高生産✓化合物デザイン
✓化合物推定
新シーズを用いた再帰解析
ゲノム・生物オミクス情報の包括的利用
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MIDDAS-M:Motif-Independent De novo Detection Algorithm for SMB gene
clusters
+
ゲノム情報と遺伝子発現情報を用いて
Genes on genome
機能しているものを鋭敏・正確に検出二次代謝遺伝子群が共発現する性質に基づき
遺伝子発現
Genes on genome
Ind
uct
ion
rat
io
ゲノム
既知の種類だけでなく、全く新規な種類の二次代謝経路を検出可能特 5780560、2015/07/24; PCT/JP2011/071731 (WIPO), 2011/09/22; Umemura et al., PLoS One, 8(12), e84028 (2014)
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MIDDAS-M algorithm
仮想遺伝子クラスターのin
silico網羅的構築
標準分布からの外れを統計的に強調
• クラスターサイズは1から30程度
まで変化させて、すべて構築
仮想遺伝子クラスターの発現誘導スコア計算
• クラスターメンバーの発現誘導
比を足し合わせ、正規化
ncli
d
nclM
nclncli
ncli PMM
,
,
,
, log
1
,
ncli
ik m
kncli
mmM
•スコア確率 Pを導入
解析後
Genes on genome
特 5780560、2015/07/24; PCT/JP2011/071731 (WIPO), 2011/09/22; Umemura et al., PLoS One, 8(12), e84028 (2014)
元データ
ゲノム上遺伝子
生産 / 非生産条件下遺伝子発現
遺伝子発現量
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ウスチロキシン生合成遺伝子群の発見
遺伝子破壊培養
Aspergillus flavus genes
MID
DA
S-M
スコア
アフラトキシン
ba
28C/37C
EIC m/z 644.2 [M-H]-
LC-MS分析
bbb
MS強度
m/z
ウスチロキシンB
抽出
クラスターbに対応する破壊株ではウスチロキシンB生産性が消失
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RiPP前駆体遺伝子の発見
• 14種類のRNA-seq データをゲノム上にマッピング
Drawn by IGV ver. 2.3.23
ustMustRustTustQustF2ustDustHustYbustPustYaustAustCustF1ustO ustS
遺伝子領域と機能を再定義
• 非リボソームペプチド生合成遺伝子が含まれない
ustA
NCBIアノテーション
• その代わりに、前駆体遺伝子を発見
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カビのリボソームペプチドとしてのウスチロキン生合成機構
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A. flavus Ustilaginoidea virens
Tsukui et al., Bioinformatics, 31:981-985 (2015); Kumagai et al., Genome Announcements, 4:e00306-16 (2016)
化合物構造と対応した前駆体ペプチド UstA
Ustiloxin
AUstiloxin
B
RT (min)
Ion in
ten
sity
ウスチロキンA
YVIG
ウスチロキンB
YAIG
コアペプチド配列が化合物の構造と一致
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人工合成遺伝子からのウスチロキン生合成
• ウスチロキンBは人工DNAからA. flavusで生合成できる
ustMustRustTustQustF2ustDustHustYbustPustYaustAustCustF1ustO ustS
YAIG: MKLILTLLVSGLCALAAPAAKR [NSVED YAIG IDKR]x16
YVIG: MKLILTLLVSGLCALAAPAAKR [NSVED YVIG IDKR]x16
FAIG: MKLILTLLVSGLCALAAPAAKR [NSVED FAIG IDKR]x16
人工DNA（イントロンなし）に置換
Ptef1
• ウスチロキンAは A. flavusでは生合成できない（経路の最適化が必要）
*Normalised to -tubulin
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ウスチロキシンB生産量
ゴルジ体局在KexBによる前駆体ペプチドの切断
KexBによる切断がウスチロキン生合成には不可欠Yoshimi et al., AMB Express, 6:9-16 (2016)
[NSVEDYAIGIDKR]x16
KexB
KexA
kexB
kexBWT (A. oryzae RIB40)ustRE
X
ustREX
ustRE
X
ustREX/kexB P10 (10 proteases deletant)* ustREX/P10ustRE
X
*tppA, ∆pepE, ∆nptB, ∆dppIV,
∆dppV, ∆alpA, ∆pepA,
∆AopepAa, ∆AopepAd, ∆cpI
ustMustRustTustQustF2ustDustHustYbustPustYaustAustCustF1ustO ustS
missing
PglaA
?
A. flavusAspergillus oryzae RIB40
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ウスチロキン生合成経路の解明
Signal[NSVEDYAIGIDKR]x16
UstA
Golgi apparatus
Ustiloxin F
Ye et al., Angewandte Chemie International Edition, 55:8072-8075 (2016)
ER
[NSVEDYAIGIDKR]x16
KexBprotease
NSVEDYAIGID
UstQ
UstYa
UstYb
KexA
UstH/P
UstP/H
UstM
MT
Oxidase
UstC
P450
UstF1FMO
Ustiloxin B
UstF2
UstD
FMO
PLP
enzyme
ustMustRustTustQustF2ustDustHustYbustPustYaustAustCustF1ustO ustS
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ウスチロキシン型RiPPs生合成経路のゲノム探索
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環状化因子の発見
ustMustRustTustQustF2ustDustHustYbustPustYaustAustCustF1ustO ustS
機能未知遺伝子
破壊すると…
Ustiloxin B
どの環状中間体も産生されない
• UstYは新規環状化因子である可能性が高い
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アスペルギルス属でのウスチロキシン型経路探索
• ウスチロキシン型 RiPPs生合成 (ust-RiPS)経路はアスペルギルス属に広く保存
• 多くの場合、一株が複数のust-RiPS経路を保有
シグナルペプチド Kex2認識配列 繰り返し配列
前駆体ペプチド近傍 <10 kb に存在 (e-value <1E6)
Nagano et al., Fungal Genetics and Biology, 86:58-70 (2016)
Aspergillus20株のゲノム情報に対して、ust-RiPS経路を探索
前駆体ペプチド
UstYホモログ
前駆体ペプチド遺伝子：1400個（一株平均70個）+ UstYホモログ：93個（一株平均5個）
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多様なust-RiPSコアペプチド配列
FYYTGYKR NAETPEDLDKR
SNAKVKYDVYDGPEKR
QEPIPSDALGSLIGGGLGRR
EEGIYDYYDIDAKATKHKRLHRAIVYRKSDDTETGSLDKR
DQEGTTVDDISEALYGAWGGIKR
AEAGEDNVGQANDVDEISTRSQWFYNKKR
ETEEPYEHKASIYNKR
SEEAEAIPYYPKR
GDDADDAYHTITPHKR
DTTKEKVDKRDMNHPEWPANNAVRPGETPNAESENKEFVYWRR
AYDGFVGFEYAKGLEDSKVAARDD
DEDLGIYRDADLYLDTVEKR
LPTSHSEVTHSIEENIAYPEAYNEKR
DDGAIRIPVKGVPEPEKR
特願2014-232267, 2014/11/1; PCT/2015/56667 (WIPO), 2015/03/06
• アスペルギルス属だけでも 36種類以上
化合物の骨格構造となるust-RiPSコアペプチド配列の例
A. flavus
Ustiloxin
Chr.1 Chr.2 Chr.3 Chr.4 Chr.5 Chr.6 Chr.7 Chr.8
新規環状ペプチドの発見
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UstYホモログが環状化に必須
新規ust-RiPS化合物の発見
MHLSRYIAVLLSASSFVSALPLQNDVISDDGSKPIDAIMATAMEHKVVNPENLDATPATPENPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPDDLDKRFYYTGYKR NAETPDDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDKRFYYTGYKR NAETPEDLDK
ustYホモログ
前駆体ペプチド
A. flavus type-2a RiPS経路
輸送体イソフラボン還元酵素
ustYa homolog
シグナル強度
EIC m/z 808 [M-H]-
WT
precursor gene
特願2015-215256, 2015/10/30
Asperipin-2aAspergillus ribosomal peptide type-2a
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カビだけではなくキノコにも分布するUstYホモログ
UstYホモログはカビ・キノコに広く保存されている
Blastp search against NR,
e-value < 1e-4 (Jul 2016)
環状化因子UstYホモログはDikarya75種270株に存在
Ascomycota 268
Basidiomycota 2Talaromyce
sPenicillium
AspergillusBotrytis
Pseudogymnoasc
us
Magnaporthe
Metarhizium
Cordyceps
Trichoderma
Colletotrichum
Ustilaginoidea
Paxillus
Bipolaris
Neurospora
Drawn by iTOL: http://itol.embl.de/
リモートホモログはそれ以上Ascomycota >1000
Basidiomycota >100PSIblast against UniProtKB
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ust-RiPS遺伝子シーズを用いた期待される展開
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• Well studied in plant pathogens
‒ Most are secreted and cysteine-rich
‒ Many effectors localise in apoplast, whilst some including Avr567
function inside the plant cytoplasm
‒ Host cells develop cognate resistance genes against them
• 最近、ヒト病原真菌Candida albicansにおいて、ペプチド毒素candidalysinが同定された
‒ 上皮細胞を損傷
‒ Kex2pによって切断される
‒ 構造的にust-RiPS前駆体と酷似（繰り返してはいない）
類似するカビの機能タンパク質の例
Moyes et al., Nature, 532:64-68, 2016;
Extended Data Figure 3a,b
動物感染性真菌Candida albicansにおける報告
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ust-RiPSシーズでできること
特徴• Fungiに幅広く保存（何らかの機能を持つはず）
• 多くの場合一株10個以上保有（機能を使い分け?）
• 多様な前駆体配列（Aspergillusだけで >36種類）
• NRPSとは異なる性質（細胞内での特異的分子接着）
• 芳香環への直接のエーテル結合構造（芳香環＋親水性）
まったく新規な機能性化合物を多数生合成できる可能性
Asperipin-2a Ustiloxin B
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希望する連携
• 化合物の親水性を制御したい
• 対象分子の活性部位にうまくはまる構造を作りたい
• 細胞内分子にじわじわと効く薬を作りたい
• 欲しい活性（機能）があるが、何が効くか分からない
• 緩やかな活性を持つ健康サプリを開発したい
などございましたら…以下までお問い合わせください：
産業技術総合研究所
イノベーションコーディネータ 新間 陽一
ＴＥＬ ０２９－８６２ － ６０３２
ＦＡＸ ０２９－８６２ － ６０４８
e-mail [email protected]
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ご清聴ありがとうございました
謝辞
Rutgers大学Joan W. Bennett教授
(株)ファームラボ熊谷 俊高
北海道大学及川 英秋 教授南 篤志 准教授Ye Ying
東北大学五味 勝也 教授阿部 敬悦 教授吉見 啓 博士
AIST
新家 一男 GL
長野 希美 博士小池 英明 博士町田 雅之 博士石井 智子河野 仁
その他ラボメンバー
基盤C (H26-28FY)
