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FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI
1: I dentificazione, isolamento e clonaggio genecodificante per proteina bersaglio
2: espressione in sistema eterologo
3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type(stabilità termodinamica e cinetica)
4: progettazione, produzione e caratterizzazione versionimutate
(⇔ BIOINFORMATICA)
(⇔ BIOINFORMATICA)
(⇔ FOLDING)
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ISOLAMENTO DEL GENE
ANALISI DI REPERTORI MOLECOLARI (gene o cDNA)
Isolamento per omologia (clone di topo per ottenere cDNA umano)Genetica inversa (dalla proteina al gene)Isolamento in base alla posizione genomica (informazioni genetiche)Anticorpo (libreria di espressione)
CLONAGGIO DIRETTOPCR (geni procariotici o cDNA)
SINTESI EX-NOVOOligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)
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Le caratteristiche di una libreria di cloni idealeCompleta – Almeno un clone per mRNA
Ben classificabile – Possibilità di formare sottogruppi
Flessibile – Cloni trasferibili in altri vettori velocemente
Esprimibile – I cloni devono essere completi e pronti per l’inserzione disequenze aggiuntive utili
Ad alta qualità – Tutti I cloni sequenziati
Economicamente accessibile –
www.invitrogen.com mgc.nci.nih.govhttp://www.geneservice.co.uk/products/image/index.jsp
Disponibilità commerciale e informazioni
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La completezza delle librerie è condizionata dalledimensioni degli inserti
N = [ln (1-P)]/[ln (1-f)]P – probabilità di completezzaN – numero di cloni richiestif – proporzione di genoma nel singolo clone
N = [ln .01]/[ln 0.99999886] = -4.6/-1.14 x 10-7
= 40,350,877 cloni
Genoma umano - plasmidi (max 5Kb)
P – 99%f – 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-6
Batteriofagi (40kB)= 578, 616 cloni
YACs(500kB) = 40,350 cloni
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Libreria digeni umani
Cloni su filtro
Sonda costruita su genedi topo
Positivi sonoomologhi al gene di topo
ISOLAMENTO PER OMOLOGIA
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MOLTI METODI DI CLONAGGIO (e altro) SONO BASATI SULL’USO DELLA PCR
….e i primers? Si scrivono sempre 5’->3’ Primer sense (forward) = filamento codificante -> 5’-ATG………-3’Primer antisense (reverse) = reverse complement -> 5’-TTA……-3’
ATG TAA
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PCR Primers: ALCUNE REGOLE DA RICORDARE.....1. Primer Length: Lunghezza ottimale 18-22 bp. Assicura specificità e facilità di legame.
2. Melting Temperature: è la temperatura a cui la metà di un duplex si denatura dando unsingle strand. Tm= 52-58 oC danno risultati ottimali; primers con Tm più elevate (>65°C) tendonoa formare strutture secondarie.
Formula per calcolo Tm (rigorosa e basata su la valutazione per coppie di basi delle interazioni):
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FORMULE SEMPLIFICATE
1. Più corti di 18 basi
Tm= 4°C x (G +C) + 2°C x (A + T)
2. Più lunghi di 18 basi
Tm = 64.9°C + 41°C x [(G+C) – 16.4]/N
3. Tiene conto dell’effetto dei sali (Primer 3 program e altri)
Tm = 81.5°C + 16.6°C x (log10[Na+] + [K+]) + 0.41°C x (%GC) – 675/N
3. Calcolo del peso molecolare (accurato):
MW = (329.2 * G) + (313.2 * A) + (304.2 * T) + (289.2 * C)
Correzioni:
-78 per il 5' phosphate group (PO3) sostituito da un idrogeno (primers defosforilati)
+17 per il 3’ OH .
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4.Primer annealing temperature : Stima della stabilità dell’ibrido DNA-DNA.
Ta troppo elevata: primer-template hybridization insufficiente: resa bassa prodotto PCR.
Ta troppo bassa: prodotti aspecifici per la presenza di mismatches
Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (prodotto) – 14.9
Dove Tm(primer) = Melting Temperature dei primers
Tm(product) = Melting temperature del prodotto di PCR
5. GC Content : (numero di G e C nel primer come % basi totali) dovrebbe essere 40-60%.
6. GC Clamp : La presenza di basi G o C nelle ultime 5 basi al 3’ dei primer ha un effetto positivo(meglio non più di tre).
7. Strutture secondarie : La presenza di strutture secondarie abbassa la resa in prodottoinfluenzando il processo di annealing primer-templato. Riduce la concentrazione effettiva deiprimers.
Hairpin : Intramolecolare nel primer. Sono tollerati: 3' -hairpin con DeltaG di -2 kcal/mol ehairpin interni con DeltaG di -3 kcal/mol
Self Dimer : Intermolecolari tra primer omologhi. Sono tollerati: 3' - self dimer con DeltaG di -5kcal/mol e self dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.
Cross Dimer : Intermolecolari tra primer senso e antisenso. Sono tollerati: 3' - cross dimer conDeltaG di -5 kcal/mol e cross dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.
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8. Repeats : ripetizioni consecutive di due nucleotidi: possono dare errori di innesco.
Sono tollerati massimo 4 dinucleotidi
9. Runs : sequenze formate dallo stesso nucleotide: possono dare errori di innesco.
Esempio: AGCGGGGGATGGGG.
Sono tollerati runs di massimo 4 nucleotidi.
10. 3' End Stability : è il valore massimo del deltaG delle 5 basi al 3’. Non dovrebbe esseremolto negativo.
11. Evitare le zone in cui nel templato sono presenti strutture secondarie.
12. Evitare le regioni di cross-omologia tra geni presenti nella miscela di reazione.
ACUNI SITI ONLINE PER IL DISEGNO DI PRIMERS
PRIMER3
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
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CloningSequencingPrimer_List
Primer_Check
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Differential PrimersPCR primer design per:•Gene-specific primers (per multi-gene families)
-identificare specie o ceppi specifici -diagnostica molecolare•Consensus primers amplificare geni appartenenti a una famiglia digeni
BISOGNA LAVORARE SU ALLINEAMENTI MULTIPLI E TROVAREZONE CONSERVATE O MENO (CONSENSUS O SPECIFICHE)
Primer 3 at the MIT Whitehead Institutehttp://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
GeneFisher by Folker Meyer & Chris Schleiermacherat Bielefeld University, Germanyhttp://bibiserv.TechFak.Uni-Bielefeld.DE/genefisher2/
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GENETICA INVERSA
1. La sequenza della proteina è nota e si può dedurre una sequenza genica (o proteine omologhe)
NH3+-Met-Asp-Gly--------------Trp-Ser-Lys-COO-
5’-ATG-GAT-GCT TGG-AGT-AAA-3’ C C C G A TCT G C A G
2. Si possono progettare primers degenerati
Forward primer: 5’-ATGGAT/CGCN-3’ (sense)Reverse primer: 5’-T/CTTNC/GT/ACCA-3’ (antisense)
Note: T/C = miscela di T e C; N = miscela di 4 nucleotidi (anche dInosina)NB La degenerazione diminuisce la concentrazione effettiva del singolo primer(nell’esempio: sense= 1/4x1/2=1/8 ; antisense= 1/4x(1/2)3=1/32)Evitare degenerazioni maggiori di 1/512…..
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Libreria
Cloni su filtro
Sonda = frammento di PCR
Positivi sono il gene umano di interesse
4. Si analizza una libreria di cloni
3. Si amplifica il frammento di gene mediante PCR
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ISOLAMENTO DIRETTO DA MATERIALE GENETICO
Fonti di materiale genetico di vario tipoMicrorganismi, Virus vegetali, Linee cellulari animali ed umaneSITO : www.dsmz.de
PCR su stampi a sequenza nota (genomi caratterizzati)
SINTESI EX-NOVO
Oligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)
www.genscript.com < 1.5 USD/bp (da 1800 USD espressione)www.geneart.com < 1 euro/bp
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Polimerasi ad alta fedeltà
Taq polimerasi (dal termofilo Thermus aquaticus)= 94 kDa con 2 attività cataliticheA) 5’⇒3’ DNA polymerase (50-60 nucleotidi/sec)B) 5’ ⇒ 3’ esonucleasi (rimuove nucleotidi al 5’)Versioni ricombinanti di Taq
Manca la attività 3’ ⇒ 5’ esonucleasiFrequenza di errore: 1 per 104 nucleotidi per un frammento di 400 bp amplificato per 106 volte(=20 cicli) : 33% mutati
Polimerasi ad alta fedeltà(= con attività 3’ ⇒ 5’ esonucleasi)Riconosce se il nucleotide al 3’ si appaia con il templato.A volte taglia anche i nucleotidi non appaiati al 3’ del primer (‘nibbling’)Aumento di fedeltà 5-12 volteVent®, DeepVent®, Tli (Thermoccocus litoralis),Pfu (Pyrococcus furiosus)Blunt ends invece che overhangs(Si può fare ultimo ciclo con Taq per TA cloning)
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I METODI DI CLONAGGIO SONO DI GRANDE IMPORTANZASIA NELL’ISOLAMENTO E PRODUZIONE DELLA PROTEINA WILD TYPE
CHE NELLA PRODUZIONE DI MUTANTI
-NECESSITA’ DI LAVORARE CON UN NUMERO ELEVATO DI CLONIIN TEMPI SPERIMENTALI RAGIONEVOLI
SONO STATE SVILUPPATE NUOVE TECNOLOGIE DI CLONAGGIO RAPIDO
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• Strategia comune per clonare invettori diversi
• Singola reazione di breve durata• Alta resa (HTP)• Efficienza quasi 100%• No mutazioni
Approccio per ricombinazione
CLONAGGI: Approccio tradizionale(ligasi)
SISTEMI GATEWAY E TOPO (Invitrogen)
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Integrase (Int)Host Integration Factor (IHF)
Int+IHF+ Excisionase (Xis)
Il sistema Gatewaysi basa sul processo di ricombinazione tra fago lambda ed E. coli
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ccdB gene= gene killer: interferisce con l’attività della DNA girasi causando morte cellulare (plasmide F con ccdA=antidoto)
Il principio Gateway: le reazioni LR e BP
La LR clonasi comprende le attivitàInt, IHF e Xis
(= excisione di lambda)
Il costrutto di espressione:-ha selezione positiva (Apr)- non ha selezione negativa (ccdB)
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La procedura sperimentale è semplice
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IL VETTORE DI INGRESSO PUO’ ESSERE COSTRUITO CON STRATEGIE DIVERSE
1. Restrizione e clonaggio in vettore Gateway attL
2. PCR con primers attB(>20-25 basi extra) eclonaggio in vettore Gateway attP
3. Libreria di clonaggio
4. Libreria di espressione
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QUALSIASI VETTORE PUÒ DIVENTARE VETTORE DI DESTINAZIONE
Deve essere replicato in un ceppo con una mutazione nellaDNA girasi (gyrA462) (DB3.1™)
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I vettori di destinazione possono avere caratteristiche diverse a seconda dello scopo dell’esperimento
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3 giorni:6 prodotti di fusionee loro espressione
……e i tempi?
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Il sistema TOPO si basa sulla attività della topoisomerasi I
1. Si lega covalentemente al gruppo fosfato di una sequenza specifica2. Svolge il DNA3. Riforma il legame covalente (attività = ligasi)
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1 (TOPO) La topoisomerasi è covalentemente legata ad un gruppo fosfato presentealle estremità del vettore di clonaggio2 (TOPO) L’inserto ha una estremità 3’ che si allinea al vettore3 (TOPO) L’enzima forma il legame covalente (attività = ligasi) e poi si stacca
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Il sistema TOPO può essere trasformato in sistema di clonaggioad alta resa (High-Throughput,HT) se nella singola provetta sono presenti
molte reazioni (es. 500)
Il metodo di clonaggio è molto veloce
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I sistemiGateway e TOPOpossono essere
combinati
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I vantaggi di questi sistemi sono molteplici:1. i tempi sperimentali si abbreviano
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Si possono progettare esperimentiHTP (High-throughput)
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E.coliE.coli expression screenings (1) expression screenings (1)
Expression screening (normalized)with auto-inducing medium in 24well plate followed by anti-His Dot-Blot and Ni affinity purificationwith 96-well filter plate
Freedom Tecan robotTotal Soluble
Total expression (mg/L of culture) Soluble Fraction (mg/L of culture)0.27 3.34 0.48 3.78 11.94 0.60 1.51 0.04 2.85 0.270.04 3.38 0.18 2.50 1.50 0.14 3.93 0.26 4.99 0.091.31 10.09 0.34 13.87 1.30 1.38 0.82 0.19 0.46 0.131.00 0.75 0.55 2.73 0.82 1.22 1.20 0.46 7.88 0.258.20 24.56 0.83 7.77 51.64 1.58 25.00 1.35 16.97 2.619.64 1.65 12.10 20.31 21.94 1.24 1.34 0.33 1.57 8.4222.37 18.75 6.13 12.87 19.40 1.53 0.23 0.02 0.54 15.380.61 10.87 6.74 9.65 3.22 0.17 0.08 -0.02 0.77 1.23
No expression Soluble < 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble
No expression Soluble > 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble
Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L No expression Not Soluble Not Soluble
Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble > 2mg/L Not Soluble
Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble > 2mg/L
Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L
Soluble < 2mg/L Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L
Not Soluble Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L
Fully automated expression screening: 8 hours for 160 culturesFully automated expression screening: 8 hours for 160 cultures
reference scale
• 3 classes:-soluble-partially soluble-not soluble
Vincentelli R et al. (2005) Anal. Bioch.for 1-4 mL cultures
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Si possono ottenere moltepliciinformazioni sulla stessa proteina
2
–
–
+
X
c
1167121
––––+–+
–––––––
–––––––
LCZYABA
nccpncnLocalizzazione
Interazioni
Saggio funz #1
Saggio funz #2
Saggio funz #3
Purificazione